CN112370537B - 一种双靶向磁性荧光纳米微球、其制备方法及在肝癌循环肿瘤细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双靶向磁性荧光纳米微球、其制备方法及在肝癌循环肿瘤细胞中的应用。此纳米微球以羧基修饰的磁性四氧化三铁微球作为基质,通过在磁性四氧化三铁表面同时引入抗上皮细胞粘附分子和与氨基肽酶具有强亲和力的荧光探针,获得双靶向磁性‑荧光纳米微球。该双靶向纳米微球在没有破坏细胞活性(>90%)的基础上大大提高了对肝癌循环肿瘤细胞的捕获效率(>90%)和捕获纯度(>90%)。更为重要的是,纳米粒子具有的精准双靶向性能,高分辨率荧光成像以及优异的选择性使本申请的纳米平台成为了第一例实现对体内循环肿瘤细胞的实时识别成像和监控。
Description
技术领域
本发明属于生物材料传感技术领域,特别涉及一种双靶向磁性荧光纳米微球、其制备方法及在肝癌循环肿瘤细胞中的应用。
背景技术
肝癌是一种恶性和异质性疾病,每年导致近100万例与肝癌相关的死亡。高复发率(肝切除术后5年内几乎70%)和远处转移是肝癌成为第二大癌症相关死亡的主要原因。传统的肝癌循环肿瘤细胞的影像学诊断和分期评估具有检测局限性,导致了对疾病真实程度的低估。因此,在复杂的肝癌生物学研究中,寻找有效的,具有代表性的生物标志物对肝癌的早期诊断、复发预测和预后评估是迫切需要的。转移性扩散源于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs),这些细胞通过血液途径从原发肿瘤中脱落,在远处组织处继续生长。
从外周血中检测CTCs可以预测原发性肿瘤的信息、评估疾病进展以及跟踪各种癌症的预后。此外,作为“液体活检”最有前景的靶点,CTCs的计数为临床癌症的诊断和个性化治疗提供了可靠的依据。因此,CTCs作为肝癌循环肿瘤细胞(Hepatocellular carcinomacirculating tumor cells,HCC)的有效生物标志物已被广泛研究。
目前,基于上皮细胞粘附因子(Epithelial cell adhesion,EpCAM)的修饰磁珠检测HCC-CTCs是食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的。然而,考虑到HCC-CTCs在血流中的高复发率和极少量的数目,使用EpCAM作为分离CTCs的单一靶点,其检测率仅在30%到80%之间。单纯基于EpCAM的分离技术主要存在以下缺点:(1)体外模拟的CTCs实验结果与体内实验结果不一致,或者由于CTCs的高度异质性和表型的改变,导致出现漏捕和假阴性信号;(2)由于良性上皮细胞因炎症或其他肝病释放到血液循环中而导致的假阳性结果。因此,并非所有的肝癌循环上皮细胞都是肿瘤细胞;(3)其他血液细胞(白细胞、红细胞等)产生的信号干扰无法避免。
氨基肽酶(Aminopeptidase N,APN)作为一种锌依赖性金属蛋白酶,位于细胞外膜,在信号肽(脑啡肽)的下调、转移性肿瘤细胞侵袭或肿瘤血管生成促进和肿瘤细胞存活中起着重要的作用。APN酶在多种肿瘤细胞中呈现高表达,如肝细胞癌、前列腺癌、卵巢癌和肾细胞癌,这表明APN酶可以作为肿瘤影像学标志物和治疗靶点。APN酶与肿瘤肽序列天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)具有很高的亲和力。因此,通过将APN酶作为受体合成了各种基于NGR结构的荧光探针。与复杂的NGR肽结构相比,具有高生物利用度、选择性、分辨率、无创性和体内稳定性等优点的小分子荧光显像剂受到了前所未有的关注。
除此之外,现有的大多数技术主要集中在对CTCs的体外检测。这些研究的缺点包括:(1)预处理时间长,检测效率低;(2)提取过程中,CTCs的形态发生变化;(3)难以做到长时间的实时动态监测。因此,对生物体血管内流动的CTCs进行动态成像和监测的技术需求也是亟待解决的。
发明内容
