CN110585449A - 基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法 - Google Patents

基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学检测技术领域，公开了一种基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，包括A、BSA还原；B、合成Gd负载BSA纳米颗粒；C、Bodipy标记Gd负载BSA纳米颗粒；以及D、中性粒细胞探针构建，首先以PBS为介质，将DTNB加入至步骤C的产物溶液中，并在室温下相互作用一定时间，完成BSA纳米颗粒活化；超滤纯化后，将活化的BSA纳米颗粒用无FBS的RPMI 1640培养基稀释至0.1mg mL‑1，然后在室温下与1.25×106cells.mL‑1中性粒细胞一起孵育；随后用冰冷的PBS洗涤，获得中性粒细胞探针。

Description

基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，涉及活细胞探针的构建，尤其涉及基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法。
背景技术
及时准确地识别肿瘤病灶是临床癌症干预的重要前提，也是肿瘤影像学诊断的目标。基于纳米颗粒的分子影像的进展极大地提高了肿瘤检测的灵敏度和特异性。例如，受生物矿化作用的启发，前期研究成功地构建螯合钆离子(Gd3+)的牛血清白蛋白(BSA)纳米颗粒，在磁共振成像(MRI)检测肿瘤方面相较于商业化钆造影剂(DTPA)具有明显的优势。一些报道对Gd负载的纳米颗粒做进一步研究，特别是修饰上过表达的癌细胞受体的配体赋予其主动识别肿瘤的功能，在动物水平上也取得了令人鼓舞的结果。
然而，由于血液循环的快速清除、有限的肿瘤靶向能力以及体内的脱靶效应，很少有基于纳米颗粒的药物递送系统被用于临床肿瘤诊断或治疗。因此，开发一种可以在血液循环中“免于检查”并且能够有效识别肿瘤微环境(TME)的成像剂仍是临床迫切需要的。
在肿瘤的发生发展过程中，各种细胞因子和趋化因子可以募集大量的免疫细胞来对抗疾病，诱导形成炎性TME。受到免疫细胞对炎症的天然趋化反应的启发，基于白细胞的细胞载体被认为有可能提高纳米颗粒的不良肿瘤递送效率而越来越受到关注。在所研究的许多细胞载体中，中性粒细胞被认为是最具潜力的选择之一，原因如下：中性粒细胞是体内循环中最丰富的白细胞(50％-70％)，并且很容易获得；癌细胞分泌的各种细胞因子和肿瘤相关性粒细胞分泌的趋化因子可以引起循环中的中性粒细胞快速迁移至TME以响应炎症；与结构及功能相对单一的纳米载体相比，中性粒细胞具有多种生理机制可以逃避。
免疫系统的攻击、克服各种生理屏障，使其能够特异性地靶向肿瘤区域。已有研究选择中性粒细胞作为内化载药纳米颗粒的递送平台，并在肿瘤治疗应用中表现出优异的效果。但是通过内化法递送造影剂(例如Gd)可能会受到限制，因为Gd3+在细胞内不易与自由水发生交换，从而影响螯合在蛋白质纳米颗粒上的Gd3+的高T1弛豫率。此外，成像剂的细胞内递送可能会潜在地影响中性粒细胞的活性与生物学特性，导致特异性肿瘤递送能力受损。
发明内容
本发明的目的在于，依托上述研究背景，成功构建了基于中性粒细胞的活细胞探针，用于肿瘤的精确影像学诊断。
发明人调研大量的最新生物材料文献报道，基于对自身免疫、肿瘤微环境以及纳米技术的深入研究，提出用于精准肿瘤诊断的“智能”探针的设想，主体思路如下：
