CN105705638A - 改善的具有高效能的纳米颗粒型寡核苷酸结构及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及寡核苷酸结构及其制备方法且更具体地涉及这样的寡核苷酸结构，其中聚合物化合物经共价键连接至寡核苷酸以改善所述寡核苷酸的体内稳定性和所述寡核苷酸的细胞递送效能；且涉及其制备方法。所述寡核苷酸结构被改善为均质物质，由此解决了由于在连接至所述寡核苷酸的亲水性材料为合成聚合物时产生的多分散特性所导致的物质确认中的问题；相比于现有方法，所述核苷酸结构易于合成；且双螺旋寡RNA结构的大小可通过控制亲水性材料嵌段的重复数目而精确地调节，且因此所述寡核苷酸的基因表达调节功能通过合成优化的寡核苷酸结构而不会变坏，且所述寡核苷酸可甚至以相对低浓度的剂量递送到细胞中。因此，本发明的寡核苷酸结构可用作用于治疗癌症、感染性疾病等的一类新的寡核苷酸递送系统及工具。
Description
技术领域
本发明涉及具有高效能的寡核苷酸结构，其可有效用于治疗癌症、感染性疾病等。
本发明的寡核苷酸结构具有这样的结构，其中通过使用简单的共价键或由衔接物介导的共价键将亲水性材料和疏水性材料缀合于寡核苷酸的两端，使得包含在寡核苷酸结构中的寡核苷酸有效递送到细胞中，其中可通过寡核苷酸结构在水溶液中的疏水性相互作用将所述结构转化为纳米颗粒形式。
此外，本发明涉及包含所述寡核苷酸结构的药物组合物、制备所述寡核苷酸结构的方法及使用所述寡核苷酸结构递送寡核苷酸的技术。
背景技术
目前已经积极地开发了基于寡核苷酸诸如反义寡核苷酸(ASO)、RNA干扰(以下称为‘RNAi’)、微小RNA(miRNA)等的各类治疗剂。
ASO具有通过改变mRNA经单链RNA或DNA链的中间代谢来控制信息由基因转移至蛋白的功能，从而通过选择充分互补且特定杂交的碱基序列而实现预期的对靶标蛋白的表达控制。ASO以序列特异性结合于靶标基因，其对除靶标基因以外的其它基因的表达不具有作用。因此，ASO技术是一种用于分析特定蛋白的体内功能的工具且具有用作针对特定疾病的基因疗法的可能性(FASEBJ.9,1288-1296,1995)。
miRNA(微小RNA)是在受试者中天然产生的一大类小的RNA，且它们中的至少一些控制靶标基因的表达。miRNA由约70个核苷酸单链发夹结构前体转录组通过核糖核酸酶Dicer形成(Ambrosetal.2003.currentbiology13(10):807-818)，其中Dicer切割前体以形成21-23个核苷酸双链miRNA。在许多情况下，miRNA由一些功能尚未被发现的DNA序列转录。miRNA不被翻译为蛋白，但是miRNA与阻断翻译的特定mRNA结合。据信miRNA与其靶标不正确地形成碱基对，从而抑制翻译。
自从已经发现了RNAi的作用，在各种类型的哺乳动物细胞中发现RNAi以序列特异性对mRNA发挥作用(Silenceofthetranscripts:RNAinterferenceinmedicine.JMolMed,2005,83:764-773)。当将双链RNA的长链递送到细胞中时，所递送的双链RNA转化为小干扰RNA(以下称为‘siRNA’)，其通过称为Dicer的核酸内切酶被加工为21至23个碱基对(bp)。siRNA具有双链RNA的含有19至27个碱基的短链且偶联至由RNA诱导的沉默复合物(RISC)，由此向导(反义)链识别并分解靶标mRNA，从而序列特异性地抑制靶标基因的表达(Nucleic-acidtherapeutics:basicprinciplesandrecentapplications.NatureReviewsDrugDiscovery.2002.1,503-514)。
具体地，由外部递送的双链RNA的长链存在由于干扰素在哺乳动物细胞中表达而过度引起非序列特异性免疫反应的问题；然而，发现该问题可通过短链siRNA来克服(Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.2001.411,494-498)。
然而，siRNA也具有由细胞中存在的感受器产生先天免疫应答刺激的可能性，且因此，为了克服该可能性，改变siRNA的特异性结构或已经开发了2-甲氧基替代物或2-氟替代物。
化学合成的siRNA具有约19-27个碱基对(bps)的双链且在3’-端具有2-nt(核苷酸)悬突结构，且为了双链siRNA表达活性而已知的是，双链siRNA具有由3’-羟基(OH)和5’-磷酸基团(PO4)构成的结构(EffectofasymmetricterminalstructuresofshortRNAduplexesontheRNAinterferenceactivityandstrandselection.NucleicAcidsRes1October2008:5812-5821)。已知的是，商品化和合成的siRNA具有其中在两端存在羟基的结构，且当合成的siRNA被递送到细胞中时，siRNA5’-端通过磷酸化激酶被磷酸化以表达siRNA的功能(siRNAfunctioninRNAi:Achemicalmodificationanalysis.RNA2003.9:1034-1048)。
Bertrand等人发现与在相同靶标基因上的反义寡核苷酸(ASO)相比，siRNA具有显著抑制mRNA体外和体内表达的作用，且相应的作用可长时间地保持(ComparisonofantisenseoligonucleotidesandsiRNAsincellcultureandinvivo.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002.296:1000-1004)。
此外，由于siRNA与靶标mRNA互补性地偶联，从而序列特异性地调节靶标基因的表达，相比于现有的基于抗体的医药产品或小分子药物而言，siRNA的作用机制所具有的优势是可显著增加能够被施用的靶标(ProgressTowardsinVivoUseofsiRNAs.MOLECULARTHERAPY.200613(4):664-670)。
即使基于寡核苷酸(siRNA等)的治疗剂具有良好的作用和广泛使用范围，为了开发作为治疗剂的siRNA，siRNA也需要通过改善siRNA的稳定性和siRNA的细胞递送效能而被有效地递送到靶标细胞中(HarnessinginvivosiRNAdeliveryfordrugdiscoveryandtherapeuticdevelopment.DrugDiscovToday.2006Jan；11(1-2):67-73)。
具体地，由于寡核苷酸诸如siRNA等由于其荷负电而不能穿过细胞的疏水性磷脂双层，因此将其通过简单的扩散而递送到细胞中是困难的。
为了提高寡核苷酸的体内或体外递送效能，已经开发了各种类型的细胞递送材料。通常且广泛使用脂质体、阳离子表面活性剂等。此外，已经知晓了使用载体的方法，诸如将基因融合在脂质体中的方法、使用阳离子脂质或阳离子聚合物等的方法、改变化学结构即改变寡核苷酸与甲基膦酸酯、肽核酸(PNA)等的组合基本结构的方法及使用缀合物的方法(ChemicallymodifiedsiRNA:toolsandapplications.DrugDiscovToday.2008Oct；13(19-20):842-855；MechanismsandstrategiesforeffectivedeliveryofantisenseandsiRNAoligonucleotides.NucleicAcidsRes.2008Jul；36(12):4158-71)。
在这些方法中，使用纳米载体的方法即使用各种聚合物诸如脂质体、阳离子聚合物复合物等的方法用于通过形成纳米颗粒而在纳米载体中捕获寡核苷酸，从而将捕获的寡核苷酸递送到细胞中。在使用纳米载体的方法中，主要应用的是使用聚合纳米颗粒、聚合物胶束、脂质复合物等的方法，其中脂质复合物由与细胞的内涵体的阴离子脂质相互作用的阳离子脂质构成，由此诱导内涵体的脱稳定化作用以将siRNA递送到细胞中(Mechanismofoligonucleotidereleasefromcationicliposomes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996Oct15；93(21):11493-8)。
具体地，已知当寡核苷酸为siRNA时，化学材料等连接于siRNA过客(有义)链的端部以提供增强的药代动力学特性，由此可体内诱导高效能(TherapeuticsilencingofanendogenousgenebysystemicadministrationofmodifiedsiRNAs.Nature.2004Nov11；432(7014):173-8)。在此，siRNA的稳定性可取决于与siRNA有义(过客)或反义(向导)链的端部连接的化学材料的性质而变化。例如，与聚合物化合物诸如聚乙二醇(PEG)缀合的siRNA与siRNA的阴离子磷酸基团在阳离子材料的存在下相互作用以形成复合物，由此作为具有改善的siRNA稳定性的载体(LocalandsystemicdeliveryofVEGFsiRNAusingpolyelectrolytecomplexmicellesforeffectivetreatmentofcancer.JControlRelease.2008Jul14；129(2):107-16)。具体地，相比于用作药物递送媒介物的其它系统诸如微球、纳米颗粒等，由聚合物复合物构成的胶束具有极小的尺寸、显著均匀的分布且是自发形成的，由此易于控制形成质量且获得重现性。
此外，为了改善siRNA的细胞内递送效能，开发了使用siRNA缀合物的技术以由此获得siRNA的稳定性且具有有效的细胞膜渗透性，在所述siRNA缀合物中，亲水性材料为生物相容性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))，其通过简单的共价键或由衔接物介导的共价键缀合于siRNA(参见韩国专利公开文本883471)。然而，siRNA的化学修饰及与聚乙二醇(PEG)的缀合(PEG化)仍然具有以下缺陷，即在生物体中的稳定性差且向靶标组织的递送不平顺。
为了解决所述缺陷，开发了包含双链寡RNA的结构(‘双链寡RNA结构’)，其中亲水性材料和疏水性材料与寡核苷酸且具体为双链寡RNA诸如siRNA结合，其中双链寡RNA结构通过疏水性材料的疏水性相互作用形成自组装纳米颗粒，其称为自组装胶束抑制性RNA(SAMiRNATM)(参见韩国专利公开文本1224828)，SAMiRNATM技术相比于现有的递送技术而言具有以下优势，即能够获得具有显著小的尺寸的均匀的纳米颗粒。
作为SAMiRNATM技术的具体实例，PEG(聚乙二醇)用作亲水性材料，其中PEG为合成聚合物，其用于提高药物且具体为蛋白的溶解性且用于控制药代动力学。PEG如所有合成聚合物一样为多分散材料，一批中的聚合物由不同数目的单体的总和构成，分子量以高斯曲线显示，且多分散性指数(Mw/Mn)表示物质的均匀程度。也就是说，当PEG具有低的分子量(3至5kDa)时，多分散性指数为约1.01，且当PEG具有高的分子量(20kDa)时，多分散性指数为约1.2，其是高的，由此当分子量更高时，物质的均匀度是相对低的(F.M.Veronese.PeptideandproteinPEGylation:areviewofproblemsandsolutions.Biomaterials(2001)22:405-417)。