针对现有技术中的不足之处,本发明通过在磁性四氧化三铁表面同时引入抗上皮细胞粘附分子和与氨基肽酶具有强亲和力的荧光探针,获得了一种用于肝癌循环肿瘤细胞体内捕获和识别的双靶向磁性-荧光纳米微球。该双靶向纳米微球在没有破坏HCC-CTCs活性(>90%)的基础上,大大提高了对HCC-CTCs的捕获效率(>90%),与MB-COOH,MB-MLP和MB-EpCAM组相比,在捕获效率方面分别提高了60.1%,35.5%和25.5%。
本发明第一方面提供了一种双靶向磁性荧光纳米微球MB-MLP-EpCAM,此纳米微球是:首先,以羧基修饰的四氧化三铁微球(Magnetic Beads,MB-COOH)为内核,在EDC/DMAP催化下“一锅法”同时修饰上MLP-PEG和TZ-PEG,形成MB-PEG纳米微球;然后,TCO-PEG4-NHS-EpCAM(TCO-PEG4-EpCAM)通过Diels-Alder反应修饰到MB-PEG上。反应结束后,合成了粒径为50.4~60.2nm,电位为-31.0~-31.4mV的目标纳米微球MB-MLP-EpCAM。
本发明第二方面提供了一种纳米微球MB-MLP-EpCAM的制备方法,包括以下步骤:
首先,以羧基修饰的四氧化三铁微球为底物,一锅法合成MB-PEG:即通过在EDC/DMAP的催化下,将MLP-PEG与可点击的PEG四嗪(TZ-PEG)共组装到MB-COOH上,形成MB-PEG纳米微球,其中修饰上的MLP-PEG和TZ-PEG的比率为(1-3):(2-4);然后,通过四嗪和亲二烯基之间的Diels-Alder-click反应,将TCO-PEG4-NHS-EpCAM(TCO-PEG4-EpCAM)偶联到MB-PEG纳米微球上,亲水性PEG4间隔臂可以最大限度地减少抗体和四嗪之间的空间位阻。
进一步的,上文技术方案中所述的可点击的PEG四嗪为5-(4-1,2,4,5-四嗪)苄基氨基-5-氧戊二酸。
进一步的,上文技术方案中所述的MLP-PEG为引入L-丙氨酸的二氰基类荧光团PEG。
进一步的,上文技术方案中所述MB-PEG纳米微球修饰上的MLP-PEG和TZ-PEG的比率优选为(1-2):(3-4),最优选为2:3。
进一步的,上文技术方案中所述的制备方法具体包括如下步骤:
(1)探针分子MLP的合成方法参考Aminopeptidase N Activatable FluorescentProbe for Tracking Metastatic Cancer and Image-Guided Surgery via in SituSpraying.J.Am.Chem.Soc.2020,142(13),6381-6389.文献中的YH-APN分子;TZ的合成方法参考Synthetically Tractable Click Hydrogels for Three-Dimensional CellCulture Formed Using Tetrazine-Norbornene Chemistry.Biomacromolecules.2013,14,949-953.文献中的Tz分子。
(2)MLP-PEG的合成
将COOH-PEG3400-OH加入到含有三乙胺的无水DMF中,在惰性气体的保护下混合均匀,之后加入溶在DMF中的MLP和HATU,混合物继续在惰性气体保护下19-28℃充分反应后,除去反应液中的DMF,冻干得到乳黄色MLP-PEG药品粉末;其中,COOH-PEG3400-OH、三乙胺、MLP和HATU按照(350-650mg):(0.01-0.03mL):(0.1-0.3g):(0.150-0.180g)的比例混合;
进一步的,上文技术方案中所述的HATU为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
进一步的,上文技术方案中所述的步骤(2)中的COOH-PEG3400-OH、三乙胺、MLP和HATU优选的比例范围是(450-620mg):(0.015-0.025mL):(0.08-0.25g):(0.141-0.162g)。