负载成像剂(Gd和bodipy)的BSA纳米颗粒通过DTT的还原暴露出多个自由巯基，随后这些巯基被5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)活化，即以二硫键取代DTNB中的5-硫代-2-硝基苯甲酸酯(TNB)；活化的BSA纳米颗粒再次通过取代反应与中性粒细胞表面的巯基形成二硫键交联，最终获得具有成像功能的活细胞探针(NEs探针)。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供的基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，包括如下步骤：
A、BSA还原
在经标记的BSA蛋白溶液中引入还原剂以及2％SDS，在90～100℃条件下持续搅拌，充分暴露自由巯基，而后采用MES溶液稀释制备得到浓度为1mg.mL-1的工作溶液；
B、合成Gd负载BSA纳米颗粒
将上述工作溶液在35～40℃中振荡温育，而后加入浓度为2mmol/L的GdCl3溶液，工作溶液与GdCl3溶液的体积比为30～40:1；温育20～30min后加入0.1mmol/L的NaOH溶液，继续反应40～60min后进行超滤纯化获得Gd负载BSA纳米颗粒；
C、Bodipy标记Gd负载BSA纳米颗粒
Gd负载BSA纳米颗粒在NaHCO3溶液中与bodipy溶液室温下搅拌，随后超滤纯化以获得产物；
D、中性粒细胞探针构建
首先以PBS为介质，将DTNB加入至步骤C的产物溶液中，并在室温下相互作用一定时间，完成BSA纳米颗粒活化；超滤纯化后，将活化的BSA纳米颗粒用无FBS的RPMI1640培养基稀释至0.1mg mL-1，然后在室温下与1.25×106cells.mL-1中性粒细胞一起孵育；随后用冰冷的PBS洗涤，获得中性粒细胞探针。
优选的，在步骤A中，经标记的BSA蛋白为采用FITC标记的BSA蛋白分子，其标记方法如下：将溶解在10mg.mL-1的NaHCO3溶液中的BSA蛋白与FITC，以质量比为1:40的比例混合，匀速搅拌至少5小时充分反应；随后超滤纯化得到FITC-BSA。
BSA还原时，FITC-BSA蛋白溶液与还原剂DTT以摩尔比1:16混合，并与2％SDS在90℃条件下持续搅拌2小时进行还原反应，充分暴露自由巯基；而后采用浓度为0.1mg.mL-1、pH为4.4的MES溶液进行稀释。
优选的，在步骤B中，工作溶液在37℃条件下以130rpm振荡温育5小时，而后加入浓度为2mmol/L的GdCl3溶液，工作溶液与GdCl3溶液的体积比为33:1；温育20min后，加入体积为工作溶液体积的25％～30％、浓度为0.1mmol/L的NaOH溶液，继续反应400min后进行超滤纯化获得Gd负载BSA纳米颗粒，该BAS纳米颗粒粒径为42nm。
优选的，在步骤C中，Gd负载BSA纳米颗粒在0.1mmol/L的NaHCO3溶液中与10mg.mL- 1bodipy溶液室温下搅拌1小时，随后超滤纯化获得Bodipy标记的Gd负载BSA纳米颗粒。其中，Gd负载BSA纳米颗粒与bodipy的摩尔比为1:3。
优选的，步骤D中，BSA与DTNB的质量比为1:0.42，BSA纳米颗粒的活化时间为1小时；稀释后的BSA纳米颗粒在室温下与中性粒细胞的孵育时间为20min，随后用冰冷的PBS洗涤，获得中性粒细胞探针。
本发明中，中性粒细胞的收集于小鼠腹腔，首先向小鼠腹腔内注射无菌巯基醋酸盐培养基以模拟腹腔“炎症”环境；“招募”一段时间后，用冰冷的PBS灌洗腹腔3-4遍，并参照使用说明裂解灌洗液中的红细胞，离心后用RPMI 1640培养基重悬得到小鼠白细胞；随后将细胞悬液静置于37℃，5％CO2培养箱中30分钟，以去除贴壁的巨噬细胞；收集上悬液并离心(850g)，5分钟可得到小鼠中性粒细胞。
