JP2010515771A - トポイソメラーゼインヒビターの治療効果を増強する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
DNAトポイソメラーゼは、正常な細胞周期を通じてDNA鎖の切断および再結合を触媒することにより、DNAのトポロジーにおける高次構造上の変化を調節する核酵素である。それらは、複製および転写の間のねじれのストレスを開放する。
本発明は、細胞増殖を調節するための方法であって、細胞とE3ユビキチンリガーゼ阻害剤の有効量とを接触することと、並びに当該細胞とトポイソメラーゼ阻害剤の有効量とを接触することとを含み、それによって、当該E3ユビキチンリガーゼ阻害剤とトポイソメラーゼ阻害剤が、トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された対応する細胞に比べてより大きい程度に細胞増殖を調節する方法を提供する。
試験薬剤を用意すること;
E3ユビキチンリガーゼを、ユビキチン活性化酵素、E3ユビキチンリガーゼの基質およびユビキチンを当該試験薬剤の存在または不在において接触すること;並びに、
当該試験薬剤の存在下において、当該基質のユビキチン化が減少するか否かを判断すること;
ここで、当該基質のユビキチン化が当該試薬剤の存在下で減少した場合には、当該試験薬剤がE3ユビキチンリガーゼ阻害剤であるとして識別される。
当該薬剤を製造すること;
を含む方法を提供する。
試験薬剤を用意すること;
細胞を試験薬剤の有効量と接触すること、および当該細胞とトポイソメラーゼ阻害剤の有効量と接触すること;並びに
トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された細胞と比較して、当該試験薬剤とトポイソメラーゼ阻害剤とでの処理が、細胞増殖を調節するか否かを識別すること;ここにおいて、当該細胞増殖が減少した場合に、当該試験薬剤を、当該トポイソメラーゼ阻害剤に対して細胞を再感受性化する化合物として識別する;
を有する方法を提供する。
上述の方法を実施し、E3ユビキチンリガーゼによるE3ユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化を阻害する試験薬剤を識別すること;および
当該試験薬剤と製造すること;
を含む方法を提供する。
NM_005180.5 または NM_002931.3 に示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同な第一の鎖のヌクレオチドと当該第一の鎖と実質的に相補的な第二の鎖とを含むdsRNA;および
NM_005180.5 or NM_002931.3 に示される配列を含む第一の鎖のヌクレオチドと、当該第一の鎖のヌクレオチドと実質的に相補的な配列を含む第二の鎖のヌクレオチドとを含むdsRNA;
ここで、当該dsRNA分子は、NM_005180.5 または NM_002931.3 に示される鎖を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
標的遺伝子配列としてのE3ユビキチンリガーゼを選択すること;
細胞を、当該標的遺伝子配列の一部分と実質的に相同なdsRNAと接触すること;および
dsRNAがトポイソメラーゼを安定化するか否かを決定すること。
この発明は、細胞を有効量のE3ユビキチンリガーゼ阻害剤と接触すること、および前記細胞を有効量のトポイソメラーゼ阻害剤と接触することで前記E3ユビキチンリガーゼ阻害物質および前記トポイソメラーゼ阻害剤が細胞増殖を前記トポイソメラーゼ阻害剤のみで処理される対応する細胞に比べてより大きい程度に調節することを含む細胞増殖を調節する方法を提供する。
X1およびX2は独立して酸素または硫黄である;および
R3,R4,R5およびR6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。
R3,R4,R5およびR6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。
R7は水素、ハロゲン、アルキル、アシル、カルボン酸、アルコキシ、アリル、またはヘテロ環式アリルである。
R3,R4,R5およびR6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである;
を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である。
R7は水素、ハロゲン、アルキル、アシル、カルボン酸、アルコキシ、アリル、またはヘテロ環式アリルである、
を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である。
当該試験薬剤を製造すること;
を含む方法が提供される。
試験薬剤を提供すること;
細胞を試験薬剤の有効量と接触すること、および当該細胞をトポイソメラーゼ阻害剤の有効量と接触すること;および
トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された細胞と比較して、当該試験薬剤とトポイソメラーゼ阻害剤とでの処理が、細胞増殖を調節するか否かを決定すること;
ここで、当該細胞増殖が低下した場合に、当該試験薬剤が、細胞を当該トポイソメラーゼ阻害剤に対して再感受性化する化合物である識別する;
を含む方法を提供する。
当該試験薬剤を製造すること
を含む方法を提供する。
配列番号3で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号4で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
配列番号5で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号6で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
配列番号7で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号8で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
配列番号9で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号10で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
その組み合わせ。
NM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同なヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖と実質的に相補的な第二の鎖を含むdsRNA分子;および
NM_005180.5 または NM_002931.3で示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖に実質的に相補的な配列を含むヌクレオチドの第二の鎖を含むdsRNA分子;