进一步的,上文技术方案中所述的步骤(2)中的COOH-PEG3400-OH加入到含有三乙胺的无水DMF的比例范围是(450-620mg):(1.0-2.0mL)。
(3)TZ-PEG的合成
将NH2-PEG3400-OH加入到含有三乙胺的无水DMF中,在惰性气体的保护下混合均匀,之后加入溶在DMF中的TZ和HATU,混合物继续在惰性气体保护下19-28℃充分反应后,除去反应液中的DMF,冻干到粉色TZ-PEG药品粉末;其中,NH2-PEG3400-OH、三乙胺、TZ和HATU按照(400-600mg):(0.01-0.03mL):(0.1-0.3g):(0.141-0.162g)的比例混合。
进一步的,上文技术方案中所述的步骤(3)中的NH2-PEG3400-OH、三乙胺、TZ和HATU的优选比例范围是(450-620mg):(0.015-0.025mL):(0.08-0.25g):(0.141-0.162g)。
进一步的,上文技术方案中所述的步骤(3)中的将NH2-PEG3400-OH加入到含有三乙胺的无水DMF中的比例范围是(450-620mg):(1.0-2.0mL)。
(4)纳米微球MB-MLP-EpCAM的制备:加入DMSO溶解MB-COOH制得MB-COOH-DMSO溶液,超声后,分别称取二环已基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、MLP-PEG和TZ-PEG加入到MB-COOH-DMSO溶液中;混合物在惰性气体保护下30-55℃充分反应后除去DMSO,去离子水清洗后制得浓度为0.5~2.5mg/mL的MB-PEG水溶液,之后加入TCO-PEG4-EpCAM充分反应后,得到浓度为1-2mg/mL的MB-MLP-EpCAM纳米溶液;其中,MB-COOH、二环已基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶三乙胺、MLP-PEG、TZ-PEG和TCO-PEG4-EpCAM按照(1-2mg/mL):(5-10mg):(5-10mg):(4-8mg):(6-12mg):(0.5-1mg)的比例混合。
进一步的,上文技术方案中所述的步骤(4)中的MB-COOH加入到DMSO中的比例范围是(1-2mg/mL):(1-3mL)。
进一步的,上文技术方案中所述的步骤(4)中的MB-PEG溶液是浓度为0.5~2.5mg/mL;更优选的浓度为0.8~1.2mg/mL,最优选的浓度为1mg/mL。
进一步的,上文技术方案中所述的步骤(4)中的MB-COOH、二环已基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶三乙胺、MLP-PEG、TZ-PEG和TCO-PEG4-EpCAM之间优选的比例范围是(1.2-2mg/mL):(6-8mg):(6-8mg):(5-8mg):(8-12mg):(0.6-0.9mg)的比例混合。
本发明第三方面提供了所述纳米微球MB-MLP-EpCAM的应用,纳米微球可以应用于肝癌循环肿瘤细胞的检测中,同时也实现了对体内循环肿瘤细胞的实时识别成像和监控。所述的应用具体是在肝癌循环肿瘤细胞检测方法、检测设备以及检测试剂盒等方面的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1.本发明采用“一锅法”合成,大大简化了反应流程。
2.本发明利用肝癌细胞中过量表达的EpCAM和APN酶作为HCC的两个特异性靶点,显著提高了HCC-CTCs的捕获效率和检测纯度,避免了由单一靶点引起的假阳性干扰。
3.本发明中纳米微球具有的精准双靶向性能,高分辨率荧光成像以及优异的选择性使本申请的纳米微球成为了第一例实现对体内循环肿瘤细胞的实时识别成像和监控。
附图说明
图1是本发明用于肝癌循环肿瘤细胞的双靶向荧光-磁性纳米微球的制备和响应机理图。
图2是本发明实施例1制备的荧光磁性纳米微球的粒子表面电位变化图。
