CN114990074A

CN114990074A - 一种杂交瘤细胞株、抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN114990074A
Application number: CN202210714655.XA
Authority: CN
Inventors: 范磊
Original assignee: Beijing Sino Fir Jinqiao Biological Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Sino Fir Jinqiao Biological Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-23
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-06-23
Also published as: CN114990074B

Abstract

本发明提供了一种杂交瘤细胞株、抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体及其应用，所述杂交瘤细胞株于2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45153，所述抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体由所述杂交瘤细胞株产生。本发明所述的杂交瘤细胞株可稳定分泌单克隆抗体，且与FH蛋白特异性结合，显著提高了FH蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于多种肿瘤中FH蛋白的标记。

Description

一种杂交瘤细胞株、抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种杂交瘤细胞株、抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体及其应用。

背景技术

延胡索酸水合酶(fumarate hydratase，FH)是一类参与三羧酸循环的关键性酶，能够在细胞内催化延胡索酸转变成L-苹果酸。FH蛋白由510个氨基酸组成，基因位于染色体1q42.3-q43，大小约22kb。FH基因突变引起双等位基因失活导致FH活性降低或完全丧失，造成细胞内延胡索酸积累，糖酵解加强，引起不依赖低氧环境的低氧诱导因子1α(HIF-1α)稳定表达，导致细胞内微环境改变，从而促进肿瘤发生。

FH的显性突变可以引起多发性皮肤和子宫平滑肌瘤病(multiple cutaneous anduterine leiomyomatosis，MCUL1)、遗传性平滑肌瘤和肾细胞癌(hereditaryleiomyomatosis and renal cell cancer，HLRCC)、副神经节瘤、睾丸间质细胞瘤、卵巢囊腺瘤等疾病。尽管皮肤和子宫的平滑肌瘤是良性的，但是HLRCC病人中的肾肿瘤具有很强的侵袭性，预后很差。皮肤平滑肌瘤和子宫平滑肌瘤的FH的表达缺失是HLRCC敏感性和特异性的标志物，血管内皮细胞是阳性内对照。

目前临床上主要通过免疫组织化学(简称免疫组化， Immunohistochemistry，IHC)病理实验检测肿瘤组织中FH蛋白的表达状况，及时准确的病理诊断对FH缺陷型肾细胞癌患者的治疗以及预后的评估起到了关键的作用。因此，研制出一种结合特异性较高的针对FH蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种杂交瘤细胞株、抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体及其应用，以提供一种与FH蛋白特异性结合的单克隆抗体。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种杂交瘤细胞株，命名为鼠抗人延胡索酸水合酶（FH）单克隆抗体杂交瘤细胞株OTI1F10，所述杂交瘤细胞株于2022年5 月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.45153。

抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述所述杂交瘤细胞株的筛选方法及单克隆抗体制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据FH ORF核苷酸序列(FH ORF核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，FH氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，设计引物，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry，构建重组表达质粒pCMV6-rFH。

(2)重组FH蛋白的表达与纯化：将构建的FH重组表达质粒转化 HEK293T细胞，裂解离心获得上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的重组FH蛋白。

(3)单克隆抗体杂交瘤细胞筛选及其分泌的单克隆抗体制备：采用上述重组FH蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗FH 蛋白的特异性抗体杂交瘤细胞株，并进行亚型鉴定；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得抗FH蛋白鼠单克隆抗体OTI1F10。

进一步地，所述鼠单克隆抗体OTI1F10，其轻链可变区含104aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其重链可变区含115aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地，所述鼠单克隆抗体OTI1F10，其中轻链可变区包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa-31aa， 49aa-51aa和88aa-93aa。其氨基酸序列分别如SEQ ID No.5-7所示。

进一步地，所述鼠单克隆抗体OTI1F10，其中重链可变区包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为26aa-33aa， 51aa-58aa和97aa-104aa。其氨基酸残基序列分别如SEQ ID No.8-10所示。

进一步地，所述的鼠单克隆抗体OTI1F10可以与FH蛋白高特异性结合，通过免疫检测方法，如蛋白印记(Western blot，WB)、免疫组织化学实验 (IHC)，验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

根据上述的单克隆抗体在制备免疫检测工具中的应用；优选地，所述免疫检测工具用于检测FH蛋白；进一步优选地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

根据上述的单克隆抗体在制备用于标记肿瘤细胞或肿瘤组织试剂盒中的应用；优选地，所述肿瘤包括FH缺陷型子宫平滑肌瘤、FH缺陷型肾癌和肠癌中的一种或多种。

一种免疫组织化学检测试剂盒，包括如上所述的单克隆抗体，可检测组织细胞中FH蛋白的表达状况。

相对于现有技术，本发明所述的杂交瘤细胞株、抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体及其应用具有以下优势：