因此，当PEG结合于药物时，PEG的多分散性特征反映在缀合物上，由此难于确定单一物质。最近，为了克服该问题，通过合成PEG且改善纯化方法来生产具有低的多分散性指数的物质处于一个上升的趋势，但是仍然具有由于所述物质的多分散特性而产生的问题，具体地，当PEG结合于具有小分子量的物质时，难于证实该结合是否容易地进行等(FrancescoM.VeroneseandGianfrancoPasut.PEGylation,successfulapproachtodrugdelivery.DRUGDISCOVERYTODAY(2005)10(21):1451-1458)。
此外，纳米颗粒的尺寸显著地影响向靶标细胞的递送有效性，当纳米颗粒的尺寸为50nm或更小时，纳米颗粒经由排泄而从体内快速清除，且当纳米颗粒的尺寸为100nm或更大时，纳米颗粒无法均匀地递送到组织中，且效果是降低的。因此，需要形成各自具有预定尺寸的纳米颗粒(WimHDeJongandPaulJABorm.IntJNanomedicine.2008June；3(2):133-149.)。
因此，市面上迫切地需要一种新概念的寡核苷酸递送技术以解决亲水性材料诸如PEG等本身的多分散性特征同时保持它们所属相关领域的SAMiRNATM的优秀效果。
发明内容
本发明的一个目标是提供一种新概念的具有小尺寸和改善的多分散性的纳米颗粒及形成所述纳米颗粒的寡核苷酸结构。
此外，本发明的另一个目标是提供一种制备寡核苷酸结构和由所述寡核苷酸结构形成的纳米颗粒的方法、包含所述寡核苷酸结构的药物组合物及使用所述寡核苷酸结构控制基因表达的技术。
发明人有如下发现并完成了本发明：在作为现有的自组装纳米颗粒的SAMiRNATM技术中，当构成SAMiRNATM的寡核苷酸结构的亲水性材料被嵌段为包含具有预定分子量的均一单体(单体数目为m)及衔接物(需要时)的基本单元并按需要使用适当数目的经嵌段的亲水性材料时，相比于现有的SAMiRNATM，由所述寡核苷酸结构形成的纳米颗粒具有显著小的尺寸及显著改善的多分散性。
具体实施方式
本发明的寡核苷酸为由DNA(脱氧核糖核苷酸)或RNA(核糖核苷酸)构成的物质且是指在互补结合所形成的单链或双链中形成的反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA抑制剂、适体等，但是本发明不限于此。
具体地，当本发明的寡核苷酸为双链寡核苷酸时，反义链为在由RNA诱导的沉默复合物(RISC)中与靶标mRNA互补结合以分解靶标mRNA的链，由此具有RNAi活性，且有义链是指具有与反义链互补的序列的链。本发明的“互补”或“互补结合”是指两个序列彼此结合以形成双链结构，其中所述结合不必是完全匹配结合且在一些序列不同的情况下也可包含错配。
此外，本发明的miRNA模拟物为具有与天然存在的miRNA相同的序列和结构的双链RNA，其是指呈化学合成形式的miRNA。miRNA抑制剂是指化学合成的单链寡核苷酸，其与天然存在的miRNA互补结合以抑制相应的miRNA的作用。
在示例性实施方案中，本发明提供新形式的寡核苷酸结构，其具有由以下结构式(1)或结构式(2)表示的结构。
Q-(Am-J)n-X-R-Y-B结构式(1)
Q-(J-Am)n-X-R-Y-B结构式(2)
在结构式(1)和(2)中，A为亲水性材料单体，B为疏水性材料，J为其中亲水性材料单体(总数为m)彼此连接的衔接物或其中亲水性材料单体(总数为m)与寡核苷酸连接的衔接物，X和Y各自独立地为简单的共价键或由衔接物介导的共价键，R为单链或双链寡核苷酸，m为1至15的整数，且n为1至10的整数，
Q为(Li-Zj)或P-J1-J2，
L为与通过由受体介导的内吞作用(RME)促进靶标细胞内摄的受体特异性结合的配体，且Z为介导简单的共价键或介导亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体和配体之间的键的衔接物，
i表示0-5的整数，优选为0-3的整数，且j表示0或1，条件是当i为0时，j必须为0，
P表示氨基或多组氨酸基团，且
J1和J2独立地为介导简单的共价键或介导氨基或多组氨酸基团与亲水性材料之间的键的衔接物。
本发明的“亲水性材料嵌段”是指由结构式(1)和(2)中的(Am-J)或(J-Am)表示的重复单元。
在结构式(1)和(2)中，在多种非离子性亲水性聚合物的单体中，亲水性材料单体A可不受限制地使用，只要其满足本发明的目标。亲水性材料单体A优选为选自在下表1中显示的化合物(1)至(3)的单体，更优选为化合物(1)的单体，且化合物(1)中的G可优选地选自CH2、O、S和NH。
具体地，在多种亲水性材料单体中，化合物(1)的单体可具有引入到其中的各种官能团及良好的体内亲和性且诱导很少的免疫反应，由此具有极佳的生物相容性，且进一步可提高包含在结构式(1)和(2)的结构中的寡核苷酸的体内稳定性且可提高递送效能，所述单体显著适于产生本发明的结构。
[表1]在本发明中优选的亲水性材料的单体结构
结构式(1)和(2)中的亲水性材料优选具有1,000至2,000的总体分子量。因此，例如当由化合物(1)表示的六乙二醇即其中G为O且m为6的物质用在结构式(1)和(2)中时，六乙二醇间隔基的分子量为344，使得重复数目(n)优选为3至5。
具体地，在本发明中，由结构式(1)和(2)中的(Am-J)或(J-Am)表示的亲水性基团即亲水性材料嵌段的重复单元能够根据需要以由n表示的适当数目使用。包含在每个亲水性材料嵌段中的A即亲水性材料单体和J即衔接物可在每个亲水性材料嵌段中独立地彼此相同或彼此不同。也就是说，当使用3个亲水性材料嵌段(n＝3)时，化合物(1)的亲水性材料单体在第一个嵌段中使用，化合物(2)的亲水性材料单体在第二个嵌段中使用，化合物(3)的亲水性材料单体在第三个嵌段中使用等。也就是说，对于所有亲水性材料嵌段而言可使用不同的亲水性材料单体，且选自化合物(1)至(3)的亲水性材料单体的任何一种亲水性材料单体可在所有亲水性材料嵌段中等同地使用。类似地，对于所有亲水性材料嵌段而言，介导亲水性材料单体的结合的衔接物也可彼此相同或彼此不同。此外，在所有亲水性材料嵌段中，m即亲水性材料单体的数目可彼此相同或彼此不同。也就是说，3个亲水性材料单体(m＝3)连接在第一个亲水性材料嵌段中，5个亲水性材料单体(m＝5)连接在第二个亲水性材料嵌段中，4个亲水性材料单体(m＝4)连接在第三个亲水性材料嵌段中等。也就是说，在所有亲水性材料嵌段中可使用各自具有不同数目或各自具有相同数目的亲水性材料单体。
此外，在本发明中，衔接物(J)优选选自PO3 -、SO3和CO2，但是本发明不限于此。对于本领域技术人员显而易见的是，可使用任何衔接物，这取决于所使用的亲水性材料单体等，只要其满足本发明的目标。
一些或全部亲水性材料单体可根据需要被修饰为具有与其它物质诸如靶标特异性配体等结合所需要的官能团。
亲水性材料嵌段可结合于单链寡核苷酸的3’端或5’端的任何位置且可结合于双链寡核苷酸的有义链或反义链的3’端或5’端的任何位置。
结构式(1)和(2)中的疏水性材料B通过疏水性相互作用形成由结构式(1)和(2)的寡核苷酸结构构成的纳米颗粒。疏水性材料优选具有250至1,000的分子量且可包括类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12至C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺等，但是本发明不限于此。对于本领域技术人员显而易见的是，可使用任何疏水性材料，只要其满足本发明的目标。
类固醇衍生物可选自胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇甲酸酯、胆甾烷醇甲酸酯和胆甾醇胺，且甘油酯衍生物可选自甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯等，其中甘油酯的脂肪酸优选为C12至C50不饱和或饱和脂肪酸。
具体地，在疏水性材料中，优选饱和或不饱和烃或胆固醇，这是因为其在本发明的寡核苷酸结构的合成步骤中能够容易地被结合，且C24烃且具体为包含二硫键的二十四烷是最优选的。
疏水性材料与结合于亲水性材料嵌段的寡核苷酸的另一端(远端)结合且可结合于双链寡核苷酸的有义链或反义链的任何位置。
本发明的寡核苷酸(R)可不受限制地包括双链或单链siRNA或shRNA、反义微小RNA模拟物、微小RNA抑制剂、反义寡核苷酸(ASO)等，且具体地，双链siRNA是较优选的。
当使用双链寡核苷酸诸如双链siRNA、miRNA等时，双链寡核苷酸的有义链和/或反义链由15至40个且优选19至31个核苷酸构成，且具体地，优选将至少一个磷酸基团且优选一个至三个磷酸基团结合于反义链的5’端。
此外，寡核苷酸具有用于提供对核酸酶的抗性和减少非特异性免疫刺激的各种修饰以改善体内稳定性，其中所述修饰可为选自以下的一种或多种组合：修饰，其中一个或多个核苷酸的糖结构中的2’碳处的-OH基团被替换为-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、-NH2、-F(氟)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫基乙基、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基、-O-甲基氨甲酰基甲基或-O-二甲基氨甲酰基氧基乙基；修饰，其中核苷酸中的糖结构中的氧被替换为硫；和由核苷酸结合修饰为硫代磷酸或硼代磷酸、甲基膦酸结合，或可为对肽核酸(PNA)的修饰、对锁核酸(LNA)的修饰或对解锁核酸(UNA)的修饰(Crookeetal.,Ann.Rev.Med.Vol.55:pp61-652004,US5,660,985,US5,958,691,US6,531,584,US5,808,023,US6,326,358,US6,175,001BraaschD.A.etal.,Bioorg.Med.Chem.Lett.14:1139-1143,2003；ChiuY.L.etal.,RNA,9:1034-1048,2003；AmarzguiouiM.etal.,NucleicAcidRes.31:589-595,2003,NucleicAcidsResearch,2010,Vol.38,No.175761-5773,NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.51823-1832)。
同时，相比于正常组织，肿瘤组织不易具有扩散-限制，其中该扩散-限制影响肿瘤生长所需要的物质诸如养分、氧气和二氧化碳的移动，由此所述扩散-限制由于在肿瘤周围通过血管生成作用形成血管而被克服。在肿瘤组织中通过血管生成作用形成的血管具有渗漏且缺陷的血管结构，其具有100nm至2μm的缝隙，这取决于肿瘤的类型。因此，纳米颗粒容易通过癌症组织的与正常组织的有组织的毛细血管相比具有渗漏且缺陷的血管结构的毛细血管内皮，由此在血液循环过程中易于到达肿瘤间质。此外，在肿瘤组织中不存在淋巴管(淋巴引流)，使得药物积累，这称为增强的渗透和保留(EPR)效应。这种纳米颗粒通过该效应被特异性递送到肿瘤组织中的现象称为被动靶向(Nanoparticlesfordrugdeliveryincancertreatment.Urol.Oncol.2008Jan-Feb；26(1):57-64)。