图3是本发明实施制备的纳米微球由透射电镜检测得到的形貌表征图和粒径分布图。
图4是本发明用于MB-MLP-EpCAM与APN酶之间的结合计算。
图5是本发明中纳米微球MB-MLP-EpCAM在HepG2、B16F10、MDA-MB-231和L02细胞内的共聚焦成像。其中,纳米微球MB-MLP-EpCAM的激发波长为488nm,采集波段为650-750nm。
图6是本发明中纳米微球MB-NB-COOH、MB-NB-EpCAM、MB-NB-MLP和MB-NB-MLP-EpCAM在HepG2细胞内的共聚焦成像。其中,蓝色细胞核商业化染料Hoechst33342的激发波长为405nm,采集波段为440-480nm。纳米微球MB-MLP-EpCAM的激发波长为488nm,采集波段为650-750nm。萘酰亚胺(NB-NH2)的激发波长为405nm,采集波段为500-540nm。
图7是不同纳米微球在HepG2细胞内涉取的荧光强度定量分析。
图8是本发明中纳米微球MB-MLP-EpCAM对悬浮HepG2细胞的磁响应。
图9是本发明中不同结构纳米微球在PBS缓冲溶液中特异捕获CTCs的能力测试分析图。
图10是本发明中不同结构纳米微球在绵羊血中特异捕获CTCs的能力测试分析图。
图11是本发明中纳米微球MB-MLP-EpCAM在裸鼠内的磁共振成像。
图12是本发明中纳米微球MB-MLP-EpCAM从肝癌病人血液样本中捕获HCC-CTCs的共聚焦图。
图13是本发明中纳米微球MB-MLP-EpCAM对裸鼠体内的HCC-CTCs活体动态抓捕成像。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细地描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
一.制备方法:
本发明提出的用于肝癌循环肿瘤细胞的双靶向荧光-磁性纳米微球的制备和响应机理如图1A-C所示,构建纳米微球MB-MLP-EpCAM有两个步骤。首先,以羧基修饰的四氧化三铁(MB-COOH)为底物,一锅法合成了MB-PEG。通过EDC/DMAP反应,将MLP-PEG与可点击的PEG四嗪(TZ-PEG)共组装到MB-COOH上,形成MB-PEG,其中修饰上的MLP-PEG和TZ-PEG的比率为2:3。然后,通过四嗪和亲二烯基之间的Diels-Alder-click反应,将TCO-PEG4-NHS-EpCAM(TCO-PEG4-EpCAM)偶联到MB-PEG纳米微球上,亲水性PEG4间隔臂可以最大限度地减少抗体和四嗪的空间位阻。用Brandford法测定EpCAM结合在MB-MLP-EpCAM的结合效率为20%。详细的方法步骤如下:
进一步的,上文技术方案中所述的EpCAM为抗上皮细胞粘附分子。
进一步的,上文技术方案中所述的TCO-PEG4-EpCAM为反式环辛烯-聚乙二醇4-抗上皮细胞粘附分子。
(1)探针分子MLP的合成方法参考(Aminopeptidase N Activatable FluorescentProbe for Tracking Metastatic Cancer and Image-Guided Surgery via in SituSpraying.J.Am.Chem.Soc.2020,142(13),6381-6389.)文献中的YH-APN分子;TZ的合成方法参考(Synthetically Tractable Click Hydrogels for Three-Dimensional CellCulture Formed Using Tetrazine-Norbornene Chemistry.Biomacromolecules.2013,14,949-953.)文献中的Tz分子。
(2)MLP-PEG的合成