前期的基础研究只是提供并在动物模型中验证了一个利用免疫细胞的天然肿瘤趋化能力提高诊断效能的智能探针的设想。在临床转化方面，可以尝试利用动物自身中性粒细胞在体内构建成像探针并实现肿瘤特异性成像，这种方式可以减少创伤以及避免潜在的自体排斥，从而增加实用性及推广性。
探针制备后，发明人首先探究了探针对中性粒细胞的活力、形貌、膜蛋白标记以及在小鼠体内的趋化能力等生物学特性方面的影响。结果显示，纳米颗粒的锚定对中性粒细胞功能的影响不大，NEs探针保留有中性粒细胞的生理功能，可以穿过血管屏障从循环迁移到腹腔的“发炎区域”。
随后，发明人通过小鼠皮下肺癌模型评估NEs探针的肿瘤特异性靶向能力，结果显示，中性粒细胞作为载体可以高效地递送成像剂至肿瘤区域，使得NEs探针可以通过识别体内复杂的生物学信号有效地迁移到肿瘤区域，从而产生具有诊断应用价值的T1WI信号，成像效果显著优于当前基于纳米颗粒的成像剂。
本发明的有益保障及效果：
首先，中性粒细胞是体内循环中最丰富的白细胞(50％-70％)，并且很容易获得；癌细胞分泌的各种细胞因子和肿瘤相关性粒细胞分泌的趋化因子可以引起循环中的中性粒细胞快速迁移至肿瘤微环境(TEM)以响应炎症，因此，本发明中选用中性粒细胞作为探针的细胞载体。与结构及功能相对单一的纳米载体相比，中性粒细胞具有多种生理机制可以逃避免疫系统的攻击、克服各种生理屏障，使其能够特异性地靶向肿瘤区域，进而高效地递送成像剂至肿瘤区域，具备更高效地成像剂递送效率，从而提高了肿瘤的检测灵敏度。
其次，胎牛血清白蛋白(BSA)内部的二硫键通过DTT还原暴露出多个自由巯基，这些巯基在一定的条件下可以再次形成二硫键，作为蛋白纳米骨架中主要的作用力。该种纳米构建方法简便、绿色、高效、稳固，并且成像剂(Gd和bodipy)的载入是以前期研究为基础，合成技术成熟、便捷，无需进行过大投入，从而降低了探针的制备成本，有利于实现探针的工业化生产，并在临床推广应用。
第三，中性粒细胞与BSA纳米颗粒是利用DTNB，经历两次巯基-二硫键交换实现的，该细胞表面工程法可操作性强，对细胞生理功能影响小，且能保证Gd高弛豫率(14.53s-1/mM)，保证其在目标区域的最终成像效果。
总之，本发明利用中性粒细胞的炎症识别和肿瘤归巢能力，构建了一种高度敏感的活细胞探针。该探针能够实现肿瘤区域更快、更强、更持久的信号富集，有利于精确的肿瘤诊断。
附图说明
图1为本发明中活细胞探针的构建及在小鼠体内的成像验证过程示意图；
图2为本发明中Bodipy标记的Gd负载BSA纳米颗粒(Gd@BSA-FITC/Bodily NPs)的表征结果图；
图3为本发明中中性粒细胞探针(Gd@BSA-FITC NPs/NE)制备示意图与结果图；
图4为本发明中探针对中性粒细胞性能影响结果；
图5为本发明中探针在体内趋化性研究结果；
图6为本发明中探针用于小鼠活体荧光成像结果；
图7为本发明中探针用于小鼠活体MR成像结果。
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。实施例不包括对传统方法的详细描述，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、本领域工具书上的实验方法或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
图1对本发明的工作流程进行了展示，首先构建中性粒细胞探针并在荧光显微镜下对探针进行观察；然后将探针经尾静脉注射入小鼠体内，探针穿过内皮细胞在肿瘤处富集，经活体荧光成像以及磁共振成像探究NEs探针在肿瘤特异性靶向与诊断应用中的价值。具体实验方法请参见下述实施例：
