CN109420177A - 用于有效体内递送dna纳米结构至动脉粥样硬化斑块的材料和方法 - Google Patents
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Abstract
DNA包被的纳米颗粒(DNA‑NP)可作为有效成像剂,用于靶向动脉粥样硬化病变并对动脉粥样硬化病变成像,以及治疗动脉粥样硬化疾病。DNA‑NP可以通过A类清道夫受体(SR‑A)介导的途径特异性地进入巨噬细胞,实现短的半衰期和动脉粥样硬化斑块的靶向积累。
Description
相关申请的引用
本申请要求2017年8月28日提交的美国临时申请第62/550,995 号的权益,通过援引的方式将其公开内容整体并入本文,包括所有附 图、表格和图示。
发明背景
心血管疾病(CVD)是全球死亡的主要原因,每年造成1730万人死 亡(1)。动脉粥样硬化最初由内皮的慢性炎症引发,其特征在于动脉壁 中持续的炎症和富含脂质的斑块或病变的积累,并且是CVD的主要原 因(2)。动脉粥样硬化的标志性特征是动脉粥样硬化斑块或病变的发 展,所述动脉粥样硬化斑块或病变的特征在于动脉壁中脂质的滞留和 白细胞的浸润(3)。作为斑块中最多的细胞类型,单核细胞衍生的巨噬 细胞很容易内化脂质并变成泡沫细胞(4)。巨噬细胞还通过消化细胞外 基质而帮助斑块的破裂,从而导致中风和心肌梗塞(5)。然而,由于动 脉粥样硬化的进展是渐进和无症状的(6),早期检测动脉粥样硬化斑块 和准确鉴定促进动脉粥样硬化的炎症细胞需要开发用于以更高的特异 性和灵敏度检测斑块的先进技术(7)。对于一半以上死于冠心病的患 者,动脉粥样硬化的无痛过程通常不会导致出现临床症状(5)。动脉粥 样硬化是许多具有全球高死亡率的心血管疾病的基础,诸如中风和缺 血性心脏病。由于动脉粥样硬化的缓慢和无症状进展,目前的临床挑战是在尽可能早的阶段对动脉粥样硬化斑块进行成像和治疗。尽管在 药物开发和血管成形术过程中支架设计取得了进展,但仍存在大量残 余风险。在体内有效地递送治疗剂和/或造影剂至斑块是至关重要的。
目前,准确鉴定有风险的患者具有挑战性,因为常规的成像工具 只能确定动脉狭窄的程度,但不能检测早期病变或分析斑块大小、成 分、活动度或总体疾病负担。目前大多数非侵入性心血管成像方法(诸 如正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和 X射线血管造影)依赖于辐射暴露来产生照片,并且与癌症风险增加相 关(8)。
最近,高分辨率MRI以准确和非侵入性方式提供对病理斑块组分 的表征(9),并因此被认为是诊断动脉粥样硬化和监测动脉粥样硬化治 疗效果的最佳技术。然而,MRI技术的显影需要适当的对比成像剂的 参与,其中一些成像剂是基于超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)。
目前,正在积极研究用于治疗和诊断动脉粥样硬化的工程化生物 纳米材料。它们不仅增强治疗剂和造影剂向斑块的递送,而且还能够 将治疗剂和造影剂递送至斑块的特定组织和细胞(10)。纳米颗粒被认 为是最佳成像探针,主要是由于它们有利的纳米尺寸依赖性性质和表 面修饰的可行性(5)。生物纳米材料是有希望的递送载体,因为它们在 静脉内(i.v.)注射时天然地能够在斑块内积累。内源性高密度脂蛋白(一 种具有抗炎和抗氧化性质的基于脂质的纳米颗粒(NP))是向动脉粥样 硬化斑块的治疗分子和造影分子的常见载体(11);循环脂蛋白可以穿 透动脉壁并积累在膜(lamina)内的亚内皮富含蛋白多糖的层中(12)。当 肽和抗体与作为靶向配体的NP表面缀合时,可以促进NP向斑块的特 定组分(诸如活化的内皮细胞(13-15)、血管平滑肌细胞(16)、胶原蛋白 (17-18)、弹性蛋白(19)、纤连蛋白(20)和巨噬细胞(21-24))的递送。最 近的研究表明,将基于糖的生物纳米材料(诸如基于透明质酸的 NP(25-27)和含有粘酸核心的两亲性聚合物NP(28-30))应用于靶向斑 块、减轻炎症和减弱斑块巨噬细胞的增殖。关于含有核酸的生物纳米 材料,现有文献的特点是将作为NP的遗传货物的核酸(例如, siRNA(31)、微小RNA(32)或DNA质粒(33))包封,用于促进将它们递 送至斑块和调节与动脉粥样硬化形成有关的基因的表达。
SPION是优选的MRI造影剂,不仅因为它们可以比其他造影剂(诸 如钆螯合物)在体内实现更长的循环时间(34),还因为它们可以通过增 加对比度噪声比产生可靠的可视化(35)。
传统的MRI造影剂(诸如ferumoxtra-10,一种超小型超顺磁性氧 化铁纳米颗粒(USPIO))以“被动靶向”方式将动脉粥样硬化斑块可视 化,并在长循环时间后终止于淋巴结巨噬细胞(36-37)。
为了实现针对动脉粥样硬化斑块的特异性靶向,已经引入各种靶 向配体,包括在血管炎症和活化的血小板血栓形成中表达的血管细胞 粘附分子-1(VCAM-1)和P-选择蛋白(13-14),以及靶向血管平滑肌细胞 (VSMC)的profilin-1(16)。最近,巨噬细胞由于其在动脉粥样硬化斑块 中的优势增殖存在而成为靶向的目标(38-40)。例如,载脂蛋白衍生肽(21、41)或单克隆抗体(22)、如抗CD36抗体的抗体(23-24)和肽(42)已 被用于靶向巨噬细胞清道夫受体。在这些研究中,在注射后24小时或 更长时间段获得体内MRI图像,并且纳米颗粒的清除需要甚至更长的 时间段。对于临床应用,需要MRI造影剂的更快速的靶向和清除。
对于动脉粥样硬化斑块的成像,可使用商购的纳米颗粒(诸如 Ferumoxytol和Ferumoxtra-10),但它们不含DNA。
为了实现将治疗剂靶向递送至动脉粥样硬化斑块,目前可用的递 送载体通常需要使用肽、基于脂质的蛋白质和糖来靶向斑块的某些组 分。
例如,用纳米颗粒靶向动脉粥样硬化斑块的可用方法主要针对靶 向(1)炎性血管内皮上的血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)或P-选择蛋白, (2)非细胞组分(诸如胶原蛋白和纤维蛋白),或(3)免疫细胞(诸如巨噬细 胞)。鉴于巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块中的丰度及其在动脉粥样硬化 发展中的关键作用,巨噬细胞被认为是最具吸引力的靶标。在可用于靶向巨噬细胞的生物分子中,肽、糖和脂蛋白是常见的并且通常被展 示在纳米颗粒的表面上。
生物纳米材料用于靶向动脉粥样硬化斑块的已报道的临床前应用 通常使用肽、蛋白质、脂质或糖。对于含有核酸的那些生物材料,核 酸仅用作调节斑块中基因的有效加载,而不是斑块组分的靶向配体。
目前没有临床批准的用于治疗动脉粥样硬化的基于纳米颗粒的疗 法。临床应用中仍然存在的一个关键问题是缺乏用于动脉粥样硬化诊 断和预后的高准确性、非侵入性的方法。
磁共振成像作为最有前景的方法之一,主要使用SPION作为造影 剂来增强空间分辨率和动脉粥样硬化病变。然而,由于缺乏特异性、 等待时间长和清除速率慢,很难有纳米材料在动脉粥样硬化成像的临 床试验中被批准。
因此,需要用于动脉粥样硬化的高准确性、非侵入性诊断和预后 以及将治疗剂特异且有效地递送至动脉粥样硬化斑块的基于纳米颗粒 的方法。
发明概述
为了简化语言表述,本文中使用了如下缩写:NP代表纳米颗粒 (nanoparticle),SPN代表超顺磁纳米颗粒(superparamagnetic nanoparticle),SPION代表超顺磁氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles),其中SPION是本申请的一个代表性实例。
本文提供了用于产生和使用具有纳米颗粒(NP)核心的球形核酸 (DNA-NP)的材料和方法,所述DNA-NP能作为有效成像剂来选择性 地靶向和治疗患有或疑似患有动脉粥样硬化疾病的个体的动脉粥样硬 化病变。在一些实施方案中,DNA-NP为具有超顺磁性纳米颗粒(SPN) 核心的球形核酸(DNA-SPN)。在一些实施方案中,DNA-NP为具有超 顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)核心的球形核酸(DNA-SPION)。
本申请的DNA-NP在表面植入DNA寡核苷酸。如果纳米颗粒核 心含有造影分子(诸如氧化铁或钆离子),则可以将DNA-NP用作斑块 的体内成像剂(例如作为MRI造影剂)。如果核心加载有抗炎分子(诸如 他汀类或细胞因子,如白细胞介素IL-10),则可以将DNA-NP用作动 脉粥样硬化的体内治疗剂。
在具体的优选实施方案中,DNA-NP含有超顺磁性氧化铁纳米颗 粒核、聚合物间隔层和外部DNA寡核苷酸壳。然而,核心通常可以 被其他造影剂或治疗分子取代。
有利的是,如在载脂蛋白E敲除小鼠中所证明的,当系统性注射 DNA-SPION时,DNA-SPION在动脉粥样硬化斑块内快速积累。例如, 本申请的DNA-SPION快速(即,短至注射后2小时)且大量(即,每克 组织约60%的注射剂量)积累在ApoE-/-小鼠的主动脉病变中。在斑块 内部,DNA包被的纳米颗粒定位在病变内巨噬细胞附近,并且与M1 巨噬细胞、内皮细胞和树突细胞相比,更易于内化到M2巨噬细胞中。 本申请的DNA-SPION在注射后长达24小时仍保留在斑块内。总之, 本申请的DNA-SPION可以是针对动脉粥样硬化斑块的治疗剂和造影 剂的有用载体。
附图简述
图1A显示荧光标记的DNA包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒 (DNA-SPION)的示意图。将具有或不具有荧光标签的单链寡核苷酸 (ssDNA)与SPION表面上的聚(乙二醇)(PEG)分子偶联。图1B显示制 备DNA-SPION的示意图。图1C显示DNA-SPION进入动脉粥样硬化 斑块并与动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞上的A类清道夫受体结合的示 意图。
图2A显示与含有10%FBS的DMEM一起孵育的DNA-SPION的 流体动力学尺寸和电荷。图2B显示PEG-SPION和DNA-SPION的透 射电子显微镜(TEM)图像。图2C显示PEG-SPION的磁化曲线。图2D 显示PEG-SPION和DNA-SPION的琼脂糖凝胶电泳。图2E显示 PEG-SPION的热重量分析仪(TGA)曲线。
图3A显示制备FITC-PEG-SPION和FITC-DNA-SPION的示意图。 图3B显示在RAW267.4细胞中FITC标记的SPION的细胞摄取。
图4A显示在AML-12、C166、MOVAS和RAW 264.7细胞中定量 PEG-SPION的细胞毒性的MTT测定结果。图4B显示在AML-12、 C166、MOVAS和RAW 264.7细胞中定量DNA-SPION的细胞毒性的 MTT测定结果。
图5A显示针对SR-A(绿色)标记的RAW 267.4(巨噬细胞)、C166(内 皮)细胞、MOVAS(平滑肌)和AML-12(肝细胞)细胞的共聚焦显微镜图 像。图5B显示在四种细胞系中SR-A表达的Western印迹分析。图5C 和图5D显示通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测的5nMDNA-SPION和5nM PEG-SPION的细胞摄取。图5E显示细胞团块中 铁含量(褐色所示)的图像。图5F显示骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)和 骨髓衍生的树突细胞(BMDC)中SR-A表达的Western印迹分析。图5G 显示BMDM细胞和BMDC细胞中PEG-SPION和DNA-SPION的细胞 摄取。图5H显示暴露于PEG-SPION的RAW 264.7细胞的TEM图像。 图5I显示暴露于DNA-SPION的RAW264.7细胞的TEM图像。
图6A显示通过铁含量的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)确定的 RAW 264.7细胞对DNA-SPION的细胞摄取动力学(左)和细胞团块中 的铁含量图像(右)。图6B显示与FITC标记的DNA-SPION和 PEG-SPION一起孵育的细胞的共聚焦显微镜图像(左)和细胞团块的荧光强度(右)。
图7A显示在普鲁士蓝染色后,与PEG-SPION和DNA-SPION一 起孵育的细胞的显微图像。图7B显示与Cy3标记的PEG-SPION和 Cy3标记的DNA-SPION一起孵育的RAW 267.4细胞的共聚焦显微镜 图像。
图8显示了RAW 264.7细胞对PEG-SPION和DNA-SPION的细 胞摄取的透射电子显微镜(TEM)图像。
图9A显示在用岩藻多糖、菲律宾菌素III、细胞松弛素D和戴纳 索尔处理后,与Cy3标记的DNA-SPION一起孵育的RAW267.4细胞 的共聚焦显微镜图像。图9B显示在用岩藻多糖、菲律宾菌素III、细 胞松弛素D和戴纳索尔(Dynasore)处理后,与Cy3标记的DNA-SPION一起孵育的RAW 267.4细胞中铁含量的ICP-MS测量。图9C显示在 用岩藻多糖、菲律宾菌素III、细胞松弛素D和戴纳索尔处理后,与 Cy3标记的DNA-SPION一起孵育的RAW 267.4细胞中通过阿尔玛蓝 (Almar Blue)测定的细胞活力。图9D显示si-RNA转染的RAW 267.4 细胞的Western印迹分析。图9E显示在用岩藻依聚糖、菲律宾菌素III、 细胞松弛素D和戴纳索尔处理后,与Cy3标记的DNA-SPION一起孵 育的RAW 267.4细胞中铁含量的ICP-MS测量。
图10显示用针对MSR1、FLOT1和CAV1的siRNA处理RAW 267.4细胞后,Cy3标记的DNA-SPION和DAPI的共聚焦显微镜图像。
图11显示用针对MSR1、FLOT1和CAV1的siRNA处理后,RAW 264.7细胞中Cy3标记的MSR1、FLOT1、CAV1和DAPI的共聚焦显 微镜图像。
图12显示与针对CAV1和FLOT1的Cy3标记的抗体一起孵育的 RAW 264.7细胞的荧光显微图像。
图13显示在加入FITC-DNA-SPION后30分钟,在RAW 264.7 细胞中针对FLOT1的Cy3标记的抗体和FITC标记的DNA-SPION的 共聚焦显微镜图像。
