CN107074767A - 用于反义基因调节的生物相容的无限配位聚合物纳米颗粒–核酸缀合物 - Google Patents
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Abstract
本文中公开了含有多核苷酸的金属‑配体复合物，用于制备它们的化合物，和使用它们的方法。
Description
政府支持的声明
本发明在Army Research Office授予的W911NF-11-1-0229、NationalInstitutes of Health授予的U54CA151880和Defense Advanced Research ProjectsAgency(DARPA)授予的HR0011-13-2-0018下在政府支持下做出。政府具有本发明的某些权利。
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通过引用整体并入与本文一起呈递并如下识别的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名称为“2014-110_Seqlisitng.txt”的ASCII(文本)文件，2,619字节，2015年8月20日创建。
背景技术
球形核酸(SNA)已经作为一类新的令人感兴趣的在可编程的材料合成、生物检测和细胞内基因调节中表现出前途的材料出现。这样的结构经常包含被致密的寡核苷酸层官能化的纳米颗粒核心。最密集地研究的SNA构建体由被烷基硫醇-修饰的DNA官能化的金核心组成。尽管由金制成的SNA已经表现出作为医学诊断和研究工具的商业前景且尚未在体内表现出急性毒性，但是存在关于金纳米颗粒的潜在长期毒性和它们的代谢结局的担忧。结果，非常需要具有由生物相容的材料制成的核心的SNA的新形式。
发明内容
本文提供了具有以下结构的化合物：
其中L是C1-20亚烷基或-C(O)NH-C1-20亚烷基；且n是1或2。在某些情况下，n是1，且在特定情况下，吡啶酮连接在苯基环上的对位处。在某些情况下，n是2，且在特定情况下，吡啶酮连接在苯基环上的每个间位处。在不同的情况下，L是C1-20亚烷基。在某些情况下，L是-C(O)NH-C1-20亚烷基。
本文还提供了包含如本文中公开的化合物和Fe(III)的金属-配体复合物。在某些情况下，所述金属-配体复合物是呈无限配位聚合物(ICP)的形式，所述无限配位聚合物(ICP)具有Fe2(化合物)3的重复式或每2个Fe(III)离子3个化合物部分的比率。在某些情况下，所述金属-配体复合物还包含多核苷酸，所述多核苷酸通过所述多核苷酸上的炔烃部分共价地连接至所述化合物之一上的叠氮化物以形成三唑键。在某些情况下，所述多核苷酸连接至所述ICP上的表面叠氮化物。
还提供了这样的多核苷酸，其在末端处包含含有的部分，其中L是C1-20亚烷基或-C(O)NH-C1-20亚烷基；且n是1或2。在某些情况下，n是1，且在特定情况下，吡啶酮连接在苯基环上的对位处。在某些情况下，n是2，且在特定情况下，吡啶酮连接在苯基环上的每个间位处。在不同的情况下，L是C1-20亚烷基。在某些情况下，L是-C(O)NH-C1-20亚烷基。在某些情况下，所述多核苷酸的末端具有结构 或其混合物，L2是C1-10亚烷基、-C(O)-C1-10亚烷基-Y-和-C(O)-C1-10亚烷基-Y-C1-10亚烷基-(OCH2CH2)m-Y-；每个Y独立地选自键、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；且m是0、1、2、3、4或5。所述多核苷酸可以包含DNA。所述多核苷酸可以包含5-100个核苷碱基、或10-60个核苷碱基、或15-30个核苷碱基。本文还提供了包含如本文中公开的多核苷酸和Fe(III)的金属-配体复合物。
本文还提供了一种超分子结构，其包含本文中公开的第一金属-配体复合物和本文中公开的第二金属-配体复合物，其中所述第一金属-配体复合物的多核苷酸与所述第二金属-配体复合物的多核苷酸充分互补以在适当条件下杂交。
本文还提供了抑制由靶多核苷酸编码的基因产物的表达的方法，所述方法包括在足以抑制所述基因产物的表达的条件下使所述靶多核苷酸与如本文中公开的超分子复合物或如本文中公开的金属-配体复合物接触。在某些实施方案中，在体内抑制所述基因产物的表达。在某些实施方案中，在体外抑制所述基因产物的表达。在某些实施方案中，使所述基因产物的表达被抑制至少约5％。
本文还提供了检测靶分子的方法，所述方法包括使所述靶分子与如本文中公开的超分子复合物或如本文中公开的金属-配体复合物接触，其中所述靶分子和所述超分子复合物或所述金属-配体复合物之间的接触导致可检测的变化。在某些实施方案中，所述检测是在体外。在某些实施方案中，所述检测是在体内。
附图说明
图1显示了ICP颗粒的合成和装配以及它们的细胞摄取。a)二-3,4-HOPO叠氮化物(4)的合成方案。b)从Fe(NO3)3和化合物4装配ICP颗粒，随后通过无Cu‘点击(Click)’反应与DNA缀合。c)描绘ICP-DNA缀合物的细胞摄取的方案。
图2显示了DNA-ICP颗粒的表征。以下对象的AFM图像：(a)在云母上滴铸和干燥的裸ICP颗粒。b)在云母上滴铸和干燥的DNA-官能化的ICP颗粒。c)对比裸ICP和DNA-官能化的ICP的尺寸分布的DLS直方图。d)对于不同盐浓度，ICP-DNA聚集体的协作熔化。
图3显示了DNA-ICP颗粒的UV-Vis分析。a)裸ICP颗粒与DNA-ICP颗粒的对比，显示了在260nm的DNA吸光度的变化。插图：在460nm的LMCT消光系数的确定。b)LMCT吸光度的pH依赖性。具有递减pH的λmax的红移指示复杂解离(参见插图)。
图4显示了细胞摄取和基因击倒。用(a)Cy5-ssDNA和(b)DNA-ICP颗粒(在每种情况下100nM DNA)处理的C166细胞的共焦显微术图像。Hoechst染色用蓝色表示细胞核，而与DNA连接的Cy5染料是呈红色。c)通过流式细胞计量术定量的Cy5染料的荧光强度。d)被摄入沉淀的MCF-7乳腺癌细胞中的DNA-ICP的裸眼观察。e)用非靶向DNA-ICP、HER2靶向ssDNA+Lipofectamine和HER2靶向DNA-ICPS处理的SKOV-3细胞中的HER2蛋白的表达。
图5显示了，左：用铁(IIl)滴定配体4；和右：ICP-N3颗粒的ε460的确定。
图6显示了互补的(左)和非互补的(右)ICP/AuNP-DNA缀合物的热变性。
图7显示了在不同时间点和浓度亲本ICP配体3的MTT毒性测定。
具体实施方式
本文提供了采用由三价铁离子和刚性双配位螯合配体制成的无限配位聚合物(ICP)纳米颗粒合成新的SNA纳米颗粒缀合物的策略。
本公开内容可以用于，例如，反义基因调节、药物递送和生物检测。本公开内容的几个优点包括在生理pH以下解体的无毒核心；它们在穿过细胞膜方面与AuNP-SNA一样有效或更好；和所述核心从廉价的结构单元装配，这使得它们易于放大。
在本文中将DNA-官能化的无限配位聚合物(ICP)纳米颗粒公开为生物相容的基因调节剂。从硝酸铁和带有伸出的叠氮化物的双配位的3-羟基-4-吡啶酮(HOPO)配体合成ICP纳米颗粒。Fe(III)向配体溶液的添加会产生纳米颗粒，其在有盐存在下是胶体学上不稳定的。通过无铜点击化学使DNA与Fe(III)-HOPO ICP颗粒缀合，得到胶体学上稳定的核酸纳米构建体。所述DNA-ICP颗粒当通过序列特异性的杂交交联时表现出与致密DNA表面负载相一致的狭窄的高度协作的熔化转变。还评价了DNA-ICP颗粒的进入细胞和改变蛋白表达的能力。我们的结果指示这些新的颗粒不需要转染剂即可将核酸携带进哺乳动物细胞中，并且能够实现有效的基因击倒。
球形核酸(SNA)已经作为一类新的令人感兴趣的在可编程的材料合成[1]、生物检测[2]和细胞内基因调节[3]中表现出前途的材料出现。这样的结构经常包含被致密的寡核苷酸层官能化的纳米颗粒核心，尽管已经开发了中空的无核心形式[4]。SNA的最早例子包括被烷基硫醇-官能化的DNA的致密层修饰的金纳米颗粒[5]，但是还已经探究了氧化铁[6]、银[7]、半导体量子点[8]和有机核心[9]。值得注意的是，SNA的化学和生物学特性显著不同于它们的直链相应物。SNA表现出协作结合和尖锐的热变性谱，不需要阳离子转染剂即可进入细胞，且具有以多价方式结合受体的能力[10]。结果，它们是用于通过基因调节[11]、药物递送[12]和免疫调节途径[13]来操纵细胞过程的强大新实体。SNA的活跃摄取通过窖蛋白介导的胞吞作用而发生，所述胞吞作用通过窖蛋白与A类清道夫受体(SR-As)的结合而触发[14]。尽管由金制成的SNA已经表现出作为医学诊断和研究工具的商业前景且尚未在体内表现出急性毒性[15]，但是存在关于金纳米颗粒的潜在长期毒性和它们的代谢结局的担忧[16]。结果，非常需要具有由生物相容的材料制成的核心的SNA的新形式。本文提供了采用由三价铁离子和刚性双配位螯合配体制成的无限配位聚合物(ICP)纳米颗粒合成新的SNA纳米颗粒缀合物的策略。这些DNA-ICP从被FDA批准用于其它药物用途的化学结构单元设计而成，表现出协作结合，且可以容易地穿过哺乳动物细胞膜和以靶向方式抑制蛋白表达。