实施例一NEs探针构建
1、FITC标记BSA分子
将溶解在10mg.mL-1的NaHCO3溶液中的BSA蛋白与FITC以质量比为1:40的比例混合，匀速搅拌至少5小时充分反应；随后超滤纯化得到FITC-BSA。
2、FITC-BSA还原
FITC-BSA蛋白溶液与还原剂DTT以摩尔比1:16混合，并与2％SDS在90℃条件下持续搅拌2小时进行还原反应，充分暴露自由巯基；而后采用浓度为0.1mg.mL-1、pH为4.4的MES溶液进行稀释，制备得到浓度为1mg.mL-1的工作溶液。
3、合成Gd@BSA-FITC纳米颗粒(nanoparticles，NPs)
将上述工作溶液置于24孔板(0.5mL/孔)中并在37℃以130rpm温育5小时；随后，加入GdCl3溶液(15μL/孔，2mM)，温孵20分钟后引入NaOH溶液(137.5μL/孔，0.1M)，继续反应40分钟后进行超滤纯化以获得最终产物。
4、Bodipy标记Gd@BSA NPs
在之后的活体荧光成像实验中，由于FITC会受到小鼠自体荧光的干扰，故用bodipy代替以制备Gd@BSA-bodipy纳米颗粒。简言之，Gd@BSA纳米颗粒在0.1mmol/L的NaHCO3溶液中与10mg.mL-1bodipy溶液室温下搅拌1小时，随后超滤纯化获得Bodipy标记的Gd负载BSA纳米颗粒。其中，Gd负载BSA纳米颗粒与bodipy的摩尔比为1:3。
Gd@BSA-FITC/Bodily NPs的表征结果如图2所示，获得到的Gd@BSA-FITC NPs的平均流体动力学直径约为42nm(图2A)，表面电荷为-13.5mV。为了阐明稳定纳米颗粒的内部作用力，Gd@BSA-FITC NPs经SDS破坏疏水相互作用后，如图2B所示，纳米颗粒的尺寸在处理后没有明显的改变，提示单独的SDS或DTT均不能解离纳米颗粒；然而，当经历DTT与SDS结合处理后，纳米颗粒尺寸显著性变小，提示解离；这意味着在Gd@BSA-FITC NP内部存在物理和化学力协同稳定纳米颗粒的结构。
SDS-PAG分析(图2C)中，经SDS处理的Gd@BSA-FITC NP显示出非常弱的BSA分子迁移带，而SDS和DTT结合处理的Gd@BSA-FITC NP解离成天然BSA分子，这进一步支持二硫键的存在。纳米颗粒内的这些协同稳定力对于成像剂的负载尤其重要。
为了评估纳米颗粒在循环中的稳定性，将冻干的Gd@BSA-FITC NPs粉末重悬于含有10％FBS的DMEM培养基中，用以模拟生理环境。如图2D所示，DLS测定的纳米颗粒在72小时内的尺寸分布显示出可忽略的变化，表明其稳定性质。
此外，作为探针的功能部分，需要通过测定纵向(r1)和横向(r2)弛豫率(即弛豫时间T的倒数)来评估纳米颗粒的磁共振成像性能。结果表明，Gd@BSA NPs表现出高r1值(14.53s-1/mM)，r2/r1值非常低，为1.94(图2E)。可能的原因是BSA纳米颗粒上螯合Gd3+后增加了顺磁中心的数量，同时减慢了顺磁中心的翻滚运动，从而加速纵向弛豫(T1缩短，r1增高)。如图2F所示，相同Gd3+浓度下，Gd@BSA NPs的MR信号强度远强于Gd-DTPA。高弛豫性和优异的MRI增强能力表明Gd@BSA NPs作为阳性造影剂具有巨大的潜力。
5、中性粒细胞收集