图14A显示在加入DNA-SPION后10分钟,RAW 264.7细胞中 DNA-SPION摄取的TEM图像。图14B显示加入DNA-SPION后30 分钟的TEM图像。
图15A显示在加入DNA-SPION后10分钟,RAW 264.7细胞中 DNA-SPION摄取的TEM图像。图15B显示加入DNA-SPION后30 分钟的TEM图像。
图16A显示在加入DNA-SPION后10分钟,RAW 264.7细胞内荧 光标记的DNA-SPION(绿色)的共聚焦免疫荧光图像。图16B显示1小 时的共聚焦图像。图16C显示4小时的图像。图16D显示8小时的图 像。图16E显示16小时的图像。
图17A显示在ApoE-/-小鼠中PEG-SPION的血液药代动力学。图 17B显示ApoE-/-小鼠中DNA-SPION的血液药代动力学。图17C显示 i.v.注射后,PEG-SPION在不同器官中的生物分布。图17D显示i.v. 注射后,DNA-SPION在不同器官中的生物分布。图17E显示注射Cy5.5-PEG-SPION和Cy5.5-DNA-SPION的ApoE-/-小鼠的体内NIRF 成像。图17F显示从注射Cy5.5-PEG-SPION和Cy5.5-DNA-SPION的 ApoE-/-小鼠收集的器官的离体NIRF成像。
图18A显示通过用ICP-MS测量铁含量,在纳米颗粒注射后不同 时间点,具有晚期动脉粥样硬化病变的ApoE-/-小鼠的主动脉中 PEG-SPION的积累。图18B显示通过ICP-MS测量铁含量,在纳米颗 粒注射后不同时间点,具有晚期动脉粥样硬化病变的ApoE-/-小鼠的主动脉中DNA-SPION的积累。
图19A显示从正面和背面视角,注射Cy5.5标记的PEG-SPION 和DNA-SPION后0.5小时、2小时和24小时,具有早期动脉粥样硬 化病变的ApoE-/-小鼠的体内近红外荧光(NIRF)成像。图19B显示静脉 内注射Cy5.5标记的纳米颗粒后0.5小时、2小时和24小时,具有早 期动脉粥样硬化病变的ApoE-/-小鼠的不同器官的离体近红外荧光 (NIRF)成像。
图20A至20G显示ApoE-/-小鼠的心脏和主动脉中PEG-SPION和 DNA-SPION的细胞水平分布。图20A显示注射Cy5.5-PEG-SPION或 Cy5.5-DNA-SPION后0.5小时、2小时和24小时从ApoE-/-小鼠切除的 心脏和主动脉的离体近红外荧光(NIRF)成像。图20B显示从主动脉收集的内皮细胞的流式细胞术分析。图20C显示从主动脉收集的树突细 胞的流式细胞术分析。图20D显示从主动脉收集的总体巨噬细胞的流 式细胞术分析。图20E显示从主动脉收集的M2巨噬细胞的流式细胞 术分析。图20F显示从主动脉收集的M2巨噬细胞的代表性低细胞计 数直方图。图20G显示用Cy5.5-PEG-SPION和Cy5.5-DNA-SPION注 射ApoE-/-小鼠后0.5小时、2小时和24小时的主动脉根的免疫荧光图 像,其中将主动脉根部针对斑块巨噬细胞(绿色)和弹性膜(蓝色)染色。
图21显示用用于检测巨噬细胞的Cy3标记的抗CD68抗体染色 的,来自具有早期和晚期病变的ApoE-/-小鼠的主动脉根的共聚焦显微 镜图像。
图22A至22F显示注射Cy5.5-PEG-SPION或Cy5.5-DNA-SPION 后0.5小时、2小时和24小时,具有动脉粥样硬化斑块的ApoE-/-小鼠 中PEG-SPION和DNA-SPION的细胞水平分布。图22A显示肝脏中 Cy5.5阳性细胞的百分比。图22B显示肝脏中内皮细胞的代表性直方 图。图22C显示脾脏中Cy5.5阳性细胞的百分比。图22D显示脾脏中 总巨噬细胞的代表性直方图。图22E显示脾脏中树突细胞的代表性直 方图。图22F显示肺中Cy5.5阳性细胞的百分比。
图23A显示从PEG-SPION和DNA-SPION处理的ApoE-/-小鼠的 肝脏分离的细胞中PEG-SPION和DNA-SPION的细胞水平分布。图 23B显示从PEG-SPION和DNA-SPION处理的ApoE-/-小鼠的脾脏分离 的细胞中PEG-SPION和DNA-SPION的细胞水平分布。图23C显示 从PEG-SPION和DNA-SPION处理的ApoE-/-小鼠的肺中分离的细胞 中PEG-SPION和DNA-SPION的细胞水平分布。
图24A显示在静脉内注射后2小时和24小时,来自主动脉、肺、 肝脏和脾脏的不同细胞类型中PEG-SPION和DNA-SPION分布的流式 细胞术分析,显示为Cy5.5阳性细胞的百分比。图24B显示样品的结 果,显示为平均荧光强度。
图25显示用于流式细胞术分析来自ApoE-/-小鼠肝脏的单细胞悬 浮液的设门策略。
图26显示用于流式细胞术分析来自ApoE-/-小鼠脾脏的单细胞悬 浮液的设门策略。
图27显示用于流式细胞术分析来自ApoE-/-小鼠肺部的单细胞悬 浮液的设门策略。
图28显示用于流式细胞术分析来自ApoE-/-小鼠的主动脉细胞的 单细胞悬浮液的设门策略。
序列简述
SEQ ID NO:1显示与DNA-SPION相关的寡核苷酸的DNA序列。
SEQ ID NO:2显示与FITC-DNA-SPION相关的寡核苷酸的DNA 序列。
SEQ ID NO:3显示与Cy3-DNA-SPION相关的寡核苷酸的DNA 序列。
SEQ ID NO:4显示与Cy5.5-DNA-SPION相关的寡核苷酸的DNA 序列。
发明详述
本文提供了用于产生和使用具有纳米颗粒(NP)核心的球形核酸 (即DNA-NP)的材料和方法,所述DNA-NP可作为有效成像和治疗剂, 选择性地靶向患有或疑似患有动脉粥样硬化疾病的个体的动脉粥样硬 化病变。本申请的纳米颗粒在其表面上展示DNA寡核苷酸包被,并 且与没有DNA包被的NP相比,偏好性地在动脉粥样硬化斑块或病变 内积累。本申请的DNA-NP可以在不借助于转染剂的情况下快速进入 多种细胞类型。
本文还提供了用于产生和使用DNA-NP作为治疗性靶向剂的材料 和方法,用于将治疗剂靶向递送至患有或疑似患有动脉粥样硬化疾病 的患者的动脉粥样硬化病变。
在具体的实施方案中,本申请提供了用于将DNA-NP靶向存在于 血管中的动脉粥样硬化病变中的巨噬细胞的方法,其中本申请的 DNA-NP经由A类清道夫受体(SR-A)通过内吞作用快速被巨噬细胞摄 取。有利的是,本申请的DNA-NP在例如静脉内(i.v.)注射后以增强的 速率和量在动脉粥样硬化斑块中积累。
在优选的实施方案中,通过将DNA寡核苷酸与PEG-SPION上存 在的聚(乙二醇)(PEG)分子共价连接来制备DNA-SPION。PEG-SPION 是具有高度生物相容性,先前已用于体内应用,并且与DNA包被的 SPION相比,具有对SR-A的低结合亲和力。
本申请的PEG包被的SPION是通过按照回流方式在PEG二酸(在 两端带有羧基的PEG链)和作为螯合剂的油酰胺的存在下分解乙酰丙 酮铁(III)来制备的。超磁性性质和高饱和磁化使得PEG包被的SPION 成为有吸引力的T2加权磁共振成像(MRI)造影剂。因此,本文提供了 使用根据本申请PEG-SPION和DNA-SPION在T2加权的MRI成像中 作为MRI造影剂的方法。
根据本申请的方法,PEG-SPION的PEG链的一个羧基保持与氧 化铁纳米颗粒核心螯合,另一个羧基允许随后的化学修饰。根据本申 请方法的一种此类化学修饰是通过1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳 二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDS/NHS)化学过程将含酰胺的DNA寡核 苷酸与具有羧基端的PEG-SPION共价连接。
在一些实施方案中,本申请的DNA-SPION包含包被有聚乙二醇 (PEG)和油酰胺的超顺磁性核心以及与聚乙二醇链共价连接的胺修饰 的单链DNA寡核苷酸。
在优选的实施方案中,PEG链包含低至10个PEG单元至高达5000 个PEG单元。例如,PEG链可以包含约15个单元至约4900个单元; 约20个单元至约4800个单元;约25个单元至约4700个单元;约30 个单元至约4600个单元;约50个单元至约4500个单元;约100个单 元至约4200个单元;约150个单元至约4000个单元;约200个单元 至约3500个单元;约250个单元至约3300个单元;约300个单元至 约3000个单元;约350个单元至约2800个单元;约400个单元至约 2600个单元;约450个单元至约2400个单元;约500个单元至约2200 个单元;约550个单元至约2100个单元;约600个单元至约2000个 单元;约650个单元至约2100个单元;约700个单元至约2000个单 元;约750个单元至约1900个单元;约800个单元至约1800个单元; 约850个单元至约1700个单元;约900个单元至约1600个单元;约 950个单元至约1500个单元;约1000至约1400个单元;约1200至 约1300个单元。
在优选的实施方案中,与本申请的NP连接的寡核苷酸是单链寡 核苷酸。在其他实施方案中,与本申请的NP连接的寡核苷酸是双链 寡核苷酸。
在其他优选的实施方案中,寡核苷酸与NP的表面共价连接。可 以使用提供寡核苷酸共价连接的任何方法来实施本申请的方法,并且 此类方法包括在本申请的实践中。
在一些实施方案中,寡核苷酸通过5'连接与NP结合。在其他实 施方案中,寡核苷酸通过3'连接与NP结合。
在优选的实施方案中,共价连接是通过胺修饰的寡核苷酸连接于 PEG链的连接。在其他实施方案中,共价连接是通过寡核苷酸3'末端 的硫醇基团。
在一些实施方案中,通过与共价连接至NP的寡核苷酸杂交,将 一种或多种另外的寡核苷酸连接至DNA-NP。有利的是,可以根据本 申请的方法将更大和更复杂的DNA寡核苷酸连接到PEG-NP,以产生 具有特定临床干预和/或特定临床诊断方法所需性质的DNA-NP。
在一些实施方案中,寡核苷酸仅由胸苷核苷酸组成。在其他实施 方案中,寡核苷酸包含具有散布的非胸苷核苷酸的胸苷核苷酸的重复 序列。散布的非胸苷核苷酸可以是腺苷、鸟苷或胞嘧啶核苷酸或本领 域已知的任何种类的经修饰核苷酸。胸苷核苷酸的重复序列的长度范 围可以从低至约5个核苷酸至高达约200个核苷酸。
例如,包含胸苷核苷酸的寡核苷酸可以是约7个核苷酸至高达190 个核苷酸;约10个核苷酸至约180个核苷酸;约15个核苷酸至约170 个核苷酸;约20个核苷酸至约160个核苷酸;约30个核苷酸至约150 个核苷酸;约40个核苷酸至约140个核苷酸;约50个核苷酸至约130 个核苷酸;约55个核苷酸至约120个核苷酸;约60个核苷酸至约110 个核苷酸;约65个核苷酸至约100个核苷酸;约70个核苷酸至约75 个核苷酸。
在优选的实施方案中,寡核苷酸为约25至约100个核苷酸。在进 一步优选的实施方案中,寡核苷酸为约25至约75个核苷酸。在更优 选的实施方案中,寡核苷酸为约25至约50个核苷酸。在最优选的实 施方案中,寡核苷酸的长度为约30个核苷酸。在进一步优选的实施方 案中,DNA-NP的DNA寡核苷酸含有30个重复胸苷。有利的是,所 述含有30个胸苷的DNA-NP的特征在于,NP表面上的DNA加载量 高于相同长度但由其他类型核苷酸组成的DNA序列。
在一些实施方案中,包含散布的非胸苷核苷酸的寡核苷酸包含低 至约5个非胸苷核苷酸至高达约100个非胸苷核苷酸,其散布在由连 续胸苷核苷酸组成的重复序列之间。
例如,散布的非胸苷核苷酸可以是约7个核苷酸至约190个核苷 酸;约10个核苷酸至约180个核苷酸;约15个核苷酸至约170个核 苷酸;约20个核苷酸至约160个核苷酸;约30个核苷酸至约150个 核苷酸;约40个核苷酸至约140个核苷酸;约50个核苷酸至约130 个核苷酸;约55个核苷酸至约120个核苷酸;约60个核苷酸至约110 个核苷酸;约65个核苷酸至约100个核苷酸;约70个核苷酸至约75 个核苷酸。
在一些实施方案中,本申请的DNA-NP包含与寡核苷酸连接的荧 光标记分子。荧光标记物可以连接到寡核苷酸的5'端或3'端,这取决 于哪个末端与NP核心连接。例如,当寡核苷酸的5'端与NP核心或与 共价连接至NP核心的PEG分子共价连接时,荧光标记蛋白与寡核苷 酸的3'端连接。当寡核苷酸的3'端与NP核心或与共价连接至NP核心 的PEG分子共价连接时,荧光标记蛋白与寡核苷酸的5'端连接。
荧光标记物可以是本领域已知的任何荧光标记物。例如,荧光标 记物可以是6-FAM(荧光素)、Cy3TM、TAMRATM、JOE、Cy5TM、Cy5.5TM、 MAX、TETTM、羧基-X-罗丹明、TYETM 563、TYETM 665、TYE 705、 六氯荧光素、TEX 615、 ATTOTM488、ATTOTM532、ATTOTM550、ATTOTM565、 ATTOTMRho101、ATTOTM590、ATTOTM633、ATTOTM647、罗丹明绿TM -X、罗丹明红-X、5-TAMRATM、WEllRED D2、WellRED D3、WellRED D4、DY 750、BODIPY FL、EDANS 或IAEDANS。
在优选的实施方案中,荧光标记物是与寡核苷酸的5'端连接的荧 光素。在进一步优选的实施方案中,荧光标记物是与寡核苷酸的5'端 连接的Cy3。在其他优选的实施方案中,荧光标记物是与寡核苷酸的 5'端连接的Cy5.5。
裸NP核心的物理直径可以为低至10nm至高达200nm。例如, NP核心的尺寸可以为约12nm至约180nm;约15nm至约150nm;约 20nm至约125nm;约25nm至约100nm;约30nm至约75nm;约35nm 至约70nm;约40nm至约65nm;约45nm至约60nm;约50至约55nm。 在优选的实施方案中,NP的尺寸为约15nm至约20nm。在更优选的 实施方案中,NP的尺寸为约16nm。
PEG-NP的流体动力学直径可以为低至10nm至高达200nm。例如, PEG-NP的流体动力学直径可为约12nm至约180nm;约15nm至约 150nm;约20nm至约125nm;约25nm至约100nm;约30nm至约75nm; 约35nm至约70nm;约40nm至约65nm;约45nm至约60nm;约50 至约55nm。在优选的实施方案中,PEG-NP的流体动力学直径为约 40nm至约50nm。在更优选的实施方案中,PEG-NP的流体动力学直 径为约41nm。
本申请的PEG-NP的ζ电势可以为约-50mV至约-5mV;约-45mV 至约-10mV;约-40mV至约-12mV;约-30mV至约-13mV;约-25mV 至约-14mV;或约-20mV至约-15mV。在优选的实施方案中,PEG-NP 的ζ电势为-12mV。
