CN114533904A - 荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高分子材料技术领域，具体地说，涉及荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法及应用。包括如下步骤：将1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺加入N,N‑二甲基甲酰胺的烧瓶中，搅拌数分钟后加入3‑巯基丙酸，继续搅拌，在剧烈搅拌条件下逐滴加入含氨基高分子长链聚合物溶液；该荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法及应用中，制备了明亮红色荧光的金纳米簇，然后利用1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N‑羟基琥珀酰亚胺反应偶联Napsin A抗体，来得到具有靶向功能的复合物，并进行肺癌早期诊断及术中定位。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料技术领域，具体地说，涉及荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法及应用。
背景技术
伴随高分辨率CT在肺癌筛查中的广泛应用，早期肺癌的磨玻璃结节检出率不断增高，针对肺小结节，传统的检查手段如穿刺活检、支气管镜、正电子发射断层显像-X线计算机体层成像(PET-CT)等难以明确诊断。肺小结节在胸外科手术疾病谱中所占比重逐年上升。胸腔镜手术具有微创、快速康复等优势，是肺磨玻璃结节患者手术的首选方式。但是，由于肺磨玻璃结节本身特点，常常发生胸腔镜术中靶灶辨认失败，传统的术中解剖标志物定位、CT引导下经皮辅助定位等方式均有其局限性，导致中转开胸或者扩大手术切除范围的情况常有发生。因此，科研人员志在开发出一种新的肺癌特异性检测手段，来解决肺癌磨玻璃结节早期精准诊断及术中准确辨认的问题。
近年来纳米材料以尺寸小、生物毒性低、光稳定性强等优点在肿瘤领域大放异彩。到目前为止，已经开发了许多技术，可以将金纳米粒子在肿瘤部位聚集新型多功能材料，本研究的难点为选择一个特异性的靶点，能将材料在肿瘤部位聚集。Napsin A是一种功能性天冬氨酸蛋白酶A，其是由NAPSA所编码的蛋白，在肺腺癌中表达超过85％，是原发性肺腺癌的标记物之一。
我们将Napsin A与金簇结合用于靶向识别肺腺癌小结节，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入N,N-二甲基甲酰胺的烧瓶中，搅拌数分钟后加入3-巯基丙酸，继续搅拌30min；
S2、将含氨基的高分子长链聚合物溶液在剧烈搅拌下逐滴加入烧瓶中，搅拌12-48h，将混合溶液在-40Pa真空、45℃条件下浓缩至1-5mL后，将溶液加入丙酮与三氯甲烷配比为3:1的混合溶剂中，通过8000rpm离心方式收集沉淀；
S3、将收集的沉淀分散至5mL水中，取其中0.1-0.5mL加入5mL水中，再加入氯金酸溶液和水合联氨，在90℃、快速搅拌下，加热4-12h，反应溶液由淡黄色变为棕色，将合成的金纳米簇24-48h渗析冻干；
S4、10-50μL抗体加入到1-5mL TPBS缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌活化15-30min，将冻干的5-10mg金纳米簇加入其中，反应8-12h。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺用量为16-64mg，N-羟基琥珀酰亚胺用量为10-40mg，N,N-二甲基甲酰胺的烧瓶中用量为10-40mL，3-巯基丙酸用量为15-60mg。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2中，含氨基的高分子长链聚合物溶液用量为1-5mL 100mg/ml，含氨基的高分子长链聚合物溶液为聚乙烯亚胺。
作为本技术方案的进一步改进，所述S3中，氯金酸溶液用量为0.1-0.5mL，水合联氨用量为0.3-1.2mL。
作为本技术方案的进一步改进，所述S4中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺用量为14.4-64mg，N-羟基琥珀酰亚胺用量为4.8-20mg。
作为本技术方案的进一步改进，所述。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、该荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法及应用中，制备了明亮红色荧光的金纳米簇，然后利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺反应偶联Napsin A抗体，来得到具有靶向功能的复合物，并进行肺癌早期诊断及术中定位。