收集过程如图3B所示，小鼠(BALB/c，雌性，5-6周)腹腔内注射3mL 3％的无菌巯基醋酸盐培养基以模拟腹腔“炎症”环境；“招募”6小时后处死并用冰冷的PBS灌洗腹腔(3-4遍)；参照使用说明裂解灌洗液中的红细胞，离心后用RPMI 1640培养基重悬得到小鼠白细胞；随后将细胞悬液静置于37℃，5％(v/v)CO2培养箱中30分钟，以去除贴壁的巨噬细胞；收集上悬液并离心(850g)，5分钟可得到小鼠中性粒细胞。
采用流式细胞术分析收集得到中性粒细胞的纯度。CD11b是一种中性粒细胞特异性表面蛋白，可调节中性粒细胞的粘附和迁移。如图3A所示，随着纯化时间的延长，CD11b的浓度逐渐增大，中性粒细胞的纯度也越来越高。
6、Gd@BSA-FITC NPs/中性粒细胞(NEs探针)的制备
如图3C所示，通过将中性粒细胞与DTNB活化的Gd@BSA-FITC NPs一起温育来制备中性粒细胞(NEs)探针，具体过程参见图1：首先以PBS为介质，将DTNB加入NPs溶液中(BSA/DTNB＝1/0.42，w/w)，并在室温下相互作用1小时，进行Gd@BSA-FITC NPs的活化；超滤纯化后，将活化的Gd@BSA-FITC NPs用无FBS的RPMI 1640培养基稀释至0.1mg.mL-1，然后在室温下与中性粒细胞(1.25×106cells.mL-1)一起孵育20分钟；随后用冰冷的PBS洗涤两次后获得NEs探针，用于后续研究。
根据本实施例中的方法制备得到的NEs探针的典型共聚焦激光扫描图像(比例尺：7.5μm)如图3D所示；采用流式细胞术分析用不同浓度的Gd@BSA-FITC NPs合成的NEs探针的平均荧光强度，0.1mg.mL-1的Gd@BSA-FITC NPs合成的NEs探针的平均荧光强度最强(图3E)。
实施例二、NEs探针对中性粒细胞性能影响
验证这种细胞表面工程法对中性粒细胞的活力、形貌、膜蛋白标记的影响。如图4A所示，Gd@BSA NPs表现出低细胞毒性；随后NEs探针的细胞凋亡测定显示修饰后的中性粒细胞的细胞活性与单纯中性粒细胞之间的差异可忽略不计，表明本研究中的细胞表面工程法具有较好的细胞相容性(图4B)；Gd@BSA NPs缀合后的中性粒细胞在形貌上也未见明显变化(图4C)。
CD11b是一种中性粒细胞特异性表面蛋白，可调节中性粒细胞的粘附和迁移。因此，参照单纯中性粒细胞评估NPs修饰的中性粒细胞CD11b表达的变化。流式细胞术分析结果(图4D)显示，无论共孵育的纳米颗粒浓度如何，CD11b表达的变化可忽略不计，这表明纳米颗粒的锚定对中性粒细胞功能的影响可能不大。
实施例三、NEs探针在小鼠体内的趋化能力
为了满足实际应用的需求，本发明还考察了NEs探针的迁移能力在体内是否保留。受到从腹腔收集中性粒细胞的过程的启发，对尾静脉注射NEs的小鼠腹腔给予无菌巯基醋酸盐培养基，6小时后收集腹腔灌洗液，纯化得到中性粒细胞。
流式细胞术分析显示获得的中性粒细胞被分成两个群体(图5A)，左下方细胞群不显示荧光，为小鼠自体中性粒细胞，而右上方细胞群显示出荧光信号，为尾静脉给予的NEs探针(bodipy标记)。上述结果表明，NEs探针保留有中性粒细胞的生理功能，可以穿过血管屏障从循环迁移到腹腔的“发炎区域”。正如预期的那样，较低浓度的Gd@BSA-bodipy NPs(0.1mg mL-1)合成的NEs探针表现出更好的迁移能力。
然而，对于诊断应用，评价成探针的标准应为其在目标区域的最终成像效果，即造影剂(Gd与bodily)的富集水平，这是中性粒细胞的负载水平与特异性趋化能力相互平衡的结果，荧光强度最高的NEs探针为最终的成像诊断工具。如图5B所示，较低浓度的Gd@BSA-bodipy NPs(0.1mg mL-1)合成的NEs探针组的小鼠腹腔中性粒细胞的平均荧光强度MFI明显高于其他两组，表明具有更高的净药物递送效率(p<0.01)。因此，0.1mg.mL-1Gd@BSA-bodipyNPs合成的NEs探针用于随后的活体荧光成像与MR成像。体内趋化实验流程图如图5C所示。