DNA-NP的流体动力学直径可以为低至10nm至高达200nm。例 如,DNA-NP的流体动力学直径可以为约12nm至约180nm;约15nm 至约150nm;约20nm至约125nm;约25nm至约100nm;约30nm至 约75nm;约35nm至约70nm;约40nm至约65nm;约45nm至约60nm; 约50至约55nm。在优选的实施方案中,DNA-NP的流体动力学直径 为约50nm至约60nm。在更优选的实施方案中,DNA-NP的流体动力 学直径为约56nm。
有利的是,与缺乏寡核苷酸的类似NP(例如PEG-NP)相比,本申 请的DNA-NP在蛋白质溶液存在下的流体动力学直径增加不超过 40%。在优选的实施方案中,本申请的DNA-NP的流体动力学直径增 加高至约40%和低至约20%。在一些实施方案中,在蛋白质溶液的存在下,DNA-NP的流体动力学直径增加约38%至22%、约36%至约 24%、约34%至约26%、约32%至约28%。在更优选的实施方案中, 在蛋白质溶液的存在下,本申请的DNA-NP的流体动力学直径增加约 27%。
在本申请的多个实施方案中,PEG与NP核心的重量比大于5:1。 在优选的实施方案中,PEG与NP核心的重量比大于7:1。在最优选 的实施方案中,PEG与NP核心的重量比是9:1。
在本申请的多个实施方案中,每个NP的PEG分子的数量可以为 低至约5至高达约500。例如,每个NP的PEG分子的数量可以是每 个NP约7至约480个PEG分子;约10至约450个;约15至约400 个;约20至约380个;约25至约350个;约30至约300个;约35 至约280个;约40至约260个;约45至约240个核苷酸;约50至约 220个;约55至约200个;约60至约180个;约65至约160个;约 70至约140个;约75至约120个;约80至约100个核苷酸。
在优选的实施方案中,每个NP的PEG分子的数量为60至100。 在更优选的实施方案中,每个NP的PEG分子的数量为80至90。
在本申请的多个实施方案中,每个NP的DNA链的数量为低至20条链至高达100条链。
例如,每个NP的DNA链的数量可以为约22至约95;约25至 约90;约30至约85;约35至约80;约40至约75;约45至约70; 约50至约65。
在优选的实施方案中,每个NP的DNA链的数量为约55至约65。 在更优选的实施方案中,每个NP的DNA链的数量为约57至约63。 在最优选的实施方案中,每个NP的DNA链的数量为约为61。
在一些实施方案中,本申请的NP包含与荧光标记的PEG分子共 价连接的NP核心。
本申请还提供了通过使具有羧基端的PEG-NP与胺官能化的 FITC(荧光素尸胺)反应来荧光标记PEG-NP的方法。每个NP的FITC 标记的PEG分子的数量可以是每个NP低至约5至高达约500个FITC 标记的PEG分子。
例如,每个NP的FITC标记的PEG分子的数量可以为约7至约 450;约10至约400;约15至约350;约20至约300;约30至约250; 约40至约200;约50至约150;约55至约100;约60至约80。
在优选的实施方案中,每个NP的FITC标记的PEG分子的数量 为60至100。在进一步优选的实施方案中,每个NP的FITC标记的 PEG分子的数量为80至90。在最优选的实施方案中,每个NP的FITC 标记的PEG分子的数量为约85。
本申请的DNA-NP的ζ电势可以为约-100mV至约-5mV;约-90mV 至约-10mV;约-80mV至约-12mV;约-70mV至约-14mV;约-60mV 至约-15mV;约-50mV至约-17mV;约-40mV至约-20mV。在优选的 实施方案中,DNA-NP的ζ电势是-25mV。
本文还提供了用于产生DNA-SPION的方法。该方法包括通过在 二苯醚中的油酰胺和PEG的存在下热分解乙酰丙酮铁(Fe(aca)3)来合 成PEG-SPION的步骤,和通过EDC/NHS化学过程将胺修饰的DNA 寡核苷酸与PEG-SPION连接的步骤。可以根据本文提供的限定适于产 生DNA-SPION的任何方法用于产生本申请的DNA-SPION。
在一些实施方案中,本申请的DNA-SPION包含超顺磁性氧化铁 纳米颗粒核心、油酰胺、聚乙二醇链和胺修饰的DNA寡核苷酸,但 在核心和DNA寡核苷酸之间的层中不存在其他聚合结构。
本文还提供了本申请的DNA-NP(包括DNA-SPN和DNA-SPION) 在制备用于诊断患有或疑似患有动脉粥样硬化病变的个体中存在动脉 粥样硬化病变的产品(例如成像剂或试剂盒)中的用途。
本文还提供了使用本申请的DNA-NP作为成像剂的方法,用于对 患有或疑似患有动脉粥样硬化疾病的个体的动脉粥样硬化病变进行选 择性和灵敏性成像。有利的是,在系统性施用后,本申请的DNA-NP 在个体的动脉粥样硬化病变中快速积累。在优选的实施方案中,施用 途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、脑内、眼内、肾 内、肝内、动脉内、颈动脉内、腹股沟内、心脏内施用。
在一些实施方案中,本申请提供了包含本申请的DNA-NP和药物 赋形剂的组合物。在优选的实施方案中,静脉内注射本申请的组合物。 在进一步优选的实施方案中,诊断方法包括向需要诊断的个体施用包 含本申请的DNA-NP的组合物的步骤,和使用磁共振成像(MRI)获得 疑似含有动脉粥样硬化病变的个体身体区域的至少一个图像的步骤。 在进一步优选的实施方案中,在施用包含DNA-NP的组合物后约0.1 小时至100小时,进行使用MRI获取身体区域的至少一个图像的步骤。
例如,执行使用MRI获取身体区域的至少一个图像的步骤是在约 90小时至约0.2小时;约80小时至约0.3小时;约70小时至约0.5 小时;约60小时到约0.7小时;约50小时至约1小时;约40小时至 约1.2小时;约30小时至约1.5小时;约20小时至约2小时;约15 小时至约2.5小时;约20小时至约3小时;约18小时至约4小时; 约16小时至约5小时;约15小时至约6小时;约14小时至约7小时; 约12小时至约8小时;约10小时至约9小时。在优选的实施方案中, 在约0.2小时至约8小时获取至少一个MRI图像。在更优选的实施方 案中,在约0.4小时至约4小时获取至少一个MRI图像。在最优选的 实施方案中,在施用包含DNA-NP的组合物后约0.5小时至约2小时 获取至少一个MRI图像。
在本申请的一些实施方案中,使用DNA-NP作为成像剂的方法包 括向患有或疑似患有心血管疾病的个体施用。
在本申请的一些实施方案中,使用DNA-NP作为成像剂的方法包 括向患有或疑似患有脑动脉粥样硬化疾病的个体施用。
在其他实施方案中,使用DNA-NP作为显像剂的方法包括向患有 或疑似患有肾动脉粥样硬化疾病的个体施用。
本文还提供了本申请的DNA-NP(包括DNA-SPN和DNA-SPION) 在制备用于治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的用途。
本文还提供了用于产生和使用DNA-NP作为治疗靶向剂的材料和 方法,用于将治疗剂靶向递送至患有或疑似患有动脉粥样硬化疾病的 患者的动脉粥样硬化病变。
有利的是,本申请的DNA-NP选择性地定位于动脉粥样硬化斑块 病变并且被内化到动脉粥样硬化斑块病变中存在的巨噬细胞中。具体 而言,本申请的DNA-NP被内化到动脉粥样硬化斑块病变中存在的 M2巨噬细胞中。因此,本申请的DNA-NP是新型治疗靶向剂,以特 异性靶向动脉粥样硬化病变和动脉粥样硬化病变内的巨噬细胞(特别 是M2巨噬细胞)。因此,本申请提供了用于患有动脉粥样硬化疾病或 在任何器官系统的任何血管中具有动脉粥样硬化病变的个体的任何器 官系统的动脉粥样硬化的新疗法。
在一些实施方案中,本文提供了使用DNA-NP作为治疗靶向剂的 方法,用于将治疗剂靶向递送至患有或疑似患有心血管疾病的患者的 动脉粥样硬化病变。
在其他实施方案中,本文提供了使用DNA-NP作为治疗靶向剂的 方法,用于将治疗剂靶向递送至患有或疑似患有脑动脉粥样硬化疾病 的患者的动脉粥样硬化病变。
在另外的实施方案中,本文提供了使用DNA-NP作为治疗靶向剂 的方法,用于将治疗剂靶向递送至患有或疑似患有肾动脉粥样硬化疾 病的患者的动脉粥样硬化病变。
在优选的实施方案中,本申请的DNA-NP加载有治疗性分子或调 节动脉粥样硬化病变中存在的细胞中的基因表达的核酸。可以将本申 请的DNA-NP加载可用于治疗动脉粥样硬化疾病的任何治疗剂。
在一些实施方案中,本申请的DNA-NP加载有治疗剂,使得治疗 剂被含在NP核心内和/或与NP核心相关联。在其他实施方案中, DNA-NP加载有治疗剂,使得治疗剂存在于NP核心的表面和/或 DNA-NP的表面上。在其他实施方案中,DNA-NP加载有治疗剂,使 得治疗剂存在于DNA-NP中存在的PEG链上或与DNA-NP中存在的 PEG链相关联。在另外的实施方案中,DNA-NP加载有治疗剂,使得 治疗剂存在于DNA-NP表面上存在的寡核苷酸上和/或与DNA-NP表 面上存在的寡核苷酸相关联。
在本申请的DNA-NP中加载和/或DNA-NP上加载和/或与 DNA-NP相关联的试剂可以包括但不限于,抗炎分子(包括但不限于他 汀类、细胞因子、凝血酶抑制剂)、抑制性核酸(包括但不限于抗miR)、 免疫抑制剂、类固醇和/或前列腺素。例如,在DNA-NP中和/或DNA-NP 上加载的试剂可包括但不限于辛伐他汀、阿托伐他汀、白细胞介素 -10(IL-10)、水蛭肽、抗miR712、抗miR12、吡格列酮、双十二烷基 甲氨蝶呤、卡莫司汀,针对趋化因子受体2(CCR2)的siRNA、泼尼松 龙和/或前列环素。
在优选的实施方案中,使用DNA-NP作为治疗靶向剂用于将治疗 剂靶向递送至动脉粥样硬化病变的方法包括将治疗性分子递送至患有 或疑似患有动脉粥样硬化疾病的患者的动脉粥样硬化病变中的巨噬细 胞。
在更优选的实施方案中,使用DNA-NP用于靶向递送治疗剂的方 法包括将治疗性分子递送至患有或疑似患有动脉粥样硬化疾病的患者 的动脉粥样硬化病变中的M2巨噬细胞。已知M2巨噬细胞是参与抗 炎过程和组织修复的一个巨噬细胞亚群。
在最优选的实施方案中,使用DNA-NP用于靶向递送治疗剂的方 法包括通过DNA-NP与患有或怀疑患有动脉粥样硬化疾病的患者的动 脉粥样硬化病变中的M2巨噬细胞上的A类清道夫受体(SR-A)的相互 作用而将治疗分子递送至M2巨噬细胞。
有利的是,本申请的DNA-NP可以通过静脉内注射被施用并定位 于个体的血液循环系统中任何地方的动脉粥样硬化病变或斑块中存在 的巨噬细胞,从而允许将一种或数种治疗剂靶向递送至存在于个体的 血液循环系统中任何地方的动脉粥样硬化病变或斑块中的巨噬细胞和 /或其他细胞,和/或将一种或数种治疗剂递送至存在于个体的血液循环系统中任何地方的动脉粥样硬化病变或斑块中的细胞之间的细胞外空 间。
在一些实施方案中,本申请的DNA-NP包含与DNA-NP的NP核 心和/或PEG层和/或DNA层相关联的单一治疗剂。
在其他实施方案中,本申请的DNA-NP包含与DNA-NP的NP核 心和/或PEG层和/或DNA层相关联的多种治疗剂。
在另外的实施方案中,本申请的DNA-NP包含与DNA-NP的NP 核心相关联的至少一种治疗剂,与DNA-NP的PEG层的PEG分子相 关联的至少一种治疗剂,和/或与DNA-NP的DNA层的DNA寡核苷 酸相关联的至少一种治疗剂。
在一些实施方案中,至少一种治疗剂是相同治疗剂与NP核心和/ 或PEG层和/或DNA层相关联。
在一些实施方案中,至少一种治疗剂是与NP核心相关联的至少 一种治疗剂,与PEG层相关联的至少一种不同的治疗剂和/或与DNA 层相关联的至少一种不同的治疗剂。
在其他实施方案中,至少一种治疗剂可以与NP核心以及PEG层 相关联,或至少一种治疗剂可以与NP核心以及DNA层相关联,或至 少一种治疗剂可以与PEG层以及DNA层相关联。本文还提供了检查 和定量由SR-A受体介导的细胞摄取程度的方法。由于SR-A在存在于动脉粥样硬化病变或斑块中的巨噬细胞和泡沫细胞的摄取机制中的作 用,本申请提供了检测和定量SR-A介导的摄取的方法,以及检测或 筛选化合物抑制动脉粥样硬化病变或斑块中的巨噬细胞和泡沫细胞中 SR-A介导的摄取能力的方法。
在一些实施方案中,所提供的方法使用本申请的DNA-NP来检测 和定量体外细胞和体内动脉粥样硬化斑块相关的细胞中SR-A介导的 摄取。
在优选的实施方案中,该方法提供DNA-NP在体外与巨噬细胞一 起孵育和/或DNA-NP注射到动物体内,所述动物在其血液循环系统中 携带动脉粥样硬化斑块。在一些实施方案中,在施用DNA-NP之前, 将怀疑影响巨噬细胞和/或泡沫细胞中SR-A介导的摄取的化合物在体 外加入到细胞或注射到动物体内。有利的是,与未接受化合物的体外 细胞或动物体内相比,在相应化合物存在的情况下,体外细胞或动物 体内DNA-NP摄取的定量允许测定和定量相应化合物对SR-A介导的 体外细胞或动物体内摄取的影响。
然后可以将此类抑制SR-A介导的体外细胞摄取或动物体内摄取 的化合物用于阻止巨噬细胞和/或泡沫细胞通过SR-A受体摄取物质, 并可以帮助减少巨噬细胞和/或泡沫细胞在动脉粥样硬化斑块内的生 长和发育。
此外,可以将此类增强SR-A介导的体外细胞摄取或动物体内摄 取的化合物与本申请的DNA-NP结合使用,或者可以用于在动脉粥样 硬化病变或斑块中靶向巨噬细胞和/或泡沫细胞的其他治疗化合物的 情境中,以抑制动脉粥样硬化病变或斑块中巨噬细胞存活和/或巨噬细 胞增殖和/或巨噬细胞转化为泡沫细胞,和/或可以用于有助于稳定动脉 粥样硬化病变或斑块和/或抑制存在于动脉粥样硬化病变或斑块中的 巨噬细胞和/或泡沫细胞中的炎性信号传导的治疗性化合物的情境下, 以防止斑块破裂和通常与动脉粥样硬化病变或斑块破裂相关的血管阻 塞。
材料与方法
寡核苷酸的合成
在Oligo-800寡核苷酸合成仪(Azco Biotech)上,利用标准固相合成法 和试剂(Azco Biotech和Glen Research),合成DNA。所有DNA均使用配 备Microsob C18柱的Agilent 1260Inifinity Quaternary LC系统(Agilent Technologies)进行纯化。表S1包含DNA-SPION缀合物及其相关寡核苷 酸序列的详细序列信息。
表S1
PEG-SPION和DNA-SPION的合成