主动靶向是指靶向部分结合于纳米颗粒的情况，且报道了主动靶向促进纳米颗粒在靶标组织中的优先积累或改善细胞内摄，纳米颗粒通过所述细胞内摄被递送到靶标细胞中(DoesatargetingligandinfluencenanoparticletumorlocalizationoruptakeTrendsBiotechnol.2008Oct；26(10):552-8.Epub2008Aug21)。主动靶向所使用的物质(靶向部分)能够与以下糖类、受体、抗原结合，所述糖类、受体、抗原就靶标细胞表面而言是特异性的或是过表达的(Nanotechnologyincancertherapeutics:bioconjugatednanoparticlesfordrugdelivery.MolCancerTher2006；5(8):1909-1917)。
因此，当靶向部分提供在本发明的寡核苷酸结构及由此形成的纳米颗粒中时，有效地促进了向靶标细胞的递送以实现甚至以相对低浓度的剂量递送到靶标细胞中，由此显示出对靶标基因表达的高控制功能且由此防止了寡核苷酸向其它器官和细胞中的非特异性递送。
因此，本发明提供由结构式(3)和(4)表示的结构，其中Q为在结构式(1)和(2)的结构中的(Li-Zj)，且其中额外地包含配体(L)且特别是与通过由受体介导的内吞作用(RME)促进靶标细胞内摄的受体特异性结合的配体(L)。
(Li-Zj)-(Am-J)n-X-R-Y-B结构式(3)
(Li-Zj)-(J-Am)n-X-R-Y-B结构式(4)
结构式(3)和(4)中的配体可优选选自靶标受体特异性抗体或适体；具有RME性质从而以靶标细胞特异性的方式促进细胞内摄的的肽；或叶酸盐/酯(通常，叶酸盐/酯和叶酸可互换使用，且本发明的叶酸盐/酯是指天然状态或人体中活化状态的叶酸盐/酯)；化学物质诸如糖、碳水化合物等，包括己糖胺诸如N-乙酰基半乳糖胺(NAG)等、葡萄糖、甘露糖，但是本发明不限于此。
具体地，当本发明的配体为糖诸如N-乙酰基半乳糖胺(NAG)、甘露糖、葡萄糖等时，相应的配体不但可补充和增强亲水性(其可取决于亲水性材料嵌段中的单体的重复数目而降低)，而且可提供由本发明的结构式(3)和(4)的结构形成的纳米颗粒的靶向效能，由此可容易地形成纳米颗粒。
配体可通过共价键直接连接于亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体或可通过介导配体的结合的衔接物(Z)连接于亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体。对于本领域技术人员显而易见的是，当配体通过衔接物(Z)共价结合于亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体时，可使用任何衔接物，只要其满足本发明的目标。具体地，衔接物优选具有选自在下表2中显示的化合物(4)至(7)的任何一种结构。
表2.在本发明中优选的衔接物结构
在化合物(4)中，T为这样的化合物，其中选自化合物(1)至(3)的任何一种化合物重复1至15次，且具体地，由结构式(1)表示的化合物优选重复1至15次。在化合物(4)中，T结合于配体，且远端结合于亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体或衔接物。
此外，在化合物(5)至(7)中，官能团的左侧结合于配体且右侧结合于亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体，且化合物(5)中的n为0或1。能够与配体结合的至少一个官能团包含在化合物(5)至(7)中，由此至少一个配体结合可更加改善本发明的双链寡RNA结构向靶标组织中的递送效能。
在结构式(3)和(4)中，当i和j均为0时，提供了不与配体结合的寡核苷酸结构，且当i为1且j为0时，提供了其中配体直接结合于亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体的形式，且当i为1或更大的整数且j为1时，提供了由衔接物介导的其中配体结合于亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体的形式。
此外，本发明提供这样的结构，其中将氨基或多组氨酸基团额外地引入到由结构式1和2表示的结构的亲水性材料的端部且具体为结合于siRNA的端部的远端部分，即由结构式5和6表示的结构，其中Q为在结构式(1)和(2)中的P-J1-J2。
P-J1-J2-(Am-J)n-X-R-Y-B结构式(5)
P-J1-J2-(J-Am)n-X-R-Y-B结构式(6)
在结构式(5)和(6)中，J1和J2为衔接物且彼此独立地为简单的共价键或优选选自C2-12烷基、烯基、炔基、PO3 -、SO3和CO2，但是本发明不限于此。对于本领域技术人员显而易见的是，可使用任何衔接物作为J1和J2，只要其满足本发明的目标，这取决于所使用的亲水性材料。
优选地，当引入氨基时，在结构式(5)中，J2优选为PO3 -，且J1优选为C6烷基，且在结构式(6)中，J2优选为简单的共价键，且J1优选为C6烷基，但是本发明不限于此。
此外，当引入多组氨酸基团时，在结构式(5)中，J2优选为PO3 -，且J1优选为化合物(8)，且在结构式(6)中，J2优选为简单的共价键，且J1优选为化合物(8)，但是本发明不限于此。
结构式(5)和(6)中的氨基可为伯氨基至叔氨基，且伯氨基是特别优选的。所引入的氨基可按胺盐的形式存在。例如，伯氨基的盐可按NH3 +的形式存在。此外，结构式(5)和(6)中的多组氨酸基团优选包含3至10个组氨酸、更优选为5至8个组氨酸且最优选为6个组氨酸。除了组氨酸之外，还可包含至少一个半胱氨酸。
引入氨基或多组氨酸基团以容易地进行细胞间引入并由寡核苷酸RNA结构的内含体脱离，且已经报道了引入氨基并使用多组氨酸基团以容易地进行细胞间引入并由载体诸如量子点、树状大分子、脂质体等的内含体脱离的可能性及其效果。
具体地，已知在载体的端部或外侧表达的伯氨基在体内pH下发生质子化以通过静电相互作用形成具有荷负电的基因的缀合物，且由内含体的脱离由于在引入到细胞中后内部叔胺在内含体的低pH下具有缓冲作用而可容易地进行，由此能够保护载体不被溶酶体分解(GeneDeliveryandExpressionInhibitionUsingPolymer-BasedHybridMaterial.PolymerSci.Technol.,Vol.23,No.3,pp254-259)。
已知作为非必需氨基酸之一的组氨酸在残基(-R)处具有咪唑环(pKa36.04)以增加在内含体和溶酶体中的缓冲能力，由此组氨酸的表达可用于在包括脂质体在内的非病毒基因载体中增加由内含体的脱离效能(Novelhistidine-conjugatedgalactosylatedcationicliposomesforefficienthepatocyteselectivegenetransferinhumanhepatomaHepG2cells.J.ControlledRelease118,pp262-270)。
在本发明的结构式(1)至(6)中，亲水性材料嵌段或疏水性材料通过简单的共价键或由衔接物介导的共价键(X或Y)结合于寡核苷酸。介导共价键的衔接物在寡核苷酸的端部共价结合于由结构式(1)和(2)中的(Am-J)n或(J-Am)n表示的亲水性材料嵌段或疏水性材料且不受具体限制，只要根据需要提供可在具体环境下分解的键。因此，用于在制备寡核苷酸结构中进行结合以活化寡核苷酸和/或亲水性材料(或疏水性材料)的任何化合物可用作衔接物。共价键可为不可降解的键或可降解的键中的任何一种。在此，不可降解的键的实例可包括酰胺键或磷酸化键，且可降解的键的实例可包括二硫键、酸可降解的键、酯键、酐键、生物可降解的键或酶可降解的键等，但是本发明无须仅限于此。
在本发明的结构式(1)至(6)中，当使用双链寡核苷酸且具体为双链寡RNA时，双链寡RNA与亲水性材料嵌段和疏水性材料的键合可以是各种各样的，如在下表3的结构式7至18中所示。
表3.本发明优选的双链寡RNA与亲水性和疏水性材料的键合的类型
在表3中，S表示双链寡RNA的有义链，AS表示双链寡RNA的反义链，且pAS表示与磷酸基团连接的反义链。剩余的A、B、X、Y、L、Z、n和m与在结构式(1)和(2)中的定义相同。
具体地，由结构式(4)表示的本发明的寡核苷酸结构优选具有由以下结构式(19)表示的结构：
在结构式(19)中，A为亲水性材料单体，B为疏水性材料，L为与通过由受体介导的内吞作用(RME)促进靶标细胞内摄的受体特异性结合的配体，Z为介导亲水性材料单体和配体之间的键的衔接物，R为单链或双链寡核苷酸，m为1至15的整数，n为1至10的整数，且A、B、L、R等与在本说明书的结构式(4)中的定义相同。
具体地，A为选自在表1中所示的化合物(1)至(3)的任何一种物质，且Z优选为化合物(4)。
在本发明的另一个方面，本发明提供由以下结构式(20)表示的固体载体：
在结构式(20)中，L与在结构式(3)和(4)中的定义相同，且T与在化合物(4)中的定义相同。此外，C和D中的一个为固体载体，另一个为二甲氧基三苯甲基，E和F各自独立地为1至10的整数，且i表示0或1。
在本发明的另一个方面，本发明提供通过使用由结构式(20)表示的固体载体来制备由结构式(1)至(4)表示的寡核苷酸结构的方法。
所述方法通过使用由本发明的结构式(20)表示的固体载体来制备由结构式(1)至(4)表示的寡核苷酸结构，且当寡核苷酸为单链时，所述方法包括：
(1)将亲水性材料嵌段以n次重复共价结合于由结构式(20)表示的固体载体；
(2)基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链寡核苷酸；
(3)将疏水性材料共价结合于与亲水性材料嵌段结合的寡核苷酸的5’端；和
(4)将寡核苷酸结构与固体载体分开。
在本发明中，固体载体包括可控多孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯、硅胶、纤维素纸等，但是本发明不限于此。当固体载体为CPG时，直径优选为40至180μm且优选具有500至的孔径。
此外，当本发明的寡核苷酸结构的寡核苷酸为双链RNA时，双链寡核苷酸优选由19至31个核苷酸构成。可用于本发明的双链寡核苷酸可为与用于基因疗法或基因研究或具有用于基因疗法或基因研究的可能性的任何基因相关的任何双链寡核苷酸。
本发明提供由在表3中所示的结构式(7)至(10)和(13)至(16)表示的双链寡核苷酸(RNA)结构及其制备方法。具体地，所述方法通过使用由本发明的结构式(20)表示的固体载体来制备由结构式(7)至(10)和(13)至(16)表示的寡核苷酸结构，且当寡核苷酸为双链时，所述方法包括：