ICP纳米颗粒由通过金属结点桥连的有机配体的无定形网络组成[17]。它们是用于SNA构建的有前途的材料，因为可以理性地设计限定ICP结构的配体/金属组合以优化DNA-ICP缀合物的毒理学和药代动力学特性。为医药应用设计的许多ICP的一个主要限制是它们在水性缓冲液中的不稳定性。一些研究人员已经通过将颗粒核心包封在硅胶[18]或脂质壳[19]中来规避了该限制。相反，本文提供了设计ICP颗粒的策略，所述ICP颗粒可以在水性条件下合成、纯化和无限储存，且无需专门设备或试剂。此外，相对无毒的金属离子的应用是生物学应用的一个重要需求。这些目标通过从与FeIII(体内最丰富的转变金属)组合的强螯合3-羟基-4-吡啶酮(3,4-HOPO)配体合成ICP纳米颗粒而完成。已经系统地研究了3,4-HOPO的配位化学和药理学[20]，且1,2-二甲基衍生物(去铁酮)被FDA批准用于治疗人类中的铁超载[21]。此外，已知Fe(HOPO)3复合物在生理pH以下解离[22]。这会提供在细胞进入以后将DNA递送进胞质溶胶中的潜在释放机制，即一种通常与迄今为止制备的SNA无关的新性质。
已知的是，双配位的HOPO和儿茶酚配体(是等电子的)可以与亲氧的金属阳离子诸如FeIII、CrIII、GaIII和其它形成不溶性的配位聚合物，但是，这样的聚合物难以理解，并且在文献中没有被充分研究[23]。这些配体主要被研究用于金属隔离而不是材料合成。因此，这是构建用于DNA修饰的新纳米颗粒支架的机会。具体地，制备了新的双配位的配体DABA-二-HP-N3(4)，其有意地采用廉价的结构单元麦芽酚和3,5-二氨基苯甲酸(DABA,1)(图1a)。两个连续的酸催化的麦芽酚与DABA(1-2；2-3)的缩合，随后的HATU介导的羧酸酰胺化，提供带有叠氮化物的双配位的配体4。重要的是，在3中的羧酸可能被多种胺结构单元酰胺化，从而提供具有可定制的合成后化学(其取决于伸出的官能团)的ICP颗粒。
为了从配体4合成ICP纳米颗粒，制备了配体4的稀NaOH溶液(1.07mM配体,1877μL)，并向其中注射硝酸铁溶液(10.8mM,123μL)(图1b)。颗粒形成立即发生，并且溶液的颜色由于三-HOPO-FeIII复合物的配体-金属电荷转移带(LMCT)(λmax≈460nm)而从澄清变成红色[24]。得到的ICP-N3纳米颗粒在有低浓度的盐(NaCl,Tris·HCl)存在下是胶体学上不稳定的，从而导致红色不溶物的逐渐沉淀。将粗制的ICP-N3颗粒通过离心过滤(100kDa分子量截止)进行纯化并再悬浮于H2O中。颗粒被截留在滤器上，因为它们太大而不能穿过。穿过滤器的材料的微小损失指示得到高分子量物质的胶体分散体。在去离子的H2O中，刚合成的(as-synthesized)颗粒是稳定的，具有10-20nm的平均流体动力学直径，如通过动态光散射(DLS)所确定的(图2c，左)。TEM和AFM成像揭示小纳米颗粒的聚集体，在干燥后发生一定程度的融合。此外，通过光谱法探测了ICP-N3颗粒的组成。制备了含有固定浓度的DABA-二-HP-N3配体在H2O中的溶液的等分试样，并用0-1.1当量范围内的递增量的铁处理。在加入0.66当量的FeIII之前，在460nm的吸光度增加，这与Fe2L3的金属-配体化学计量学相一致(参见图5)。
为了缀合至裸ICP-N3颗粒，将所有寡核苷酸在自动化的DNA合成仪上制备，通过反相HPLC纯化，并通过MALDI-ToF表征。二苯并环辛炔(DBCO)氨基亚磷酸酯是商购可得的，且容易掺入在寡核苷酸的5’末端上。将被酞菁5(Cy5)染料修饰的DNA链用于细胞内成像研究。将被5’烷基硫醇修饰的DNA链用于构建AuNP-SNA以与DNA-ICP颗粒对比(表1)。
如下将带有DBCO的寡核苷酸缀合至ICP-N3颗粒：在NaCl水溶液(0.5M)中简单地混合两种反应物，随后进行重复超滤以除去未反应的DNA。将得到的DNA-ICP颗粒悬浮于Tris·HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，并当在5℃储存时保持胶体学上无限稳定。相反，当在相同离子强度的溶液中储存时，裸ICP-N3颗粒形成沉淀。
除了表现出胶体稳定性以外，还发现DNA-ICP纳米颗粒与裸ICP-N3颗粒相比在大小、表面电荷和形态学方面存在差异。DLS和ζ电位测量分别表明流体动力学直径(图2c，右)和表面电荷的一致增加。另外，可以使用UV-Vis光谱法计算DNA对在260nm的吸光度的相对贡献，且因此可以确定DNA浓度。还使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)直接计算ICP颗粒的消光系数ε460(图3a)。另外，在与DNA缀合以后通过AFM获取颗粒图像以观察大小和形态学的变化(图2a,b)。最后，DNA-ICP颗粒在从生理pH(7.4)至低溶酶体pH(4.0)范围内的水性缓冲液中的温育表明LMCTλmax的明显红移，从而指示包含三配位的FeIII结点的颗粒的部分解离(图3b)。
为了探测DNA-ICP颗粒上的寡核苷酸的表面密度，进行了热变性实验，其中将含有互补序列的ICP(A-ICP和B-ICP)混合，允许杂交，然后加热到双链体的熔化转变以上。游离的双链DNA双链体具有17个碱基对重叠，在0.3M NaCl中具有Tm＝54.0℃。相反，当与ICP-N3颗粒缀合时，相同互补链形成具有Tm＝66.9℃的双链体，接近13℃的增加。另外，DNA-ICP颗粒聚集体的熔化转变是非常狭窄的，这是协同性的标志符号；在熔化曲线的半数最大值处的整个宽度(FWHM)通常<2℃，而游离双链DNA为10-20℃。A-ICP和B-ICP颗粒在从0.1M至1MNaCl范围内的盐浓度熔化，表明Tm随着离子强度增加而增加(图2d)。作为对照实验，单独的A-ICP颗粒在实验条件下没有表现出聚集或熔化，与非互补的颗粒混合的A-ICP颗粒(非靶标-ICP)也没有。
还研究了DNA-ICP颗粒与常规AuNP-SNA的相互作用，以确定DNA-ICP颗粒是否具有与它们的金相应物类似的DNA识别和结合性能。将金纳米颗粒(15nm，Ted Pella)用烷基硫醇修饰的寡核苷酸A-SH官能化，并根据建立的方案进行纯化以得到A-AuNP颗粒[25]。当将A-AuNP和B-ICP颗粒以1:1比率混合时，与在λmax≈520nm处AuNP等离子体共振的伴随增宽和红移一起观察到聚集。在0.3-0.7M NaCl范围的盐浓度收集热变性曲线。作为对照，还混合了非互补的错配的颗粒A-AuNP和A-ICP，并且如预期的，没有表现出聚集或熔化行为(参见图6)。总之，热变性研究定性地提示在ICP-N3颗粒上的高DNA表面负载。以前的研究表明，尖锐的热变性曲线(FWHM<2℃)仅在寡核苷酸负载达到或超过在10nm颗粒核心上的大约50条链时产生[6a]。
表1
由于在DNA-ICP表面上的高表观寡核苷酸密度，假定它们作为有效的基因递送剂起作用，更像它们的金前辈[3]。为了验证该假设，将ICP-N3颗粒用带有内部荧光团标记的聚(CCT)寡核苷酸Cy5-DBCO官能化以得到Cy5-ICP颗粒。同样地，将金纳米颗粒(15nm)用类似的Cy5-SH寡核苷酸官能化以得到具有大约113条链/AuNP的负载的Cy5-AuNP颗粒，如通过荧光测量所确定的。
通过共焦显微术(图3a,b)和流式细胞计量术(图4c)在HeLa宫颈癌细胞中检查了摄取。发现DNA-ICP颗粒比游离的DNA链更有效地穿过细胞膜，且表现出与带有相同序列的AuNP-SNA纳米颗粒相当的摄取[26]。这些结果提示，DNA-ICP纳米颗粒具有将大量呈颗粒结合形式或游离形式的DNA运输至胞质溶胶的潜力。此外，在MCF-7乳腺癌细胞中温育DNA-ICP24小时以后，发现铁浓度的剂量依赖性增加。用肉眼在DNA-ICP处理过的沉淀细胞中可以看到铁复合物的颜色(图4d)。使用C166小鼠内皮细胞的另外共焦显微术实验证实，DNA-ICP无需转染剂容易地进入众多细胞系中。