具有官能化羧基的PEG包被的SPION(PEG-SPION)是通过在二苯醚 中油酰胺和聚(乙二醇)二酸2000(HOOC-PEG2000-COOH)的存在下热分 解乙酰丙酮铁(Fe(acac)3)合成的(43),并随后纯化和冻干。 HOOC-PEG2000-COOH是根据文献(44)合成。通过EDC/NHS化学法将 胺修饰的DNA寡核苷酸连接至PEG-SPION。通常,将5mg PEG-SPION 溶于0.5mL DMSO,并利用20μmol DCC和NHS活化2h,然后加入6 nmol胺修饰的DNA至混合物中,振荡过夜。通过离心过滤器(MWCO: 50000),将DNA包被的SPION(DNA-SPION)对超纯水(nanopure water) 透析3次,并重悬于超纯水中。通过透射电子显微镜(TEM)利用TecnaiTM Spirit电子显微镜(FEI)检测纳米颗粒的大小和形态。
磁化强度曲线
通过振动样品磁强计(VSM,Lakeshore VSM 7400),在室温下测量冻 干的PEG包被的SPION(PEG-SPION)粉末的磁特性。测量了-6,000Oe 至6,000Oe的一系列施加场的磁化强度。
DNA-SPION相关的寡核苷酸序列
对于ICP-MS和TEM研究,通过EDC/NHS化学法,将具有氨基端 的DNA寡核苷酸链连接至表面包含具有羧基端的聚(乙二醇)链的SPION (核心尺寸为16nm)。
对于共聚焦免疫荧光研究,使用与ICP-MS和TEM研究相同的方案, 区别在于使用双官能化DNA寡核苷酸,其在3’端包含用于缀合至SPION 的羧基化的PEG壳的氨基,以及在5’端包含FITC(荧光素异硫氰酸酯) 或Cy3(青色素3)部分。
对于体内NIRF成像,使用与共聚焦免疫荧光研究相同的方案,区别 在于以在3’端包含氨基且在5’端包含Cy5.5部分的双官能化DNA寡 核苷酸替代上述双官能化DNA寡核苷酸。
细胞培养和纳米颗粒处理
在3个细胞系中进行PEG-SPION和DNA-SPION的细胞摄取: AML-12(小鼠肝细胞)、C166(小鼠内皮细胞)、MOVAS(小鼠平滑肌细 胞)、RAW 264.7(小鼠巨噬细胞)和原代骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)以及 骨髓来源的树突细胞(BMDC),将细胞于ATCC描述的培养基和补充物 中,在37℃和5%CO2下进行培养。为了通过ICP-MS测量细胞摄取程 度,根据细胞大小和生长速率不同,以合适的群体(104-105)将细胞首先接 种于24孔板中。用2.5nM或5nMPEG-SPION和DNA-SPION与细胞孵 育24h。然后去除纳米颗粒。用PBS冲洗细胞,并进行胰蛋白酶处理或 者用移液管吹下,通过使用血细胞计数器计数来测定细胞数目。将细胞 以8000rpm离心5min以形成细胞团,用于通过ICP-MS定量或TEM成 像。两种SPION的摄取动力学均在RAW 264.7细胞中进行,采用上述相 同的方案,以5nM在每个孔中孵育细胞,并在不同的时间点收获用于 ICP-MS分析。
ICP-MS
将细胞团在0.3mL浓缩的微量金属HNO3中室温下消化过夜。加入 5μL 5ppm铟(内标)和10mL 2%HNO3溶液后,在减去未处理细胞的背 景Fe含量后,通过ICP-MS测量所得溶液中的Fe含量。除非另有提及, 报告值表示来自3个独立实验的平均值的均值±标准误。
TEM
将细胞团首先悬浮于0.3mL PB溶液中,并通过4000rpm离心10min 再次成团。室温下将细胞在2.5%戊二醛中固定2h,用2%OsO4染色, 然后在H2O中冲洗3次。用乙醇和氧化丙烯逐步脱水后,将细胞团包埋 于Epon 812树脂(Electron Microscopy Sciences)中。我们在200目铜网 (Electron Microscopy Sciences)上沉积70nm厚度的切片,并用4%乙酸铀酰(SPI Supplies)和Renylds柠檬酸铅染色,用于在H7700透射电子显微镜 (Hitachi)下,采用80kV的射柱电压进行成像。
细胞毒性研究
为了评估PEG-SPION和DNA-SPION的细胞毒性,在实验前24小 时,将4种类型的细胞(AML-12、C166、MOVAS和RAW 264.7)以合适 的细胞密度(例如以每孔105个细胞的密度)接种于96孔板上。在一系列 最终Fe浓度范围上(1-500μg/mL),将PEG-SPION或DNA-SPION与细 胞孵育24h。之后,将细胞用1x PBS洗涤3次,并在5%CO2孵育器中, 于37℃,在MTT试剂(Cayman Chemical)中孵育4h。去除培养基后,将 100μL酸化异丙醇(0.04M HCl配制于纯异丙醇中)加入至每个孔中,轻轻 振荡以将暗紫色晶体完全溶解。使用MultiskanTMGO微孔板分光光度计 (Thermo Scientific)记录570nm处每个孔的吸光度。在相对于未处理细胞 的信号进行标准化后,可以比较两种纳米颗粒的相对细胞毒性。报告的 数据表示来自6个独立实验的均值±标准差。
共聚焦显微镜和免疫荧光
在染色前24h,将细胞以每孔5×105个细胞接种于24孔板(SPL Life Sciences)中的直径12mm的载玻片(Marienfeld Superior)上,并与2.5nM 或5nM的FITC-PEG-SPION或FITC-DNA-SPION孵育不同的时间点。 用PBS冲洗细胞,于配制于PBS中的4%多聚甲醛(PFA)以及1%Triton X-100(Sigma-Aldrich)固定15min。4℃下,以5μg/mL浓度的一抗(配制 于PBS的1%BSA)对细胞染色过夜。用配制于PBS中的0.05%Tween-20 冲洗后,在室温下,以1μg/mL浓度的荧光标记的二抗(配制于PBS中的1%BSA)对细胞染色1h。
对于MSR-1表达的检测,所使用的一抗为大鼠抗小鼠CD204(AbD Serotec;MCA1322GA),二抗为488标记的山羊抗小鼠IgG二抗(Thermo Fisher Scientific;R37120)。利用DAPI复染细胞,并采用Nikon C1si激光 扫描共聚焦显微镜成像。DAPI的激发波长为405nm,对应的发射滤光片 为480/25nm。FITC的激发波长为488nm,对应的发射滤光片为500-530 nm。
对于基因敲低效率的测定,所使用的一抗包括针对以下的抗体: MSR1(大鼠抗小鼠CD204抗体,AbD Serotec;MCA1322GA)、CAV1(小窝 蛋白-1兔mAb,Cell Signaling;D46G3)和FLOT1(flotillin-1兔mAb,Abcam; ab41927)。二抗包括青色素5标记的山羊抗大鼠IgG二抗(Thermo Fisher Scientific;A10525)和青色素5标记的山羊抗兔IgG二抗(Thermo Fisher Scientific;A10523)。用DAPI复染细胞,并采用Olympus共聚焦显微镜(FV1000IX81-TIRF)成像。DAPI的激发波长为405nm,对应的发射滤光 片为440-500nm。Cy5的激发波长为635nm,对应的发射滤光片为 650-750nm。
用配备有光谱成像探测器的Nikon C1si激光扫描共聚焦显微镜 (Nikon,Japan)对细胞成像。激发波长为488nm,对应的发射滤光片为 495-540nm。为了追踪SPION与细胞蛋白的共定位,在将细胞与 FITC-DNA-SPION孵育不同的时间后,将细胞洗涤、固定,并利用1% Triton-100渗透10min。在用配制于PBS中的2%BSA封闭后,在4℃ 下、以5μg/mL(配制于PBS中的1%BSA)浓度的针对目的蛋白标志物的 一抗对细胞染色过夜。在用配制于PBS中的0.05%Tween-20冲洗后,在 室温下以1μg/mL(配制于PBS中的1%BSA)浓度的Cy3标记的二抗[Life Technologies,Cy3山羊抗兔IgG(H+L)]对细胞染色1h。使用Olympus共 聚焦显微镜(FV1000IX81-TIRF)对细胞成像。二抗的激发波长为543nm, 对应的发射滤光片为550-630nm。一抗包括兔抗Rab5(Abcam ab18211)、 兔抗Rab 9(Santa Cruz Biotechnology FL-201)和兔抗LAMP1(Abcam ab 24170)。为了标记MSR1,将细胞洗涤、固定并渗透,将细胞与作为一抗 的大鼠抗小鼠CD204(AbD Serotec,MCA1322GA)孵育,然后使用AlexaFluor 488标记的二抗(Life Technologies,AlexaFluor 488山羊抗大鼠 IgG(H+L))进行染色。利用Nikon C1si激光扫描共聚焦显微镜对细胞成 像。
通过共聚焦显微镜检测细胞摄取
将细胞接种于24孔板(SPL Life Sciences)中的12mm直径的载玻片 (MarienfeldSuperior)上,将0.3mL FITC标记的PEG-SPION或 DNA-SPION(5nM,配制于含血清的DMEM中)与RAW 264.7细胞孵育 不同时间。用PBS冲洗细胞,在配制于PBS中的4%多聚甲醛(PFA)中固 定15min,并使用Nikon C1si激光扫描共聚焦显微镜成像。FITC的激发 波长为488nm,对应的发射滤光片为500-530nm。在另一个实验中,以 FITC标记的SPION将RAW 264.7细胞处理不同时间,然后进行胰蛋白 酶消化、离心以形成细胞团,并通过使用UV透照器(GeneDireX)成像。
药物抑制剂的细胞毒性
在实验前24h,将RAW 264.7细胞以每孔105个细胞的密度接种于 96孔板。将化学封闭剂或封闭抗体与细胞在含血清DMEM中孵育24h, 使用的浓度与药物抑制实验中相同。在去除培养基和冲洗细胞后,根据 厂商说明书,使用alamarBlue试剂(Invitrogen)检测细胞活力,通过测量 570nm和600nm处的光学吸光度。报告的数据表示来自6个独立实验的 均值±标准差。
化学试剂和抗体封闭研究
在24孔板中,每孔使用包含不同浓度的化学封闭剂和两种抗体的300 μL OptiMEM将细胞预处理1h。我们向每个孔中加入包含75nM DNA-SPION的280μL补充有10%胎牛血清的DMEM,并将细胞再孵育 4h。为了检测封闭程度,将细胞离心沉淀并消化,以用于ICP-MS分析。
siRNA转染
在转染前12h,将RAW264.7细胞接种于24孔板中。使用200nM 的杂乱(scrambled)siRNA对照(ON-TARGETplus Non-targeting, Dharmacon)、MSR1siRNA(ON-TARGETplusMsr1siRNA-SMARTpool, Dharmacon)和CAV1siRNA(ON-TARGETplus Msr1siRNA-SMARTpool,Dharmacon),采用2000转染试剂(Thermofisher Scientific), 根据厂商提供的标准方案转染细胞。24h后,将细胞进行无血清处理24h, 然后以5.0nM PEG-SPION处理4h。在转染后两天,收获细胞,离心沉 淀并消化,以用于ICP-MS分析。
用于基因敲低分析的Western印迹
在转染前12h,将RAW 264.7细胞接种于6孔板。将细胞用冰冷TBS 缓冲液洗涤3次,并用0.1mL包含1×蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷RIPA 缓冲液(Thermo Scientific)制备匀浆。通过12,000×g离心15min来澄清 匀浆,并保留上清液作为蛋白裂解物。通过PierceBCA蛋白测定试剂盒 对总蛋白量定量。将具有相同量的总蛋白的裂解物转移至0.5mL微量离 心管,用包含10%巯基乙醇(Sigma-Aldrich)的4×Laemmi样本缓冲液 (Bio-Rad)稀释。煮沸5min后,通过10-15%预制聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad) 对具有等量总蛋白的样本进行分离。然后将完整的凝胶转移至聚偏二氟 乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad),并用配制于TBST缓冲液中的5%脱脂奶(用于 MSR1和β-肌动蛋白)或5%BSA(用于CAV1)封闭1h。用在包含5%脱脂 奶的TBST中稀释的一抗处理蛋白,一抗包括针对MSR1(1:500)(大鼠抗 小鼠CD204抗体,AbD Serotec)、CAV1(1:1000)(小窝蛋白-1兔mAb,Cell Signaling)、β-肌动蛋白抗体(1:1000)(ab8227,Abcam),随后用兔抗大鼠IgG H&L(HRP)(1:1000)(ab6734,Abcam)和山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1:1000) (Bio-Rad)处理。然后用ClarityTMWestern ECL Substrate(Bio-Rad)处理膜, 并使用ChemiDoc Touch成像系统(Bio-Rad)对蛋白成像。
动物实验-小鼠
以高脂膳食(致动脉粥样硬化的膳食,MP Biomedicals)将6-8周龄的 ApoE–/–小鼠饲喂6周或12周,以分别诱导早期和晚期动脉粥样硬化病变。 在膳食期后,小鼠经静脉注射接受5mg Fe/kg剂量的PEG-SPION和DNA-SPION,PEG-SPION和DNA-SPION在需要时(用于心脏和主动脉 的NIRF成像、免疫组织化学、流式细胞术分析)以荧光染料(Cy5.5)标记。 在设定的注射后时间点,将小鼠首先麻醉并通过颈脱位法处死。
小鼠中的药代动力学和生物分布
为了测定血液清除参数,通过心脏穿刺抽取血液,并存储于EDTA 包被的管(Becton Dickinson)中。1,500×g离心10min后,收集上清液中 的200μL血浆,在0.5mL65%HNO3中裂解。对于SPION的生物分布研 究,去除包括脑、心脏(下半部)、主动脉、肺、肝、脾和肾在内的不同器 官,切成小块,并在0.5mL 65%HNO3中氧化,直至其完全溶解。将血液和器官样本稀释于2%HNO3溶液中,用0.2μm亲水性注射器式滤器过 滤,然后通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)(Perkin Elmer)进行 Fe含量分析。将来自未注射的ApoE-/-小鼠的血液和组织用于计算背景 Fe含量。报告的值表示为每克组织的ID百分比。误差条指示每个小鼠组 (n=3)中的1个SD。通过单指数和双指数衰减模型,使用PrismGraphpad 6软件拟合血液清除数据。将从相关系数r2推断而来的最佳拟合模型用于 报告。