实施例四、活体荧光成像以及磁共振成像
1、小鼠皮下肺癌模型构造
利用小鼠皮下肺癌模型评估NEs探针的肿瘤特异性靶向能力。选择4-5周龄的雌性小鼠(BALB/c)皮下植瘤(2×106个Lewis肺癌细胞/小鼠)，一周后肿瘤体积增加至15mm3，模型构造成功。
2、活体荧光成像
将NEs探针通过尾静脉注射给荷瘤小鼠，并在注射前后收集荧光图像。如图6A，NEs探针组中肿瘤区域的荧光强度在注射后0.5小时明显增强，在之后的8小时内保持高水平，8小时后荧光信号出现衰减的趋势。而对照组(Gd@BSA-bodipy NPs)小鼠的肿瘤区域荧光信号延迟增强，且较快出现衰减。这表明NEs探针得益于中性粒细胞的生物学功能，因此能够在肿瘤区域实现更快，更强，更持久地富集。
当成像剂在肿瘤区域中最大程度地富集时，取出同批次小鼠的肿瘤以及各脏器并采集其荧光图像。如图6B和C所示，NEs探针比Gd@BSA-bodipy NPs表现出更强的肿瘤积累(p<0.001)，这表明中性粒细胞作为载体可以高效地递送成像剂至肿瘤区域，因而具有巨大的荧光成像诊断应用价值。
3、磁共振成像
荷瘤小鼠尾静脉注射NEs探针、Gd@BSA-bodipy NPs和Gd-DTPA(Gd含量一致)，随后以特定时间间隔采集MR图像。如图7A所示，NEs探针可以通过识别体内复杂的生物学信号有效地迁移到肿瘤区域，从而产生具有诊断应用价值的T1WI信号；虽然Gd@BSA-bodipy NPs也可以通过EPR效应在肿瘤区域富集，但MRI信号强度相对较弱；而给予相同Gd含量的Gd-DTPA的小鼠在观察期间未显示出明显的肿瘤增强，可能是由于该浓度下的Gd远小于临床使用的剂量。
通常，肿瘤与正常组织(肌肉)(T/N)造影剂的肿瘤增强能力。如图7B所示，NEs探针显示出快速且显着的肿瘤对比增强特征，最大T/N值达154％，显著高于Gd@BSA-bodipy NPs和Gd-DTPA。
为了进一步证明NEs探针的肿瘤递送优势，ICP-AES测定在最强MRI信号时取出的小鼠肿瘤样品的Gd含量。由于Gd-DTPA组中的小鼠不能显示肿瘤区域的明显MR信号增强，因此在注射30分钟后取出肿瘤标本。结果显示，在肿瘤大小相似的情况下，NEs探针能够有效地将Gd(造影剂)递送至肿瘤区域(0.0187μg)，这显着高于Gd@BSA-bodipy NPs组(0.0040μg)和Gd-DTPA组(0.0008μg)(图7C)。这些结果表明，中性粒细胞衍生的活细胞探针在分子成像领域具有很大的MRI诊断应用潜力。
综上，本发明利用中性粒细胞的炎症识别和肿瘤归巢能力，构建了一种高度敏感的活细胞探针，用于精确的肿瘤诊断。通过DTNB介导的快速有效的二硫键-硫醇交换，将载有成像剂的BSA纳米颗粒共价固定在中性粒细胞的细胞表面上。这种细胞表面工程法被证明在细胞活力、形貌和细胞表面特异性蛋白标记方面对中性粒细胞的生物学特性产生可忽略的影响，从而确保其作为活体探针的可行性。在肺癌皮下种植瘤模型中，活体荧光成像与磁共振成像共同证实，相较于基于纳米颗粒的成像剂，NEs探针具有更快的靶向和更强的富集。这些结果表明基于中性粒细胞的活细胞探针在精确肿瘤诊断应用中具有巨大潜力，为肺癌靶向精准诊断提供的一种新的技术支持，为进一步临床转化应用提供了可能。

Claims (7)

1.一种基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、BSA还原
