CN112933252A - 一种乳腺癌特异靶向分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳腺癌特异靶向分子探针及其制备方法和应用，所述探针为cRGD‑MNP，其包括黑色素纳米颗粒MNP，外部通过聚乙二醇PEG修饰偶联三肽RGD。本发明提供一种乳腺癌特异靶向分子探针及其制备方法和应用，该探针生物安全性好，黑色素纳米颗粒MNP光声性能优良，通过PEG修饰偶联三肽RGD，可作为特异性识别乳腺癌的靶向肽，使用该探针解决保乳手术切缘问题，准确、及时判断切缘状态进而解决了局部复发难题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乳腺癌特异靶向分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌居全球女性恶性肿瘤发病率及死亡率首位。保乳手术是早期乳腺癌的标准手术，不仅彻底切除肿瘤，同时保留乳房，有较好的美容外观。
光声成像是近年来热门研究的一种无创成像技术，可以提供高分辨率和高对比度的组织成像，并且能实时观察、无放射性，因此该成像技术在肿瘤边界精准界定领域有较大的应用潜力。PAI在乳房的诊断成像具有独特的优势，因乳腺组织位于表面，并且大部分位于PAI的最大可实现成像深度内，同时健康的乳房组织具有低光学吸收和超声波散射，可以实现高效的PAI。光声成像的对比剂分为内源性对比剂和外源性对比剂。虽然内源性造影剂具备对人体安全无副作用的优点，但其提供的光声信号对比度较低，同时缺乏针对特定病灶的特异性靶向作用。并且由于肿瘤本身吸收光的能力较差，往往需要使用外源性影像探针增强光声成像的检测灵敏度和准确度。目前开发的具有良好光吸收性能的材料如染料、亚甲蓝、考马斯亮蓝、纳米金棒、纳米炭等，大多存在长期毒性问题，难以进行临床转化。
发明内容
本发明一种乳腺癌特异靶向分子探针及其制备方法和应用，该探针生物安全性好，黑色素纳米颗粒MNP光声性能优良，通过PEG修饰偶联三肽RGD，可作为特异性识别乳腺癌的靶向肽，使用该探针解决保乳手术切缘问题，准确、及时判断切缘状态进而解决了局部复发难题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种乳腺癌特异靶向分子探针，所述探针为cRGD-MNPs，其包括黑色素纳米颗粒MNP，外部通过聚乙二醇PEG修饰偶联三肽RGD。
一种乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、将20mg黑色素加入6mL的0.1N NaOH水溶液中搅拌溶解，得到碱性黑色素溶液；
S2、将0.1N HCl水溶液迅速滴入S1所得碱性黑色素溶液中，并通过超声处理将pH调节至7.0，得到a溶液；
S3、加入去超纯水并重复4-5次洗涤离心a溶液，直至滤出液澄清透明得出黑色素溶液，冷冻干燥得到固体黑色素纳米颗粒MNPs；
S4、称取10mg MNPs分散于10ml超纯水中，滴加NaOH水溶液调节 pH至9.5，得到b溶液；
S5、称取50mg NH2-PEG5000-NH2，加入5ml超纯水，滴加NaOH水溶液调节pH至9.5，得到c溶液；
S6、混合b溶液和c溶液，搅拌反应得到d溶液
S7、加入超纯水并重复5次洗涤离心d溶液，除去未结合的PEG，收集剩余溶液冷冻干燥得到偶联PEG的黑色素纳米颗粒PEG-MNPs；
S8、将1.2mg氨基-巯基交联剂溶于36μL二甲基亚砜中得到e溶液；
S9、称取1mg固体PEG-MNP溶解于1mL磷酸缓冲盐溶液，并调节PH 至7.2,得到f溶液；
S10、混合e溶液和f溶液，搅拌反应，所得溶液经过滤除去过量的氨基- 巯基交联剂和副产物后，得到SMCC-PEG-MNPs溶液；
S11、将120μL、5mM的靶向环肽溶液加入SMCC-PEG-MNPs溶液中旋转搅拌，所得溶液经过滤除去未偶联的RGD肽后，浓缩过滤得到最终产物 cRGD-MNPs。
优选地，步骤S2中所述超声处理的输出功率40W。
优选地，步骤S6中所述b溶液和c溶液搅拌反应的条件为室温，反应时间为24h。
优选地，步骤S3和S7中洗涤离心采用截留分子量均为30kDa的超滤离心管，其中步骤S3离心转速为4000rpm，离心时间为15min，步骤S6离心转速为4000rpm，离心时间为15min。
优选地，步骤S10中所述e溶液和f溶液的搅拌反应的条件为室温，反应时间为2h。
优选地，步骤S11中所述旋转搅拌的温度为4℃，旋转搅拌的时间为24h。