(1)将亲水性材料嵌段以n次重复共价结合于由结构式(20)表示的固体载体；
(2)基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链RNA；
(3)将疏水性材料共价结合于与亲水性材料嵌段结合的RNA的5’端；
(4)将RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA与固体载体分开；和
(5)通过对RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行退火形成双链寡核苷酸。
更优选地，所述方法包括：
(1)基于由结构式(20)表示的固体载体结合亲水性材料嵌段；
(2)将步骤(1)重复n-1次；
(3)基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链RNA；
(4)将疏水性材料结合于单链RNA的5’端；
(5)当合成完成时，将RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA与固体载体分开并纯化；和
(6)通过对RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行退火来制备双链寡RNA结构。
在以上步骤(5)后，当制备完成时，预期的RNA-聚合物结构和单链RNA是否被制备可通过使用高效液相色谱(HPLC)纯化反应混合物并使用MALDI-TOF质谱测量其分子量来证实。在制备方法中，具有与在步骤(3)中合成的单链RNA的序列互补的序列的单链RNA可在步骤(1)之前合成或可在步骤(1)至(5)中的任何一步期间合成。
此外，当磷酸基团结合于结构式(8)或(14)所示的反义链的5’端时，磷酸基团可在制备方法的步骤(6)之前或之后结合于反义链的5’端。
此外，本发明提供与配体结合的由结构式(9)、(10)、(15)和(16)表示的双链寡RNA结构及其制备方法。具体地，通过使用由结构式(20)表示的固体载体来制备双链寡RNA结构的方法包括：
(1)基于由结构式(20)表示的固体载体以n次重复共价结合亲水性材料嵌段；
(2)基于通过步骤(1)合成的与配体-亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链RNA；
(3)将疏水性材料共价结合于步骤(2)所获得的物质的5’端；
(4)当合成完成时，将与配体结合的单链RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA与固体载体(CPG)分开并纯化；和
(5)通过对与配体结合的RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行退火来形成双链寡RNA结构。
在以上步骤(5)后，当制备完成时，预期的与配体结合的RNA-聚合物结构和单链RNA是否被制备可通过使用高效液相色谱(HPLC)纯化反应混合物并使用MALDI-TOF质谱测量其分子量来证实。在制备方法中，具有与在步骤(2)中合成的单链RNA的序列互补的序列的单链RNA可在步骤(1)之前合成或可在步骤(1)至(4)中的任何一步期间合成。
此外，当磷酸基团结合于结构式(10)或(16)所示的反义链的5’端时，磷酸基团可在制备方法的步骤(6)之前或之后结合于反义链的5’端。
在另一个方面，本发明提供使用物质制备由结构式(21)表示的物质和由结构式(1)至(4)表示的寡核苷酸结构的方法。结构式(21)与结构式(20)的区别仅在于取代基C和D：
在由结构式(21)表示的物质中，C和D中的一个为二甲氧基三苯甲基，且另一个为氰基乙基亚磷酰胺。
所述方法通过使用由本发明的结构式(21)表示的物质来制备由结构式(1)至(4)表示的寡核苷酸结构，且当寡核苷酸为单链时，所述方法包括：
(1)使用与官能团结合的固体载体且优选为CPG合成单链寡核苷酸；
(2)基于与寡核苷酸结合的固体载体以n次重复共价结合亲水性材料单体；
(3)将由结构式(21)表示的物质共价结合于与亲水性材料结合的寡核苷酸的5’端；
(4)将寡核苷酸聚合物结构与固体载体分开；和
(5)通过结合于由步骤(4)获得的寡核苷酸结构的3’端的官能团共价结合疏水性材料。
此外，所述方法通过使用由本发明的结构式(21)表示的物质来制备由结构式(1)至(4)表示的寡核苷酸结构，且当寡核苷酸为双链时，所述方法包括：
(1)使用与官能团结合的固体载体且优选为CPG合成单链寡核苷酸；
(2)基于与寡核苷酸结合的固体载体以n次重复共价结合亲水性材料单体；
(3)将由结构式(21)表示的物质共价结合于与亲水性材料结合的寡核苷酸的5’端；
(4)将RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA与固体载体分开；
(5)通过结合于由步骤(4)获得的寡核苷酸结构的3’端的官能团共价结合疏水性材料；和
(6)通过对RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行退火来形成双链寡核苷酸结构。
此外，当磷酸基团结合于反义链的5’端时，磷酸基团可在制备方法的步骤(6)之前或之后结合于反义链的5’端。
在另一个方面，本发明提供由结构式(1)至(6)中的任何一个表示的寡核苷酸结构所形成的纳米颗粒。所述寡核苷酸为两亲性的，其含有疏水性材料和亲水性材料两者，其中由n个亲水性材料嵌段构成的亲水性部分通过相互作用诸如氢键等而与存在于体内的水分子具有亲和性以朝向外部，而疏水性材料通过之间的疏水性相互作用而朝向内部，由此形成热力学上稳定的纳米颗粒(SAMiRNA)。也就是说，疏水性材料位于纳米颗粒的中心，而亲水性材料嵌段位于寡核苷酸的外部方向，由此形成保护双链寡RNA的纳米颗粒(参见图1)。如上形成的纳米颗粒可改善寡核苷酸的细胞内递送且改善对可用于治疗疾病的寡核苷酸的基因表达进行控制的效能。
此外，由于可容易地控制亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体及其单体数目，且也可容易地控制待使用的亲水性材料嵌段的数目，因此在所有寡核苷酸结构中由n个亲水性材料嵌段构成的亲水性材料部分彼此相同，由此具有所述亲水性材料部分的寡核苷酸结构具有以下优势：材料分析是容易进行的，且合成方法与通过使用亲水性材料并通过额外的纯化操作以具有相同的分子量而合成的寡核苷酸结构相比是简单的，且可降低成本。
此外，由于由寡核苷酸结构形成的纳米颗粒的尺寸可通过控制亲水性材料嵌段的重复数目及亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体来调节，因此基于寡核苷酸形成的纳米颗粒可具有显著可再现的细胞递送能力。
此外，在配体具体为糖类诸如N-乙酰基半乳糖胺(NAG)、甘露糖、葡萄糖等且寡核苷酸结构由结构式(1)或(2)表示的情况下，与配体结合的寡核苷酸可使在亲水性材料嵌段的重复数目降低时减弱的亲水性得以同时补充和增强，由此使纳米颗粒的形成得以稳定。如上形成的与配体结合的纳米颗粒可改善寡核苷酸的细胞内递送并改善可用于治疗疾病的寡核苷酸的效能。由寡核苷酸结构形成的纳米颗粒的更具体的合成和表征、细胞内递送效能及作用将通过以下实施例更详细地描述。
此外，本发明提供使用寡核苷酸结构或基于寡核苷酸结构形成的纳米颗粒的治疗方法。具体地，所述治疗方法包括制备由寡核苷酸结构形成的纳米颗粒并将所述纳米颗粒给予到动物体内。
此外，本发明提供药物组合物，其包含药学有效量的由寡核苷酸结构形成的纳米颗粒。
本发明的组合物可如下制备：除了上述用于给药的有效成分之外，额外地包含至少一种类型的用于给药的药用载体。药用载体需要与本发明的有效成分相容。可使用选自以下的一种成分：盐水、无菌水、林格溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、糊精-麦芽糖复合剂溶液、甘油、乙醇或其中两种或更多种的混合物。此外，可根据需要向其中加入其它常规添加剂诸如抗氧化剂、缓冲剂、抑真菌剂等。此外，可通过向其中额外地加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂将组合物制备成注射用制剂诸如水溶液、混悬液、乳液等。此外，在本领域中适当的方法或在Remington’spharmaceuticalScience,MackPublishingcompany,EastonPA中公开的方法可优选用于配制，这取决于各种疾病或成分。
可基于一般患者的症状和疾病严重度由本领域一般专家确定本发明的药物组合物。此外，组合物可被配制成各种类型诸如粉末剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、注射剂、软膏剂、糖浆剂等且可按单位剂量或多剂量容器的形式提供，例如密封的安瓿、瓶等。
本发明的药物组合物可口服或胃肠外给药。本发明的药物组合物的给药途径的实例可包括口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹膜内、肠内、舌下或局部给药，但是本发明不限于此。
对于上述临床给药，本发明的药物组合物可通过已知的技术制备成适当的制剂。本发明的组合物的给药量具有不同的范围，这取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、方法、排泄速率、疾病严重度等且可由本领域一般专家容易地确定。
本发明提供使用所述寡核苷酸结构调节体内或体外基因表达的方。此外，本发明提供使用含有所述寡核苷酸结构的纳米颗粒调节体内或体外基因表达的方法。
有利的作用
本发明的寡核苷酸结构可具有全部相同的亲水性材料部分，使得在连接于寡核苷酸的亲水性材料为合成性聚合物时出现的多分散性特征所引起的问题诸如质量控制等可得以显著的改善。此外，相比于现有的使用多分散性亲水性材料的纯化方法，制备本发明的寡核苷酸结构的方法可以是简单的，可降低合成成本且可容易地对寡核苷酸结构进行物质分析。此外，纳米颗粒的粒度可通过控制亲水性材料嵌段的重复数目和在每个亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体来调节。
具体地，当本发明的寡核苷酸结构中的配体额外地结合于通过由受体介导的内吞作用(RME)促进靶标细胞内摄的受体时，向靶标细胞的递送可更有效地进行。此外，当配体为糖时，连同纳米颗粒的靶向效果，取决于亲水性材料嵌段的重复数目而降低的亲水性可得以补充以改善寡核苷酸的细胞内递送且改善对寡核苷酸基因表达进行控制的效能。
此外，在寡核苷酸结构被吸收到细胞中之后，寡核苷酸可容易地由内含体脱离且可具有抑制被溶酶体分解的作用，由此可通过将氨基或多组氨酸基团引入到亲水性材料嵌段中而获得更高的治疗效果。
附图说明
图1为本发明的由与各自具有相同分子量的亲水性材料连接的寡核苷酸结构形成的纳米颗粒的示意图。
图2显示了3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基-半乳糖胺-CPG(可控多孔玻璃)的完整合成路线。
图3显示了2,3,4,6-四乙酰基-1-六(乙二醇)-甘露糖-CPG(可控多孔玻璃)的完整合成路线。