已经证实了DNA-ICP缀合物以与AuNP-SNA类似的方式进入细胞的能力，研究了它们通过靶向已知的癌症相关的mRNA转录物而改变蛋白表达的能力。作为概念验证(proof-of-concept)，选择SKOV-3卵巢癌细胞，因为它们过表达人上皮生长因子受体2(HER2)，所述HER2参与导致恶性细胞生长和分化的信号转导途径[27]。利用抗-HER2DNA-ICPS执行了一系列基因击倒实验。将SKOV-3细胞与不同浓度的反义DNA-ICPS(HER2-ICP)或非靶向DNA-ICP(非靶标-ICP)一起温育，与(Life Technologies)形成复合物的游离抗-HER2DNA作为阳性对照。3天以后，收获细胞，并通过蛋白质印迹分析确定HER2表达(图4e)。这些结果指示，抗-HER2DNA-ICP会使HER2表达减少55-81％，取决于DNA浓度(1-10μM)。这与用市售转染剂实现的结果相当，且此外用非靶向DNA-ICP未观察到HER2表达的变化。最后，DNA-ICPS处理未导致毒性效应或细胞死亡，如通过MTT测定所预测的。
综上所述，本文提供了合成生物相容的、DNA修饰的无限配位聚合物纳米颗粒的容易方法，所述颗粒在没有转染剂的情况下能够实现细胞进入和基因调节。在水中合成的基于铁(III)的ICP纳米颗粒可以直接缀合至寡核苷酸并携带它们穿过细胞膜。此外，所述核心包含预期不具有显著健康危害的良性结构单元。该工作代表朝向临床上可行的基因调节构建体的构建的一个重大进步，所述构建体用于体内应用于癌症和其它遗传性疾病的治疗中。
金属-配体复合物
在不同的方面，本公开内容提供了Fe(III)和结构的化合物的金属-配体复合物，所述结构具有如本文中公开的取代基。在某些情况下，所述金属-配体复合物是通式Fe2(化合物)3的无限配位聚合物。在不同的情况下，所述金属-配体复合物还可以包含通过来自一种化合物的表面叠氮化物而连接的多核苷酸，以形成具有的表面化合物的叠氮化物的结构，其中L是C1-20亚烷基或-C(O)NH-C1-20亚烷基；且n是1或2。所述多核苷酸可以在多核苷酸的末端处包含炔烃(例如，DBCO)用于连接至表面化合物的叠氮化物。
可以如下得到在末端处含有如本文中公开的部分的多核苷酸：将所述部分连接至被修饰成具有反应性官能团的多核苷酸。例如，可以将氨基烷基修饰的多核苷酸连接至具有羧酸基团或活化的羧酸基团的配体或配体前体。用于活化羧酸基团的合适试剂包括、但不限于：碳二亚胺(例如，二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺、苯基乙基碳二亚胺、苯基异丙基碳二亚胺)、苯并三唑(例如，1-羟基-1H-苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四-甲基脲鎓六氟磷酸盐、O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)、及其混合物。
在某些情况下，所述多核苷酸在末端处被用于与HOPO-配体的叠氮化物反应的DBCO-型部分修饰，其中L是与多核苷酸的末端的接头。L2可以是C1-10亚烷基、-C(O)-C1-10亚烷基-Y-和-C(O)-C1-10亚烷基-Y-C1-10亚烷基-(OCH2CH2)m-Y-；其中每个Y独立地选自键、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；且m是0、1、2、3、4或5。例如，所述DBCO官能团可以通过具有的结构的接头连接，其中末端“O”来自多核苷酸的末端核苷酸。
通常如下制备金属-配体复合物：在合适的溶剂中将如本文中所述的叠氮化物化合物的溶液与Fe3+的溶液组合。通常，当在溶剂中组合时，Fe3+与化合物的摩尔比是至少1:10，例如，至少1:5，至少1:3，至少1:2，至少1:1.5，至少1:1，至少1:0.75，至少1:0.5，至少1:0.25，和/或至少1:0.1。合适的溶剂包括、但不限于水和水性缓冲溶液诸如磷酸盐缓冲盐水。通常，溶剂的pH是约6至约11，例如，约7至约10，约7至约9，和/或约7至约8。然后，使在一个末端处具有炔烃部分的多核苷酸与金属-配体复合物反应以连接至表面叠氮化物。
在不同的方面，本公开内容提供了一种超分子复合物，其包含如本文中所述的第一金属-配体复合物和如本文中所述的第二金属-配体复合物，其中所述第一金属-配体复合物的多核苷酸和所述第二金属-配体复合物的多核苷酸充分互补以在适当条件下杂交。在不同的实施方案中，所述超分子复合物包含与所述第二多核苷酸杂交的所述第一多核苷酸。在某些实施方案中，在超分子复合物内的杂交的第一多核苷酸和第二多核苷酸的熔化温度(Tm)是至少约30℃、至少约35℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃、至少约65℃、至少约70℃、至少约75℃、至少约80℃、至少约85℃、至少约90℃、至少约95℃和/或至少约100℃。所述超分子复合物通常作为纳米颗粒存在，所述纳米颗粒具有约1nm至约1000nm的平均粒径，例如，约2nm至约900nm、约3nm至约800nm、约4nm至约700nm、约5nm至约600nm、约5nm至约500nm、约5nm至约400nm、约5nm至约300nm、约5nm至约200nm、约10nm至约200nm、约10nm至约100nm、约10nm至约90nm、约10nm至约80nm、约10nm至约70nm、约10nm至约60nm、约10nm至约50nm、约20nm至约40nm和/或约30nm。
通常如下制备超分子复合物：在合适的溶剂中将第一多核苷酸-金属-配体复合物的溶液与第二多核苷酸-金属-配体复合物的溶液组合，以通过所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的杂交(由于它们的足够互补性)形成超分子复合物。所述溶液还可以包括氯化钠。
在不同的方面，本公开内容提供了一种抑制由靶多核苷酸编码的基因产物的表达的方法，所述方法包括在足以抑制所述基因产物的表达的条件下使靶多核苷酸与如本文中所述的超分子复合物或金属-配体复合物接触。在某些实施方案中，在体内抑制基因产物的表达。在某些实施方案中，在体外抑制基因产物的表达。在不同的实施方案中，相对于在没有使靶多核苷酸与超分子复合物或金属-配体复合物接触存在下基因产物的表达，基因产物的表达被抑制了至少约5％，例如，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％和/或至少约95％。在不同的方面，本公开内容也提供了一种检测靶分子的方法，所述方法包括使靶分子与如本文中所述的超分子复合物或金属-配体复合物接触，其中所述靶分子和所述超分子复合物或金属-配体复合物之间的接触导致可检测的变化。在某些实施方案中，所述检测是在体外。在某些实施方案中，所述检测是在体内。
多核苷酸
本公开内容预见到的多核苷酸包括DNA、RNA、修饰形式和如本文中定义的它们的组合。因此，在某些方面，所述金属-配体复合物、超分子复合物或纳米颗粒包含DNA。在某些实施方案中，所述DNA是双链的，且在其它实施方案中，所述DNA是单链的。在其它方面，所述金属-配体复合物、超分子复合物或纳米颗粒包含RNA，且在其它方面，所述金属-配体复合物、超分子复合物或纳米颗粒包含双链RNA，且在一个具体实施方案中，所述双链RNA剂是小干扰RNA(siRNA)。术语“RNA”包括两条单独链的双链体、以及单链结构。单链RNA也包括具有二级结构的RNA。在一个方面，预见到具有发夹环的RNA。
在某些方面，所述多核苷酸包含与多核苷酸的靶序列充分互补的序列，使得所述多核苷酸(其为所述金属-配体复合物、超分子复合物或纳米颗粒的组成部分)与所述靶多核苷酸的杂交发生。在不同的方面，所述多核苷酸是单链的或双链的，只要双链分子也包括与靶多核苷酸的单链序列杂交的单链序列。在某些方面，所述多核苷酸(其为所述金属-配体复合物、超分子复合物或纳米颗粒的组成部分)的杂交可以与双链靶多核苷酸形成三链体结构。在另一个方面，双链多核苷酸(其为金属-配体复合物、超分子复合物或纳米颗粒的组成部分)与单链靶多核苷酸的杂交可以形成三链体结构。三链体多核苷酸复合物的进一步描述参见PCT/US2006/40124，其通过引用整体并入本文。