小鼠的体内和离体近红外荧光成像
具有早期和晚期动脉粥样硬化病变的ApoE-/-小鼠均经尾静脉注射接 受5mg Fe/kg体重的剂量的Cy5.5-PEG-SPION和Cy5.5-DNA-SPION。在 注射后2h和24h,通过腹腔注射氯胺酮与赛拉嗪的组合来诱导麻醉。为 了获取体内NIRF成像,使用Bruker体内Xtreme成像系统(Bruker),采 用675nm激发和720nm发射滤光片收集信号。然后将小鼠处死并灌注PBS。使用相同的仪器对主动脉、心脏、肝、脾、胰腺和肾成像。将光子 计数用于定量来自每个组织的荧光强度,且其通过颜色编码的比例尺反 映。
小鼠主动脉根的免疫组织化学
从注射Cy5.5标记的纳米颗粒的小鼠,采集了几个心脏上部样本。 将样本冷冻于Shandon Cryomatrix冷冻包埋介质(Thermo Fisher Scientific) 中,并切成10μm厚的切片。在染色前,将其在4%多聚甲醛中固定10min。 在用SEA BLOCK封闭缓冲液(ThermoFisher Scientific)封闭后,将主动脉 根切片用针对CD68的小鼠单克隆[ED1](Abcam,ab31630)染色。在孵育 2h和PBS洗涤后,加入Alexa Fluor 532缀合山羊抗小鼠IgG(H+L)交叉 吸附二抗(Thermo Fisher Scientific,A-11002),并孵育1h。使用Olympus 共聚焦显微镜(FV1000IX81-TIRF)获取成像。
流式细胞术
具有晚期动脉粥样硬化病变的ApoE-/-小鼠经尾静脉注射接受5mg Fe/kg体重剂量的Cy5.5-PEG-SPION和Cy5.5-DNA-SPION。在注射后2h 和24h杀死小鼠(对于每种纳米颗粒,每个时间点N=3或4)。用含有肝 素(100U/mL)的磷酸盐缓冲盐水灌注主动脉,从动脉外膜和血管周脂肪组 织切开,并在37℃下,在轻轻振荡下,使用包含胶原酶I(450U/ml)、胶 原酶XI(125U/ml)、DNase I(60U/ml)和透明质酸酶(60U/ml)的酶混合物 (Worthington)离解1小时。将肝和肺首先切成小块,并类似处理。将消化 组织切碎并过滤(70μm),以得到单细胞悬液(45)。将脾磨碎并过滤(70 μm),以得到单细胞悬液,室温下用RBC裂解缓冲液处理10min并离心。 将细胞团重悬于FACS缓冲液(PBS、5mM EDTA和1%FBS)中,以用于 免疫染色和随后的流式细胞术分析。对于肺、肝和主动脉染色,Fc-封闭 (BioLegend.货号101320)后使用的抗体包括以下3组染色:(1)CD31 (BioLegend,MEC13.3,货号102514),(2)F4/80(Invitrogen,BM8,货号 MF48020)和CD301(Bio-Rad,ER-MP23,货号MCA2392A647),(3)II类MHC(BioLegend,M5/114.15.2,货号107616)和CD11c(BioLegend,N418, 货号117327)。用于脾细胞染色的抗体包括以下两组染色:(1)F4/80 (Invitrogen,BM8,货号MF48020)和CD301(Bio-Rad,ER-MP23,货号 MCA2392A647),(2)II类MHC(BioLegend,M5/114.15.2,货号107616) 和CD11c(BioLegend,N418,货号117327)。将样本固定于FluoroFix缓冲 液(Biolegend)中,并在分析前存储于4℃。使用流式细胞仪(BD Biosciences Diva)检测荧光,并使用FlowJO软件(Tree Star)分析数据。来自主动脉、 肝和肺的内皮细胞鉴定为CD31+细胞,来自所有器官的树突细胞鉴定为 MCHII+和CD11c+细胞,巨噬细胞鉴定为F4/80+细胞,M2细胞鉴定为 F4/80+和CD301+细胞。
在不与本说明书的明确教导不一致的前提下,本文中提及或引用的 所有专利、专利申请、临时申请和出版物均通过援引方式整体并入本文 中,包括所有图片和表格。
以下为说明实施本申请的方案的实施例。这些实施例不应解释为限 制性的。所有百分数均为根据重量的,并且所有溶剂混合物比例均为根 据体积的,除非另有说明。
实施例
实施例1—PEG-SPION和DNA-SPION的表征
尽管具有SPION核心的球状核酸的核心物质不影响其生物学特性, 但是在将SPION用作体内递送媒介或成像剂时,其生物相容性仍然引起 很大的关注。由于氧化铁纳米颗粒熟知的生物相容性和作为MRI造影剂 的优越性能,将氧化铁纳米颗粒选作模型材料。图1A显示了荧光标记的 DNA包被的SPION(DNA-SPION)的组分,其由SPION核心、致密聚(乙 二醇)(PEG)层和最外层中的DNA缀合组成,其中DNA缀合于荧光分子。 在DNA缀合前,在PEG二酸和作为螯合剂油酰胺的存在下,从乙酰丙 酮化铁(III)的高温分解合成PEG包被的SPION(PEG-SPION)(图1B,左 图)。通过EDC/NHS化学法,利用配制于DMSO中的催化剂介导的羧酸 与氨基的交联,将具有氨基端的单链DNA寡核苷酸(ssDNA-NH2)共价缀 合至在远端携带羧基的PEG链包被的SPION核心(HOOC-PEG-SPION) 的表面(图1B,右图)。将荧光标签加入DNA寡核苷酸(图1A)。对于体 外和体内研究,DNA-SPION的组成性DNA寡核苷酸包含30个重复胸苷。 选择该序列是因为相比由其他类型的核苷酸组成的相同长度的DNA序 列,其具有向纳米颗粒表面的更高的DNA装载。然而,可以将其他类型 核苷酸的重复或非重复序列用于DNA-SPION。本申请的DNA-SPION能 够进入动脉粥样硬化斑块,并与动脉粥样硬化斑块中存在的细胞(如内皮 细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞)上的A类清道夫受体(SR-A)相互作用(图 1C)。
动态光散射(DLS)测量揭示,所合成的PEG-SPION的平均流体动力 学直径和ζ电位分别为40.9nm和-12.1mV(图2A)。PEG-SPION在含血 清的细胞培养基中是稳定的。在包含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中 37℃孵育24h后,PEG-SPION的流体动力学直径增加至60.6nm,这一 条件是模拟体内环境(图2A)。通过TEM成像,PEG-SPION和DNA-SPION 的Fe3O4核心的直径测定为~16nm(图2B),这小于磁性氧化铁的“临界尺 寸”(46);因而,PEG-SPION和DNA-SPION显示超顺磁特性。
由于表面的DNA层,相比PEG-SPION,DNA-SPION显示更多的负 ζ电位、更大的流体动力学尺寸和更高的电泳移动性(图2A和2D)。 DNA-SPION的DLS测量显示平均流体动力学直径和ζ电位分别为55.8 nm和-25.2mV(图2A)。DNA-SPION的TEM成像表明,DNA-SPION的SPION核心的大小和形态类似于PEG-SPION的大小和形态(图2B)。在包 含10%FBS的DMEM中37℃孵育24小时后,DNA-SPION达到了74.7 nm的平均流体动力学直径;比其在血清孵育前的直径增大20nm,这与 PEG-SPION数据一致(图2A)。DNA-SPION相比PEG-SPION的更高的电泳移动性证明了带负电荷的DNA寡核苷酸的结合(图2D)。由于有机PEG 包被层的存在,通过TEM成像揭示的物理直径通常比通过DLS测得的 流体动力学直径要小一些。PEG-SPION和DNA-SPION的数据证明二者 均是稳定的,流体动力学尺寸增加仅~20nm,这被认为是由于对DMEM 中存在的胎牛血清蛋白(“蛋白冠(corona)”)的吸收(47)。
通过振动样品磁强计(VSM)研究了SPION的磁特性。检测到 PEG-SPION的剩磁接近零,且发现其饱和磁化(Ms)值为55emu/(氧化铁 克数),其对应于76emu/(Fe克数)(图2C)。所合成的PEG-SPION的超顺 磁特性和高磁化使得其成为有吸引力的T2加权的磁共振成像(MRI)造影 剂,导致磁场的局部和总体扰动并产生阴性MRI信号对比(48)。
由于DNA装载密度是调节DNA-SPION的细胞摄取效率的关键参数 (49),通过测量FITC缀合的DNA的荧光强度,对每个纳米颗粒的DNA 序列数进行了定量。为了达到这一目的,具有羧基端的PEG-SPION与在 一端包含氨基且在另一端包含荧光素异硫氰酸酯(FITC)分子的双官能化 DNA-寡核苷酸反应,以形成FITC标记的DNA-SPION(图3A和表S1)。 在EDC/NHS偶联反应之前和之后,通过测量反应混合物中FITC标记的 DNA链的浓度,测定了DNA装载。DNA-SPION的平均DNA装载达到 ~61条DNA链/PEG-SPION(图3B)。类似地,通过将具有羧基端的 PEG-SPION与氨基官能化的FITC(荧光素尸胺)反应,对PEG-SPION进 行荧光标记。PEG-SPION对氨基官能化的FITC的反应性定量为~85FITC 标记的PEG分子/纳米颗粒(图3B)。尽管DNA的覆盖率小于例如类似大 小(50)的基于AuNP的SNA和通过“链接反应(clickreaction)”制备的其他 基于SPION的SNA(51),但是本申请所合成的DNA-SPION已显示,使用这种便捷和经济的合成方法,能实现显著更高的细胞摄取效率。荧光 图标记的SPION被用于体外和体内的验证性摄取和分布研究。由于在 FITC标记后,在PEG和DNA上均未观察到SPION的细胞摄取的显著差 异(图3B),荧光SPION被认为具有与非荧光SPION相同的胞内行为。
实施例2—不同细胞类型上的SR-A表达和DNA-SPION的细胞摄取
如图1B中所示的,动脉粥样硬化斑块中的主要细胞类型为单核细胞 /巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞(40,52)。为了探测DNA-SPION与代 表动脉粥样硬化斑块中存在的细胞的不同类型细胞的相互作用,体外研 究了4种模型细胞类型中纳米颗粒的摄取,包括小鼠内皮细胞(C166)、小 鼠平滑肌细胞(MOVAS)和小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)。由于已知纳米颗粒 能够在单核吞噬细胞系统(MPS)的器官(包括肝和脾(55))中积累,还纳入 了小鼠肝细胞(AML-12)用于比较。在进行细胞摄取研究之前,通过MTT 测定测试了PEG-SPION和DNA-SPION对4种类型细胞的细胞毒性。在 该MTT测定中,将PEG-SPION和DNA-SPION与细胞孵育24小时(图 4)。在细胞摄取研究使用的浓度下(50-100μg/mL Fe3O4,等同于2.5-5.0nMSPION),未观察到PEG-SPION或DNA-SPION具有明显的细胞毒性(图 4A和4B)。
对于摄取研究,通过免疫荧光染色对不同细胞上SR-A受体的表达进 行了定量。利用DAPI的细胞核染色,SR-A受体显示为绿色信号(图5A)。 结果表明:巨噬细胞上存在大量的SR-A表达,这可通过RAW 264.7中 的饱满绿色信号证明,而其他3个细胞系(AML-12、C166和MOVAS)则 显示可忽略不计的绿色,表明SR-A可检测到但表达很低。该差异在 Western印迹分析中也可显示(图5B),表明相比其他3种细胞类型, RAW264.7中SR-A受体的表达丰富。然后将细胞系与2.5nM(图5C)或5 nM SPION(图5D)孵育4小时,并通过ICP-MS对SPION与细胞的结合 进行定量。在这些研究中还纳入了两种原代细胞类型。从ApoE-/-小鼠分 离了骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和骨髓来源的树突细胞(BMDC),其均 表达高水平的SR-A(图5F)。将原代BMDM和BMDC细胞与5nM SPION 孵育4小时。将细胞与作为对照的等摩尔的PEG-SPION孵育。24小时后, 收集细胞并裂解,以用于铁含量的ICP-MS定量。
在分别与2.5nM和5nM孵育4小时后,DNA-SPION与每个RAW 264.7细胞的总结合达到0.6pg,比PEG-SPION的结合高3倍(0.2pg/细 胞)(图5C和5D)。在2.5nM SPION下,PEG-SPION和DNA-SPION在 不能结合AML-12和C166细胞的方面未显示明显差异(图5C)。即使在5nM SPION下,C166细胞在PEG-SPION和DNA-SPION之间未显示明显 差异(0.2pg/细胞相对于0.3pg/细胞,图5D)。这些数据与AML-12和C166 细胞未显示SR-A高表达水平的观察结果一致(图5B)。对于MOVAS细胞, 2.5nM和5nM下PEG-SPION和DNA-SPION的细胞结合分别达到~0.2 pg/细胞和~0.5pg/细胞(图5C和5D),尽管免疫荧光和Western印迹数据 显示仅存在有限表达的SR-A(图5A和5B)。MOVAS细胞具有细长的形 状和达100μm的边长,且显著大于RAW 264.7细胞,RAW 264.7细胞为 圆形且直径为约10μm(参见,例如,美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC)网站)。考虑到形状和尺寸,两种SPION类型与MOVAS细胞的真实细胞结合大致接近C166内皮细胞中观察到的水 平,即,对于两种SPION类型为~0.2-0.3pg/细胞。在与DNA-SPION和 PEG-SPION孵育4小时后的所有细胞类型的细胞团的图片中, DNA-SPION处理的RAW 264.7细胞显示出最深的褐色(图5E)。
相比PEG-SPION,原代BMDM和BMDC细胞与DNA-SPION的结 合表现出几乎两倍的偏好性,PEG-SPION达到~1.2pg/细胞,DNA-SPION 达到~2.2pg/细胞(图5G)。