本发明所述的杂交瘤细胞株可稳定分泌单克隆抗体，且与FH蛋白特异性结合，显著提高了FH蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于多种肿瘤中FH蛋白的标记。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例2所述的重组FH蛋白Western blot检测结果图，以anti-DDK抗体检测重组FH蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中泳道L 为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果、泳道R为转染 pCMV6-rFH质粒的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果；

图2为本发明实施例2所述的FH蛋白SDS-PAGE结果图，用抗DDK 亲和层析柱纯化重组FH蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色；

图3为本发明实施例5所述的OTI1F10分泌的单克隆抗体IHC检测FH 缺陷型子宫平滑肌瘤的结果示意图；

图4为本发明实施例5所述的OTI1F10分泌的单克隆抗体IHC检测FH 缺陷型肾癌的结果示意图；

图5为本发明实施例5所述的OTI1F10分泌的单克隆抗体IHC检测正常肾脏的结果示意图；

图6为本发明实施例5所述的OTI1F10分泌的单克隆抗体IHC检测肠癌组织的结果示意图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

实施例1：FH蛋白重组表达质粒的构建

从Genebank中选调FH基因NM_000143，根据FH ORF核苷酸序列(FH ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，FH氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示)。设计引物PCR，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，克隆入表达载体pCMV6-Entry，建立FH重组表达质粒pCMV6-rFH。

实施例2：重组FH蛋白的表达与纯化

1.实验方法

(1)转染HEK293T细胞：HEK293T细胞以1:3传至培养皿中继续培养；取7.5mL DMEM(无血清及抗生素)至50mL管中，加入300μL PEI MegaTran1.0混匀；加入75μg FH重组表达质粒DNA至混匀液中，混匀并静置30分钟；分别取515μL至各培养皿中于37℃5％CO₂培养箱中培养。转染24小时后，每皿细胞添加25μL 2M丁酸钠至终浓度5mM。

(2)裂解细胞：转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入1mL PBS进行漂洗，吸去PBS。加入1mL裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中的裂解液，4℃离心，收集上清。取少量上清采用WB鉴定重组FH的表达，结果图1。

(3)DDK亲和层析柱纯化：以0.45μM，33mm PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15mL管，加入混合好的Beads 1mL，封口后放入360 度混匀器中，于4℃结合2小时；取出15mL管，将裂解液倒入BIO-RAD 层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样WB检测；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用TBST冲洗Beads 3次，滴尽后用0.1M Glycine buffer(pH3.5)洗脱，第一次200μL，滴尽不收集，第二、三次各500μL，第四次250μL，收集至1.5mL离心管中，并迅速加入NaH₂PO₄ buffer(pH11.0) 中和至pH7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10％，Tween-80至终浓度为 0.1％。纯化后的重组FH蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图2。

2.实验结果

(1)由图1结果可见，转染pCMV6-rFH质粒的HEK293T细胞裂解液中WB检测后在54kD处有明显的特异条带(R)，分子量与预期分子量大小一致，而转化空载体的对照裂解液(L)中则没有相应大小的条带。表明细胞中重组FH蛋白特异表达。

(2)由图2结果可见，纯化的蛋白在SDS-PAGE电泳胶上54kD处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明已获得了纯度较好的重组FH蛋白。

实施例3：OTI1F10分泌抗FH蛋白单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用纯化的重组FH蛋白(以下简称FH抗原)用于对BALB/c 小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

(1)动物免疫：经过纯化的FH抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为60μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为30μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

(2)细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃预热的50％PEG(pH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀， MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

(3)筛选和克隆：融合7-10天内挑选杂交瘤细胞克隆，使用纯化的重组FH蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD₂₈₀阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为OTI1F10。

(4)细胞上清单抗的制备与纯化：将杂交瘤细胞株OTI1F10用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×10⁷个细胞时， 800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×10⁵个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×10⁶个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，据抗体亚型选择相应柱料进行纯化(亚型为IgG1，采用protein G柱料进行纯化)。对纯化后的单抗浓度测定，冻干和分装(100μg/管)，最后保存在-20℃。

实施例4：单克隆抗体OTI1F10可变区基因与氨基酸序列分析

从Takara Bio USA公司采购

RACE 5’/3’试剂盒，采用 5’RACE(RapidAmplification of cDNA Ends，快速扩增cDNA末端)技术扩增杂交瘤细胞功能性抗体的可变区轻链与重链基因序列。具体实验过程参见Takara Bio USA公司