“多核苷酸”在本领域中被理解为包括单个地聚合的核苷酸亚基。本文中使用的术语“核苷酸”或它的复数形式可与本文中讨论的和本领域以其它方式已知的修饰形式互换。在某些情况下，本领域使用术语“核苷碱基”，其包括天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸，后者包括修饰的核苷酸。因而，核苷酸或核苷碱基是指天然存在的核苷碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。非天然存在的核苷碱基包括，例如、但不限于，黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶、N',N'-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C3-C6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和在以下文献中描述的“非天然存在的”核苷碱基：Benner等人,美国专利号5,432,272和Susan M.Freier和Karl-Heinz Altmann,1997,Nucleic AcidsResearch,第25卷:第4429-4443页。术语“核苷碱基”也不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且包括杂环类似物及其互变异构体。其它天然和非天然存在的核苷碱基包括在以下文献中公开的那些：美国专利号3,687,808(Merigan,等人.)，Sanghvi在第15章中，AntisenseResearch and Application,Ed.S.T.Crooke和B.Lebleu,CRC Press,1993；Englisch等人,1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613-722(特别参见第622和623页，和Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,J.I.Kroschwitz编,John Wiley&Sons,1990,第858-859页,Cook,Anti-Cancer Drug Design 1991,6,585-607，它们中的每一篇特此通过引用整体并入)。在不同的方面，多核苷酸也包括一个或多个“核苷碱基”或“碱基单元”，它们是一类非天然存在的核苷酸(其包括化合物诸如可以充当类似核苷碱基的杂环化合物)，包括在最经典含义上不是核苷碱基、但是充当核苷碱基的某些“通用碱基”。通用碱基包括3-硝基吡咯、任选地被取代的吲哚(例如，5-硝基吲哚)和任选地被取代的次黄嘌呤。其它合乎需要的通用碱基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括本领域已知的那些通用碱基。
修饰的核苷酸被描述在EP 1 072 679和WO 97/12896中，其公开内容通过引用并入本文。修饰的核苷酸包括、但不限于，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫基烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代、特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它经修饰的碱基包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的碱基还可以包括这样的碱基：其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环替代，例如，7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核苷碱基包括：在美国专利号3,687,808中公开的那些，在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.,编.John Wiley&Sons,1990中公开的那些，由Englisch等人,1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613公开的那些，和由Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编,CRC Press,1993公开的那些。这些碱基中的某些可用于增加结合亲和力，且包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经证实5-甲基胞嘧啶取代会使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃，且在某些方面与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合。参见，美国专利号3,687,808；4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692和5,681,941，其公开内容通过引用并入本文。
制备预定序列的多核苷酸的方法是众所周知的。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989年第2版)和F.Eckstein(编)Oligonucleotides and Analogues,第1版(Oxford University Press,New York,1991)。固相合成方法对于多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸而言是优选的(众所周知的合成DNA的方法也可用于合成RNA)。还可以酶促地制备多核糖核苷酸。同样可以将非天然存在的核苷碱基掺入多核苷酸中。参见，例如，美国专利号7,223,833；Katz,J.Am.Chem.Soc.,74:2238(1951)；Yamane,等人,J.Am.Chem.Soc.,83:2599(1961)；Kosturko,等人,Biochemistry,13:3949(1974)；Thomas,J.Am.Chem.Soc.,76:6032(1954)；Zhang,等人,J.Am.Chem.Soc.,127:74-75(2005)；和Zimmermann,等人,J.Am.Chem.Soc.,124:13684-13685(2002)。
金属-配体复合物和超分子复合物通常包含长度为约5个核苷酸至约500个核苷酸、或5至约100个核苷酸的多核苷酸。更具体地，金属-配体复合物和超分子复合物包含具有以下长度的多核苷酸：约5至约90个核苷酸长度、约5至约80个核苷酸长度、约5至约70个核苷酸长度、约5至约60个核苷酸长度、约5至约50个核苷酸长度、约5至约45个核苷酸长度、约5至约40个核苷酸长度、约5至约35个核苷酸长度、约5至约30个核苷酸长度、约5至约25个核苷酸长度、约5至约20个核苷酸长度、约5至约15个核苷酸长度、约5至约10个核苷酸长度，和在长度上介于具体公开的大小之间的所有多核苷酸，只要所述多核苷酸能够实现期望的结果。因此，预见到长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个核苷酸的多核苷酸。
如本文中定义的多核苷酸也包括适体。适体的生产和应用是本领域普通技术人员已知的。一般而言，适体是能够紧密地结合和谨慎地区分靶配体的核酸或肽结合物质(Yan等人,RNA Biol.6(3)316-320(2009)，通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，可以通过被称作指数富集(SELEX)法配体系统进化的技术得到适体(Tuerk等人,Science 249:505-10(1990)，美国专利号5,270,163和美国专利号5,637,459，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。核酸适体的一般讨论参见，例如、但不限于，Nucleic Acid and PeptideAptamers:Methods and Protocols(Mayer编,Humana Press,2009)和Crawford等人,Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2(1):72-79(2003)。在Kopylov等人,Molecular Biology 34(6):940-954(2000)(从Molekulyarnaya Biologiya,第34卷,第6期,2000,第1097-1113页翻译而来，通过引用整体并入本文)中提供了适体的另外讨论，包括、但不限于RNA适体的选择、DNA适体的选择、能够共价地连接至靶蛋白的适体的选择、经修饰的适体文库的应用、以及适体作为诊断剂和治疗剂的应用。在不同的方面，适体的长度是在10-100个核苷酸之间。
在不同的方面，所述方法包括与靶多核苷酸100％互补(即，完美匹配)的多核苷酸的应用，而在其它方面，所述多核苷酸在多核苷酸的长度上与靶多核苷酸具有至少(意味着大于或等于)约95％互补性，在多核苷酸的长度上与靶多核苷酸具有至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％互补性，只要所述多核苷酸能够实现靶基因产物的期望抑制。本领域技术人员将理解，杂交程度不如靶多核苷酸的结果检测或基因产物表达的抑制程度显著。
多核苷酸密度