图4显示了2,3,4,6-四乙酰基-1-六(乙二醇)-葡萄糖-CPG(可控多孔玻璃)的完整合成路线。
图5显示了1,3,4,6-四乙酰基-N-乙酰基半乳糖胺(图2的化合物1)的NMR分析结果。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)；7.91～7.86(d,1H),5.66～5.61(d,1H),5.28～5.25(d,1H),5.10～5.03(d,1H),4.25～4.19(t,1H),4.15～3.94(m,3H),2.12～2.10(s,3H),2.04～2.02(s,3H),2.00～1.98(s,3H),1.91～1.89(s,3H),1.78～1.76(s,3H)
图6显示了3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺(图2的化合物2)的NMR分析结果。
1HNMR(300MHz,CDCl3)；6.66～6.61(d,1H),5.33～5.29(d,1H),5.02～4.96(d,1H),4.80～4.75(d,1H),4.25～4.07(m,2H),3.93～3.79(m,2H),3.73～3.54(m,24H),2.16～2.14(s,3H),2.05～2.03(s,3H),1.99～1.97(s,6H)
图7显示了3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’,2’-丙二醇]-N-乙酰基-半乳糖胺(图2的化合物3)的NMR分析结果。
1HNMR(300MHz,CDCl3)；6.83～6.78(d,1H),6.10～6.08(s,1H),5.33～5.29(d,1H),5.00～4.94(d,1H),4.82～4.77(d,1H),4.22～4.08(m,4H),3.94～3.85(m,2H),3.83～3.74(m,1H),3.66～3.52(m,24H),3.40～3.24(m,2H),2.18～2.16(s,6H),2.05～2.03(s,3H),2.00～1.98(s,3H)
图8显示了3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’-甲氧基(二甲氧基三苯甲基)-2’-丙醇]-N-乙酰基半乳糖胺(图2的化合物4)的NMR分析结果。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)；7.80～7.75(d,1H),7.40～7.20(m,9H),7.00～6.98(s,1H),6.90～6.85(d,4H),5.22～5.20(s,1H),5.00～4.87(m,2H),4.58～4.55(d,1H),4.04～4.02(s,4H),3.94～3.82(m,1H),3.74～3.72(s,6H),3.51～3.49(s,24H),3.18～3.12(m,1H),2.94～2.85(m,2H),2.11～2.09(s,3H),2.00～1.98(s,3H),1.90～1.88(s,3H),1.78～1.76(s,3H)
图9显示了3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’-甲氧基(二甲氧基三苯甲基)-2’-丙氧基(琥珀酸)]-N-乙酰基半乳糖胺(图2的化合物5)的NMR分析结果。
1HNMR(300MHz,CDCl3)；7.43～.38(d,2H),7.31～7.19(m,7H),6.84～6.79(d,4H),6.75～6.67(t,1H),5.52～4.89(m,1H),5.32～5.30(s,1H),5.21～5.19(s,1H),5.01～4.95(d,1H),4.81～4.76(d,1H),4.30～4.08(m,3H),3.93～3.86(m,2H),3.79～3.77(s,6H),3.66～3.52(m,24H),3.36～3.32(m,1H),3.21～3.17(d,2H),2.75～2.56(m,4H),2.18～2.16(s,3H),2.04～2.01(m,6H),1.98～1.96(s,3H)
图10显示了与配体结合的寡核苷酸结构的结构及其实施例即单-NAG-(六乙二醇)n-寡核苷酸-脂质及引入到其中的脂质的结构。
(A)与配体结合的寡核苷酸结构的结构。
(B)单-NAG-(六乙二醇)n-寡核苷酸-脂质的结构。
图11显示了单-NAG-(六乙二醇)1-寡核苷酸-脂质的质谱(MALDI-TOFMS)结果。
(单-NAG-(六乙二醇)1-寡核苷酸-脂质的分子量(MW7807.4))。
图12显示了单-NAG-(六乙二醇)2-寡核苷酸-脂质的质谱(MALDI-TOFMS)结果。
(单-NAG-(六乙二醇)2-寡核苷酸-脂质的分子量(MW8152.7))。
图13显示了单-NAG-(六乙二醇)3-寡核苷酸-脂质的质谱(MALDI-TOFMS)结果。
(单-NAG-(六乙二醇)3-寡核苷酸-脂质的分子量(MW8498.0))。
图14显示了单-NAG-(六乙二醇)4-寡核苷酸-脂质的质谱(MALDI-TOFMS)结果。
(单-NAG-(六乙二醇)4-寡核苷酸-脂质的分子量(MW8843.3))。
图15为通过对本发明的与各自具有相同分子量的亲水性材料结合的双链寡RNA结构的纳米颗粒(SAMiRNA)的临界胶束浓度进行测量所获得的图形。
图16为通过对本发明的与各自具有相同分子量的亲水性材料结合的双链寡RNA结构的纳米颗粒(SAMiRNA)的粒度和多分散性指数进行测量所获得的图形。
(n表示亲水性材料单体的重复数目，且双链寡RNA结构的纳米颗粒由相应的结构形成。)
图17显示了在用本发明的与各自具有相同分子量的亲水性材料结合的双链寡RNA结构的纳米颗粒(SAMiRNA)进行处理的细胞系中对靶标基因表达的抑制程。
(n表示亲水性材料单体的重复数目，且双链寡RNA结构的纳米颗粒由相应的结构形成。)
实施例
以下，本发明将根据下述实施例进行详细的描述。这些实施例仅用于示例说明本发明，且对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不应该被理解为局限于这些实施例。
实施例1.制备(3’N-乙酰基半乳糖胺)CPG(可控多孔玻璃)
为了制备与配体连接的双链寡RNA结构，制备了N-乙酰基半乳糖胺CPG，其为配体材料且可与双链寡RNA结构结合。
实施例1-1.制备1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG(可控多孔玻璃)试剂
为了将N-乙酰基半乳糖胺(NAG)与双链寡RNA结构结合，如图2所示制备了1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG(可控多孔玻璃)。
实施例1-1-1.制备1,3,4,6-四乙酰基-NAG(图2的化合物1)
将起始物质即半乳糖胺盐酸盐(SigmaAldrich,USA)(10g,46.37mmol)、乙腈(150ml)和三乙胺(556.48ml)彼此混合并回流1小时。将混合物缓慢冷却至室温，使用冰水冷却至0℃并逐滴加入乙酸酐(43.83ml,463.70mmol)。加完后，移去冰水并将混合物在室温搅拌24小时。反应完成后，缓慢加入饱和碳酸氢钠水溶液直到pH为中性。pH为中性后，将混合物在室温搅拌2小时得到固体，将所得固体过滤并将滤液先后用乙酸乙酯、蒸馏水和乙酸乙酯洗涤。将固体真空干燥得到1,3,4,6-四乙酰基-NAG(9.792g,56％)(参见图2)。
实施例1-1-2.制备3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺(图2的化
合物2)
将由实施例1-1-1得到的1,3,4,6-四乙酰基-N-乙酰基-半乳糖胺(6.77g,18.04mmol)、氯化铁(III)(3.80g,23.45mmol)和二氯甲烷(200ml)彼此混合并在室温搅拌。搅拌10分钟后，向其中加入六(乙二醇)(5.90ml,4.82mmol)并回流2小时。反应完成后，将混合物用硅藻土过滤并将滤液用二氯甲烷洗涤。将滤液减压浓缩并加入乙酸乙酯和蒸馏水以萃取水层。将所得水层用二氯甲烷萃取并收集有机层并用无水硫酸镁干燥且过滤。将滤液减压浓缩并真空干燥得到3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基-半乳糖胺(2.24g,74.9％)(参见图3)。
实施例1-1-3.制备3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’,2’-丙二醇]-N-乙酰
基半乳糖胺(图2的化合物3)
将由实施例1-1-2获得的3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺(13.66g,22.33mmol)加到乙腈(220ml)中并搅拌。向其中加入N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(9.15g,35.73mmol)和三乙胺(9.90ml,71.46mmol)并搅拌24小时。将3-氨基-1,2-丙二醇(3.26g,35.73mmol)用N,N’-二甲基甲酰胺(60ml)稀释，向其中加入三乙胺(4.95ml,35.73mmol)并将混合物加到反应溶液中并搅拌24小时。将混合物减压浓缩并真空干燥。将混合物通过柱分离并将获得的溶液减压浓缩。将所得混合物真空干燥得到3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’,2’-丙二醇]-N-乙酰基半乳糖胺(9.23g,56.7％)(参见图4)。
实施例1-1-4.制备3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’-甲氧基(二甲氧基三
苯甲基)-2’-丙醇]-N-乙酰基半乳糖胺(图2的化合物4).
将由实施例1-1-3获得的3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’,2’-丙二醇]-N-乙酰基半乳糖胺(9.23g(12.67mmol,1eq))加到二氯甲烷(120ml)中并搅拌。向其中加入三乙胺(5.27ml(38.00mmol,3eq))。加入稀释在二氯甲烷(20ml)中的DMT-Cl(4.72g,13.93mmol)并将混合物搅拌24小时。将混合物减压浓缩，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸镁干燥且过滤。将滤液减压浓缩。将混合物通过柱分离并将获得的溶液减压浓缩。将所得混合物真空干燥得到预期的3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’-甲氧基-二甲氧基三苯甲基-2’-丙醇]-N-乙酰基-半乳糖胺(7.77g,59.5％)。
实施例1-1-5.制备3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’-甲氧基(二甲氧基三
苯甲基)-2’-丙氧基(琥珀酸)]-N-乙酰基半乳糖胺(图2的化合物5).