将COOH-PEG3400-OH(500mg)加入到含有三乙胺(0.022mL,0.15mmol)的无水DMF(3mL)的两口烧瓶中,反应体系在氮气保护下磁力搅拌15min,之后加入溶在2mL DMF中的MLP(0.1g,0.277mmol)和HATU(0.156g),混合物继续在氮气保护下室温反应15小时。反应结束后,反应液转入透析袋(MWCO 20Kda),用去离子水透析48小时,彻底去除DMF后,取出溶液于离心管中冻存得到乳黄色药品粉末。
(3)TZ-PEG的合成
将NH2-PEG3400-OH(500mg)加入到含有三乙胺(0.022mL,0.15mmol)的无水DMF(3mL)的两口烧瓶中,反应体系在氮气保护下磁力搅拌15min,之后加入溶在2mL DMF中的TZ-COOH(0.124g,0.41mmol)和HATU(0.156g),混合物继续在氮气保护下室温反应15小时。反应结束后,反应液转入透析袋(MWCO 20Kda),用去离子水透析48小时,彻底去除DMF后,取出溶液于离心管中冻存得到粉色药品粉末。
(4)各种纳米粒子的合成
(41)纳米粒子MB-MLP的制备:把羧基修饰的四氧化三铁(MB-COOH,1mg/mL),加入到4.5mL的DMSO中,超声1h后,分别称取二环已基碳二亚胺(DCC,5mg)、4-二甲氨基吡啶(DMAP,5mg)、三乙胺(100μL)和MLP-PEG(10mg)加入到MB-COOH溶液中。混合物在氮气保护下45℃机械搅拌反应12小时,反应结束后,离心移去DMSO,接着用去离子水反复清洗三遍,最后溶在1mL的去离子水中,获得浓度约为1mg/mL的MB-MLP纳米溶液,置于4℃冰箱中备用。
(42)纳米粒子MB-EpCAM的制备:把羧基修饰的四氧化三铁(MB-COOH,1mg/mL),加入到4.5mL的DMSO中,超声1h后,分别称取二环已基碳二亚胺(DCC,5mg)、4-二甲氨基吡啶(DMAP,5mg)、三乙胺(100μL)和TZ-PEG(10mg)加入到MB-COOH溶液中。混合物在氮气保护下45℃机械搅拌反应12小时,反应结束后,离心移去DMSO,接着用去离子水反复清洗三遍,最后溶在1mL的去离子水中,之后加入TCO-PEG4-EpCAM(0.7mg)充分反应后,获得浓度约为1mg/mL的MB-EpCAM纳米溶液,置于4℃冰箱中备用。
(43)纳米微球MB-MLP-EpCAM的制备:把羧基修饰的四氧化三铁溶液(MB-COOH,1mg/mL),加入到4.5mL的DMSO中,超声1h后,分别称取二环已基碳二亚胺(DCC,5mg)、4-二甲氨基吡啶(DMAP,5mg)、三乙胺(100μL)、MLP-PEG(4mg)和TZ-PEG(6mg)加入到MB-COOH溶液中。混合物在氮气保护下45℃机械搅拌反应12小时,反应结束后,离心移去DMSO,接着用去离子水反复清洗三遍,获得浓度约为1mg/mL的MB-PEG纳米溶液,之后加入TCO-PEG4-EpCAM(0.7mg)充分反应后,获得浓度约为1mg/mL的MB-MLP-EpCAM纳米溶液,置于4℃冰箱中备用。
二.检测
利用动态光散射(DLS)分别检测MB-COOH、MB-PEG和MB-MLP-EpCAM的粒径、电位和多分散系数。分析结果如图2(A)-(C)所示,测得MB-COOH、MB-PEG和MB-MLP-EpCAM的粒径分别为21.2nm、37.8nm和58.8nm。PDI系数分别为0.465、0.184和0.165。此外,这三种纳米结构的Zeta电位分别为-22.18mV、-13.2mV和-31.2mV。通过以上数据表明所制备的四氧化三铁纳米微球粒径分布较为均一,且PEG链成功的修饰在了MB-COOH上。
如图3(A)-(C)所示为纳米粒子在透射电镜(TEM)下的观察结果。透射电镜下可以清晰的看见四氧化三铁粒径约为11.18nm,PEG层和EpCAM层分别为6.04nm和10.15nm。透射电镜所得的粒径小于使用动态光散射所测得粒径值,这是由于动态光散射测试时,纳米粒子处于溶液中,而TEM检测的样品要经过脱水处理,纳米粒子会失去水化层而导致粒径变小。
