CN110407940B - 一种抗天门冬氨酸蛋白酶a（napsin a）单克隆抗体及其免疫检测应用 - Google Patents

一种抗天门冬氨酸蛋白酶a（napsin a）单克隆抗体及其免疫检测应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种由杂交瘤细胞株OTI8A5(保藏编号为CGMCC No.18190)分泌的抗天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSIN A)单克隆抗体。本发明还涉及OTI8A5分泌的单克隆抗体在制备用于检测NAPSIN A蛋白的免疫检测工具中的应用，包含免疫组织化学检测试剂盒与标记肿瘤试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与NAPSIN A蛋白特异性结合，显著提高了NAPSIN A蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

Description

一种抗天门冬氨酸蛋白酶A（NAPSIN A）单克隆抗体及其免疫 检测应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株OTI8A5分泌的单克隆抗体与天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSIN A)特异性结合用于免疫检测的方法和应用。
背景技术
NAPSIN A是一种天门冬氨酸蛋白酶，其主要参与蛋白水解过程，诱导蛋白前体成熟，维持组织形态及正常功能。NAPSIN A蛋白由420个氨基酸组成，是由19q13.33号染色体上NAPSIN A基因编码的，包含24个氨基酸的信号肽，36个氨基酸的前肽区，342个氨基酸的成熟区和18个氨基酸的C末端残基，相对分子量为45KDa左右。NAPSIN A蛋白是由2条肽链组成的同质二聚体，在人肺和肾脏组织中显著表达。在肺中，NAPSIN A蛋白主要表达于II型肺泡上皮细胞，在肺泡巨噬细胞、I型肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮及一部分淋巴细胞中也有少量的表达。在肾中，NAPSIN A蛋白主要在肾皮质的近端小管曲部、近端小管直部、远端小管曲部的上皮细胞中显著表达，少数肾髓质的集合管及髓袢细段的上皮细胞内有轻微表达。肿瘤学研究显示，NAPSIN A蛋白主要表达于肺腺癌和肾细胞癌。非小细胞肺癌患者占所有肺癌患者的80％，主要分为肺腺癌和肺鳞癌。NAPSIN A蛋白在90％的肺腺癌组织中呈阳性表达，在肺鳞癌组织中呈现阴性表达，是用于鉴别诊断区分肺腺癌和肺鳞癌的标志物之一。总而言之，NAPSIN A蛋白不仅为肿瘤检测提供一个指标，对肿瘤的发生和进展都起着重要作用。
目前临床上主要通过免疫组织化学(简称免疫组化，Immunohistochemistry，IHC)病理实验检测肿瘤组织中NAPSIN A蛋白的表达状况，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对 NAPSIN A蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与NAPSIN A蛋白特异性结合的单克隆抗体，及其在制备用于检测NAPSIN A蛋白的免疫检测工具中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种能分泌抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株 OTI8A5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为 CGMCC)，保藏日期为2019年7月11日，保藏编号为CGMCC No.18190。
本发明还提供了一种特异性结合NAPSIN A的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株OTI8A5分泌。
本发明所述单克隆抗体制备方法如下：
(1)重组表达载体的构建：基因合成NAPSIN A核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，ORF长度为543bp，相对应的NAPSIN A蛋白包括第62-244氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示，氨基酸长度为181aa。将合成的NAPSIN A的ORF插入表达载体pET23a-His(购于Origene公司)，构建NAPSIN A的重组表达质粒 pET23a-His-rNAPSIN A。
(2)重组NAPSIN A蛋白的表达与纯化：将构建的NAPSIN A重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解离心获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的重组NAPSIN A蛋白。
(3)单克隆抗体杂交瘤细胞筛选及其分泌的单克隆抗体制备：采用上述重组NAPSIN A蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗NAPSIN A蛋白的特异性抗体杂交瘤细胞株，并进行亚型鉴定；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体。通过免疫检测方法，如蛋白印记(Western-blot，WB)、免疫组织化学实验(IHC)，验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。