优选地，步骤S10和S11所述过滤均采用PD-10脱盐柱。
优选地，步骤S11中所述浓缩过滤的具体方法为纯化后的溶液通过30kDa 的超滤离心管浓缩后溶液，再经过0.22μm的过滤器过滤得到最终的产物 cRGD-MNPs。
乳腺癌特异靶向分子探针可应用于乳腺癌保乳手术中的光声导航探针。
采用上述技术方案后，本发明与背景技术相比，具有如下优点：
本发明提供一种乳腺癌特异靶向分子探针及其制备方法和应用，黑色素作为分布于人体的正常组成成分，生物安全性好，在可见光及近红外区均具有强烈的光吸收，通过碱性溶剂法合成黑色素纳米颗粒MNP光声性能优良，通过PEG修饰偶联三肽RGD，RGD作为肿瘤归巢配体，可以靶向结合乳腺癌上过表达的αvβ3整联蛋白，可作为特异性识别乳腺癌的靶向肽，使用该探针解决保乳手术切缘问题，准确、及时判断切缘状态进而解决了局部复发难题，光声成像引导下术中可视化肿瘤病灶，可以提高病灶检出的准确度、敏感度和特异度，实现实时术中准确定位病灶并精准切除，提高患者的生活质量并延长总生存期，对改善患者预后具有重要临床意义。
附图说明
图1为本发明探针cRGD-MNPs结构示意图；
图2为本发明实施例中实验1MNPs和cRGD-MNPs的电镜图；
图3为本发明实施例中实验1MNPs和cRGD-MNPs溶液的光声图像及光声强度定量结果；
图4为本发明实施例中实验2cRGD-MNPs的细胞靶向性检测；
图5为本发明实施例中实验3MDA-MB-231移植瘤小鼠模型中 cRGD-MNPs在体肿瘤靶向性检测；
图6为本发明实施例中实验4MDA-MB-231移植瘤小鼠模型手术导航。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明中需要说明的是，术语“上”“下”“左”“右”“竖直”“水平”“内”“外”等均为基于附图所示的方位或位置关系，仅仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示本发明的装置或元件必须具有特定的方位，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例
如图1所示，本发明公开了一种乳腺癌特异靶向分子探针，所述探针为 cRGD-MNPs，其包括黑色素纳米颗粒MNP，外部通过聚乙二醇PEG修饰偶联三肽RGD。
一种乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
S1、将20mg黑色素加入6mL的0.1NNaOH水溶液中搅拌溶解，得到碱性黑色素溶液；
S2、将0.1N HCl水溶液迅速滴入S1所得碱性黑色素溶液中，并通过输出功率40W的超声处理将pH调节至7.0，得到a溶液；
S3、采用截留分子量均为30kDa的超滤离心管，加入去超纯水并重复4-5 次洗涤离心a溶液，离心转速为4000rpm，离心时间为15min，直至滤出液澄清透明得出黑色素溶液，冷冻干燥得到固体黑色素纳米颗粒MNPs；
S4、称取10mg MNPs分散于10ml超纯水中，滴加NaOH水溶液调节 pH至9.5，得到b溶液；
S5、称取50mg NH2-PEG5000-NH2(PEG)，加入5ml超纯水，滴加NaOH水溶液调节pH至9.5，得到c溶液；
S6、混合b溶液和c溶液，通过磁体搅拌器在室温下拌24h反应得到d 溶液
S7、采用截留分子量均为30kDa的超滤离心管，加入超纯水并重复5次洗涤离心d溶液，离心转速为4000rpm，离心时间为15min，除去未结合的 PEG，收集剩余溶液冷冻干燥得到偶联PEG的黑色素纳米颗粒PEG-MNPs；
S8、将1.2mg氨基-巯基交联剂(sulfo-SMCC)溶于36μL二甲基亚砜(DMSO)中得到e溶液；
S9、称取1mg固体PEG-MNP溶解于1mL磷酸缓冲盐(PBS)溶液，并调节PH至7.2,得到f溶液；
S10、混合e溶液和f溶液，在室温下搅拌反应2h，所得溶液经PD-10脱盐柱过滤除去过量的氨基-巯基交联剂和副产物后，得到SMCC-PEG-MNPs溶液；
S11、将120μL、5mM的靶向环肽(cRGDfC)溶液加入SMCC-PEG-MNPs 溶液中在4℃旋转搅拌24h，所得溶液经PD-10脱盐柱过滤除去未偶联的RGD 肽后，由30kDa的超滤离心管浓缩，再经过0.22μm的过滤器过滤得到最终的产物cRGD-MNPs，存储于4℃中。
步骤S11中浓缩过滤的具体方法为纯化后的溶液通过30kDa的超滤离心管浓缩后溶液，再经过0.22μm的过滤器过滤得到最终的产物cRGD-MNPs。