为了验证MLP-PEG与APN酶之间的相互作用,基于Discoverystudio2.5软件进行了对接计算。从PDB数据库中检索到人体APN的三维结构。如图4(A)-(C)所示,MLP-PEG可通过APN的疏水空腔到达锌离子配位中心。MLP-PEG(n=0、1、2、3、4、5、6、7、8)与APN酶的配位键长分别为 和(Zn-O)。与氨基酸残基的配位键(/>和/>)基本相同,说明MLP-PEG与APN催化中心有很强的结合亲和力。此外,图4B中的Cdocker能量值表明,随着PEG上乙二醇段的增加,荧光团MLP和APN之间的相互作用增强,这是由于乙二醇和氨基酸残基ALA474和ARG907之间存在氢键(n=9,图4C)MLP-PEG在APN特定空腔中的折叠和结合。在本申请的工作中,带有乙二醇片段(n=9)的PEG链是钩子,空腔外剩余较长的乙二醇链段保证了MLP-PEG的柔韧性和MB-MLP-EpCAM与APN酶相互作用的足够空间,这有助于提高与APN酶的亲和力,有利于肿瘤细胞的靶向性。
基于探针分子MLP对APN表现出的理想的光学响应和良好的生物相容性等优点,本申请将修饰了MLP分子的纳米微球MB-MLP-EpCAM应用于不同细胞,通过不同细胞内APN含量和EpCAM的差异,进而区分正常细胞与肿瘤细胞。依据相关的文献报导,恶性肿瘤细胞(比如肝癌细胞、非小细胞肺癌细胞和黑色素瘤细胞)内APN蛋白和EpCAM呈过量表达相比于正常细胞(比如正常肝细胞),值得注意的是APN蛋白在乳腺癌细胞系内也相对呈低表达状态。因此,APN被认定为一种生物标志物用于肿瘤的诊断和预后评价。由此,本申请探讨纳米微球MB-MLP-EpCAM在过量表达APN蛋白和EpCAM的肿瘤细胞(HepG2细胞和B16F10细胞)、低表达APN蛋白和EpCAM的肿瘤细胞(MDA-MB-231细胞)和正常细胞(L02细胞)内的荧光成像。细胞成像见图5所示,在HepG2细胞和B16F10细胞中,相比于对照组MDA-MB-231和L02细胞,加入纳米微球MB-MLP-EpCAM(50μg/mL)在37℃培养箱中孵育1小时后,得到明显的近红外(650~750nm)荧光信号。由此证明,纳米微球MB-MLP-EpCAM可以实现对过量表达APN蛋白和EpCAM的肿瘤细胞有效区分。
为了研究不同结构的四氧化三铁纳米粒子对细胞摄取的影响,考察了MB-COOH、MB-MLP、MB-EpCAM和MB-MLP-EpCAM在HepG2细胞内的摄取情况。为了选取单一荧光强度表征这四类纳米粒子的摄取,采用酰胺化反应合成了萘酰亚胺修饰的四氧化三铁纳米粒子(MB-NB)。利用萘酰亚胺的绿色荧光信号定性评价四种纳米粒子细胞摄取的差异。用50μg/mLMB-NB(-COOH/-MLP/-EpCAM/-MLP-EpCAM)在37℃培养中与肝癌细胞孵育1小时。如图6和图7所示,裸露没有修饰靶向的MB-NB-COOH展现出微弱的绿色荧光,其进入细胞主要依赖于内吞作用。相比之下,由于MLP探针与APN蛋白之间的结合能力,MB-NB-MLP与细胞结合的几率增加,绿色荧光信号增强。同样,传统的“抗原-抗体”效应保证了EpCAM修饰后的磁珠与细胞之间的高效结合。因此,在此机理上,与其他修饰的磁珠相比,双靶向的MB-MLP-EpCAM在发射波长为500~540nm的萘酰亚胺绿色通道中表现出更强的荧光信号。考虑到以上结果,表明了双靶向修饰的磁珠对HepG2细胞具有更优异高效的靶向作用,可应用于CTC的检测实验中来提高捕获效率。
为了观察MB-MLP-EpCAM对肿瘤细胞的捕获情况,本申请在共聚焦下直接研究磁性纳米粒子在磁场作用下借由双靶向作用对肝癌细胞的抓捕情况。用Hoechst33342(蓝色通道)预染离心后悬浮的HepG2细胞,之后用MB-MLP-EpCAM(50μg/mL)在37℃培养箱中孵育细胞10分钟。将孵育后的细胞置于8孔玻璃培养皿(Ibidi)中,把磁铁放置于培养皿的边缘处,磁吸引10秒后,在共聚焦目镜内可以清晰地看见每个HepG2细胞在向磁铁处移动。见图8所示,选择靠近磁铁边缘的区域进行表征。在未放置磁铁前,HepG2细胞不规则地分布在培养皿的每个角落,放置磁铁后,被MB-MLP-EpCAM标记的HepG2细胞稳定地向磁铁处移动,只有极少量细胞贴壁保持不动,这表明大多数细胞被磁纳米粒子有效地捕获。此外,检测到MLP的荧光信号和Hoechst33342信号高度重叠,证实了HepG2细胞与MB-MLP-EpCAM之间的特异性结合。
