CN101806795A - 一种肿瘤靶向性的功能化量子点及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化领域，具体涉及一种肿瘤靶向性的功能化量子点及其制备方法。该功能化量子点是由叶酸、环糊精和量子点共同构成，叶酸分子有一部分包含于环糊精的疏水空腔内形成叶酸-环糊精包合物，再进一步结合到量子点表面。制备该功能化量子点时，首先将叶酸与γ-环糊精结合形成包合物，再将γ-环糊精叶酸包合物修饰到量子点表面，即得具有优异荧光特性和肿瘤靶向性的双功能的纳米尺寸材料。由于用γ-环糊精包合叶酸，改善了叶酸的水溶性和分散性。再通过一种有效的方法将叶酸和量子点连接起来，所得的荧光探针可用于肿瘤细胞的生物学研究。该制备方法简单易行，成本较低，经过多种肿瘤细胞的筛选及小鼠体内实验，表明该材料具有低毒性、选择性高等特点。
Description
技术领域
本发明属于生化领域，具体涉及一种特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点及其制备方法。
背景技术
肿瘤是人类的头号疾病，肿瘤的早期诊断和治疗，是关于人类健康的重要环节，目前肿瘤的发病机理、治疗方法等方面的研究成为医学界备受关注的焦点，这对肿瘤研究手段提出了越来越高的要求。肿瘤靶向性的探针分子，就是近年来研究和治疗肿瘤的一种重要手段。
叶酸是目前制备肿瘤靶向性的探针分子的一种重要物质。叶酸受体是一种糖蛋白受体，在许多肿瘤细胞中过度表达，而在绝大多数正常组织中几乎不表达。叶酸对叶酸受体具有高度的亲合性，所以可利用这一特性将叶酸作为抗肿瘤药物的靶向配体。随着对细胞膜表面叶酸受体认识的逐步深入，发现在多种肿瘤细胞(如卵巢癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌和肾细胞癌等)膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞，这为叶酸介导药物靶向肿瘤细胞的研究奠定了基础(Sudimack，Lee RJ.AdvDrug Deliv Rev，2000；41(2)：147-15 1)。
此外，用于生物分子和细胞上的一种重要的标志物——量子点(Quantum Dots，DQs)，也在肿瘤研究中有广泛的应用。DQs又可称为半导体纳米微晶体，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的、稳定的、尺寸在2nm~20nm之间的纳米晶粒。由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。基于量子效应，量子点在太阳能电池，发光器件，光学生物标记等领域具有广泛的应用前景。尤其在光学生物标记领域，量子点II-VI族半导体纳米颗粒(量子点)(CdSe，CdS，ZnS等)作为一种新型的荧光材料，比起传统的有机染料，更适合偶联到生物分子上作为生物荧光探针应用于免疫生物学和临床检验学等医学领域，在生命科学研究中起到定性和定量标识生物分子和细胞的作用。其功能很大程度上取决于纳米粒子的大小、分散性、均一性、稳定性和生物兼容性。
量子点的这些特点，符合了目前肿瘤研究的需要。但是，由于叶酸分子本身难溶于水，无法直接连接到量子点上，如何将叶酸连接到量子点上的同时，保持叶酸与肿瘤叶酸受体良好的亲和性和特异结合性，是目前研究上的一个难题。现有的技术，如申请号为200610098270.6和200810050803.2的中国专利申请均公开了改进型的以叶酸作为配体的肿瘤靶向性功能化量子点，这些技术多采用高分子化合物作为介导使叶酸和量子点得以结合，但是这样所制得的纳米复合物颗粒较大，并且叶酸分子中作为受体配体的有效基团部分容易受高分子化合物的影响，肿瘤靶向性不强，细胞穿透力也较弱。