乳腺癌特异靶向分子探针可应用于乳腺癌保乳手术中的光声导航探针。
通过对制取的cRGD-MNPs探针进行表征和细胞实验，该探针粒径较为均一，具备良好的光声效应，光声信号强度与浓度线性相关；具有乳腺癌细胞靶向性；cRGD-MNPs相较于MNPs具有更好的肿瘤富集效果；且探针的动物安全性高；将其应用于乳腺癌光声手术导航中，解决了一直困扰临床医生的保乳手术切缘问题，准确、及时判断切缘状态进而解决了局部复发难题。近红外光声手术导航系统因其高敏感性、实时、可视化的特点在保乳手术中独具优势。光声成像引导下术中可视化肿瘤病灶，可以提高病灶检出的准确度、敏感度和特异度，实现实时术中准确定位病灶并精准切除，提高患者的生活质量并延长总生存期，对改善患者预后具有重要临床意义。
实验1：cRGD-MNPs的表征
1.cRGD-MNPs形貌和尺寸检测：将少量cRGD-MNPs和MNPs溶于超纯水中，稀释溶液至浅棕色。超声分散后，吸取10μl溶液滴加在超薄碳膜上，室温晾干。使用TEM检测，设置加速电压100kV，观察样品的形貌、分布和大小，选取清晰、无污染的视野拍照保存。
2.cRGD-MNPs光声光谱检测：取适量cRGD-MNPs、MNPs溶于超纯水中，配置溶液浓度梯度为3.75、7.5、15、30、60、120μM。使用Vevo LAZR-X 光声成像设备分别检测其在680～970nm的光声光谱(间隔5nm)，并记录 680nm激发下不同浓度溶液的光声信号强度。
实验1测试结果：如图2MNPs和cRGD-MNPs的电镜图所示， cRGD-MNPs探针，其在电镜下粒径较为均一；如图3MNPs和cRGD-MNPs 溶液的光声图像及光声强度定量结果所示cRGD-MNPs探针具备良好的光声效应，光声信号强度与浓度线性相关。
实验2：cRGD-MNPs的细胞靶向性检测
1.MDA-MB-231细胞铺板培养24h，分别加入MNPs、PEG-MNPs、 cRGD-MNPs探针，终浓度均为0.5μM(以MNPs定量)，PBS作为对照，孵育4h后，收集各组细胞检测光声信号强度。
2.MDA-MB-231细胞和MCF-10A细胞铺板，MDA-MB-231细胞分为探针组和RGD阻断组，分别加入终浓度为0.5μM cRGD-MNPs探针,RGD阻断组另外加入终浓度0.5μM游离RGD。MCF-10A细胞加入相同浓度的 cRGD-MNPs探针。孵育4h后，收集各组细胞检测光声信号强度。
实验2测试结果：如图4(a)不同黑色素纳米颗粒孵育的MDA-MB-231 细胞的光声图像及定量结果所示cRGD-MNPs组光声信号明显高于MNPs和 PEG-MNPs两组，如图4(b)cRGD-MNPs孵育的MDA-MB-231细胞和 MCF-10A的光声图像及定量结果所示，乳腺癌细胞MDA-MB-231中的信号明显高于正常乳腺细胞MCF-10A，并且可被过量RGD阻断，证明所合成的 cRGD-MNPs探针具有乳腺癌细胞靶向性。
实验3：MDA-MB-231移植瘤小鼠模型中cRGD-MNPs在体肿瘤靶向性检测
取MDA-MB-231皮下移植瘤小鼠8只，随机分为cRGD-MNPs组和MNPs 组。每组小鼠通过尾静脉注射相应探针，分别于注射前及注射后不同时间点(1、 2、4、12h)使用Vevo LAZR-X光声成像设备采集肿瘤部位光声图像，通过 Vevo LAB软件分析各组在不同时间点的光声信号强度差异。
实验3测试结果：如图5(a)注射MNPs或cRGD-MNPs后，不同时间点(pre,1,2,4和12h)肿瘤部位光声和超声融合图像(标尺＝2mm)和图5(b) a中肿瘤部位光声信号的定量分析图所示MDA-MB-231荷瘤小鼠尾静脉注射探针后，各时间点cRGD-MNPs组的肿瘤区域的信号强度均高于MNPs组，证明cRGD-MNPs相较于MNPs具有更好的肿瘤富集效果。
实验4：MDA-MB-231移植瘤小鼠模型手术导航
MDA-MB-231皮下移植瘤小鼠通过尾静脉注射200μM，200μL cRGD-MNPs探针，2h后处死小鼠，将小鼠仰卧位固定于操作台上，打开皮肤暴露肿瘤，采集肿瘤部位680nm处光声图像以获得准确的肿瘤边界。基于光声图像结果，分段切除肿瘤，每次切除完成后再将小鼠置于成像设备的探头下，检测光声信号，采集光声图像。直至肉眼判断肿瘤完全切除后，并检查残腔是否有光声信号残留，当确认无光声信号残留后判定切除干净。待肿瘤完全切除后，再次切除瘤床周围正常组织用于后续检测。光声图像采集完毕后，使用4％多聚甲醛固定切除的组织，制成石蜡切片进行H&E染色，并由病理科医生分析判断组织边缘。