RACE 5’/3’Kit使用者手册。

根据所述的抗体OTI1F10为IgG1亚型，设计针对其Ig和Kappa恒定区 3’端的特异性基因引物pRace-H-GSP和pRace-K-GSP，引物序列如下：

pRace-H-GSP：CATCDGTCTATCCACTGGCCCCTG

pRace-K-GSP：CTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTT

从杂交瘤细胞OTI1F10中提取mRNA，逆转录为cDNA，RACE扩增抗体重链和轻链的DNA片段。分别将扩增的轻链与重链通过酶切连于克隆载体PUC119，通过蓝白斑挑取阳性克隆，纯化阳性质粒进行测序，采用测序仪ABI 3730，测序引物为通用引物M13f和M13r。

利用互联网，在http://www.imgt.org上使用IMGT/V-QUEST分析软件，分别将轻链与重链的核苷酸序列进行测序结果数据分析，得到鼠单克隆抗体OTI1F10的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链氨基酸序列如 SEQ ID NO.4所示。轻链可变区全长为104个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和11，CDR的3个结构域氨基酸数分别为5、3和6，CDR1、CDR2和CDR3的区域相应地分别为27aa-31aa，49aa-51aa 和88aa-93aa，其氨基酸序列分别：STANS、STS、LQWISF。

通过分析，所述鼠单克隆抗体OTI1F10重链可变区全长为115个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为25、17、38和11，CDR的3个结构域氨基酸数分别为8、8和8，CDR1、CDR2和CDR3分别为26aa-33aa， 51aa-58aa和97aa-104aa，其氨基酸序列分别为：GYTFTDYT、INDGSGGT、 TRFAYFDY。

实施例5：单克隆抗体OTI1F10为一抗的免疫组化检测

1.实验方法：

(1).取福尔马林固定的子宫平滑肌瘤、肾癌、肾脏以及肠癌组织块进行石蜡包埋，使用Leica组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。

(2).脱蜡与水化：分析纯二甲苯10min×3次，无水乙醇1min×3次，95％乙醇1min，85％乙醇1min，75％乙醇1min，去离子水浸泡2min×3次。

(3).修复抗原：加入抗原修复液[1mM EDTA,10mM Tris buffer (pH8.0)]高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出切片，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡2min×3次。

(4).灭活：使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置 15min，去离子水浸泡2min×3次。

(5).用免疫组化笔在组织外围画框，0.1％PBST洗涤2min x 1次。

(6).孵育一抗：加入稀释后的OTI1F10分泌的单克隆抗体200μl置于湿盒中，37℃孵育60min。用0.1％PBST洗涤2min×3次。

(7).孵育二抗：加入二抗PV-8000 100μl，37℃孵育30min。用0.1％ PBST洗涤2min×3次。

(8).DAB显色：加入120μl DAB显色液，室温静置5min，自来水龙头水流下冲洗以终止显色，自来水漂洗3次。

(9).苏木素复染、分化及返蓝：在苏木素溶液中静置10-120s，自来水漂洗3次终止显色，于1％盐酸乙醇溶液中分化，自来水漂洗3次以终止，放入刚煮沸的pH8.0的Tris-EDTA二钠溶液中返蓝，再放入室温的pH9.0的 Tris-EDTA二钠溶液中数秒，自来水漂洗3次。显微镜下观察染色，若正常则结束并回收苏木素染液；若分化过了，则需重复上述步骤直至染色合格。

(10).脱水和透明：75％乙醇1min，85％乙醇1min，95％乙醇1min，100％乙醇1min×3次，二甲苯1min×3次，中性树胶封片。

(11).镜检，如图3-6所示。

2.实验结果：

杂交瘤细胞OTI1F10分泌的单克隆抗体以IHC法检测FH基因缺失的子宫平滑肌瘤以及肾癌组织，结果显示癌细胞中未表达FH蛋白，仅在血管内皮中呈特异性细胞质表达。图3和图4中的虚线箭头指示为FH蛋白阴性表达的子宫平滑肌瘤细胞以及肾癌细胞，实线箭头指示为FH蛋白阳性表达的血管内皮细胞。

由图5结果可见，杂交瘤细胞OTI1F10分泌的单克隆抗体IHC法检测肾脏组织，结果显示在肾小管中FH蛋白呈特异性细胞质表达。实线箭头指示为FH蛋白阳性表达的肾小管上的细胞。