2、该荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法及应用中，制备的复合物尺寸均匀，直径为5.2nm，具有明亮的红色荧光，可以特异性摄取并识别点亮肺腺癌细胞。
附图说明
图1为本发明制备的荧光金纳米簇抗体复合物的TEM图；
图2为本发明所制备的荧光金纳米簇的荧光性质图；
图3为本发明所制备的荧光金纳米簇抗体复合物与A549细胞共培养的CCK-8图；
图4为本发明所制备的荧光金纳米簇抗体复合物与Beas-2B细胞共培养的CCK-8图；
图5为本发明所制备的荧光金纳米簇抗体复合物的流式图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将16mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和10mg N-羟基琥珀酰亚胺加入含有10mL N,N-二甲基甲酰胺的烧瓶中，搅拌数分钟后加入15mg 3-巯基丙酸，继续搅拌30min，将1mL 100mg/mL的聚乙烯亚胺，溶液剧烈搅拌下逐滴加入烧瓶中，搅拌12h；
将混合溶液旋蒸、反沉淀、离心，将收集的沉淀分散至1mL水中，取其中0.1mL加入5mL水中、再加入氯金酸溶液0.1mL和0.3mL水合联氨，在90℃、快速搅拌下，加热4h，反应溶液由淡黄色变为棕色；
将合成的金纳米簇24h渗析冻干，将10μL抗体加入到1mL TPBS缓冲溶液中，加入14.4mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺,4.8mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌活化15min，将冻干的5mg金纳米簇加入其中，反应8h；
CCK8方法验证毒性反应：将实验所需要的肺癌细胞和正常肺泡上皮细胞，以细胞计数5000个/孔进行96孔板的铺板，铺板时四周一圈板孔加入等量PBS封孔，在5％二氧化碳，温度为37℃条件下培养24小时，待细胞均贴壁后，将金簇抗体复合物配置5个浓度梯度，每个浓度5个复孔，加药后继续在5％二氧化碳，温度为37℃条件下培养24小时后，弃去培养基后，在96孔板中加入含10％CCK8的培养基，加入后0.5h、1h、2h用酶标仪测450nm OD值，计算细胞存活率，选择最适纳米材料浓度，此步骤相同条件重复实验3遍；
流式细胞术测定荧光强度：将肺癌细胞与正常肺泡上皮细胞以5×105细胞/皿，培养在6孔板中，在5％二氧化碳，温度为37℃条件下培养24小时细胞贴壁，加入纳米材料4小时后，将6孔板用PBS冲洗3遍、胰酶消化、配置106/ml浓度，并用流式细胞术检测癌细胞株与正常细胞株摄取纳米材料的荧光强度差异。
实施例2
将32mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和20mg N-羟基琥珀酰亚胺加入含有20mL N,N-二甲基甲酰胺的烧瓶中，搅拌数分钟后加入30mg 3-巯基丙酸，继续搅拌30min，将2mL 100mg/mL的聚乙烯亚胺，溶液剧烈搅拌下逐滴加入烧瓶中，搅拌24h；
将混合溶液旋蒸、反沉淀、离心，将收集的沉淀分散至2mL水中，取其中0.3mL加入5mL水中、再加入氯金酸溶液0.3mL和0.6mL水合联氨，在90℃、快速搅拌下，加热8h，反应溶液由淡黄色变为棕色；
将合成的金纳米簇24h渗析冻干，将30μL抗体加入到3mL TPBS缓冲溶液中，加入32mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺,10mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌活化25min，将冻干的8mg金纳米簇加入其中，反应10h；
CCK8方法验证毒性反应：将实验所需要的肺癌细胞和正常肺泡上皮细胞，以细胞计数5000个/孔进行96孔板的铺板，铺板时四周一圈板孔加入等量PBS封孔，在5％二氧化碳，温度为37℃条件下培养24小时，待细胞均贴壁后，将金簇抗体复合物配置5个浓度梯度，每个浓度5个复孔，加药后继续在5％二氧化碳，温度为37℃条件下培养24小时后，弃去培养基后，在96孔板中加入含10％CCK8的培养基，加入后0.5h、1h、2h用酶标仪测450nm OD值，计算细胞存活率，选择最适纳米材料浓度，此步骤相同条件重复实验3遍；
流式细胞术测定荧光强度：将肺癌细胞与正常肺泡上皮细胞以5×105细胞/皿，培养在6孔板中，在5％二氧化碳，温度为37℃条件下培养24小时细胞贴壁，加入纳米材料4小时后，将6孔板用PBS冲洗3遍、胰酶消化、配置106/ml浓度，并用流式细胞术检测癌细胞株与正常细胞株摄取纳米材料的荧光强度差异。
实施例3
将64mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和40mg N-羟基琥珀酰亚胺加入含有40mL N,N-二甲基甲酰胺的烧瓶中，搅拌数分钟后加入60mg 3-巯基丙酸，继续搅拌30min，将5mL 100mg/mL的聚乙烯亚胺，溶液剧烈搅拌下逐滴加入烧瓶中，搅拌48h；