将由实施例1-1-4获得的3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’-甲氧基(二甲氧基三苯甲基)-2’-丙醇]-N-乙酰基半乳糖胺(7.72g,7.487mmol)加到吡啶(70ml)中并搅拌。向其中加入乙酸酐(3.75g,37.486mmol)和DMAP(0.46g,3.745mmol)并将混合物在60至70℃搅拌24小时。将混合物减压浓缩并真空干燥。将混合物用乙酸乙酯萃取。将混合物用无水硫酸镁干燥且过滤。将滤液减压浓缩。将滤液通过柱分离并将获得的溶液减压浓缩。将所得混合物真空干燥得到预期的3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’-甲氧基(二甲氧基三苯甲基)-2’-丙氧基(琥珀酸)]-N-乙酰基-半乳糖胺(7.61g,89.9％)。
实施例1-1-6.在封端3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG前
制备CPG化合物(图2的化合物6)
将由实施例1-1-5获得的3,4,6-三乙酰基-1-[六(乙二醇)-N’-1’-甲氧基(二甲氧基三苯甲基)-2’-丙氧基(琥珀酸)]-N-乙酰基-半乳糖胺(0.34g,0.30mmol)加到长链烷基胺-可控多孔玻璃(LCAA-CPG)(5g)、二-2-氧代-3-噁唑烷基膦酰氯(0.2g,0.45mmol)、1-羟基苯并三唑(0.06g,0.45mmol)和二氯甲烷(50ml)。向其中加入三乙胺(0.03ml,2.25mmol)。将混合物反应24小时。将混合物过滤并用甲醇洗涤。将混合物干燥得到预期的CPG化合物(4.91g)，然后封端3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG。
实施例1-1-7.制备3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基-半乳糖胺-CPG(可
控多孔玻璃)(图2的化合物7).
将在封端3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG前由实施例1-1-6获得的CPG化合物(4.86g)加到吡啶(30ml)、乙酸酐(6.02ml,63.70mmol)和1-甲基咪唑(5.08ml,63.70mmol)中并反应24小时。将混合物过滤并用甲醇洗涤。将滤液真空干燥得到预期化合物即3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG(可控多孔玻璃)(2.8g)。
实施例2.制备双链寡RNA结构
以下，为了抑制存活素，使用针对存活素的双链寡RNA。存活素作为在至今测试的大多数肿瘤或变异细胞系中通常表达的蛋白被预期是癌症治疗中的重要靶标(Survivin:anewtargetforanti-cancertherapy.CancerTreatRev.2009Nov；35(7):553-62)。
本发明的针对存活素的双链寡RNA由具有SEQIDNO:1的有义链及具有与其互补的序列的反义链构成，且用作对照组的双链寡RNA由具有SEQIDNO:2的有义链及具有与其互补的序列的反义链构成。在本发明的实施例中使用的双链寡RNA的碱基序列如下：
(SEQIDNO:1)5’-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3’
(SEQIDNO:2)5’-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3’
在双链寡RNA中，双链寡RNA的单链通过以下方法合成，所述方法使用β-氰基乙基亚磷酰胺连接磷酸二酯键，从而形成RNA骨架结构(PolymersupportoligonucleotidesynthesisXVIII:useofbeta-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholinophosphoramiditeofdeoxynucleosidesforthesynthesisofDNAfragmentssimplifyingdeprotectionandisolationofthefinalproduct.NucleicAcidsRes.1984Jun11；12(11):4539-57)。
RNA单链的预期序列可如下获得：使合成方法起始于含有与其连接的核苷的固体载体(CPG)且重复以下循环，所述循环包括去封闭、偶联、封端和氧化。RNA384合成子(BIONEER,Korea)用于双链寡RNA的一系列相应的合成方法。
为了根据形成双链寡RNA结构的亲水性材料单体的重复数目对由双链寡RNA结构形成的纳米颗粒的物理性质进行分析，制备了具有以下结构的双链寡RNA结构。
与本发明制备的配体结合的双链寡RNA结构分别具有以下在表4中所示的结构。
表4.与本发明制备的配体结合的结构的详细描述
在表4中，S为双链寡RNA的有义链；AS为双链寡RNA的反义链；PO4为磷酸基团；NAG为配体即N-乙酰基半乳糖胺；PEG为多分散性亲水性材料即聚乙二醇；1,6-己二醇-PO3 -为亲水性材料单体，其中六乙二醇通过磷酸基团(PO3 -)结合；下标为亲水性材料单体的重复数目(n)；C24为疏水性材料且包含二硫键的二十四烷；且5’和3’是指双链寡RNA端部的方向性。
双链寡RNA结构的反义链具有相同的结构。双链寡RNA结构的反义链通过上述方法制备，其中使用β-氰基乙基亚磷酰胺连接形成RNA骨架结构的磷酸二酯键。然后，为了将磷酸基团结合于5’端，化学磷酸化试剂(CPR)即[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-2,2-二羧基乙基]丙基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺用于制备S-SAMiRNALP-PO4的其中磷酸基团结合于5’端的反义链。另外，与磷酸基团结合的反义链如下制备：将RNA单链由CPG回收并处理磷酸化激酶以将磷酸基团结合于5’端。
对于SAMiRNA双链寡RNA结构的有义链，SAMiRNA的其中NAG-PEG结合于3’端且二十四烷(C24)结合于5’端的有义链如下制备：通过使用由实施例1制备的3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG作为载体的上述反应来结合亲水性材料即聚乙二醇氨基磷酸酯(PEG-亚磷酰胺，其中PEG的分子量(Mn)为2000)，合成RNA并将包含二硫键的二十四烷(C24)结合于5’端。
对于monoSAMiRNA(n＝1)双链寡RNA结构的有义链，monoSAMiRNA(n＝1)的其中NAG-六乙二醇结合于3’端且二十四烷结合于5’端的有义链如下制备：通过使用由实施例1制备的3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG作为载体的上述反应来合成RNA并额外地将疏水性材料即包含二硫键的二十四烷(C24)结合于5’端。
对于monoSAMiRNA(n＝2)双链寡RNA结构的有义链，monoSAMiRNA(n＝2)的其中NAG-六乙二醇-(-PO4-六乙二醇)1结合于3’端且二十四烷结合于5’端的有义链如下制备：通过使用由实施例1制备的3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG作为载体的上述反应来结合亲水性材料单体即脱甲氧基三苯甲基六乙二醇氨基磷酸酯，合成RNA并额外地将疏水性材料即包含二硫键的二十四烷(C24)结合于5’端。
对于monoSAMiRNA(n＝3)双链寡RNA结构的有义链，monoSAMiRNA(n＝3)的其中NAG-六乙二醇-(-PO4-六乙二醇)2结合于3’端且二十四烷结合于5’端的有义链如下制备：通过使用由实施例1制备的3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG作为载体的上述反应来连续结合亲水性材料单体即两个脱甲氧基三苯甲基六乙二醇氨基磷酸酯，合成RNA并额外地将疏水性材料即包含二硫键的二十四烷(C24)结合于5’端。
对于monoSAMiRNA(n＝4)双链寡RNA结构的有义链，monoSAMiRNA(n＝4)的其中NAG-六乙二醇-(-PO3-六乙二醇)3结合于3’端且二十四烷结合于5’端的有义链如下制备：通过使用由实施例1制备的3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG作为载体的上述反应来连续结合亲水性材料单体即三个脱甲氧基三苯甲基六乙二醇氨基磷酸酯，合成RNA并额外地将疏水性材料即包含二硫键的二十四烷(C24)结合于5’端。
当合成完成时，将通过在水浴中在60℃处理28％(v/v)氨水来合成的RNA单链和RNA-聚合物结构各自与CPG分开并通过脱保护反应从其中除去保护部分。将从其中除去保护部分的RNA单链和RNA-聚合物结构用体积比为10:3:4的N-甲基吡咯烷酮、三乙胺和三乙胺三氢氟化物在烘箱中在70℃处理以除去2’TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)。将RNA单链、RNA-聚合物结构和与配体结合的RNA-聚合物结构通过HPLC与反应混合物分离，且其分子量通过MALDI-TOF质谱仪(SHIMADZU,Japan)测量以证实碱基序列和RNA-聚合物结构是否与待合成的那些是相应的(图11至14)。然后，为了制备每种双链寡RNA结构，将等量的有义链和反义链彼此混合并置于1×退火缓冲液(30mMHEPES、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁(pH7.0至7.5))中，随后在恒温水浴中在90℃反应3分钟，然后在37℃反应，由此分别制备预期的SAMiRNA、monoSAMiRNA(n＝1)、monoSAMiRNA(n＝2)、monoSAMiRNA(n＝3)和monoSAMiRNA(n＝4)。通过电泳证实所产生的双链寡RNA结构是退火的。
实施例3.分析由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒的物理性质
纳米颗粒即胶束通过与由实施例2制备的monoSAMiRNA双链寡RNA的端部结合的疏水性材料之间的疏水性相互作用而形成(参见图1)。
由相应的monoSAMiRNA构成的纳米颗粒(SAMiRNA)的形成如下证实：根据monoSAMiRNA的亲水性材料单体的重复数目分析纳米颗粒粒度和临界胶束浓度(CMC)值及透射电子显微镜(TEM)。
实施例3-1.测量由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒的临界胶束浓度(CMC)