如本文中提供的金属-配体复合物和超分子复合物在所述复合物的表面上具有一定密度的多核苷酸。在某些方面，多核苷酸对降解的抗性和/或细胞对纳米颗粒的摄取受与所述复合物结合的多核苷酸的密度影响。如在PCT/US2008/65366(通过引用整体并入本文)中所述，在多核苷酸官能化的复合物的表面上的较高多核苷酸密度与细胞对复合物的摄取增加有关。
可以根据经验确定足以使复合物稳定的表面密度和对于复合物和多核苷酸的期望组合达到所述表面密度所需的条件。宽泛而言，使用的多核苷酸越小，多核苷酸的表面密度可以越高。通常，至少1pmol/cm2的表面密度将足以提供稳定的复合物。在某些方面，所述表面密度是至少10pmol/cm2。还提供了这样的方法，其中所述多核苷酸以至少2pmol/cm2、至少3pmol/cm2、至少4pmol/cm2、至少5pmol/cm2、至少6pmol/cm2、至少7pmol/cm2、至少8pmol/cm2、至少9pmol/cm2、至少10pmol/cm2、至少约15pmol/cm2、至少约20pmol/cm2、至少约25pmol/cm2、至少约30pmol/cm2、至少约35pmol/cm2、至少约40pmol/cm2、至少约45pmol/cm2、至少约50pmol/cm2、至少约55pmol/cm2、至少约60pmol/cm2、至少约65pmol/cm2、至少约70pmol/cm2、至少约75pmol/cm2、至少约80pmol/cm2、至少约85pmol/cm2、至少约90pmol/cm2、至少约95pmol/cm2、至少约100pmol/cm2、至少约125pmol/cm2、至少约150pmol/cm2、至少约175pmol/cm2、至少约200pmol/cm2、至少约250pmol/cm2、至少约300pmol/cm2、至少约350pmol/cm2、至少约400pmol/cm2、至少约450pmol/cm2、至少约500pmol/cm2、至少约550pmol/cm2、至少约600pmol/cm2、至少约650pmol/cm2、至少约700pmol/cm2、至少约750pmol/cm2、至少约800pmol/cm2、至少约850pmol/cm2、至少约900pmol/cm2、至少约950pmol/cm2、至少约1000pmol/cm2或更多的表面密度存在于纳米颗粒中。
预见到，在复合物中的多核苷酸的密度调节与表面上的多核苷酸和/或与复合物本身的特异性的生物分子和/或非生物分子相互作用。在不同条件下，基于由多核苷酸的密度造成的位阻，可以禁止一些多肽与多核苷酸(其为复合物的组成部分)发生相互作用。在需要多核苷酸与否则会被位阻妨碍的生物分子和/或非生物分子的相互作用的方面，降低复合物中的多核苷酸的密度以允许所述生物分子和/或非生物分子与所述多核苷酸相互作用。
还预见到，多核苷酸表面密度会调节与复合物结合的多核苷酸的稳定性。因而，在一个实施方案中，提供了包含多核苷酸的复合物，其中所述多核苷酸具有与不是复合物的组成部分的相同多核苷酸的半衰期至少基本上相同的半衰期。在其它实施方案中，所述与复合物结合的多核苷酸具有比不是复合物的组成部分的相同多核苷酸的半衰期大约5％至大约1,000,000倍或更多的半衰期。
检测靶多核苷酸的方法
本公开内容提供了检测靶分子的方法，所述方法包括使靶分子与如本文中所述的复合物接触。在不同的方面，所述接触导致基因表达的调节，如本公开内容所提供的。在另一个方面，所述接触导致可检测的变化，其中所述可检测的变化指示靶分子的检测。通过本文所述的任意方法执行可检测标记的检测，且所述可检测标记可以是在作为金属-配体复合物或超分子复合物的组成部分的分子上，或可以是在靶分子上。
抑制基因表达的方法
本公开内容提供的另外方法包括抑制从靶多核苷酸表达的基因产物的表达的方法，所述方法包括使靶多核苷酸与如本文中所述的复合物接触，其中所述接触足以抑制所述基因产物的表达。基因产物的抑制源自靶多核苷酸与本公开内容的复合物的杂交。
在本领域中理解，为了与靶多核苷酸特异性地杂交，作为金属-配体复合物或超分子复合物的组成部分的多核苷酸的序列不需要与它的靶多核苷酸的序列100％互补。此外，作为金属-配体复合物或超分子复合物的组成部分的多核苷酸可以在一个或多个区段上与靶多核苷酸杂交，使得插入或邻近区段不参与杂交事件(例如、但不限于，环结构或发夹结构)。在作为金属-配体复合物或超分子复合物的组成部分的多核苷酸的长度上确定互补性百分比。例如，假如金属-配体复合物或超分子复合物包含多核苷酸，其中所述多核苷酸的20个核苷酸中的18个与100个核苷酸总长度的靶多核苷酸中的20个核苷酸区域互补，那么作为金属-配体复合物或超分子复合物的组成部分的多核苷酸是90％互补的。在该实施例中，剩余的非互补的核苷酸可能聚簇或夹杂着互补核苷酸，且不需要彼此连续或与互补核苷酸连续。使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对研究工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)，可以常规地确定作为金属-配体复合物或超分子复合物的组成部分的多核苷酸与靶多核苷酸的区域的互补性百分比。
用于抑制基因产物表达的方法包括这样的方法，其中与在没有包含多核苷酸的金属-配体复合物或超分子复合物存在下的基因产物表达相比，靶基因产物的表达被抑制了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。换而言之，提供的方法包括导致靶基因产物的表达的基本上任何抑制程度的那些方法。
在体内从体液样品或从活组织检查样品或通过本领域众所周知的成像技术确定抑制程度。可替换地，在体外在细胞培养测定中确定抑制程度，通常作为使用如本文中所述的组合物引起的在体内可以表达的抑制程度的预测措施。本公开内容预见到，使用靶多核苷酸的抑制来评估对给定细胞的抑制的影响。作为非限制性例子，人们可以研究基因产物的抑制的影响，其中所述基因产物是信号转导途径的组成部分。可替换地，人们可以研究基因产物的抑制，其中假定所述基因产物参与细胞凋亡途径。
应该理解，本文所述的任何方法可以联合使用以实现期望的结果。例如、但不限于，可以组合本文描述的方法以允许一个或两个方法检测靶多核苷酸以及调节它的表达。在某些实施方案中，可以在体外或在体内使用该组合来量化靶多核苷酸表达随时间的抑制。在一个方面，如下实现随时间的定量：在指定的时间点从培养物取出细胞，和在每个时间点评估靶多核苷酸的相对表达水平。靶多核苷酸的量随时间的减少(在一个方面，如通过可检测标记的显影所评估的)指示靶多核苷酸的抑制速率。
因而，确定给定的多核苷酸与靶多核苷酸杂交并抑制靶多核苷酸的表达的有效性，以及确定给定的多核苷酸对细胞的抑制作用，是预见到的方面。
实施例
一般材料和方法：3,5-二氨基苯甲酸购自TCI America(Portland,OR)。4-叠氮基-丁-1-胺购自Synthonix,Inc.(Wake Forest,NC)。用于寡核苷酸合成的所有试剂购自GlenResearch(Sterling,VA)并根据生产商的说明书使用。缓冲溶液购自Invitrogen(Carlsbad,CA)。氘代溶剂购自Cambridge Isotope Laboratories Inc.(Andover,MA)。金纳米颗粒购自Ted Pella(Redding,CA)。Ultra离心过滤器单元购自EMDMillipore(Billerica,MA)。所有其它试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)且不经进一步纯化地使用。在Bruker Avance 400MHz NMR谱仪上记录1H NMR谱。1H NMR谱在内部参考氘代溶剂中的残余质子信号。在Agilent DD2 500MHz NMR谱仪(运行在100℃的内部温度)上收集化合物3和4的13C NMR谱。在Agilent 6120LC-TOF仪器上以正离子化模式记录电喷射电离(ESI)质谱图。在Agilent Cary 5000UV-Vis波谱仪上在具有1cm的路径长度的石英比色皿中收集UV-Vis波谱和热变性曲线。采用2,5-二羟基乙酰苯(DHAP)作为基体材料，在Bruker AutoFlex III MALDI-ToF质谱仪上收集基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(MALDI-ToF)数据。在Perkin-Elmer Spectrum 100FTIR波谱仪上收集FTIR波谱。在配备Silicon-SPM-Sensor的Bruker Dimension Icon原子力显微镜上以非接触模式收集AFM图像。在Hitachi H8100透射电子显微镜(运行在200kV的加速电压)上收集TEM图像。在配备2个Thermo Scientific X-射线EDX检测器的Hitachi HD2300STEM上收集TEM和EDX数据。在Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd)上收集动态光散射(DLS)和ζ电位测量结果。在Thermo X-series II ICP-MS上收集ICP-MS数据。由IntertekPharmaceutical Services(Whitehouse,NJ)离场(off-site)进行元素分析。