除此，现有技术中的肿瘤靶向性量子点还存在着有如发射光谱宽、尺寸分布不均匀、荧光量子产率低等。因此，功能化量子点的改进成为目前肿瘤研究的重要趋势之一。
发明内容
本发明的目的是在于适应肿瘤研究的需要，提供一种特异性强、稳定性高、生物兼容性好的特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供的肿瘤靶向性功能化量子点纳米复合物，叶酸-γ-环糊精包合物修饰的量子点复合物，其结构如附图1所示。
叶酸分子有一部分包含于环糊精的疏水空腔内形成叶酸-环糊精包合物，再进一步结合到量子点表面。其中叶酸分子包含于疏水空腔的是对氨基苯甲酸基团；而2-氨基-4-羟基-6-甲基喋呤啶基团和谷氨酸基团则露出于疏水空腔的外部，2-氨基-4-羟基-6-甲基喋呤啶基团作为肿瘤叶酸受体的配体活性部位，谷氨酸基团的羧基则可进一步与量子点相结合。
本发明所选用的环糊精为γ-环糊精。由于用γ-环糊精包合叶酸，改善了叶酸的水溶性和分散性。再通过一种有效的方法将叶酸和量子点连接起来，由于修饰在量子点表面的叶酸对肿瘤细胞中的叶酸受体具有高度的亲合性，使得这些荧光量子点可以特异性地识别表达有高水平叶酸受体的癌细胞，从而这种荧光探针可用于肿瘤细胞的生物学研究。
环糊精(简称CD)是一类D-吡喃型葡萄糖分子以α-1，4-糖苷键连接，互为椅式构象的环状化合物。按形成环糊精的葡萄糖残基数分别为6、7、8，相应地称为α、β、γ环糊精，他们具有“内疏水，外亲水”的特殊分子结构，这种结构使环糊精内腔与弱极性有机化合物结合而生成主客体化合物。而本发明所选用的γ-环糊精具有很强的水溶性，可以增强客体分子水溶性和生物兼容性。由于其结构的特殊性，其表面的羟基具有亲水特性，且这些羟基可增加细胞膜的附着性，提高对膜屏障的通透性。γ-环糊精叶酸包合物修饰量子点而成的纳米材料在细胞表面黏附性强，生物稳定性好。
除此，环糊精属于大分子化合物，对量子点的表面进行超分子修饰，形成核壳结构的纳米材料，克服了高分子化合物修饰的量子点的表面缺陷，所制得的纳米微粒直径仅4nm左右，远小于现有的功能化量子点，有利于纳米微粒对细胞膜的穿透；并且其对叶酸分子的包含有较高的可控性，使得叶酸功能基团的利用率高。
本发明通过设计叶酸-γ-环糊精包合物修饰量子点形成具有生物靶向性和特异性高的复合纳米材料，使其可以同时具备多种性质和功能，经此复合功能纳米材料标记的肿瘤细胞则可以通过多种检测方法进行检测，因此可有效降低单一检测方法中产生的假阳性结果。利用纳米粒子的高表面性，将肿瘤诊断试剂加载于超分子的疏水空腔内，研究其对细胞肿瘤的识别作用。
本发明同时提供了该肿瘤靶向性功能化量子点的制备方法，是将在肿瘤细胞上具有受体的小分子药物叶酸加载于超分子γ-环糊精的疏水空腔内形成包合物，然后再通过一种有效的方法修饰到量子点表面，使得这些荧光量子点可以特异性地识别表达有高水平叶酸受体的癌细胞，制成具有肿瘤靶向性的纳米材料。其反应过程如附图2所示。
其主要包括以下步骤：(1)将叶酸溶解与有机溶剂后与环糊精反应制备叶酸-环糊精包合物；(2)所得的叶酸-环糊精包合物再在有机溶液环境下与量子点反应得到叶酸-环糊精包合物修饰的量子点复合物。
具体来说，这两个步骤为：
(1)叶酸-γ-环糊精包合物的制备：将叶酸溶解于重量体积比20-50倍量的二甲亚砜中，在氮气保护下于暗处加入γ-环糊精，用量等于叶酸的物质的量，30-70℃搅拌12-48小时，反应完毕后，在反应液中加入大量丙酮，析出淡黄色固体，离心得淡黄色固体，溶解于热水中，过滤除去不溶物，冷却滤液至室温，然后再放入4℃冰箱冷却过夜，离心得到较纯的淡黄色固体，然后再重结晶2-5次，得到纯净的叶酸-γ环糊精包合物，产物真空干燥。