研究了不同结构的四氧化三铁纳米粒子在模拟样本中捕获CTCs的能力。本申请把HepG2细胞加入到PBS缓冲液中去检测不同加入细胞量时的捕获细胞细胞数。见图9A所示,所有四氧化三铁纳米粒子对HepG2细胞的捕获个数随着给定浓度(25~1000个/mL)而增加。MB-MLP-EpCAM具有探针“MLN-APN与蛋白APN结合”和“EpCAM抗原-抗体结合”的双重靶向,在PBS缓冲溶液中相比于其他纳米粒子具有更优异的性能。由于培养浓度和时间也是磁分离HepG2细胞的关键因素。因此,本申请之后探究MB-COOH、MB-MLN-APN、MB-EpCAM和MB-MLP-EpCAM的捕获效率差异,控制细胞浓度为每毫升300个细胞。见图9(B)-(E)所示,在孵育时间为20分钟时,50μg/mL的MB-MLP-EpCAM的捕获效率(86%)分别比MB-EpCAM高25.5%,比MB-MLN-APN高35.5%。此数据证明了上述观点即双靶向四氧化三铁纳米微球在PBS缓冲液中对HepG2细胞具有良好的磁分离性能。
基于以上结果,本申请进一步评估不同纳米粒子在全血样本中对肝癌细胞的捕获效率。与PBS缓冲液中的结果相类似,MB-MLP-EpCAM与其他结构的纳米颗粒相比,在全血中具有更好的磁分离肝癌细胞的能力,暗示了在体外复杂血液条件下捕获CTCs的潜力。如图10(A)-(E)所示,在相同浓度和孵育时间下,MB-MLP-EpCAM在APN和EpCAM阳性细胞中表现出比其他纳米颗粒更高的捕获效率。为了明确区分肝癌细胞和血液中其他细胞,本申请用Hoechst33342预染肝癌细胞,然后以每毫升300个细胞的最终浓度加入到绵羊血中。用浓度为50μg/mL的MB-MLP-EpCAM与肝癌细胞孵育20分钟,磁分离10分钟,去除大部分红细胞和白细胞后,用共聚焦激光显微镜在红色通道(MLN-APN)和蓝色通道(Hoechst 33342)下成像,收集抓捕到的肝癌细胞信号。见图10E,纳米粒子的红色荧光和Hoechst33342荧光信号重叠性好,证实了模拟样本中MB-MLP-EpCAM对肝癌细胞的特异靶向性。更重要的是,其他未清洗掉的白细胞只显示出微弱的荧光信号,这表明由于白细胞缺乏APN蛋白和EpCAM抗体,不能被纳米粒子所捕获。此外,本申请还比较了MB-MLP-EpCAM对肝癌细胞和MDA-MB-231细胞的捕获差异。见图9E和10D所示,纳米粒子对肝癌细胞的捕获效率大大高于MDA-MB-231细胞,说明纳米粒子在PBS缓冲液和血液中均不受MDA-MB-231细胞的干扰,可以特异性识别捕获肝癌细胞。
核磁共振成像技术(MRI)由于其在软组织对比方面的优势,已逐渐成为早期癌症诊断最有力的技术之一,并且可以在分子和遗传水平上揭示疾病信息。因此,本申请利用核磁共振成像来评估MB-COOH、MB-MLP、MB-EpCAM和MB-MLP-EpCAM在荷瘤裸鼠体内肿瘤组织的聚集。首先将HepG2细胞种植于裸鼠腋下,以此建立荷瘤小鼠模型。接种八天后,分别静脉注射MB-COOH、MB-MLP、MB-EpCAM和MB-MLP-EpCAM悬液。由于皮下肿瘤处血供不足,本申请从正常小鼠和注射纳米粒子悬液的小鼠中获得T2加权磁共振成像。如图11所示,纳米颗粒可通过增强渗透和滞留效应(EPR)在肿瘤部位积聚。因此,MB-COOH的T2加权MRI图像相比于对照组更暗。此外,由于MLP和EpCAM的靶向作用,MB-MLP和MB-EpCAM在肿瘤组织中呈渐进性累积,这种情况反应在与MB-COOH相比,注射MB-MLP和MB-EpCAM的小鼠肿瘤部位的T2加权MRI变得更暗。以此类推,具有双靶结构的纳米微球MB-MLP-EpCAM在肿瘤部位聚集最多。为了进一步验证不同四氧化三铁结构的纳米粒子由于靶向作用不同,在小鼠肿瘤部位的聚集情况,T2加权图像经过伪彩处理。与上述结果相类似,T2强度随着靶头的增多而下降。因此,得出结论,双靶向的纳米微球MB-MLP-EpCAM具有显著的靶向性能和在肿瘤组织内的聚集能力。