经过上述方法制备后，筛选出能够分泌抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为OTI8A5，亚型鉴定为IgG1，并于2019年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No.18190。
本发明还提供了由杂交瘤细胞株OTI8A5分泌的单克隆抗体在制备用于检测NAPSIN A蛋白的免疫检测工具中的应用。
作为优选，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
本发明还提供一种免疫组织化学检测试剂盒，包括由杂交瘤细胞株OTI8A5 分泌的抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体，可检测组织细胞中NAPSIN A蛋白的表达状况。
此外，本发明还提供了杂交瘤细胞株OTI8A5分泌产生的抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。
作为优选，所述肿瘤细胞包括肺腺癌细胞系(NCI H2347)；肿瘤组织包括肺腺癌，肺鳞癌和前列腺癌组织。
本发明提供了由杂交瘤细胞株OTI8A5可稳定分泌的单克隆抗体，且与 NAPSIN A蛋白特异性结合，显著提高了NAPSIN A蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各类肿瘤中NAPSIN A蛋白的标记。
生物保藏信息说明
用于保藏分泌抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株OTI8A5的分类命名为：鼠抗人天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSIN A)单克隆杂交瘤细胞株
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
保藏日期：2019年7月11日
保藏编号：CGMCC No.18190
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1所示为实施例1中NAPSIN A的ORF克隆位点设计图。
图2所示为实施例2中WB检测重组NAPSIN A蛋白的结果图，以anti-His抗体检测重组NAPSIN A蛋白在E.coli细胞裂解液中的表达。其中泳道L为转染空载体质粒的E.coli细胞裂解液为抗原的检测结果；泳道R为转染pET23a-His-rNAPSIN A质粒的E.coli细胞裂解液为抗原的检测结果。
图3所示为实施例2中SDS-PAGE电泳检测重组NAPSIN A蛋白的结果图，用镍亲和层析柱纯化重组NAPSIN A蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色。
图4所示为实施例4中OTI8A5分泌的单克隆抗体与IP64抗体IHC检测 NCI H2347肺腺癌细胞系中NAPSIN A表达的灵敏性对比图，箭头指示为 NAPSIN A蛋白阳性表达的细胞(一抗分别为OTI8A5分泌的抗NAPSIN A单克隆抗体，2μg/ml；IP64抗体，9μg/ml)。
图5所示为实施例4中OTI8A5分泌的单克隆抗体与IP64抗体IHC检测肺腺癌组织中NAPSIN A表达灵敏性对比图，箭头指示为NAPSIN A蛋白阳性表达的肺腺癌细胞(一抗分别为OTI8A5分泌的抗NAPSIN A单克隆抗体，2μg/ml； IP64抗体，9μg/ml)。
图6所示为实施例4中OTI8A5分泌的单克隆抗体与IP64抗体IHC检测肺鳞癌组织中NAPSIN A表达灵敏性对比图，箭头指示为NAPSIN A蛋白阴性表达的肺鳞癌细胞(一抗分别为OTI8A5分泌的抗NAPSIN A单克隆抗体，2μg/ml；IP64 抗体，9μg/ml)。
图7所示为实施例4中OTI8A5分泌的单克隆抗体与IP64抗体IHC检测前列腺癌组织中NAPSIN A表达灵敏性对比图，箭头指示为NAPSIN A蛋白阳性表达的前列腺癌细胞(一抗分别为OTI8A5分泌的抗NAPSIN A单克隆抗体，2μg/ml；IP64 抗体，9μg/ml)。
具体实施方式
本发明公开了由杂交瘤细胞株OTI8A5分泌的抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体用于免疫检测的方法和应用。下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，相关人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：NAPSIN A蛋白重组表达质粒的构建
以从美国傲锐东源生物科技有限公司购得的质粒RC 204715(含NAPSIN A 的ORF543bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆 ORF第190bp至732bp到表达载体pET23a-His，建立NAPSIN A片段(64-244aa) 重组表达质粒pET23a-His-rNAPSIN A。NAPSIN A的ORF克隆位点设计如图1 所示。
实施例2：重组NAPSIN A蛋白的表达与纯化
1.实验方法
(1)转化E.coli细胞：将100μl感受态细胞置于冰上融化后加入质粒DNA轻混匀，冰浴30min后42℃热激90sec，然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入500μl新鲜无抗LB培养基，于37℃摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