由图6结果可见，杂交瘤细胞OTI1F10分泌的单克隆抗体IHC法检测非FH缺失的肠癌组织，结果显示癌细胞和间质细胞中均有FH的表达。实线箭头指示为FH蛋白阳性表达的肠癌细胞和间质细胞。

以上结果表明本发明所述的杂交瘤细胞OTI1F10分泌的FH单克隆抗体具有很高的特异性：在正常组织和FH表达的肿瘤组织中均呈现清晰明确的胞浆颗粒状染色，在FH表达缺陷的肿瘤组织中，肿瘤细胞未着色，作为内对照的血管内皮等细胞呈现胞浆阳性。所以OTI1F10分泌的FH单克隆抗体可用于免疫组织化学检测，用以鉴别与FH表达相关的肿瘤。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京中杉金桥生物技术有限公司

<120> 一种杂交瘤细胞株、抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtaccgag cacttcggct cctcgcgcgc tcgcgtcccc tcgtgcgggc tccagccgca 60

gccttagctt cggctcccgg cttgggtggc gcggccgtgc cctcgttttg gcctccgaac 120

gcggctcgaa tggcaagcca aaattccttc cggatagaat atgatacctt tggtgaacta 180

aaggtgccaa atgataagta ttatggcgcc cagaccgtga gatctacgat gaactttaag 240

attggaggtg tgacagaacg catgccaacc ccagttatta aagcttttgg catcttgaag 300

cgagcggccg ctgaagtaaa ccaggattat ggtcttgatc caaagattgc taatgcaata 360

atgaaggcag cagatgaggt agctgaaggt aaattaaatg atcattttcc tctcgtggta 420

tggcagactg gatcaggaac tcagacaaat atgaatgtaa atgaagtcat tagcaataga 480

gcaattgaaa tgttaggagg tgaacttggc agcaagatac ctgtgcatcc caacgatcat 540

gttaataaaa gccagagctc aaatgatact tttcccacag caatgcacat tgctgctgca 600

atagaagttc atgaagtact gttaccagga ctacagaagt tacatgatgc tcttgatgca 660

aaatccaaag agtttgcaca gatcatcaag attggacgta ctcatactca ggatgctgtt 720

ccacttactc ttgggcagga atttagtggt tatgttcaac aagtaaaata tgcaatgaca 780

agaataaaag ctgccatgcc aagaatctat gagctcgcag ctggaggcac tgctgttggt 840

acaggtttaa atactagaat tggctttgca gaaaaggttg ctgcaaaagt ggctgcactt 900

acaggcttgc cttttgtcac tgctccgaat aaatttgaag ctctggctgc tcatgacgct 960

ctggttgagc tcagtggagc catgaacact actgcctgca gtctgatgaa gatagcaaat 1020

gatattcgat ttttgggttc tggtcctcgg tcaggtctgg gagaattgat cttgcctgaa 1080

aatgaaccag gaagcagtat catgccaggc aaggtgaacc ctactcagtg tgaagcaatg 1140

accatggttg cagcccaagt catggggaac catgttgctg tcactgtcgg aggcagcaat 1200

ggacattttg agttgaatgt tttcaagcca atgatgatta aaaatgtgtt acactcagcc 1260

aggctgctgg gggatgcttc agtttccttt acagaaaact gcgtggtggg aatccaggcc 1320

aatacagaaa ggatcaacaa gctgatgaat gagtctctaa tgttggtgac agctctcaat 1380

cctcatatag ggtatgacaa ggcagcaaag attgctaaga cagcacacaa aaatggatca 1440

accttaaagg aaactgctat cgaacttggc tatctcacag cagagcagtt tgacgaatgg 1500

gtaaaaccta aggacatgct gggtccaaag 1530

<210> 2

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Tyr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Arg Ser Arg Pro Leu Val Arg

1 5 10 15

Ala Pro Ala Ala Ala Leu Ala Ser Ala Pro Gly Leu Gly Gly Ala Ala

20 25 30

Val Pro Ser Phe Trp Pro Pro Asn Ala Ala Arg Met Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Ser Phe Arg Ile Glu Tyr Asp Thr Phe Gly Glu Leu Lys Val Pro Asn