使用TEM成像证实了RAW 264.7细胞中DNA-SPION的选择性结 合。与ICP-MS数据一致,相比PEG-SPION(图5H),DNA-SPION更多 地进入RAW 264.7细胞(图5I),其中相比PEG-SPION,更多数目的 DNA-SPION占据胞内介质。总之,这些数据表明:相比PEG-SPION, DNA-SPION在体外更为选择性地进入巨噬细胞,这使得DNA-SPION适 合用作动脉粥样硬化斑块的成像剂和药物载体。
实施例3—RAW 264.7细胞中PEG-SPION和DNA-SPION的细胞摄取动力学
通过ICP-MS测量孵育不同时间后的铁含量,研究了两种类型的纳米 颗粒的时间进程摄取。在摄取的前8小时期间,相比PEG-SPION, DNA-SPION与RAW 264.7细胞结合更为迅速(图6A)。例如,孵育后4 小时,DNA-SPION处理的细胞的铁含量比PEG-SPION处理的细胞的铁 含量高5倍(0.89pg/细胞相对于0.17pg/细胞),证明RAW 264.7巨噬细胞 对DNA-SPION的选择性摄取超过PEG-SPION,如图5C和5D中所示。 DNA-SPION的细胞结合显示8小时和16小时间的铁含量增加很少,这 一观察可能与RAW 264.7细胞的倍增时间有关,标准平板建立为~12小 时(56,57)。
普鲁士蓝染色(普鲁士蓝将内容铁转换为蓝色信号,并因而能够检测 细胞内SPION核心的存在)显示SPION孵育后4小时和16小时,铁含量 存在巨大差异,相较于与DNA-SPION孵育的强蓝色染色细胞,与 PEG-SPION孵育的细胞几乎无颜色(图7A)。观察到的差异持续达16小 时,这与ICP-MS数据一致。
因为ICP-MS仅测量胞内铁含量(由于具有Fe3O4核心的纳米球的进 入)而不能提供关于在纳米颗粒进入细胞内后纳米颗粒表面上的DNA序 列的信息,使用免疫荧光对PEG-SPION和DNA-SPION的细胞摄取动力 学进行了监测。为了追踪DNA寡核苷酸,制备了FITC标记的 DNA-SPION,与上述用于定量DNA装载的那些相同。为了追踪 PEG-SPION,使用EDC/NHS化学法将氨基官能化的FITC偶联至具有羧 基端的PEG-SPION,以形成FITC标记的PEG-SPION,每个FITC标记 的PEG-SPION携带~85FITC分子(图3B)。通过ICP-MS分析,证实了相比无荧光对应SPION,FITC分子与PEG-SPION和DNA-SPION共价结 合不会大幅影响其结合RAW 264.7细胞的能力(图3B)。使用共聚焦显微 镜研究了FITC标记的PEG-SPION和DNA-SPION的时间进程摄取。通 过记录不同时间点的不同荧光强度,比较了它们在RAW 264.7细胞中的 摄取动力学(图6B)。孵育后1小时,首先在FITC-PEG-SPION孵育的细 胞中检测到FITC信号,并逐渐增加(图6B)。相比较而言,与DNA-SPION 孵育仅0.5小时后在细胞中检测到非常强的FITC信号,表明DNA-SPION 在细胞中积累要快得多。孵育后4小时,与RAW 264.7细胞结合的 FITC-DNA-SPION比FITC-PEG-SPION多近5倍(图6B)。孵育后16小时, FITC-PEG-SPION孵育的细胞中的胞内FITC荧光继续增加,证实了 ICP-MS和普鲁士蓝数据,表明RAW 264.7细胞连续摄取PEG-SPION。 然而,FITC-DNA-SPION处理的细胞中的FITC荧光在8-16小时后消失, 尽管ICP-MS和普鲁士蓝染色数据显示SPION核心积累不断增加(图6A 和7A)。SPION和DNA的胞内积累的时间进程的这一矛盾归因于与 SPION核心结合的DNA链的降解,这一现象在之前关于孵育后16小时 C166细胞内部的FITC标记的SNA已有报导(60)。
先前的研究已表明:FITC的荧光强度强烈取决于pH,相比生理环 境(pH=7.4),溶酶体pH(~4.8)中的荧光强度仅为~10%(58,59)。
使用青色素3(Cy3)标记的PEG-SPION和Cy3-DNA-SPION重复了共 聚焦成像研究。通过将荧光团从FITC改变为Cy3,对于Cy3-PEG-SPION, 在仅16小时孵育后就在RAW 264.7细胞内观察到强的Cy3荧光,而在 前4小时期间,胞内荧光仅为可检测水平(图7B)。这一观察结果与对 FITC-PEG-SPION的观察结果一致。对于Cy3-DNA-SPION,在孵育后1 小时就可以检测到Cy3荧光,与FITC-DNA-SPION的快速细胞摄取动力 学相符(图7B)。重要的是,在孵育后24小时,Cy3-DNA-SPION的荧光 消失至不可检测水平,进一步支持了DNA降解的观点(图7B)。
还通过TEM研究了PEG-SPION和DNA-SPION的细胞摄取。将孵 育后4小时选作代表性时间点。在该时间点,发现大簇的DNA-SPION 大量存在于核周腔囊泡中(图8)。另一方面,在较小囊泡(早期核内体标准 大小(直径~200nm))中仅观察到很少的PEG-SPION(图8),显示 PEG-SPION的较低摄取效率和较慢的摄取动力学。
实施例4—巨噬细胞中DNA-SPION的内吞通过SR-A和脂筏发生
先前的研究已表明:SNA通过靶向SR-A(也称为MSR1)和经依赖脂 筏的小窝(caveolae)介导的通路(35)的内吞进入小鼠内皮细胞细胞(C166), 而与纳米颗粒核心的化学组分无关(60)。检查了RAW 264.7小鼠巨噬细 胞中的DNA-SPION的摄取。为了达到这一目的,以不诱导细胞毒性的 浓度的不同的药物抑制剂(表S2)将RAW 264.7细胞预处理1小时,以封 闭细胞摄取的某些通路(图9C)。表S2为药物抑制剂和使用的抑制剂的最 终浓度的列表。
表S2
然后将预处理的RAW 264.7细胞暴露于Cy3-DNA-SPION 4小时,然 后通过ICP-MS和共聚焦显微镜检测细胞摄取的任何衰减。
加入岩藻多糖作为SR-A的竞争性配体以封闭清道夫受体,使用了菲 律宾菌素III作为脂筏/小窝介导的隔离胆固醇的内吞作用的特异性抑制 剂,加入细胞松弛素D来破坏肌动蛋白纤维的聚合。通过ICP-MS分析, 在岩藻多糖、菲律宾菌素III和细胞松弛素D处理的RAW 264.7细胞中 分别观察到铁含量急剧减少~73%、~78%和~73%(图9B)。在平行的共聚 焦成像实验中,在Cy3-DNA-SPION孵育前,使用岩藻多糖、菲律宾菌 素III和细胞松弛素D对RAW 264.7细胞了进行了预处理。与ICP-MS 结果一致,相比未处理的对照细胞,这3种抑制剂显著减少了 Cy3-DNA-SPION胞内荧光(图9A)。结果表明:SR-A、小窝和肌动蛋白参与介导DNA-SPION的摄取。平行地,进行了ICP-MS来定量测量在不 同的药物抑制剂和抗体对细胞进行预处理并随后与DNA-SPION孵育4h 后的铁含量(图9B)。诸如氯丙嗪(网格蛋白介导的内吞的抑制剂)、阿米洛 利(巨胞饮的封闭剂)、戴纳索尔(发动蛋白介导的内吞的抑制剂)和甘露聚 糖(甘露糖受体介导的吞噬作用的抑制剂)(61-64)的化学封闭剂进行的预 处理仅分别产生~29%、~17%、~32%和~31%的细胞DNA-SPION结合减 少(图9B)。针对CD16/CD32和CD64的抗体(二者均为Fcγ受体介导的吞 噬的封闭剂(65-66))的预处理显示细胞DNA-SPION结合几乎无减少(图 9B)。这些数据表明:网格蛋白介导的内吞、巨胞饮以及甘露糖受体和Fcγ 受体介导的吞噬不参与或参与程度有限。
由于这些封闭剂的毒性是影响细胞摄取的一个考虑因素,使用 Alamar Blue测定法测量了所述封闭剂处理4小时后的细胞活力(图9C)。 未观察到可观察的毒性,证明了所述化学封闭剂和抗体的有效性。
为了进一步研究调节DNA-SPION摄取的受体或通路蛋白的作用, 利用特异性抑制目的蛋白表达的siRNA转染RAW 264.7细胞,然后通过 ICP-MS和共聚焦显微镜探测Cy3-DNA-SPION的细胞摄取。通过Western 印迹(图9D)和共聚焦免疫荧光分析(图11)证实了siRNA转染后所有靶标 蛋白得到抑制。孵育4小时后,MSR1-siRNA处理的RAW 264.7细胞的铁含量比非靶向对照siRNA转染的细胞少~53%(图9E)。与 Cy3-DNA-SPION孵育后,经MSR1-siRNA处理的细胞的共聚焦成像揭示 胞内Cy3荧光的明显减弱(图10)。从这些数据得到如下结论:RAW 264.7 细胞中DNA-SPION的摄取通过与SR-A结合而发生,并且由脂筏介导。 因为SR-A沉默的RAW 264.7细胞的DNA-SPION细胞摄取的减少少于 沉默的C166细胞中SR-A对SNA摄取的减少(约为75%(60)),因此测试 了其他细胞摄取通路的参与情况。首先,捕获了RAW 2643.7细胞的TEM 成像以可视化其早期的DNA-SPION摄取。孵育后10分钟,DNA-SPION 经与网格蛋白包被的凹点(pit)或小窝不同的椭圆形质膜内陷开始进入细 胞(图14A和15A)。通常,质膜的出牙融入至测量直径小于200nm的囊 泡。孵育30min后,DNA-SPION在囊泡内积累,遍布外围和核周细胞 质,其中囊泡具有圆形或管形形状和~100-200nm的尺寸,类似早期的核 内体(图14B和15B)。这些TEM成像表明:DNA-SPION从早期核内体 移位至晚期核内体,与其他典型内吞过程一样。
实施例5—非小窝不依赖于发动蛋白的内吞是巨噬细胞中DNA-SPION摄取的主要
途径
接下来,我们研究了脂筏中的哪种定居蛋白在内吞期间起重要作用。 尽管TEM成像数据并未显示细胞膜附近类似小窝的瓶形内陷,但是我们 还是研究了RAW 264.7细胞对DNA-SPION的内吞是否依赖于小窝,这 是因为小窝介导的内吞常常引起内化的生物分子穿梭至早期核内体以进 行进一步加工(67),并且小窝蛋白(脂筏中的一种定居蛋白)显著性介导 C166内皮细胞对SNA的摄取(61)。首先,戴纳索尔预处理巨噬细胞未显 著减少SPION摄取(图9A和图9B),尽管已知发动蛋白II是形成小窝所 需要的(68)。此外,通过ICP-MS测定,小窝蛋白1(CAV1,小窝的主要 组成性蛋白(69))的瞬时敲低仅导致孵育4小时后DNA-SPION与RAW 264.7细胞的细胞结合减少~26%(图9E)。共聚焦显微镜也显示CAV1沉 默的(CAV-1siRNA处理的)RAW 264.7细胞和以非靶向性对照siRNA转 染的对照RAW 264.7细胞内具有相似强度胞内Cy3荧光(图10)。转染后 48h收获的细胞的Western印迹分析显示CAV1的成功抑制,而相比未处 理的细胞,以对照siRNA转染细胞的未显示出明显的CAV1表达减少(图 9D)。总之,这些数据证明:小窝并未显著参与RAW 264.7细胞对 DNA-SPION的内化。
接下来,评估了flotillin 1(FLOT1),其为另一种常见的脂筏蛋白, 与小窝蛋白一样执行细胞信号传导和内吞功能。对flotillin 1的兴趣来自 免疫荧光数据,免疫荧光数据显示RAW 264.7细胞中FLOT1的表达比 CAV1更为丰富(图11)。同样,通过ICP-MS证实,FLOT1的瞬时基因敲 低未对DNA-SPION的摄取造成负面影响(图9E)。这一结果通过共聚焦成像得到了证实,其显示在FLOT1敲低后,Cy3标记的DNA-SPION的 摄取未明显减少(图10)。同样,siRNA介导的FLOT1表达降低通过免疫 荧光染色得到了证实(图11)。事实上,摄取DNA-SPION(FITC标记的)30 min后,FLOT1(Cy3标记的)的免疫荧光染色未显示明显的黄色信号,表 明FLOT1与DNA-SPION无明显共定位(图13)。
因此,得出如下结论:DNA-SPION内吞至RAW 264.7细胞为脂筏依 赖性的、肌动蛋白依赖性的过程,是非小窝、不依赖于发动蛋白的。
实施例6—DNA-SPION的胞内运输
在SPION与细胞连续孵育的条件下,研究了DNA-SPION的胞内位 置作为RAW 264.7细胞孵育时间的函数。为了绘制DNA-SPION的胞内 运输途径图,将RAW 264.7细胞与FITC-DNA-SPION孵育不同时间,然 后进行共聚焦免疫荧光来测定其与不同的目的蛋白标志物有关的胞内位 置,蛋白标志物包括小GTP结合Ras相关蛋白5(Rab5)、Ras相关蛋白9 (Rab9)和溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)。Rab5、Rab9和LAMP1对应的 胞内小室为早期核内体(74)、晚期核内体(75)和溶酶体(76)。与TEM成像 中观察到的结果一致,其中SPION在孵育后的早期时间点优势性发现在 早期核内体中,将RAW 264.7细胞与FITC-DNA-SPION孵育10min后 的共聚焦成像显示FITC-DNA-SPION与Rab5的高度共定位,证明在早 期核内体中的积累(图16A)。与C166细胞(60,61)不同,在仅孵育1小时 后,大部分DNA-SPION已与Rab9共定位,而仅小部分的DNA-SPION 与Rab5在早期核内体中共定位(图16B)。这些数据表明:DNA-SPION较 快地从早期核内体运输至晚期核内体。孵育后4小时,通过皮尔森系数 从0.73(10min的孵育)减小至0.4(4小时的孵育)所观察到的,在早期核 内体和晚期核内体中积累较少数量的DNA-SPION(图16C)。超过4小时 时间点,FITC-DNA-SPION显示中等程度的与早期和晚期核内体的共定 位,如通过其重叠荧光信号的0.4-0.6的皮尔森系数所证实的(图16D和16E)。这些观察结果支持以下观点:DNA-SPION的细胞摄取是贯穿于整 个24小时的整个观察时间窗的连续过程。值得注意的是,在16小时后, 发现大部分的FITC-DNA-SPION与LAMP1(溶酶体的生物标志物)共定 位,提示在溶酶体中的积累(图16D)。这些数据证实了:RAW264.7细胞 中的DNA-SPION摄取通过经典的内溶酶体运输途径发生,该途径在早 期核内体中起始,经过晚期核内体,并到达溶酶体。因而,RAW 264.7 巨噬细胞内DNA-SPION的命运不同于C166内皮细胞内基于金的SNA (60)。具体而言,SNA通过小窝介导的通路进入C166内皮细胞,运输至 早期核内体,并保留在晚期核内体中,而不会前进至溶酶体(60)。此外, 已知许多载体和病原体(如病毒和细菌)通过小窝介导的通路进入细胞,以 避开溶酶体并定居于晚期核内体中(77)。
实施例7—血液药代动力学