二氨基苯甲酸单-羟基吡啶酮(2)
向具有磁力搅拌器的100mL圆底烧瓶中加入3,5-二氨基苯甲酸(5.00g,32.86mmol)、麦芽酚(8.70g,69.00mmol)和30mL酸性的正丙醇(49:1丙醇/12M HCl)。给反应容器装配水冷却的冷凝器，并将混合物加热至回流保持16h。将得到的混悬液趁热真空过滤，并将固体用丙酮(200mL)洗涤以产生4.84g作为褐色粉末的(2)(18.60mmol,57％)。可以用5:1EtOH/H2O替换丙醇，得到类似的收率。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8 7.52(d,J＝7.4Hz,1H),7.28-7.26(m,1H),6.92(t,J＝1.7Hz,1H),6.67(t,J＝2.1Hz,1H),6.16(d,J＝7.3Hz,1H),5.77(s,2H),1.96(s,3H)。13C NMR(101MHz,DMSO-d6)8 169.96,167.24,150.62,145.45,142.79,138.07,133.21,129.02,115.64,115.35,114.34,111.30,13.61.HRMS-ESI(m/z):C13H13N2O4的[M+H]+计算值261.0870，实测261.0875。
二氨基苯甲酸二-羟基吡啶酮(3)
向具有磁力搅拌器的100mL圆底烧瓶中加入(2)(5.90g,22.67mmol)、麦芽酚(3.57g,28.34mmol)、和30mL酸性的2-乙氧基乙醇(49:1乙氧基乙醇/12M HCl)。给反应容器装配水冷却的冷凝器，并将混合物加热至回流保持64h。将得到的混悬液趁热真空过滤，并将固体用水(50mL)、随后用丙酮(50mL)洗涤，以得到作为细棕色固体的粗产物。将二元产物通过从煮沸的吡啶(100mL)中沉淀来选择性地分离，过滤，并从热二甲基甲酰胺(100mL)进一步沉淀，并在真空中干燥以得到0.98g作为灰色粉末的(3)(2.66mmol,12％)，其微溶于甲醇，可溶于热DMSO和DMF。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8 8.03(d,J＝2.0Hz,2H),8.00(t,J＝2.0Hz,1H),7.64(d,J＝7.4Hz,2H),6.22(d,J＝7.4Hz,211),2.02(s,6H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6)8 170.43,165.59,145.52,142.92,138.79,138.26,134.82,130.74,130.47,128.55,111.45,111.28,13.79,13.60。HRMS-ESI(m/z):C19H17N2O6的[M+H]+计算值369.1081，实测369.1084。
二氨基苯甲酸二-HP叠氮化物(4)
向具有磁力搅拌器的50mL圆底烧瓶中加入完全溶解在无水DMSO(30mL)中的(3)(0.400g,1.09mmol)。随后加入HATU(0.414g,1.09mmol)和二异丙基乙胺(0.48mL,2.73mmol)，并用橡胶隔片盖住反应容器。5分钟以后，经由注射器注射4-叠氮基丁-1-胺(0.187g,1.64mmol)，并将混合物在N2下搅拌4h。将有机相用1体积的水稀释，并将其静置1h。将得到的灰色沉淀物通过真空过滤进行收集，并用水(150mL)、随后用乙腈(100mL)充分洗涤，并在滤纸上干燥。将得到的叠氮化物单体(4)不经进一步纯化地使用(0.283g,0.61mmol,56％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8 8.72(t,J＝5.7Hz,1H),8.00(d,J＝2.0Hz,2H),7.91(t,J＝1.9Hz,1H),7.63(d,J＝7.3Hz,211),6.23(d,J＝7.4Hz,211),3.41-3.19(m,411),2.03(s,611),1.60-1.53(m,411)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6)8 170.41,164.21,145.55,142.74,138.81,138.27,137.87,128.68,128.54,126.92,126.78,111.39,111.23,51.14,39.56,26.72,26.37,13.81,13.62.HRMS-ESI(m/z):C23H25N6O5的[M+H]+计算值465.1881，实测465.1881.FTIR(KBr):vmax.2093cm-1(N＝N＝N段)。
DABA-二-HP-N3ICP颗粒(ICP-N3NP)的合成
在一个典型实验中，制备由2.28mM配体和24.5mM NaOH组成的DABA-二-HP-N3的水性储备溶液。所述配体作为它的二钠盐易溶于水。制备由10.80mM Fe3+和4mM HCl(作为稳定剂)组成的Fe(NO3)3·9H2O的储备溶液。向玻璃瓶中加入877μL配体储备溶液，随后加入1mLMilli-Q H2O，随后加入123μL Fe(III)储备溶液，并将得到的橙红色混合物(2mL)摇动10分钟。合成的颗粒具有10-20nm范围内的平均直径(DLS)。将颗粒如下纯化：穿过具有100kDa的标称分子量截止值(MWCO)的Amicon Ultra 15mL离心过滤器过滤，用3x 3mL部分的Milli-QH2O洗涤，每次在5000rcf旋转10分钟。将颗粒再悬浮于2mL H2O中以产生1mM的近似叠氮化物浓度。将颗粒溶液低压冻干，并将得到的暗红色粉末通过FTIR(KBr)表征，表明在纳米颗粒合成以后保留在2093cm-1的特征性叠氮化物段。
ICP-N3纳米颗粒的表征：为了确定金属-配体结合的化学计量学，我们进行了滴定，其中用0-220μM范围内的递增量的Fe(NO3)3·9H2O制备样品，每个样品含有在1mL H2O中的固定浓度的200uM DABA-二-11P-N3(4)。针对每个样品测量在460nm的吸光度。在460nm的LMCT带是三-HOPO-Fe3+配位络合物的特征。在133μM(0.66当量)达到等当量点，其与Fe2L3化学计量学一致(图5)。吸光度的进一步增加是由于未配位的铁前体盐的存在。另外，我们对低压冻干的颗粒样品进行了元素分析以评估它们的组成。C69H66Fe2N18O15的计算值：C55.28％，H 4.44％，N 16.82％。实测C 49.10％，H 4.18％；N 14.18％。通过ICP颗粒的多孔性质和它们的捕获极性溶剂分子(例如H2O)的能力，可以解释观察到的较低有机含量。最后，我们通过能量分散X-射线光谱法(Hitachi H2300-A STEM)研究了裸ICP。
串联使用ICP-MS和UV-Vis以确定颗粒在Milli-Q H2O中的消光系数(ε460)。简而言之，在不同稀释度制备5个ICP-N3颗粒在H2O中的样品，并通过UV-Vis测量在460nm的吸光度。随后，通过ICP-MS确定每个样品的铁浓度。在矩阵中制备由3％HNO3、5ppb铟(内部标准品)和去离子水组成的每个样品。将铁浓度相对于A460绘图，并通过简单的线性回归模型拟合数据。线的斜率对应于从ICP-N3颗粒的LMCT衍生出的约2870L·moll cm-1的ε460，从而允许铁浓度的光谱确定。
预期通过以上操作产生的颗粒的重量是在10-1000kDa的范围内，因为小部分的合成颗粒穿过100kDa截止过滤器。支持该观察结果的是，当从3,4-HOPO-Fe(III)复合物的文献稳定常数估计时，在上面给出的反应条件下，双配位的3,4-HOPO的预测聚合度是大约1000重复单元。
根据标准的生产商三苯甲基添加(trityl-on)方案，为非核苷的氨基亚磷酸酯使用另外5分钟偶联时间，在BioAutomation MM48DNA合成仪上进行所有DNA合成。使用Ac-dC和dmf-dG氨基亚磷酸酯能够在室温将核苷碱基去保护。在1μmol规模合成寡核苷酸，并在室温在浓NH4OH(30％)中去保护17小时，但是含有聚(CCT)-Cy5的寡核苷酸除外，将其在室温去保护2小时。采用0-75％乙腈在三乙基乙酸铵缓冲液(pH 7.0)中的梯度历时45分钟在配有DynaMax Microsorb C18柱的Varian Prostar HPLC上纯化得到的粗制的寡核苷酸。如下监测洗脱液的光学吸光度：对于含有DBCO的寡核苷酸在254/310nm；对于含有Cy5的寡核苷酸在254/649nm；和对于所有其它寡核苷酸在254/280nm。将DBCO封端的寡核苷酸低压冻干，再悬浮于H2O中，并立即缀合至ICP-N3纳米颗粒。将二硫化物封端的寡核苷酸低压冻干，还原成游离巯基并缀合至AuNP，如在Hurst等人,Anal.Chem.,2006,78:8313-8318中所述。