50 55 60

Asp Lys Tyr Tyr Gly Ala Gln Thr Val Arg Ser Thr Met Asn Phe Lys

65 70 75 80

Ile Gly Gly Val Thr Glu Arg Met Pro Thr Pro Val Ile Lys Ala Phe

85 90 95

Gly Ile Leu Lys Arg Ala Ala Ala Glu Val Asn Gln Asp Tyr Gly Leu

100 105 110

Asp Pro Lys Ile Ala Asn Ala Ile Met Lys Ala Ala Asp Glu Val Ala

115 120 125

Glu Gly Lys Leu Asn Asp His Phe Pro Leu Val Val Trp Gln Thr Gly

130 135 140

Ser Gly Thr Gln Thr Asn Met Asn Val Asn Glu Val Ile Ser Asn Arg

145 150 155 160

Ala Ile Glu Met Leu Gly Gly Glu Leu Gly Ser Lys Ile Pro Val His

165 170 175

Pro Asn Asp His Val Asn Lys Ser Gln Ser Ser Asn Asp Thr Phe Pro

180 185 190

Thr Ala Met His Ile Ala Ala Ala Ile Glu Val His Glu Val Leu Leu

195 200 205

Pro Gly Leu Gln Lys Leu His Asp Ala Leu Asp Ala Lys Ser Lys Glu

210 215 220

Phe Ala Gln Ile Ile Lys Ile Gly Arg Thr His Thr Gln Asp Ala Val

225 230 235 240

Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu Phe Ser Gly Tyr Val Gln Gln Val Lys

245 250 255

Tyr Ala Met Thr Arg Ile Lys Ala Ala Met Pro Arg Ile Tyr Glu Leu

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Thr Arg Ile Gly

275 280 285

Phe Ala Glu Lys Val Ala Ala Lys Val Ala Ala Leu Thr Gly Leu Pro

290 295 300

Phe Val Thr Ala Pro Asn Lys Phe Glu Ala Leu Ala Ala His Asp Ala

305 310 315 320

Leu Val Glu Leu Ser Gly Ala Met Asn Thr Thr Ala Cys Ser Leu Met

325 330 335

Lys Ile Ala Asn Asp Ile Arg Phe Leu Gly Ser Gly Pro Arg Ser Gly

340 345 350

Leu Gly Glu Leu Ile Leu Pro Glu Asn Glu Pro Gly Ser Ser Ile Met

355 360 365

Pro Gly Lys Val Asn Pro Thr Gln Cys Glu Ala Met Thr Met Val Ala

370 375 380

Ala Gln Val Met Gly Asn His Val Ala Val Thr Val Gly Gly Ser Asn

385 390 395 400

Gly His Phe Glu Leu Asn Val Phe Lys Pro Met Met Ile Lys Asn Val

405 410 415

Leu His Ser Ala Arg Leu Leu Gly Asp Ala Ser Val Ser Phe Thr Glu

420 425 430

Asn Cys Val Val Gly Ile Gln Ala Asn Thr Glu Arg Ile Asn Lys Leu

435 440 445

Met Asn Glu Ser Leu Met Leu Val Thr Ala Leu Asn Pro His Ile Gly

450 455 460

Tyr Asp Lys Ala Ala Lys Ile Ala Lys Thr Ala His Lys Asn Gly Ser

465 470 475 480

Thr Leu Lys Glu Thr Ala Ile Glu Leu Gly Tyr Leu Thr Ala Glu Gln

485 490 495

Phe Asp Glu Trp Val Lys Pro Lys Asp Met Leu Gly Pro Lys

500 505 510

<210> 3

<211> 104

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Ile Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Ser Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr Ala Asn Ser Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ile Ser Phe Phe Gly Thr

85 90 95

Gly Thr Arg Leu Glu Leu Lys Arg

100

<210> 4

<211> 115

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Asn Asp Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Lys Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Ser Thr Ala Asn Ser

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Ser Thr Ser

1

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Leu Gln Trp Ile Ser Phe

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Ile Asn Asp Gly Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Thr Arg Phe Ala Tyr Phe Asp Tyr

1 5

Claims

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株于2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45153。

2.抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体，其特征在于：由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。

3.根据权利要求2所述的抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体与FH蛋白特异性结合。

4.根据权利要求2所述的抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID No.5所示的CDR1、如SEQ ID No.6所示的CDR2及如SEQ ID No.7所示的CDR3。

6.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID No.8所示的CDR1、如SEQ ID No.9所示的CDR2及如SEQ ID No.10所示的CDR3。

8.根据权利要求2-7任一所述的单克隆抗体在制备免疫检测工具中的应用；优选地，所述免疫检测工具用于检测FH蛋白；进一步优选地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

9.根据权利要求2-7任一所述的单克隆抗体在制备用于标记肿瘤细胞或肿瘤组织试剂盒中的应用；优选地，所述肿瘤包括FH缺陷型子宫平滑肌瘤、FH缺陷型肾癌和肠癌中的一种或多种。

10.一种免疫组织化学检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求2-7任一所述的单克隆抗体。