携带包含巨噬细胞的晚期动脉粥样硬化斑块的ApoE-/-小鼠(n=3)(图 21)经单次静脉(i.v.)注射接受相同纳米颗粒浓度的PEG-SPION和 DNA-SPION。为了评估血液药代动力学,在不同的时间点通过心脏穿刺 从每个小鼠抽取血液,使用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)评估 血浆中的铁含量(图17A)。PEG-SPION的表现接近单指数血液清除动力学,其半衰期(t1/2)为1.03小时(图17A),这与先前的报导(64)相当。 DNA-SPION与PEG-SPION类似也显示了单指数血液清除动力学,但 DNA-SPION的半衰期仅为0.33小时,即短于PEG-SPION(图17B)。一般 而言,相比带中性电荷的纳米颗粒或带弱负电荷的纳米颗粒,带高负电 荷的纳米颗粒更多地分布至肝(78)。有趣的是,DNA-SPION的t1/2比在 DNA壳中含有不多于1摩尔百分数的PEG的经典的基于金的SNA的t1/2长~20倍(79)。此外,基于最近的数据,相比包含较低摩尔比的SNA,在 DNA包被中包含较高摩尔比的PEG的SNA显示明显更长的t1/2(79)。对 于本申请的DNA-SPION,DNA寡核苷酸结合至PEG-SPION的外围,并 非直接位于未修饰SPION核心的表面上。
实施例8—ApoE-/-小鼠中PEG-SPION和DNA-SPION的器官水平生物分布
在注射后不同的时间点,使用ICP-OES测量主动脉和其他内部器官 中的SPION核心的浓度,确定器官水平生物分布。在注射PEG-SPION 和DNA-SPION后不同的时间点,将ApoE-/-小鼠安乐死,提取器官用于 利用ICP-OES检测铁含量。根据基于每克组织的SPION积累,对于检测 的所有时间点,PEG-SPION和DNA-SPION在肝和脾(即,单核巨噬系统 (MPS)的器官)中积累最多,对于两种SPION类型,在肝中铁含量达到 31-69%的注射剂量(ID)/g,在脾中达到33-61%的ID/g(图17C和17D)。 胰腺、脑、肺、肾和心脏中PEG-SPION和DNA-SPION的积累可忽略不 计,每个器官中铁含量达到不多于20%ID/g。对于两种类型的SPION, 脾的铁含量(显示为%ID/g组织)甚至高于肝中的铁含量,这与先前的报导 (79,80)一致。紧跟肝和脾之后为主动脉,PEG-SPION为12%-40%ID/g 的铁含量,DNA-SPION为10%-60%ID/g(图17C及插图,和17D及插 图)。有趣的是,对于PEG-SPION组,在所有时间点,肺和肾数据显示 轻微增加的铁水平,这可能是由于较长的循环和被动靶向特性。同时, 显示为%ID/g的进入主动脉的摄取比如非MPS器官中的摄取高得多,提 示PEG-SPION和DNA-SPION具有增强的进入动脉粥样硬化病变的靶向 效率。还根据百分比注射剂量(%ID)/主动脉,测定了ApoE-/-小鼠的分离 主动脉中PEG-SPION(图18A)和DNA-SPION(图18B)的积累(图18)。PEG-SPION的最大积累为1.0%ID/主动脉(图18A),DNA-SPION为1.2% ID/主动脉(图18B),且对于PEG-SPION和DNA-SPION分别发生于注射 后~8小时和注射后~2小时(图18A和18B)。这些数据证明了由于DNA 包被,至主动脉的DNA-SPION递送得到增加和加速,主动脉为ApoE-/-小鼠和患有动脉粥样硬化疾病的人中动脉粥样硬化斑块的主要位点。
除了可供主动脉摄取的纳米颗粒的量,动脉粥样硬化斑块的靶向动 力学是靶向成像试剂的另一关键参数,特别是为了转化目的。已知MPS 器官中巨噬细胞对氧化铁纳米颗粒的摄取之前通常为调理素作用,即, 被巨噬细胞识别并吞噬(76)。因此,血液循环时间与纳米颗粒的器官水平 分布率紧密相关。如同所预期的,肝和脾中的DNA-SPION积累在给药 后2小时均达到最大水平,这是由于其较短的血液循环(图17D)。另一方 面,PEG-SPION需要16个小时来达到肝和脾中的最大积累(图17C)。类 似地,PEG-SPION和DNA-SPION至动脉粥样硬化主动脉区域的靶向和 积累与MPS器官中的相匹配,对于最大积累,PEG-SPION和DNA-SPION 分别需要8小时和2小时(图17C及插图和图17D及插图)。总之,这些 数据表明DNA-SPION以相比PEG对应物以更好时效性的方式靶向动脉 粥样硬化斑块。
实施例9—SPION的体内和离体近红外成像
接下来,我们使用近红外荧光成像(NIRF)检测了具有早期和晚期动 脉粥样硬化病变的小鼠(ApoE-/-小鼠)中Cy5.5标记的SPION的体内分布。 使用与关于Cy3-SPION所讨论的相同的EDC/MHS化学法制备Cy5.5标 记的PEG-SPION和Cy5.5标记的DNA-SPION,用于将其经静脉注射至 ApoE-/-小鼠,然后进行这些动物的体内NIRF成像(图19A)和切除器官的 离体成像(图19B)。对于注射了Cy5.5-PEG-SPION的小鼠,注射后0.5小 时和2小时,在肺内和肝附近检测到强荧光,但肾和膀胱未检测到(图19B, 左图)。通过离体NIRF成像,在Cy5.5-PEG-SPION注射后,在所有器官 中,肝中检测到的Cy5.5荧光最强,得到6×104的最大荧光强度水平。 按荧光强度降序排列,具有Cy5.5-PEG-SPION积累的其他器官为肾、肺、 脾和胰腺(图19B,左图)。
相比之下,对于Cy5.5-DNA-SPION组,在Cy5.5-DNA-SPION注射 后0.5小时和2小时,体内NIRF成像显示肾和膀胱中的荧光最强,而非 肺和肝(图19A,右图)。离体成像显示Cy5.5-DNA-SPION注射后肾中的 Cy5.5荧光最强(超过1.2×105),随后为肝(~4.5×104)和胰腺、肺和脾(图 19B,右图)。注射后24小时,体内NIRF成像显示,注射PEG-SPION 和DNA-SPION的小鼠显示类似于注射后0.5小时和2小时对应的模式的 器官水平分布模式,虽然荧光强度显著减弱(图19A)。对于DNA-SPION 处理组,肾中的Cy5.5荧光在检测的其他器官中保持最强。离体NIRF成 像显示注射24小时后,Cy5.5-DNA-SPION处理组肾中的荧光峰值仍然 为1.2×105,随后为肝、肺、脾和胰腺(图19B,右图)。有趣的是,虽然 ICP-OES数据显示注射后2小时肝是SPION核心积累的主要部位(图 17B),但是NIRF成像数据提示肾和膀胱中存在Cy5.5标记的DNA链(图 19A和19B)。SPION核心的平均物理直径(16nm)、PEG-SPION的平均 流体动力学尺寸(41nm)和DNA-SPION的平均流体动力学直径(55nm)均 超过调节纳米颗粒肾清除的10nm的阈值尺寸(81)。因为对于PEG-SPION 处理组,NIRF成像未揭示肾或膀胱中存在明显的Cy5.5荧光,因此该数 据表明,在体内一些DNA链从SPION核心脱离和/或DNA链降解为较 小片段,其开始于注射后0.5小时,并且在注射后2小时更为明显(图19A 和19B)。这些DNA片段直径通常为3-4nm(82),能够穿透小球过滤屏 障(83),穿过膀胱,并最终排出体外。注射后24小时,NIRF成像数据还 显示,在肾内积累了至少一些解离的Cy5.5标记的DNA片段(或仅为 Cy5.5分子)。
通常,Cy5.5与生物分子的结合可显著改变其器官水平的分布。例如, Kimura etal.显示,经静脉注射的Cy5.5标记的扭结菌素(knottin)肽能够在 注射的2小时内在肾中积累,并在肾中保留至注射后24小时,而无荧光 的扭结菌素肽不能(84,85)。肾积累效应似乎为Cy5.5特异性的,因为在 将Cy5.5替换为Cu64标记的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸 (DOTA)以用于正电子发射断层扫描(PET)时,在肾中未观察到更高的放射 性(84,85)。
以上研究强调了综合应用ICP-OES分析和NIRF成像来提供研究 PEG-SPION和DNA-SPION的器官水平分布的补充视角。研究的结果表 明,PEG-SPION在整个24小时过程中是大体稳定的,其相比DNA-SPION 具有略长的循环半衰期。对于DNA-SPION,原始结合至SPION核心的 一些DNA链在注射后0.5小时和2小时即经历了体内分解或降解,造成 其被肾清除出体外或者在肾中保留至少24小时(参见,例如图19B,右图)。
实施例10—向ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块的体内递送
在主动脉中确定了向ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块的体内递送。 主动脉的斑块中Cy5.5-DNA-SPION的积累快于且高于PEG-SPION,如 通过离体NIRF成像所检测的,其在注射后0.5小时起始(图20A)。注射 后30分钟,离体NIRF成像显示,相比Cy5.5-PEG-SPION注射组,来自 Cy5.5-DNA-SPION注射组的心脏和主动脉中的荧光峰值强3倍(图20A, 左图)。相比注射后0.5小时和2小时检测到的Cy5.5荧光(图20A,左图 和中间的图),注射后24小时,Cy5.5-PEG-SPION和Cy5.5-DNA-SPION 处理的动物的心脏和主动脉中的Cy5.5荧光较弱(图20A,右图),但是 DNA-SPION注射组的荧光峰值仍然比PEG-SPION注射组的荧光峰值强4倍(图20A)。在心脏和主动脉中可检测到Cy5.5荧光“热点”,这些热点 在组织中并非均匀分布,表明检测到空间限定的斑块,相比PEG-SPION, 斑块可以被DNA-SPION更有效地靶向(图20A)。这些离体NIRF成像数 据强化了关于SPION核心的器官水平的主动脉积累的ICP-OES数据(图 17C及插图、17D及插图及图18B和18B)。
因此,当以PEG-SPION为比较基准时,主动脉中DNA-SPION的积 累更为丰富(根据铁含量峰值,对于DNA-SPION的~60%ID/g相对于对 于PEG-SPION的~44%ID/g;或者对于DNA-SPION的~1.2%ID/主动脉 相对于对于PEG-SPION的~1.0%ID/主动脉;图18A和18B)且更为快速, 即,注射后2小时主动脉中达到铁含量峰值相对于注射后8小时(图17C 及插图和17D及插图)。类似地,相比Cy5.5-PEG-SPION积累,心脏和 主动脉中Cy5.5-DNA-SPION的积累更为迅速,即,注射后0.5小时达到 峰值荧光相对于注射后2小时(图20A)。在采集主动脉并切片后,如通过 强红色信号所显示的,注射后0.5小时,在具有早期和晚期动脉粥样硬化 病变的小鼠的主动脉斑块中广泛地检测到Cy5.5-DNA-SPION(图20G), 而PEG-SPION在这样早期时间点未显示积累,但在较晚的时间点可以检 测到(图20G)。在用CD68(大量存在于早期和晚期动脉粥样硬化病变中的 巨噬细胞生物标志物(图21))染色后,红色和绿色信号证实了斑块中 PEG-SPION和DNA-SPION与巨噬细胞的部分共定位(图20G),提示巨 噬细胞在递送过程中起重要作用。
实施例11—动脉粥样硬化斑块中PEG-SPION和DNA-SPION的细胞水平生物分布
为了进一步研究PEG-SPION和DNA-SPION与主动脉斑块中主要类 型细胞的相互作用,使用生物标志物来标记从ApoE-/-小鼠的主动脉分离 的内皮细胞细胞、巨噬细胞(包括M2亚型)和树突细胞,并通过流式细胞 术分析。通过Cy5.5阳性细胞的百分比和细胞中Cy5.5荧光团的MFI,评 估了存在于主动脉斑块中的每种细胞类型的Cy5.5-PEG-SPION和Cy5.5-DNA-SPION的摄取。使用针对分离自主动脉的主动脉细胞的特异 性的设门策略(图28)。在FSC-A和SSC-A上对来自主动脉的单细胞悬液 设门,以排除细胞碎片。在AmCyan上的Live/Dead Aqua对单细胞设门 来得到活细胞群。从此时开始,在不同的染色组中分离细胞,巨噬细胞 在F4/80上,内皮细胞在CD31上,树突细胞在CD11c和MHCII上为阳 性。在CD301上对F4/80+巨噬细胞进一步设门来分离M2(CD301+)巨噬 细胞(图28)。
两组数据均表明,在静脉注射后0.5小时和2小时,主动脉斑块巨噬 细胞具有最高的SPION摄取,而与SPION上包被的性质无关(图20B、 20C、20D和20E)。特别是,在注射后0.5小时和2小时,主动脉斑块的 M2巨噬细胞具有非常高的Cy5.5-DNA-SPION摄取(图20E和20F)。根据 摄取动力学,如注射后0.5小时和2小时,在所有细胞类型中均具有最高 的Cy5.5-DNA-SPION的MFI所提示的,Cy5.5-DNA-SPION更有效和更 快速地进入每种细胞类型(图20B、20C、20D、20E和20F)。
实施例12—ApoE-/-小鼠的选定器官中PEG-SPION和DNA-SPION的细胞水平生物分
布。
从注射Cy5.5-PEG-SPION或Cy5.5-DNA-SPION的ApoE-/-小鼠收获 选定器官用于NIRF成像。选择肝和脾是因为基于ICP-OES测量,其具 有高水平铁积累(图17)。还选择肺作为阴性对照,是因为其低水平铁含 量。通过酶消化这些器官并利用内皮细胞(CD31+)、总巨噬细胞(F4/80+)、 M2巨噬细胞(F4/80+和CD301+)和树突细胞(MCHII+和CD11c+)的特异性 标志物标记生成的细胞悬液,通过流式细胞术对肝(图25中的设门策略)、 脾(图26中的设门策略)和肺(图27中的设门策略)中的两种SPION类型向 这些细胞类型的递送进行了定量。例如,在FSC-A和SSC-A上对来自肝 和肺的单细胞悬液进行设门以排除细胞碎片。在AmCyan上的Live/Dead Aqua对单细胞设门来得到活细胞群。从此时开始,在不同的染色组中分 离细胞,巨噬细胞(包括Kupffer细胞)在F4/80上,内皮细胞在CD31上, 树突细胞在CD11c和MHCII上为阳性。在CD301上对F4/80+巨噬细胞 进一步设门来分离M2(CD301+)巨噬细胞(图25和27)。对于脾细胞,在 FSC-A和SSC-A上对来自脾的单细胞悬液设门来排除细胞碎片。在AmCyan上的Live/Dead Aqua对单细胞设门来得到活细胞群。从此时开 始,在不同的染色组中分离细胞,巨噬细胞在F4/80上,树突细胞在CD11c 和MHCII上为阳性。在CD301上对F4/80+巨噬细胞进一步设门来分离 M2(CD301+)巨噬细胞(图26)。