(2)裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37℃、200rpm培养至OD值达到 0.4～0.6时加入IPTG(终浓度1mM)诱导培养7hrs。离心收集菌体，然后用裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎20min后于4℃下12000rpm离心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-His抗体做WB鉴定，见图2。
(3)镍柱亲和层析柱纯化：用缓冲液平衡镍柱，将上清用0.45μm滤膜过滤后上样并收集流出，用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白，最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，分别收集后，将符合要求的洗脱蛋白合并后加入10％甘油，纯化后的重组NAPSIN A蛋白用SDS-PAGE电泳鉴定，见图3。
2.实验结果
(1)由图2结果可见，转染pET23a-His-rNAPSIN A质粒的E.coli细胞裂解液中 WB检测后大约在22kD处有明显的特异条带(R)，分子量与预期分子量大小一致，而转化空载体的对照裂解液(L)中则没有相应大小的条带。表明细胞中重组NAPSIN A蛋白特异表达。
(2)由图3结果可见，纯化的蛋白在SDS-PAGE电泳胶上22kD处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明已获得了纯度较好的重组 NAPSIN A蛋白。
实施例3：OTI8A5分泌抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体的制备与筛选
根据标准方法用纯化的重组NAPSIN A蛋白(以下简称NAPSIN A抗原) 用于对BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：
1.动物免疫：经过纯化的NAPSIN A抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
2.细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(pH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。
3.筛选和克隆：融合7-10天内挑选杂交瘤细胞克隆，使用纯化的重组NAPSIN A蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为OTI8A5。
4.细胞上清单抗的制备与纯化：将杂交瘤细胞株OTI8A5用含15％血清的 DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×107个细胞时，800rpm 离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×105个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时 (此时细胞密度大概为1-2×106个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心 20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，据抗体亚型选择相应柱料进行纯化(亚型为IgG1，采用protein G柱料进行纯化)。对纯化后的单抗浓度测定，冻干和分装(100ug/管)，最后保存在-20℃。
实施例4：OTI8A5分泌的单克隆抗体与IP64抗体的IHC对比检测
通过与目前临床中应用的抗体进行对比实验，发掘OTI8A5分泌的单克隆抗体的创新价值。Leica公司开发的IP64抗体是目前临床IHC检测NAPSIN A蛋白的“金标准”抗体，利用IHC方法分别以实施例3制备的由OTI8A5分泌的 NAPSIN A蛋白单克隆抗体(2μg/ml)和Leica公司的IP64抗体(9μg/ml)为一抗，按照下述IHC实验方法对NCI H2347肺腺癌细胞块与肺腺癌，肺鳞癌，前列腺癌组织进行染色，比较两种抗体的灵敏度。
1.实验方法：
(1).取福尔马林固定的NCI H2347肺腺癌细胞块与肺腺癌，肺鳞癌，前列腺癌组织块进行石蜡包埋，使用Leica组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。
(2).脱蜡与水化：分析纯二甲苯10min×3次，无水乙醇10min×3次，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次
(3).加入抗原修复液[1mM EDTA,10mM Tris buffer(pH8.0)]高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。
(4).使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。
(5).加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。
(6).去除封闭液，勿冲洗，加入OTI8A5分泌的单克隆抗体(2μg/ml)和IP40 抗体(9μg/ml)，置于湿盒中，37℃孵育60min。用PBST(0.1％Tween-20) 洗涤5min×2次。PBST(0.02％Tween-20)洗涤5min。