(2)叶酸-γ-环糊精包合物修饰量子点：将叶酸-γ-环糊精包合物溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，叶酸-γ-环糊精包合物与N，N-二甲基甲酰胺的重量体积比为20∶1-50∶1，加入含量子点的氯仿溶液，加入量子点的量与叶酸-γ-环糊精包合物的摩尔比为1∶20-1∶5，然后再加入少量三乙胺使反应液的pH值大于10，超声2-8小时，反应完毕后，加入大量乙酸乙酯得到沉淀，离心去上清，然后再用乙酸乙酯洗涤2-5次，离心得到淡红色固体物质，即叶酸-γ-环糊精包合物修饰的量子点纳米复合物。
本发明所述的催化剂三乙胺的用量是：叶酸-γ-环糊精包合物与三乙胺的摩尔比为10∶1-50∶1。
本发明所述的量子点可以为任一种，如CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS。
发明所采用的环糊精为γ-环糊精，所制得的为叶酸-γ-环糊精包合物。叶酸-γ-环糊精包合物进一步修饰量子点的合成方法是利用叶酸上的羧基作为功能基团与量子点表面进行弱相互作用连接。尽管现有的研究认为，以有机合成方法制备大分子修饰的量子点，如利用冠醚、环糊精、杯芳烃等大分子修饰后的量子点，虽然可以减少表面缺陷，荧光量子产率和稳定性都有明显改善，却也同时降低了水溶性和生物兼容性。但是本发明利用特定结构的叶酸-环糊精包合物修饰量子点制得的该纳米复合物，经多次实验证明具有良好的生物活性、分散性和生物兼容性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的肿瘤靶向性的功能化量子点，以γ-环糊精为载体，将在肿瘤细胞上具有受体的小分子药物叶酸加载于超分子γ-环糊精的疏水空腔内形成主客体分子，然后再修饰到量子点表面，形成既有优异荧光特性又具有生物活性，且分散性好、特异性强，具有肿瘤靶向性的双功能纳米材料。此结构中叶酸作为客体小分子一方面对肿瘤细胞中的叶酸受体具有高度的亲合性；另一方面可以利用叶酸上的羧基作为功能基团与量子点连接，形成稳定的功能化量子点。而环糊精具有“内疏水，外亲水”的特殊分子结构，生物体内稳定性好，易于纳米粒子对细胞膜的穿透。且环糊精中的羟基可以增强载体和细胞膜的黏附作用，其柔软的结构可以协同叶酸和量子点顺利穿透细胞膜屏障。进入细胞后，由于连接的量子点仍基本保持着原来的荧光特性和分散性等，具有足够的荧光可视性，使得复合物在穿越细胞膜屏障并进入溶酶体后，能有效的标识细胞。同时该结构中叶酸也保留着其原先的结构和功能，叶酸的引入，使得该复合物的肿瘤选择性的作用更加明显，在肿瘤细胞上的表达更高。本发明提供的复合功能纳米材料标记的肿瘤细胞则可以通过多种检测方法进行检测，因此可有效降低单一检测方法中产生的假阳性结果。
本发明所提供的制备该肿瘤靶向性的功能化量子点的方法，相对比现有的叶酸-γ-环糊精包合物修饰量子点的工艺相对于现有量子点修饰方法大大简化，同时能够获得有效功能基团利用率高的功能化量子点，具有较强的可应用性。
附图说明
图1是本发明肿瘤靶向性功能化量子点的结构示意图。
图2是本发明肿瘤靶向性功能化量子点的制备过程，其中(1)是叶酸的结构式，(2)是γ-环糊精模拟结构式，(3)是叶酸-γ-环糊精包合物，(4)是量子点示意图，(5)是最终产物叶酸-γ-环糊精包合物修饰的量子点的结构示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1
叶酸-γ-环糊精包合物的合成：将0.5毫摩尔量的叶酸溶解于10毫升二甲亚砜中，在氮气保护下于暗处加入0.5毫摩尔量的γ-环糊精，50℃搅拌24小时，反应完毕后，在反应液中加入大量丙酮，析出淡黄色固体，离心得淡黄色固体，溶解于热水中，过滤除去不溶物，冷却滤液至室温，然后再放入4℃冰箱冷却过夜，离心得到较纯的淡黄色固体，然后再重结晶2-3次，得到纯净的叶酸-γ-环糊精包合物，产物真空干燥。