数据以细胞的Cy5.5阳性细胞的平均分数(图22和24)和平均Cy5.5 荧光强度(MFI)(图23和24)的形式表示。总体而言,细胞水平分布在不 同器官中存在差异;位于不同的器官中的相同细胞类型(例如肝内皮细胞 相对于肺内皮细胞)显示非常不同的摄取水平。
在静脉注射两种纳米颗粒类型后30分钟,主动脉中的亚细胞水平分 布可以通过每个细胞类型中Cy5.5阳性细胞的百分比得到反映(图20B、 C、D和E):树突细胞:PEG-SPION和DNA-SPION分别为0.745%和 8.972%;内皮细胞:PEG-SPION和DNA-SPION分别为0.323%和1.012%; 总巨噬细胞:PEG-SPION和DNA-SPION分别为0.42%和7.746%;M2 巨噬细胞:PEG-SPION和DNA-SPION分别为0.554%和21.52%。
对于DNA-SPION注射组,在肝内,注射后0.5小时内皮细胞具有最 大的Cy5.5阳性细胞平均分数(~74.3%)(图22A)。注射后0.5小时,肝总 巨噬细胞和肝M2巨噬细胞显示Cy5.5-DNA-SPION注射后~30%和~60% 的Cy5.5阳性细胞,其后为肝树突细胞~16.4%(图22A)。
对于PEG-SPION注射组,对于Cy5.5阳性细胞的相对群体观察到类 似的趋势,然而所有细胞类型的Cy5.5阳性细胞的平均分数低于 DNA-SPION注射组20%-30%,即,注射后2小时,内皮细胞(~54.2%)、 巨噬细胞(~12.4%)和树突细胞(~11.9%)(图22A)。这些数据强调了 DNA-SPION优于PEG-SPION的进入肝细胞类型的选择性,在内皮细胞 中最为明显(图22A和22B),尽管大部分的PEG-SPION仍然在这些细胞 类型内积累。
根据均值荧光强度(MFI),肝内皮细胞显示最强的每细胞荧光值,超 过总巨噬细胞、树突细胞和M2巨噬细胞7-12倍(图22A、22B、23A和 24B)。对于PEG-SPION注射组,内皮细胞的MFI也比总巨噬细胞、树 突细胞和M2巨噬细胞高4-8倍,再次肯定了肝内皮细胞在内化两种 SPION类型中的关键作用(图22A和23B)。注射后24小时,未观察到Cy5.5 阳性细胞分数和MFI的严重下降,这与通过ICP-OES分析获得的器官水 平分布数据一致(图17)。
肝窦内皮细胞与肝巨噬细胞(或Kupffer细胞)共有许多受体表达 (86-87)。虽然肝内皮细胞在正常情况下不会经历吞噬作用,但是它们能 主动清除尺寸达230nm的可溶或胶体物质(88)。相比之下,Kupffer细胞 通常摄取较大尺寸的较大颗粒(89-90)。例如,Tsoiet al.报告了肝内皮细 胞有64.6%的高可能性内化经静脉注射至Wistar大鼠的PEG包被的量子 点(91),这与本研究中肝内皮细胞中PEG-SPION和DNA-SPION类型的 主要定位一致。已有报道,Kupffer细胞对PEG包被的量子点的显著摄取 (84.8%)(91),这显著高于本研究中肝巨噬细胞中PEG-SPION和 DNA-SPION的摄取(图22)。关于肝巨噬细胞对纳米颗粒摄取的差异可能 归因于几种现象。饲喂致动脉粥样硬化膳食的ApoE-/-小鼠具有与正常小鼠不同的肝病理生理学特征(例如,较高的胆固醇含量(92)和炎症(93))。 它们的肝免疫细胞(例如,巨噬细胞)可能显示与正常细胞不同的摄取特 性。另外,针对肝巨噬细胞的不同的标志物选择可能导致鉴定不同的细 胞群和不同的纳米颗粒摄取水平。对于本研究,选择了F4/80作为总巨噬 细胞的标志物,而Tsoi et al.使用CD68来识别Kupffe细胞(91)。物种差 异(ApoE-/-小鼠相对于Wistar大鼠)也可能造成不同的肝内细胞水平分布 数据。
在注射DNA-SPION的ApoE-/-小鼠的脾内,注射后2小时内化最多 DNA-SPION的细胞为M2巨噬细胞(~26.2%),然后分别为总巨噬细胞 (~18.2%)和树突细胞(~12.8%)(图22C)。在本实验中未分析内皮细胞,这 是由于其在脾中的低丰度。此外,脾巨噬细胞相比脾树突细胞具有更高 的MFI(图22D、22E、23B和24B)。
相比之下,脾巨噬细胞和树突细胞对PEG-SPION的体内摄取可忽略 不计,证据为对于两种细胞类型仅少于2%的细胞被鉴定为Cy5.5阳性的 (图22C和24A)。
在内化Cy5.5-DNA-SPION后,相比脾树突细胞(图23B和24B),脾 巨噬细胞具有更高的Cy5.5阳性细胞平均分数(图22D)和MFI。注射后2 h,Cy5.5-DNA-SPION注射组的脾巨噬细胞的MFI比Cy5.5-PEG-SPION 注射组检测的MFI高2-4倍(图22D、22E和23B)。比脾巨噬细胞低一定 程度,脾树突细胞内化的Cy5.5-DNA-SPION多于Cy5.5-PEG-SPION,这 体现在可能性(图22C和23A)和摄取量(图22E、23B和24B)。注射后24 小时,脾巨噬细胞仍然是具有最高MFI和最高的Cy5.5阳性细胞平均分 数的细胞类型,但这两个数值相比注射后0.5小时和2小时检测到的数值 (图22C、22D、23B、24A和24B)几乎降低了50%。同时,相比注射后 0.5小时和2小时检测到的数值,脾树突细胞在这两个数值也经历急剧降 低(图22C、22E、23B、24A和24B)。
在相同的时间点,脾细胞未明显内化PEG-SPION,其中不大于1% 的脾巨噬细胞和树突细胞鉴定为Cy5.5阳性的(图22C)。对于血液和脾中 的单核细胞,相比其他细胞类型,无明显荧光被检测到(数据未显示)。
总之,注射后0.5小时,在检测的所有细胞类型中,DNA-SPION最 多地进入脾巨噬细胞,相比PEG-SPION具有至少10倍的选择性。这些 细胞水平分布数据与通过ICP-OES获得的器官水平分布数据(图17)一致, 显示在注射后的前2小时内脾的铁积累的急剧增加。注射后2小时至24 小时Cy5.5阳性细胞平均分数的下跌证实了通过ICP-OES测量所揭示的 注射后2小时至24小时脾铁含量的急剧下降。
对于肺,Cy5.5阳性细胞的平均分数及其分别的MFI低于肝和脾(图 22F、23C、24A和24B)。注射Cy5.5-DNA-SPION后2小时,达7.4%的 肺树突细胞检测为Cy5.5阳性,且少于3%的其他细胞类型为Cy5.5阳性 (图22F)。然而,注射Cy5.5-DNA-SPION后0.5小时,约25%的M2巨噬 细胞为Cy.5.5阳性(图22F)。此外,Cy5.5-DNA-SPION组的Cy5.5阳性肺 内皮细胞和树突细胞的平均分数比PEG-SPION组高至少3倍(图22F)。 在MFI方面,对于两种SPION类型,肺树突细胞比其他肺细胞类型高至 少2倍(图23C和24B)。因而,DNA-SPION最偏好性地进入肺巨噬细胞 和肺树突细胞,选择性相比PEG-SPION高3倍。注射后24小时,Cy5.5 阳性细胞的平均分数和MFI小于注射后0.5小时和2小时的值,这与NIRF 成像数据一致。由于肺细胞对PEG-SPION的摄取可忽略不计,注射后2 小时通过体内NIRF成像观察到的肺中的强荧光似乎来源于肺内贮留的 血液,提示PEG-SPION相比DNA-SPION的更长的循环时间。
数据表明:巨噬细胞,特别是M2细胞,在静脉注射后0.5小时、2 小时和24小时具有最高的SPION摄取(图22)。在摄取动力学方面,如注 射后0.5小时和2小时时所有细胞类型中DNA-SPION最高的MFI所指 示的,DNA-SPION可以更有效和更快速地进入每种细胞类型。
有趣的是,SPION在其他器官中的分布显示针对不同细胞类型的不 同偏好性。首先,在血液和脾的单核细胞中SPION无显著摄取(数据未显 示)。肺细胞(除了肺M2巨噬细胞)的可忽略不计的Cy5.5信号显示了 SPION的低细胞内摄取(图22),这证明了先前的ICP结果,表明含有 PEG-SPION的肺中较高的铁含量是由于包含PEG-SPION的贮留血液, 这归因于PEG-SPION较长的循环时间。
相比之下,SPION在包括肝和脾在内的MPS器官中大量积累,这与 ICP数据良好对应。令人吃惊的是,PEG-SPION和DNA-SPION在肝内 皮细胞中均显示最高分布(>60%阳性)。已知肝脏肝窦内皮细胞(LSEC)与 巨噬细胞共有大量相同的受体表达,且具有摄取直径达1μm的分子的内 化能力(94-95)。因此,看起来PEG-SPION和DNA-SPION被MPS内皮 细胞大量吞噬。另一方面,脾内的SPION大多定位于巨噬细胞(图22), 其在注射后0.5小时和2小时具有最大的DNA-SPION摄取。
总之,DNA-SPION在淋巴器官和非淋巴器官的不同细胞类型中显示 更快和更偏好的摄取,其通过与M2细胞的相互作用具有增加的对动脉 粥样硬化斑块的靶向效率。由于DNA-SPION与SR-A之间的相互作用, DNA包被的SPION显示增强的向巨噬细胞的递送。基于RAW 264.7细 胞揭示的DNA-SPION的摄取动力学和内吞途径显示通过非小窝的经 SR-A的脂筏和肌动蛋白相关的通路向巨噬细胞中的有效摄取。因此, DNA-SPION可以用于增强向动脉粥样硬化斑块的体内递送,其在静脉注 射后0.5小时和2小时在动脉粥样硬化病变中显示DNA-SPION的最大积 累。DNA-SPION更短的循环寿命和更快的清除支持其在纳米医学应用中 用于动脉粥样硬化的成像和治疗的可用性。
应理解本文中描述的实施例和实施方案仅用于说明目的,且本领域 技术人员能够想到根据其的不同的修改或改变,这些修改或改变包含在 本申请的实质和范围以及所附权利要求的范围内。另外,可以将本文中 公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限定与本文中公开的任何和/ 或所有其他要素或限定(单独或以任何组合形式)或者任何其他发明或其 实施方案组合起来,并且所有这样的组合均考虑在本申请的范围,不设 任何限制。
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蔡宗衡
张蕾
<120> 用于有效体内递送DNA纳米结构至动脉粥样硬化斑块的材料和方法
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<212> DNA
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<223> Cy3-T30-NH2 寡核苷酸
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<223> Cy5.5-T30-NH2寡核苷酸
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Claims (22)
1.具有纳米颗粒(NP)核心的球形核酸(DNA-NP),其包含聚(乙二醇)(PEG)连接的寡核苷酸。
2.如权利要求1所述的DNA-NP,其中所述寡核苷酸包含至少20个核苷酸。
3.如权利要求1所述的DNA-NP,其包含单链寡核苷酸。
4.如权利要求1所述的DNA-NP,其包含双链寡核苷酸。
5.如权利要求3所述的DNA-NP,其包含单链多聚胸苷寡核苷酸。
6.如权利要求5所述的DNA-NP,其中所述单链寡核苷酸包含至少10个连续的胸苷寡核苷酸。
7.如权利要求1所述的DNA-NP,其中PEG与NP核心的重量比为至少7:1。
8.如权利要求1所述的DNA-NP,其中每个NP核心的PEG分子的数量为至少80。
9.如权利要求1所述的DNA-NP,其中每个NP核心的DNA寡核苷酸分子的数量为至少50。
10.如权利要求1所述的DNA-NP,其中在蛋白质溶液存在下,DNA-NP的流体动力学尺寸增加小于35%。
11.如权利要求1所述的DNA-NP,其包含至少一种治疗剂。
12.如权利要求11所述的DNA-NP,其中所述至少一种治疗剂为他汀类、核酸、凝血酶抑制剂、免疫抑制剂、细胞因子,类固醇、前列腺素或以上的任意组合。
13.如权利要求12所述的DNA-NP,其中所述至少一种治疗剂为辛伐他汀、阿托伐他汀、抗miR712、抗miR12、针对趋化因子受体2(CCR2)的siRNA、水蛭肽、双十二烷基甲氨蝶呤、卡莫司汀、白细胞介素-10(IL-10)、吡格列酮、泼尼松龙、前列环素或以上的任意组合。
14.如权利要求1-13中任一项所述的DNA-NP,其为具有超顺磁性纳米颗粒(SPN)核心的球形核酸(DNA-SPN)。
15.如权利要求14所述的DNA-NP,其为具有超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)核心的球形核酸(DNA-SPION)。
16.权利要求1-10和14-15中任一项所述的DNA-NP在制备用于诊断患有或疑似患有动脉粥样硬化病变的个体中存在动脉粥样硬化病变的产品中的用途。
17.用于产生权利要求15所述的DNA-SPION的方法,所述方法包括通过在二苯醚中的油酰胺和PEG存在下热分解乙酰丙酮铁(Fe(aca)3)来合成聚(乙二醇)-SPION(PEG-SPION),并通过EDC/NHS化学过程将胺修饰的DNA寡核苷酸与PEG-SPION连接。
18.如权利要求17所述的方法,所述方法还包括使DNA-SPION加载至少一种治疗剂。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述至少一种治疗剂为他汀类、核酸、凝血酶抑制剂、免疫抑制剂、细胞因子、类固醇、前列腺素或以上的任意组合。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述至少一种治疗剂为辛伐他汀、阿托伐他汀、抗miR712、抗miR12、针对趋化因子受体2(CCR2)的siRNA、水蛭肽、双十二烷基甲氨蝶呤、卡莫司汀、白细胞介素-10(IL-10)、吡格列酮、泼尼松龙、前列环素或以上的任意组合。
21.权利要求11-15中任一项所述的DNA-NP或根据权利要求18-20中任一项所述的方法产生的DNA-SPION在制备用于治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的用途。
22.如权利要求21所述的用途,其中所述药物中DNA-NP或DNA-SPION存在的量是在静脉内施用DNA-NP或DNA-SPION后2小时,在动脉粥样硬化病变中存在的M2巨噬细胞中至少20%结合和/或摄取DNA-NP或DNA-SPION所需的量。
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