(7).滴加Polink-试剂盒2(Catalog No.D37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤5min×3次。滴加Polink-2试剂盒试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用PBS洗涤5min×3次。
(8).应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3-10min。蒸馏水洗涤。
(9).苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。
(10).脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min×3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。
(11).镜检，见图4，图5，图6和图7。
2.实验结果：
(1).由图4结果可见，在NCI H2347肺腺癌细胞系OTI8A5分泌的单克隆抗体IHC 检测NAPSIN A蛋白阳性表达的灵敏性要高于IP64抗体，箭头指示为 NAPSIN A蛋白阳性表达的NCI H2347肺腺癌细胞。
(2).由图5结果可见，在肺腺癌细胞中OTI8A5分泌的单克隆抗体IHC检测 NAPSINA蛋白阳性表达的灵敏性要高于IP64抗体，箭头指示为NAPSIN A 蛋白阳性表达的肺腺癌细胞。
(3).由图6结果可见，NAPSIN A蛋白在肺鳞癌细胞中无表达，仅在少量淋巴细胞中呈特异性表达。在肺鳞癌细胞中OTI8A5分泌的单克隆抗体与IP64抗体IHC检测NAPSIN A蛋白呈现阴性表达，但在其它免疫细胞及间质细胞中OTI8A5分泌的单克隆抗体IHC检测NAPSIN A蛋白阳性表达的灵敏性要高于IP64抗体，箭头指示为NAPSIN A蛋白阴性表达的肺鳞癌细胞。
(4).由图7结果可见，在前列腺癌细胞中OTI8A5分泌的单克隆抗体IHC检测NAPSIN A蛋白阳性表达的灵敏性要高于IP64抗体，首次发现NAPSIN蛋白在前列腺癌细胞中的表达，箭头指示为NAPSIN A蛋白阳性表达的前列腺癌细胞。
结果表明杂交瘤细胞OTI8A5分泌的抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体和IP64 抗体在NCI H2347肺腺癌细胞系，肺腺癌，肺鳞癌，前列腺癌组织中的染色模式一致，OTI8A5分泌的单克隆抗体(2μg/ml)浓度是IP64抗体(9μg/ml)的 1/4以下，但OTI8A5分泌的单克隆抗体在各组织中染色强度高于IP64抗体，说明OTI8A5分泌的抗NAPSIN A蛋白单克隆抗体灵敏度更高。同时，结果首次证明前列腺癌细胞中NAPSIN A蛋白的存在。
序列表
<110> 无锡傲锐东源生物科技有限公司
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aagcccatct tcgtacctct ctcgaactac agggatgtgc agtattttgg ggaaattggg 60
ctgggaacgc ctccacaaaa cttcactgtt gcctttgaca ctggctcctc caatctctgg 120
gtcccgtcca ggagatgcca cttcttcagt gtgccctgct ggttacacca ccgatttgat 180
cccaaagcct ctagctcctt ccaggccaat gggaccaagt ttgccattca atatggaact 240
gggcgggtag atggaatcct gagcgaggac aagctgacta ttggtggaat caagggtgca 300
tcagtgattt tcggggaggc tctctgggag cccagcctgg tcttcgcttt tgcccatttt 360
gatgggatat tgggcctcgg ttttcccatt ctgtctgtgg aaggagttcg gcccccgatg 420
gatgtactgg tggagcaggg gctattggat aagcctgtct tctcctttta cctcaacagg 480
gaccctgaag agcctgatgg aggagagctg gtcctggggg gctcggaccc ggcacactac 540
atc 543
<210> 2
<211> 109
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
kvsnyrdvyg ggtntvadtg ssnwvsrrch svcwhhrdka sssangtkay gtgrvdgsdk 60
tggkgasvga wsvaahdggg svgvrmdvvg dkvsynrddg gvggsdahy 109

Claims (5)

1.一种单克隆抗体，其特征在于：特异性结合天门冬氨酸蛋白酶A(NAPSIN A)，这种抗体是由保藏编号为CGMCC No.18190的杂交瘤细胞株OTI8A5分泌的。
2.一种杂交瘤细胞株OTI8A5，其特征在于：分泌与NAPSIN A蛋白特异性结合的单克隆抗体，这种杂交瘤细胞株保藏编号为CGMCC No.18190。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测NAPSIN A蛋白的免疫检测工具中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
5.一种免疫组织化学检测试剂盒，包括权利要求1所述的单克隆抗体。
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