实验4测试结果：如图6第一行为小鼠的肿瘤区域的超声图像、第二行为光声图像(标尺＝2mm)、第三行为手术切除组织的H&E染色图像(标尺＝2mm)及第四行为第三行中方框标记的区域的放大图像(标尺＝100μ m)所示，根据光声图像进行肿瘤分步切除，每一步切除的组织为图中P1-4 虚线圈所示，直至瘤床周围无明显光声信号，术后将切除的组织进行H&E染色，病理检查显示肿瘤已完全切除，瘤床上PA信号阴性的组织为肌肉组织，证明该cRGD-MNPs探针的动物安全性高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种乳腺癌特异靶向分子探针，其特征在于：所述探针为cRGD-MNPs，其包括黑色素纳米颗粒MNP，外部通过聚乙二醇PEG修饰偶联三肽RGD。
2.一种权利要求1所述的乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、将20mg黑色素加入6mL的0.1N NaOH水溶液中搅拌溶解，得到碱性黑色素溶液；
S2、将0.1N HCl水溶液迅速滴入S1所得碱性黑色素溶液中，并通过超声处理将pH调节至7.0，得到a溶液；
S3、加入去超纯水并重复4-5次洗涤离心a溶液，直至滤出液澄清透明得出黑色素溶液，冷冻干燥得到固体黑色素纳米颗粒MNPs；
S4、称取10mg MNPs分散于10ml超纯水中，滴加NaOH水溶液调节pH至9.5，得到b溶液；
S5、称取50mg NH2-PEG5000-NH2，加入5ml超纯水，滴加NaOH水溶液调节pH至9.5，得到c溶液；
S6、混合b溶液和c溶液，搅拌反应得到d溶液
S7、加入超纯水并重复5次洗涤离心d溶液，除去未结合的PEG，收集剩余溶液冷冻干燥得到偶联PEG的黑色素纳米颗粒PEG-MNPs；
S8、将1.2mg氨基-巯基交联剂溶于36μL二甲基亚砜中得到e溶液；
S9、称取1mg固体PEG-MNP溶解于1mL磷酸缓冲盐溶液，并调节PH至7.2,得到f溶液；
S10、混合e溶液和f溶液，搅拌反应，所得溶液经过滤除去过量的氨基-巯基交联剂和副产物后，得到SMCC-PEG-MNPs溶液；
S11、将120μL、5mM的靶向环肽溶液加入SMCC-PEG-MNPs溶液中旋转搅拌，所得溶液经过滤除去未偶联的RGD肽后，浓缩过滤得到最终产物cRGD-MNPs。
3.如权利要求2所述的乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述超声处理的输出功率40W。
4.如权利要求2所述的乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，其特征在于：步骤S6中所述b溶液和c溶液搅拌反应的条件为室温，反应时间为24h。
5.如权利要求2所述的乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，其特征在于：步骤S3和S7中洗涤离心采用截留分子量均为30kDa的超滤离心管，其中步骤S3离心转速为4000rpm，离心时间为15min，步骤S6离心转速为4000rpm，离心时间为15min。
6.如权利要求2所述的乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，其特征在于：步骤S10中所述e溶液和f溶液的搅拌反应的条件为室温，反应时间为2h。
7.如权利要求2所述的乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，其特征在于：步骤S11中所述旋转搅拌的温度为4℃，旋转搅拌的时间为24h。
8.如权利要求2所述的乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，其特征在于：步骤S10和S11所述过滤均采用PD-10脱盐柱。
9.如权利要求2所述的乳腺癌特异靶向分子探针的制备方法，其特征在于：步骤S11中所述浓缩过滤的具体方法为纯化后的溶液通过30kDa的超滤离心管浓缩后溶液，再经过0.22μm的过滤器过滤得到最终的产物cRGD-MNPs。
10.如权利要求1所述的乳腺癌特异靶向分子探针可应用于乳腺癌保乳手术中的光声导航探针。
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