将混合溶液旋蒸、反沉淀、离心，将收集的沉淀分散至5mL水中，取其中0.5mL加入5mL水中、再加入氯金酸溶液0.5mL和1.2mL水合联氨，在90℃、快速搅拌下，加热12h，反应溶液由淡黄色变为棕色；
将合成的金纳米簇48h渗析冻干，将50μL抗体加入到5mL TPBS缓冲溶液中，加入64mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺,20mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌活化30min，将冻干的10mg金纳米簇加入其中，反应12h；
CCK8方法验证毒性反应：将实验所需要的肺癌细胞和正常肺泡上皮细胞，以细胞计数5000个/孔进行96孔板的铺板，铺板时四周一圈板孔加入等量PBS封孔，在5％二氧化碳，温度为37℃条件下培养24小时，待细胞均贴壁后，将金簇抗体复合物配置5个浓度梯度，每个浓度5个复孔，加药后继续在5％二氧化碳，温度为37℃条件下培养24小时后，弃去培养基后，在96孔板中加入含10％CCK8的培养基，加入后0.5h、1h、2h用酶标仪测450nm OD值，计算细胞存活率，选择最适纳米材料浓度，此步骤相同条件重复实验3遍；
流式细胞术测定荧光强度：将肺癌细胞与正常肺泡上皮细胞以5×105细胞/皿，培养在6孔板中，在5％二氧化碳，温度为37℃条件下培养24小时细胞贴壁，加入纳米材料4小时后，将6孔板用PBS冲洗3遍、胰酶消化、配置106/ml浓度，并用流式细胞术检测癌细胞株与正常细胞株摄取纳米材料的荧光强度差异。
实施例4荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的应用
利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺反应偶联Napsin A抗体，得到具有靶向功能的复合物，复合物尺寸均匀，直径约5.2nm，具有明亮的红色荧光，应用于肺癌早期诊断中，可以特异性摄取并识别点亮肺腺癌细胞，进行肺癌早期诊断及术中定位。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入N,N-二甲基甲酰胺的烧瓶中，搅拌数分钟后加入3-巯基丙酸，继续搅拌30min；
S2、将含氨基的高分子长链聚合物溶液在剧烈搅拌下逐滴加入烧瓶中，搅拌12-48h，将混合溶液在-40Pa真空、45℃条件下浓缩至1-5mL后，将溶液加入丙酮与三氯甲烷配比为3:1的混合溶剂中，通过8000rpm离心方式收集沉淀；
S3、将收集的沉淀分散至5mL水中，取其中0.1-0.5mL加入5mL水中，再加入氯金酸溶液和水合联氨，在90℃、快速搅拌下，加热4-12h，反应溶液由淡黄色变为棕色，将合成的金纳米簇24-48h渗析冻干；
S4、10-50μL抗体加入到1-5mL TPBS缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌活化15-30min，将冻干的5-10mg金纳米簇加入其中，反应8-12h。
2.根据权利要求1所述的荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法，其特征在于：所述S1中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺用量为16-64mg，N-羟基琥珀酰亚胺用量为10-40mg，N,N-二甲基甲酰胺的烧瓶中用量为10-40mL，3-巯基丙酸用量为15-60mg。
3.根据权利要求1所述的荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法，其特征在于：所述S2中，含氨基的高分子长链聚合物溶液用量为1-5mL 100mg/ml，含氨基的高分子长链聚合物溶液为聚乙烯亚胺。
4.根据权利要求1所述的荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法，其特征在于：所述S3中，氯金酸溶液用量为0.1-0.5mL，水合联氨用量为0.3-1.2mL。
5.根据权利要求1所述的荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物的制备方法，其特征在于：所述S4中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺用量为14.4-64mg，N-羟基琥珀酰亚胺用量为4.8-20mg。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的荧光金纳米簇偶联Napsin A复合物在肺癌早期诊断及术中定位方面的应用。
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