实施例2
叶酸-γ-环糊精包合物修饰量子点的合成：取100毫克叶酸-γ-环糊精包合物溶解于5毫升N，N-二甲基甲酰胺中(浓度为11.5毫摩尔每升)，再加入5毫升量子点浓度为0.001摩尔每升的氯仿溶液，然后再加入0.0005毫升三乙胺使反应液的pH值大于10，超声4小时，反应完毕后，加入大量乙酸乙酯得到沉淀，离心去上清，然后再用乙酸乙酯洗涤3次，离心得到淡红色固体物质，即叶酸-γ-环糊精包合物修饰的量子点纳米复合物。
上述实施例获得的产物功能化量子点，用于多种肿瘤细胞的筛选及小鼠体内实验，表明该功能纳米材料肿瘤靶向性的作用更加明显，在肿瘤细胞上的表达效率提高，毒性低。
Claims (10)
1.一种肿瘤靶向性的功能化量子点，量子点结合有叶酸分子，其特征在于：所述量子点还结合有环糊精，叶酸分子有一部分基团包含于环糊精的疏水空腔内形成叶酸-环糊精包合物，再进一步结合到量子点表面。
2.如权利要求1所述的肿瘤靶向性的功能化量子点，其特征在于所述叶酸分子的对氨基苯甲酸基团包含于环糊精的疏水空腔内，2-氨基-4-羟基-6-甲基喋呤啶基团位于环糊精疏水空腔的外部作为肿瘤叶酸受体的配体活性部位，谷氨酸基团上的羧基位于疏水空腔的外部与量子点相结合。
3.如权利要求1或2所述的肿瘤靶向性的功能化量子点，其特征在于所述的环糊精为γ-环糊精。
4.如权利要求1或2所述的肿瘤靶向性的功能化量子点，其特征在于所述的量子点包括CdSe、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdSe/ZnS。
5.一种如权利要求1所述的肿瘤靶向性的功能化量子点的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将叶酸溶解与有机溶剂后与环糊精反应制备叶酸-环糊精包合物；(2)所得的叶酸-环糊精包合物再在有机溶液环境下与量子点反应得到叶酸-环糊精包合物修饰的量子点复合物。
6.如权利要求5所述的肿瘤靶向性的功能化量子点的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的叶酸溶解于二甲亚砜中，在惰性气体的保护下避光加入γ-环糊精，于30-70℃下进行反应获得叶酸-γ-环糊精包合物粗产物；粗产物经过纯化和干燥得到纯净的叶酸-γ-环糊精包合物。
7.如权利要求5或6所述的肿瘤靶向性的功能化量子点的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的叶酸-γ-环糊精包合物溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加入含量子点的氯仿溶液，调节pH值大于10后进行反应，得到叶酸-γ-环糊精包合物修饰的量子点复合物粗产物；粗产物进一步纯化得到纯净的叶酸-γ-环糊精包合物修饰的量子点复合物。
8.如权利要求7所述的肿瘤靶向性的功能化量子点的制备方法，其特征在于所加入的量子点的量与叶酸-γ-环糊精包合物的摩尔比为1∶20-1∶5。
9.如权利要求7所述的肿瘤靶向性的功能化量子点的制备方法，其特征在于所述的叶酸-γ-环糊精包合物与N，N-二甲基甲酰胺的重量体积比为20∶1-50∶1；叶酸-γ-环糊精包合物与三乙胺的摩尔比为10∶1-50∶1。
10.如权利要求7所述的肿瘤靶向性的功能化量子点的制备方法，其特征在于所述的反应条件为超声条件下进行2-8小时。
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