在单个分子中含有疏水性基团和亲水性基团两者的两亲性物质可为表面活性剂，其中当将表面活性剂溶解在水溶液中时，其疏水性基团移动向中心部分以防止疏水性基团与水接触，而其亲水性基团移动向外部以形成胶束。在此，最初形成的胶束的浓度称为临界胶束浓度(CMC)。使用荧光色素测量CMC的方法是基于荧光色素的以下性质，其中荧光强度的曲线图的斜率在形成胶束之前/之后快速变化。为了测量由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒的CMC，将0.04mMDPH(1,6-二苯基-1,3,5-己三烯,SIGMA,USA)制备为荧光色素。用DPBS将monoSAMiRNA(n＝1)稀释为的浓度至的最大浓度以针对每个步骤制备总体积为的monoSAMiRNA(n＝1)样品。向所制备的样品中分别加入0.04mMDPH和就对照组而言作为DPH的溶剂的甲醇并充分混合且通过超声波分散器(Wiseclean:DAIHAN,Korea)处理，由此使纳米颗粒的粒度均一化(700W；幅度：20％)。使均一化的样品在室温避光反应约24小时并测量荧光值(激发：355nm，发射：428nm，顶部读数)。为了证实在测量的荧光值中的相对荧光值，测量了含有DPH的样品的荧光值-仅含有甲醇的相同浓度的样品的荧光值(Y轴)并显示为相对于monoSAMiRNA(n＝1)的处理浓度的log值(X轴)的曲线图。通过与上述相同的方法测量了MonoSAMiRNA(n＝2)和monoSAMiRNA(n＝3)。
针对每个浓度测量的荧光值在由低浓度区段移动至高浓度区段时快速增加，其中处于快速增加点的浓度为CMC浓度。因此，当通过将其中荧光量不增加的低浓度区段及其中荧光量增加的高浓度区段分为若干区段来绘制趋势线时，两条趋势线的交叉处的X值为CMC浓度。观察到由monoSAMiRNA(n＝1)构成的纳米颗粒的测量的CMC为其是相对高的，而由monoSAMiRNA(n＝2)构成的纳米颗粒的测量的CMC为 其是相对低的。观察到由monoSAMiRNA(n＝3)构成的纳米颗粒的测量的CMC为而由monoSAMiRNA(n＝4)构成的纳米颗粒的测量的CMC为(图15)。因此，证实了胶束可通过由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒很好地形成，即使在显著低的浓度。
实施例3-2.制备由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒
为了制备均一化的纳米颗粒，以的浓度将monoSAMiRNA(n＝1)溶解在1.5mlDPBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水)中并将所得混合物在-75℃和5mTorr的条件下冷冻干燥48小时。通过与上述相同的方法测量了monoSAMiRNA(n＝2)、monoSAMiRNA(n＝3)和monoSAMiRNA(n＝4)。
实施例3-3.测量由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒的粒度和多分散性指数(PDI)
纳米颗粒的粒度通过ζ电位测量。具体地，由实施例3-2制备的均一化的纳米颗粒的粒度通过ζ电位测量(Nano-ZS,MALVERN,England)在以下条件下测量：物质的折光指数为1.459，吸收指数为0.001。溶剂温度：DPBS为25℃且相应的粘度和折光指数分别为1.0200和1.335。通过包括15次重复的粒度测量来进行一次测量，随后重复六次。通过与上述相同的方法测量了monoSAMiRNA(n＝1)、monoSAMiRNA(n＝2)、monoSAMiRNA(n＝3)和monoSAMiRNA(n＝4)。
证实了由monoSAMiRNA(n＝1)构成的纳米颗粒的粒度为111nm，且由monoSAMiRNA(n＝1)构成的纳米颗粒的PDI为0.19。证实了由monoSAMiRNA(n＝2)构成的纳米颗粒的粒度为约86nm且其PDI为0.25，由monoSAMiRNA(n＝3)构成的纳米颗粒的粒度为约80nm且其PDI为0.30，且由monoSAMiRNA(n＝4)构成的纳米颗粒的粒度为约83nm且其PDI为0.26(图16)。由于PDI值是降低的，因此相应的颗粒是均匀分布的，且由此可认为本发明的纳米颗粒具有显著均一的粒度。
实施例3-4.通过TEM观察由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒
由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒通过TEM观察以证实其形状。具体地，将S-SAMiRNA溶解在DPBS中，由此具有的最终浓度且通过超声波分散器(Wiseclean:DAIHAN,Korea)处理，由此使纳米颗粒的粒度均一化(700W；幅度：20％)。用具有高电子密度的材料通过负染法观察由S-SAMiRNA构成的纳米颗粒。证实了通过TEM观察的纳米颗粒具有与在实施例3-2中测量的纳米颗粒的粒度相似的粒度。
实施例4.使用由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒在肿瘤细胞系中抑制靶标基因的表
达
转染肿瘤细胞系的存活素基因的表达方面通过使用实施例3-2所制备的由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒来分析。
实施例4-1.肿瘤细胞系的培养
将由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的人子宫颈癌细胞(HeLa)在含有10％(v/v)胎牛血清、青霉素和链霉素的EMEM培养基(由ATCC配制的伊格尔最低必需培养基,U.S.A)中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养。
实施例4-2.使用由monoSAMiRNA构成的纳米颗粒转化肿瘤细胞系
将由实施例4-1培养的1×105个成纤维细胞系在EMEM培养基中在12孔板中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养18小时并除去培养基并将相同量的Opti-MEM培养基(GIBCO,USA)分配到每个孔中。将Opti-MEM培养基和SAMiRNA及由实施例3-2制备的monoSAMiRNA以的浓度加到DPBS中并通过与实施例3-1相同的方法将所得混合物在-75℃和5mTorr的条件下冷冻干燥48小时以产生均一的纳米颗粒。然后，将其中分配有Opti-MEM的各孔肿瘤细胞系用浓度为200nM的转染溶液处理并在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养总计48小时。
实施例4-3.对存活素基因的mRNA的相对定量分析
cDNA通过由在上述实施例4-2中转染的细胞系提取全部RNA来合成且存活素mRNA的表达量通过实时PCR根据在韩国专利公开文本10-2009-0042297中公开的方法进行相对定量(参见图17)。对于SAMiRNA的每种结构，Sur584是指以下SAMiRNA，其具有就靶标基因存活素而言特异的双链寡RNA序列(SEQIDNO:1)，且CONT是指以下SAMiRNA，其包含不影响靶标基因的表达的对照组序列(SEQIDNO:2)。对靶标基因的mRNA的表达的抑制程度如下计算：通过比较定量将用Sur584处理的样品的靶标基因的表达量以用CONT处理的样品的靶标基因的表达量进行处理。所有包含存活素特异性双链寡RNA的monoSAMiRNA(n＝1至4)都具有对靶标基因表达的抑制作用，且由其中具有两个或更多个亲水性材料嵌段的monoSAMiRNA(n＝2)观察到对靶标基因表达的高抑制作用(约75％或更高的表达抑制)得以保持。
实施例5.制备其中将氨基和/或组氨酸基团引入到亲水性材料中的双链寡核苷酸
结构
实施例5.1.制备包含乙二醇作为亲水性材料单体的SAMiRNA
对于本发明的包含乙二醇且具体为1,6-己二醇作为亲水性材料单体且C24二十四烷作为疏水性材料的双链寡核苷酸结构，双链寡核苷酸结构可由以下结构式(22)表示：
在结构式(22)中，C24为二十四烷，其为疏水性材料，且n为六乙二醇的重复单元且与在结构式(1)或(2)中的定义相同。
在该实施例中，制备了由以下结构式(23)表示的双链寡RNA结构([六乙二醇]4-SAMiRNA)，其中n为4：
结构式(23)具体地由以下结构式(24)表示：
在结构式(23)和(24)中，S为siRNA的有义链；AS为siRNA的反义链；六乙二醇为亲水性材料；C24为疏水性材料即包含二硫键的二十四烷；且5’和3’是指双链寡RNA端部的方向性。
结构式(23)和(24)的siRNA的有义链如下制备：基于韩国专利公开文本10-2012-0119212的实施例1所制备的3’Uny-CPG作为载体合成具有β-氰基乙基亚磷酰胺形式的n个六乙二醇，且凭借其中形成RNA骨架结构的磷酸二酯键通过使用RNAβ-氰基乙基亚磷酰胺来连接的上述方法合成其中六乙二醇结合于3’端的寡RNA-亲水性材料结构的有义链，且将包含二硫键的二十四烷结合于5’端，由此产生预期的RNA-聚合物结构的有义链。对于其中用有义链进行退火的反义链，具有与有义链互补的序列的反义链通过上述反应产生。
当合成完成时，将通过在水浴中在60℃处理28％(v/v)氨水来合成的RNA单链和RNA-聚合物结构各自与CPG分开并通过脱保护反应从其中除去保护部分。将从其中除去保护部分的RNA单链和RNA-聚合物结构用体积比为10:3:4的N-甲基吡咯烷酮、三乙胺和三乙胺三氢氟化物在烘箱中在70℃处理以除去2’TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)。
反应产物的RNA通过配备有DaisogelC18(Daiso,Japan)柱的HPLCLC918(JapanAnalyticalIndustry,Japan)分离和纯化，且通过MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu,Japan)证实纯化的RNA是否符合靶标碱基序列。然后，为了制备各种双链寡RNA结构，将等量的有义链和反义链彼此混合并置于1×退火缓冲液(30mMHEPES、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁(pH7.0至7.5))中，随后在恒温水浴中在90℃反应3分钟并再次在37℃反应，由此制备包含具有存活素序列作为有义链的siRNA的各种双链寡RNA结构。通过电泳证实所产生的双链寡RNA结构是退火的。
实施例5.2.制备包含其中引入有氨基的乙二醇作为亲水性材料单体的SAMiRNA
制备由以下结构式(25)表示的双链寡RNA结构，其中将氨基引入到亲水性材料中。
结构式(25)具体地由以下结构式(26)表示：
在结构式(25)和(26)中，S为siRNA的有义链；AS为siRNA的反义链；六乙二醇为亲水性材料；C6为具有6个碳且将[乙二醇]4与胺连接的衔接物；C24为疏水性材料即包含二硫键的二十四烷；且5’和3’是指双链寡RNA端部的方向性。
此外，亲水性材料嵌段在siRNA有义链的3’端连接于磷酸基团。
结构式(25)和(26)的siRNA的有义链如下制备：基于包含3’琥珀酰亚胺衍生物的CPG作为载体合成具有β-氰基乙基亚磷酰胺形式的4个六乙二醇，且凭借其中形成RNA骨架结构的磷酸二酯键通过使用RNAβ-氰基乙基亚磷酰胺来连接的上述方法合成其中六乙二醇结合于3’端的寡RNA-亲水性材料结构的有义链，且将包含二硫键的二十四烷结合于5’端，由此产生预期的RNA-聚合物结构的有义链。对于其中用有义链进行退火的反义链，具有与有义链互补的序列的反义链通过上述反应产生。
当合成完成时，将通过在水浴中在60℃处理28％(v/v)氨水来合成的RNA单链和RNA-聚合物结构各自与CPG分开并通过脱保护反应从其中除去保护部分。将从其中除去保护部分的RNA单链和RNA-聚合物结构用体积比为10:3:4的N-甲基吡咯烷酮、三乙胺和三乙胺三氢氟化物在烘箱中在70℃处理以除去2’TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)。