表
AuNP-DNA缀合物的合成和表征：根据建立的方案3制备在该研究中合成的AuNP-SNA。对于在细胞摄取实验中采用的AuNP-SNA，通过荧光测量来确定寡核苷酸/AuNP的数目。使用5nM的Cy5标记的AuNP-SNA的溶液，定量AuNP-SNA上的寡核苷酸负载。使用在去离子水中稀释的100mM KCN溶解Au核心。然后将混合物在室温温育20分钟，并相对于标准曲线测量得到的荧光。标准曲线由在浓度范围内的相同寡核苷酸序列组成，将它们溶解在水中，用KCN处理，并以与SNA相同的方式温育。使用Synergy H4荧光平板读数器(BioTek)进行所有荧光测量。用作细胞摄取实验阳性对照的CCT-Cy5-AuNP上的负载是113条链/颗粒(CCT-Cy5-AuNP)。Cy5-T20-AuNP上的负载是157条链/颗粒(Cy5-T20-AuNP)。为非荧光AuNP-SNA(A-AuNP)假定类似值。
DNA-ICP缀合物的合成：在一个典型操作中，制备含有100μM期望的环辛炔-DNA、0.5M NaCl和ICP-N3颗粒(以叠氮化物计500μM)在2mL Milli-Q H2O中的溶液。将得到的澄清的橙色溶液在37℃摇动16h。将反应混合物穿过Ultra 15mL离心过滤器(100kDa MWCO)通过超滤进行纯化，用4x 3mL部分的0.1M Tris缓冲液(pH 8.0)洗涤，在5000rcf旋转10分钟。将颗粒再悬浮于1mL 0.1M Tris(pH 8.0)中。DNA-ICP颗粒在高盐浓度(直到1M NaCl)保持胶体学上稳定，这不同于裸ICP-N3颗粒，后者在1M NaCl中在几分钟内沉淀。该观察结果指示稳定DNA表面层已经成功地缀合至颗粒。
DNA-ICP缀合物的表征：通过DLS、ζ电位和UV-Vis分析DNA-ICP颗粒的大小、电荷和DNA-负载。使用比率(A260/A460)通过UV-Vis确定颗粒溶液的DNA浓度。在Milli-Q H2O中的裸颗粒具有约5.4的A260/A460。合成了具有在10.9-15.5之间变化的比率A260/A460的DNA修饰的颗粒，从而指示与颗粒连接的DNA的存在。进行充分洗涤以确保在溶液中没有剩余游离的DNA。含有Cy5的DNA的负载显著更低，可能是由于染料标记的空间大小。最后，对比了裸和DNA-负载的ICP的ζ电位，在10mM Tris缓冲液(pH 8.0)和0.1M NaCl中在相同稀释度制备所有样品。为本文中合成的ICP颗粒收集以下数据:
| ICP颗粒类型 | ζavg(mV) | dH(nm) | ％A260DNA |
| 裸 | -18.9 | 14±2 | - |
| A-ICP | -35.2 | 31±10 | 53％ |
| B-ICP | -33.7 | 32±8 | 60％ |
| Her2-ICP | -31.1 | 31±13 | 61％ |
| 非靶标-ICP | -33.4 | 31±11 | 65％ |
| Cy5-ICP | -23.7 | n/a* | 14％ |
热变性研究：将带有含17个碱基对重叠的互补序列的DNA-ICP颗粒(A-ICP)和(B-ICP)在不同盐浓度在0.1M Tris缓冲液(pH 8.0)中混合，并在0.25℃/分钟的速度从20℃加热至80℃。在室温，在混合互补DNA-ICP的30-60分钟内形成不溶性聚集体。加热后，观察到尖锐的熔化转变，其与ICP颗粒的高DNA表面负载相一致。对于一对含错配序列的DNA-ICP(B-ICP和非靶标-ICP)，没有观察到相同行为。游离的DNA双链体在0.3M NaC1中具有54℃的熔化温度，与此相比，DNA-ICP为>60℃，取决于NaC1浓度。使用金纳米颗粒/DNA-ICP对(A-AuNP和B-ICP)重复相同实验。在递增NaC1浓度的结果显示在图6中。
DABA-二-HP-N3配体的MTT毒性测定：为了确保包含颗粒核心的亲本配体不表现出细胞毒性，执行了MTT测定。将C166细胞以5x103个细胞/孔的密度(population)接种在96-孔板中。24h以后，将细胞用0.1mL化合物(3)(1μM在OptiMEM中)处理并在37℃温育24h。温育以后，将化合物从细胞除去并用0.1mL完全DMEM(补充了10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素)替换。将化合物3加给细胞以后，在24h、48h和72h通过MTT测定测量细胞生存力。简而言之，将细胞与0.1mL完全DMEM一起温育。将10μL MTT溶液(5mg/mL MTT在lx PBS中；Molecular Probes)加入每个细胞孔中，并将细胞在37℃温育2h。温育以后，将0.1mL SDS-HCl溶液(0.1g/mL SDS在0.01M HC1中)加入每个孔中以溶解甲臢产物，并将细胞在37℃进一步温育过夜。温育过夜以后，使用Synergy 114Multimode Microplate Reader(Biotek)在570nm测量细胞裂解物的吸光度。计算相对于对照孔(其含有用DMSO在OptiMEM中的溶液处理的细胞)的相对细胞生存力。报告的值代表三个独立实验的平均值±SE，如在图7中所示。
细胞培养摄取研究：为了通过共焦显微术观察细胞摄取，在补充了10％胎牛血清(Atlanta Biologicals)和1％青霉素/链霉素(Life Technologies)的DMEM中培养宫颈癌(HeLa)和C166小鼠内皮细胞。
使用SP5激光扫描共焦显微镜执行所有显微术。通过在Nunc Lab-Tek II硼硅酸盐-底室载玻片(Thermo Scientific)中在大约30％汇合时在补充的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM,Life Technologies)中培养HeLa细胞，得到细胞图像。允许细胞贴壁24小时，此后将它们用PBS洗涤一次，并再悬浮于OptiMEM中。然后将细胞用100nM浓度(DNA基础)的线性DNA、SNA或ICP处理。24小时以后，将细胞用OptiMEM洗涤一次，并再悬浮于含有Hoechst 33258(Life Technologies)的DMEM中。将相同方法用于流式细胞计量术，但是不用Hoechst处理细胞，而是在05％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)中用胰蛋白酶处理3分钟，再悬浮于OptiMEM中，并使用配备633nm激光器的Guava Easycyte 8HT(Millipore)分析。
对于细胞摄取的裸眼观察，将MCF-7细胞铺板在6孔板中(400,000个细胞/孔)。将细胞在DMEM+含有10％FBS的培养基中温育24小时以后，将细胞培养基更换成Optimem并将下述浓度的DNA-ICP加入各个孔中：0.0、0.1、0.5、1.0、2和5μM。将颗粒在细胞中温育24小时，此后将细胞在PBS中洗涤3次，给细胞补充新鲜培养基，并将细胞温育另外48小时。此后，将细胞剧烈洗涤以除去任何细胞外ICP颗粒，用胰蛋白酶处理，并立即转移至含有PBS的1.5ml eppendorf试管。然后将细胞在1100RPM离心5分钟以形成细胞沉淀。
蛋白质印迹和基因击倒分析：SKOV3细胞得自美国组织培养中心(AmericanTissue Culture Collection，ATCC)。将细胞在补充了10％热灭活的FBS的McCoy’s 5A培养基中在37℃在5％CO2中温育。以100,000个细胞/孔在6孔细胞培养板(BD Biosciences)中培养细胞，所述细胞在用ICP处理之前24小时接种。将培养基用Opti-MEM(LifeTechnologies)更换，然后立即用ICP或Lipofectamine RNAimax(Life Technologies)DNA处理。根据生产商的说明书执行Lipofectamine转染以递送25pmol的DNA。12小时以后，将培养基用新鲜培养基(含有10％FBS的McCoy's 5A)替换，并将细胞温育另外48小时。然后将细胞用PBS洗涤3次，用胰蛋白酶处理，并将沉淀物再悬浮于100μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Scientific)的哺乳动物细胞裂解缓冲液(Cell Signalling)中。然后将全细胞裂解物纯化，并通过离心进行收集和在-80℃冷冻。使用BCA Protein Assay Kit(Pierce)确定蛋白浓度。将等量的蛋白样品(25μg)通过4-20％预浇梯度凝胶(Bio-Rad)分级分离并转移至硝酸纤维素膜(Thermo Scientific)。将膜干燥过夜，在PBS中再水合，然后在封闭缓冲液(LI-COR Biosciences)中在室温封闭1小时。用针对HER2的兔第一抗体(1000:1)(CellSignaling)、针对β-微管蛋白的小鼠抗体(1000:1)(Thermo Scientific)和抗-兔或抗-小鼠IgG-染料缀合的第二抗体(10,000:1)(LI-COR Biosciences)检测蛋白。记录荧光信号，并使用Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences)定量，和使用Image Studio软件(LI-COR Biosciences)定量。