为了检验MB-MLP-EpCAM的临床适用性,本申请对临床分期为II期的肝癌患者的血液样本进行了检测。如图12共聚焦成像图所示,MB-MLP-EpCAM成功地捕获了肝癌患者血液中的CTCs。免疫荧光染色结果证实捕获的细胞为CK19阳性,证明纳米微球捕获到的是真正的HCC-CTCs。上述实验结果证实了MB-MLP-EpCAM用于HCC-CTCs分离检测的准确性和实用性,具有良好的临床应用前景。
目前,大多数技术主要集中在对CTCs的体外检测。对生物体血管内流动的CTCs进行动态成像和监测是非常有必要性的。用奥林巴斯公司生产的双光子活体成像系统观察纳米微球MB-MLP-EpCAM在小鼠血液循环过程中对CTCs的靶向能力。实验过程如下:将转染后的GFP-HepG2细胞和纳米粒子悬液尾静脉注入小鼠体内,10分钟后,剥离小鼠大腿内侧血管上方的小面积皮肤,用固定仪器确定好观察点,记录纳米粒子和转染细胞的荧光信号。如图13(A)-(B)所示,由于血流速度非常快,MB-MLP-EpCAM在视野内靶向GFP-HepG2细胞的总时间为0.096958s。每隔0.032319s进行一次成像反应纳米粒子的识别情况,根据共聚焦图可知,MB-MLP-EpCAM能够有效地捕获和靶向CTCs。更重要的是,本申请首次实现了CTCs在小鼠体内的成像和实时监测,为临床检测提供了可能。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种双靶向磁性荧光纳米微球MB-MLP-EpCAM,其特征在于:所述纳米微球是以羧基修饰的四氧化三铁微球为内核,在EDC/DMAP催化下“一锅法”同时修饰上MLP-PEG和TZ-PEG,形成MB-PEG纳米微球;然后,TCO-PEG4-NHS-EpCAM(TCO-PEG4-EpCAM)通过Diels-Alder反应修饰到MB-PEG上;反应结束后,合成了粒径为50.4~60.2nm,电位为-31.0~-31.4mV的目标纳米微球MB-MLP-EpCAM。
2.如权利要求1所述的双靶向磁性荧光纳米微球MB-MLP-EpCAM的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:首先,以羧基修饰的四氧化三铁微球为底物,一锅法合成MB-PEG:即通过在EDC/DMAP的催化下,将MLP-PEG与可点击的PEG四嗪(TZ-PEG)共组装到MB-COOH上,形成MB-PEG纳米微球,其中修饰上的MLP-PEG和TZ-PEG的比率为(1-3):(2-4);然后,通过四嗪和亲二烯基之间的Diels-Alder-click反应,将TCO-PEG4-NHS-EpCAM(TCO-PEG4-EpCAM)偶联到MB-PEG纳米微球上。
3.根据权利要求2所述的双靶向磁性荧光纳米微球MB-MLP-EpCAM的制备方法,其特征在于:所述的可点击的PEG四嗪为5-(4-1,2,4,5-四嗪)苄基氨基-5-氧戊二酸。
4.根据权利要求2所述的双靶向磁性荧光纳米微球MB-MLP-EpCAM的制备方法,其特征在于:所述的MLP-PEG为引入L-丙氨酸的二氰基类荧光团PEG。
5.根据权利要求2所述的双靶向磁性荧光纳米微球MB-MLP-EpCAM的制备方法,其特征在于:所述MB-PEG纳米微球修饰上的MLP-PEG和TZ-PEG的比率为(1-2):(3-4)。
6.如权利要求1所述的双靶向磁性荧光纳米微球MB-MLP-EpCAM制备在肝癌循环肿瘤细胞检测中,对体内循环肿瘤细胞的实时识别成像剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用是在肝癌循环肿瘤细胞检测方法、检测设备以及检测试剂盒方面的应用。
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