在经标记的BSA蛋白溶液中引入还原剂以及2％SDS，在90～100℃条件下持续搅拌，充分暴露自由巯基，而后采用MES溶液稀释制备得到浓度为1mg.mL-1的工作溶液；
B、合成Gd负载BSA纳米颗粒
将上述工作溶液在35～40℃中振荡温育，而后加入浓度为2mmol/L的GdCl3溶液，所述工作溶液与所述GdCl3溶液的体积比为30～40:1；温育20～30min后加入0.1mmol/L的NaOH溶液，继续反应40～60min后进行超滤纯化获得所述Gd负载BSA纳米颗粒；
C、Bodipy标记Gd负载BSA纳米颗粒
所述Gd负载BSA纳米颗粒在NaHCO3溶液中与bodipy溶液室温下搅拌，随后超滤纯化以获得产物；
D、中性粒细胞探针构建
首先以PBS为介质，将DTNB加入至步骤C的产物溶液中，并在室温下相互作用一定时间，完成BSA纳米颗粒活化；超滤纯化后，将活化的BSA纳米颗粒用无FBS的RPMI1640培养基稀释至0.1mg mL-1，然后在室温下与1.25×106cells.mL-1中性粒细胞一起孵育；随后用冰冷的PBS洗涤，获得所述中性粒细胞探针。
2.根据权利要求1所述的基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于：
其中，步骤A中，经标记的BSA蛋白为采用FITC标记的BSA蛋白分子，其标记方法如下：
将溶解在10mg.mL-1的NaHCO3溶液中的BSA蛋白与FITC，以质量比为1:40的比例混合，匀速搅拌至少5小时充分反应；随后超滤纯化得到FITC-BSA。
3.根据权利要求2所述的基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于：
其中，BSA还原时，FITC-BSA蛋白溶液与还原剂DTT以摩尔比1:16混合，并与2％SDS在90℃条件下持续搅拌2小时进行还原反应，充分暴露自由巯基；而后采用浓度为0.1mg.mL-1、pH为4.4的MES溶液进行稀释。
4.根据权利要求1所述的基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于：
其中，在步骤B中，所述工作溶液在37℃条件下以130rpm振荡温育5小时，而后加入浓度为2mmol/L的GdCl3溶液，所述工作溶液与所述GdCl3溶液的体积比为33:1；温育20min后，加入体积为所述工作溶液体积的25％～30％、浓度为0.1mmol/L的NaOH溶液，继续反应400min后进行超滤纯化获得所述Gd负载BSA纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于：
其中，步骤C中，所述Gd负载BSA纳米颗粒在0.1mmol/L的NaHCO3溶液中与10mg.mL- 1bodipy溶液室温下搅拌1小时，随后超滤纯化获得Bodipy标记的Gd负载BSA纳米颗粒，
所述Gd负载BSA纳米颗粒与bodipy的摩尔比为1:3。
6.根据权利要求3所述的基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于：
其中，步骤D中，BSA与DTNB的质量比为1:0.42，BSA纳米颗粒的活化时间为1小时；稀释后的BSA纳米颗粒在室温下与中性粒细胞的孵育时间为20min，随后用冰冷的PBS洗涤，获得所述中性粒细胞探针。
7.根据权利要求1所述的基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于：
其中，所述Gd负载BSA纳米颗粒的粒径为42nm。
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