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[26]Note that the gold core is capable of quenching the fluorescenceof dye-labeled oligonucleotides,which may lower the apparent fluorescenceintensity.
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序列表
<110> Mirkin等人
<120> 用于反义基因调节的生物相容的无限配位聚合物纳米颗粒–核酸缀合物
<130> 30938/2014-110
<150> US 62/039,696
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<160> 8
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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aaaaaatcct tatcaatatt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' DBCO-TEG
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aaaaaatcct tatcaatatt t 21
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> 己烷硫醇
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多核苷酸
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<222> (1)..(1)
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<400> 4
ctccatggtg ctcac 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' DBCO
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ctccttcacc ttcgcgcagc 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n是Cy5
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 丙烷硫醇
<400> 8
nttttttttt tttttttttt t 21
Claims (28)
1.一种具有以下结构的化合物
其中
L是C1-20亚烷基或-C(O)NH-C1-20亚烷基；且
n是1或2。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中n是1。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述吡啶酮部分在对位处连接至苯基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中n是2。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述吡啶酮部分在每个间位处连接至苯基。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物，其中L是C1-20亚烷基。
7.根据权利要求1-5中的任一项所述的化合物，其中L是-C(O)NH-C1-20亚烷基。
8.一种多核苷酸，其在末端处包含含有下式的部分：
其中
L是C1-20亚烷基或-C(O)NH-C1-20亚烷基；且
n是1或2。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中n是1。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中所述吡啶酮部分在对位处连接至苯基。
11.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中n是2。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述吡啶酮部分在每个间位处连接至苯基。
13.根据权利要求8-12中的任一项所述的多核苷酸，其中L是C1-20亚烷基。
14.根据权利要求8-12中的任一项所述的多核苷酸，其中L是-C(O)NH-C1-20亚烷基。
15.根据权利要求8-14中的任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的末端具有结构：或其混合物，
L2是C1-10亚烷基、-C(O)-C1-10亚烷基-Y-和-C(O)-C1-10亚烷基-Y-C1-10亚烷基-(OCH2CH2)m-Y-；
每个Y独立地选自键、C(O)、O、NH、C(O)NH和NHC(O)；且
m是0、1、2、3、4或5。
16.根据权利要求8-15中的任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含DNA。
17.根据权利要求8-16中的任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含5-100个核苷碱基。
18.一种金属-配体复合物，其包含根据权利要求8-17中的任一项所述的多核苷酸和Fe(III)。
19.一种金属-配体复合物，其包含根据权利要求1-7中的任一项所述的化合物和Fe(III)。
20.根据权利要求19所述的金属-配体复合物，其呈具有Fe2(化合物)3的重复式的无限配位聚合物形式。
21.根据权利要求19或20所述的金属-配体复合物，其还包含多核苷酸，所述多核苷酸通过所述多核苷酸上的炔烃部分共价地连接至所述化合物上的叠氮化物部分以形成三唑键。
22.根据权利要求21所述的金属-配体复合物，其中所述多核苷酸通过连接至所述化合物上的表面叠氮化物。
23.一种超分子复合物，其包含根据权利要求18-22中的任一项所述的第一金属-配体复合物和根据权利要求18-22中的任一项所述的第二金属-配体复合物，其中所述第一金属-配体复合物的多核苷酸与所述第二金属-配体复合物的多核苷酸充分互补以在适当条件下杂交。
24.一种抑制由靶多核苷酸编码的基因产物的表达的方法，所述方法包括在足以抑制所述基因产物的表达的条件下使所述靶多核苷酸与根据权利要求22所述的超分子复合物或者根据权利要求21或22所述的金属-配体复合物接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在体内抑制所述基因产物的表达。
26.根据权利要求24所述的方法，其中在体外抑制所述基因产物的表达。
27.根据权利要求24-26中的任一项所述的方法，其中相对于在没有使所述靶多核苷酸与所述超分子复合物或所述金属-配体复合物接触存在下所述基因产物的表达，所述基因产物的表达被抑制了至少约5％。
28.一种检测靶分子的方法，所述方法包括使所述靶分子与根据权利要求22所述的超分子复合物或者根据权利要求21或22所述的金属-配体复合物接触，其中所述靶分子和所述超分子复合物或所述金属-配体复合物之间的接触导致可检测的变化。
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