反应产物的RNA通过配备有DaisogelC18(Daiso,Japan)柱的HPLCLC918(JapanAnalyticalIndustry,Japan)分离和纯化，且通过MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu,Japan)证实纯化的RNA是否符合靶标碱基序列。然后，为了制备各种双链寡RNA结构，将等量的有义链和反义链彼此混合并置于1×退火缓冲液(30mMHEPES、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁(pH7.0至7.5))中，随后在恒温水浴中在90℃反应3分钟并再次在37℃反应，由此制备包含具有存活素序列作为有义链的siRNA的各种双链寡RNA结构(以下分别称为SAMiRNA-存活素)。通过电泳证实所产生的双链寡RNA结构是退火的。
实施例5.3.制备包含其中引入有多组氨酸基团的乙二醇作为亲水性材料单体的
SAMiRNA
制备由以下结构式(27)表示的双链寡RNA结构，其中将肽引入到亲水性材料中。
在结构式(27)中，H为组氨酸，且C为半胱氨酸。
结构式(27)具体地由以下结构式(28)表示：
在结构式(27)和(28)中，S为siRNA的有义链；AS为siRNA的反义链；[乙二醇]4为亲水性材料；衔接物为在肽和SAMiRNA之间的衔接；肽为由HHHHHHC序列构成的肽；C24为疏水性材料即包含二硫键的二十四烷；且5’和3’是指双链寡RNA端部的方向性。
此外，亲水性材料嵌段在siRNA有义链的3’端连接于磷酸基团。
结构式(27)和(28)中的siRNA的有义链如下制备：将具有结合于胺的官能团(例如NHS酯)和结合于肽的巯基(-SH)的官能团(例如马来酰亚胺)的衔接物与实施例5-2的由结构式(25)和(26)表示的寡核苷酸连接。具体地，将衔接物连接于具有结构式(25)和(26)的结构的寡核苷酸，然后通过HPLC或树脂纯化。将肽连接于纯化的寡核苷酸并通过HPLC纯化，由此制备siRNA的有义链。对于其中用有义链进行退火的反义链，具有与有义链互补的序列的反义链通过上述反应产生。反应产物的RNA通过配备有DaisogelC18(Daiso,Japan)柱的HPLCLC918(JapanAnalyticalIndustry,Japan)分离和纯化，且通过MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu,Japan)证实纯化的RNA是否符合靶标碱基序列。然后，为了制备各种双链寡RNA结构，将等量的有义链和反义链彼此混合并置于1×退火缓冲液(30mMHEPES、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁(pH7.0至7.5))中，随后在恒温水浴中在90℃反应3分钟并再次在37℃反应，由此制备包含具有存活素序列作为有义链的siRNA的各种双链寡RNA结构(以下分别称为SAMiRNA-存活素)。通过电泳证实所产生的双链寡RNA结构是退火的。
实施例6.通过由双链寡核苷酸聚合物结构(六乙二醇-SAMiRNA)形成的纳米颗粒
在HeLa细胞系中抑制靶标基因表达
通过使用由包含可减少存活素表达量的siRNA序列的六乙二醇-SAMiRNA形成的纳米颗粒转化子宫颈癌细胞系(HeLa)，且靶标基因的表达方面在转化的子宫颈癌细胞系(HeLa)中以RNA水平进行分析。
实施例6-1.人子宫颈癌细胞系的培养
将由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的人子宫颈癌细胞系(HeLa)在与实施例5-1相同的条件下培养。
实施例6-2.将其中引入有氨基的六乙二醇-SAMiRNA转染到人子宫颈癌细胞系中
将由实施例6-1培养的0.8×105个子宫颈癌细胞系(HeLa)在EMEM培养基中在12孔板中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养18小时并除去培养基并将相同量的Opti-MEM培养基(GIBCO,USA)分配到每个孔中。通过与实施例5-1相同的方法将所得混合物在-75℃和5mTorr的条件下冷冻干燥48小时以产生均一的纳米颗粒。加入由实施例3-2制备的六乙二醇-SAMiRNA并以的浓度溶解在DPBS中并按照50、100和200nM的浓度在Opti-MEM培养基(1ml)中处理。根据浓度在肿瘤细胞系的每个孔中分配并处理包含六乙二醇-SAMiRNA的Opti-MEM并将所得产物在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养总计48小时。
实施例6-3.对靶标基因mRNA的相对定量分析
凭借与实施例4-3相同的方法通过由在实施例6-2中转染的细胞系提取全部RNA来产生cDNA，且靶标基因的mRNA表达量通过实时PCR进行相对定量。靶标基因表达由于用其中引入有氨基的六乙二醇-SAMiRNA进行处理而观察到的抑制量明确地证实了其中引入有氨基的六乙二醇-SAMiRNA与对照组即六乙二醇-SAMiRNA相比的效能(图18)。
Claims (31)
1.具有由以下结构式(1)或结构式(2)表示的结构的寡核苷酸结构：
Q-(Am-J)n-X-R-Y-B结构式(1)
Q-(J-Am)n-X-R-Y-B结构式(2)
其中A为亲水性材料单体，B为疏水性材料，J为用于在各组m个亲水性材料单体之间连接的衔接物或用于在m个亲水性材料单体与寡核苷酸之间连接的衔接物，X和Y各自独立地为简单的共价键或由衔接物介导的共价键，R为单链或双链寡核苷酸，m为1至15的整数，且n为1至10的整数，
Q为(Li-Zj)或P-J1-J2，
L为配体，其特异性结合于通过由受体介导的内吞作用(RME)促进靶标细胞内摄的受体，
Z为衔接物，其介导简单的共价键或介导亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体和配体之间的键，
i表示0-5的整数且优选为0-3的整数，且j表示0或1，条件是当i为0时，j必须为0，
P表示氨基或多组氨酸基团，且
J1和J2独立地为衔接物，其介导简单的共价键或介导氨基或多组氨酸基团与亲水性材料之间的键。
2.权利要求1的寡核苷酸结构，其中R为双链寡核苷酸，且有义链或反义链具有19至31个核苷酸。
3.权利要求2的寡核苷酸结构，其中磷酸基团结合于双链寡核苷酸的反义链的5’端。
4.权利要求3的寡核苷酸结构，其中连接于反义链的5’端的磷酸基团为一个至三个。
5.权利要求1的寡核苷酸结构，其中所述疏水性材料具有的分子量为250至1,000。
6.权利要求5的寡核苷酸结构，其中所述疏水性材料为选自以下的一种：类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12至C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂和脂多胺。
7.权利要求6的寡核苷酸结构，其中所述类固醇衍生物选自胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇甲酸酯、胆甾烷醇甲酸酯和胆甾醇胺。
8.权利要求6的寡核苷酸结构，其中所述甘油酯衍生物选自甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。
9.权利要求1的寡核苷酸结构，其中所述亲水性材料单体具有由以下化合物(1)表示的结构：
化合物(1)
其中G选自CH2、O、S和NH。
10.权利要求1的寡核苷酸结构，其中衔接物(J)选自PO3 -、SO3和CO2。
11.权利要求1的寡核苷酸结构，其中X、Y和Z分别为不可降解的键或可降解的键。
12.权利要求11的寡核苷酸结构，其中所述不可降解的键为酰胺键或磷酸化键。
13.权利要求11的寡核苷酸结构，其中所述可降解的键为二硫键、酸可降解的键、酯键、酐键、生物可降解的键或酶可降解的键。
14.权利要求1的寡核苷酸结构，其中Q为(Li-Zj)，Z为衔接物，其介导亲水性材料嵌段中的亲水性材料单体和配体之间的键，且衔接物Z包含六乙二醇。
15.权利要求14的寡核苷酸结构，其中衔接物Z为化合物(4)：
化合物(4)
其中T是指1至15次重复的如下表示的化合物(1)，且G选自CH2、O、S和NH，
化合物(1)。
16.权利要求1的寡核苷酸结构，其中Q为(Li-Zj)且具有由以下结构式(19)表示的结构：
结构式(19)
其中A、B、R、m、n、Z和L与在权利要求1的结构式(2)中的定义相同。
17.权利要求1的寡核苷酸结构，其中Q为(Li-Zj)，且配体(L)选自糖类、肽和抗体。
18.权利要求17的寡核苷酸结构，其中所述糖类选自己糖胺、单糖、二糖和多糖。
19.权利要求1的寡核苷酸结构，其中Q为P-J1-J2，且P为选自以下的一种：伯氨基至叔氨基或包含5至8个组氨酸的多组氨酸基团。
20.权利要求19的寡核苷酸结构，其中J1和J2独立地选自简单的共价键、C2-12烷基、烯基、炔基、PO3 -、SO3和CO2。
21.由以下结构式(20)表示的固体载体：
结构式(20)
其中L为配体，其特异性结合于通过由受体介导的内吞作用(RME)促进靶标细胞内摄的受体，T为其中化合物(1)重复1至15次的化合物(化合物(1)中的G选自CH2、O、S和NH)，
化合物(1)
C和D中的一个是指固体载体，C和D中的另一个是指二甲氧基三苯甲基，i为0-3的整数，且E和F独立为1至10。
22.通过使用权利要求21的固体载体制备权利要求1的单链或双链寡核苷酸结构的方法。
23.权利要求22的方法，所述方法包括：
(1)将亲水性材料嵌段以n次重复共价结合于由结构式(20)表示的固体载体；
(2)基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链寡核苷酸；
(3)将疏水性材料共价结合于与亲水性材料嵌段结合的寡核苷酸的5’端；和
(4)将寡核苷酸结构与固体载体分开。
24.权利要求22的方法，所述方法包括：
(1)将亲水性材料嵌段以n次重复共价结合于由结构式(20)表示的固体载体；
(2)基于与亲水性材料嵌段结合的固体载体合成单链RNA；
(3)将疏水性材料共价结合于与亲水性材料嵌段结合的RNA的5’端；
(4)将RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA与固体载体分开；和
(5)通过对RNA-聚合物结构和具有与其互补的序列的单链RNA进行退火形成双链寡核苷酸。
25.权利要求23的方法，其中与步骤(2)的单链寡核苷酸互补的单链寡核苷酸具有结合于该单链寡核苷酸的5’端的磷酸基团。
26.纳米颗粒，其包含权利要求1-20中任一项的寡核苷酸结构。
27.权利要求26的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒为低压冻干的。
28.一种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项的寡核苷酸结构。
29.一种药物组合物，其包含权利要求26或27的纳米颗粒。
30.通过使用权利要求1-20中任一项的寡核苷酸结构控制体外或体内基因表达的方法。
31.通过使用权利要求26或27的纳米颗粒控制体外或体内基因表达的方法。
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