ここで、当該dsRNA分子は、NM_005180.5 または NM_002931.3に示される鎖を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
当該方法の1つの態様において、当該細胞はヒト細胞である。当該細胞は、癌細胞であってもよい。当該癌細胞は、心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞からなる群より選択される。
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
標的遺伝子配列としてE3ユビキチンリガーゼを選択すること;
細胞を当該標的遺伝子配列の一部分に対して実質的に相同なdsRNAと接触すること;
当該dsRNAがトポイソメラーゼを安定化するか否かを決定すること。
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
NM_005180.5で示される19〜25の連続するヌクレオチドに対して実質的に相同なヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖に実質的に相補的な第二の鎖を含むdsRNA分子;および
NM_005180.5で示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖に実質的に相補的な第二の鎖を含むdsRNA分子;
ここで、当該dsRNA分子は、NM_005180.5で示される鎖を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
配列番号3で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号4で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子:
配列番号5で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号6で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子:および
その組み合わせ。
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチド;
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;および
癌を有する哺乳類に対して前記化合物を投与するための指導手段(instruction means);
を含むキットを提供する
当該キットの1つの態様において、当該dsRNA分子は、上述の群から選択される。
他に記載がない限り、ここにおいて使用される用語は、当該技術分野の当業者による慣用的な使用に従って理解されるべきである。以下に提供される用語の定義に加えて、分子生物学の一般的な用語の定義は、また以下に見出されてもよい:Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5th Ed., Berlin: Springer-Verlag; and in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement)。
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」はオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列またはそのフラグメント、一部分またはこれらの何れかのサブユニット、および天然に生じた分子または合成分子を含む。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合により、または修飾されたペプチド結合により、即ち、アイソスター、互いに結合されたアミノ酸を含み、且つ20遺伝子にコードされるアミノ酸以外の修飾アミノ酸を含んでもよい。用語「ポリペプチド」はまたペプチドおよびポリペプチドフラグ綿度、モチーフなどを含んでもよい。当該用語はグリコシル化ポリペプチドも含む。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、全ての「ミメティック」および「ペプチドミメティック」形態を含み、更に詳しくは以下に記載するとおりである。
「ストリンジェントな条件」または「高いストリンジェント条件」は、ここで定義される場合、しかしながらこれに限定するものではないが、(1)洗浄のための低いイオン強度および高い温度、例えば、50℃で0.015 M 塩化ナトリウム/0.0015 M クエン酸ナトリウム/0.1% ドデシル硫酸ナトリウムの使用するもの;および/または(2)ハイブリダイゼーション中のホルムアミドなどの変性剤、例えば、42℃で、0.1% ウシ血清アルブミン/0.1% フィコール/0.1% ポリビニルピロリドン/750 mM 塩化ナトリウム、75 mM クエン酸ナトリウムを含む50 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.5) を含む50% (v/v) ホルムアミドの使用ものである。「中程度のストリンジェント条件」は、これに限定されるものではないが、次により記載され;Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989;および洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度およびSDSの%)の使用を含み、上述の条件よりも低いストリンジェントである。中程度のストリンジェント条件の例は、37℃で、20% ホルムアミド、5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM クエン酸三ナトリウム)、50 mM リン酸ナトリウム(pH 7.6)、5xデンハート溶液、10% 硫酸デキストランおよび20 mg/mL 変性断片化サケ精子DNAを含む溶液で一晩インキュベートし、次に約37-50℃で1xSSC当該フィルタを洗浄する。当業者は、例えば、プローブの長さなどの因子を適応するための必要性によりどのように温度、イオン強度などを調節するのかは認識できるであろう。
本発明は、動物細胞における遺伝子抑制または遺伝子サイレンシングする方法を提供する。本発明の1つの側面において、当該遺伝子は転写性である。本発明の1つの側面において、当該動物は哺乳類、例えば、ヒトである。
ここで提供される遺伝子サイレンシングの方法の1つの側面において、標的配列が同定される。標的配列は、siRNAにより標的化、認識および/または結合される配列である。標的配列は、これらに限定するものではないが、核酸およびタンパク質またはそれらの誘導体、変異体またはその一部分を含む。本発明の1つの側面において、標的配列はプロモーター、イントロンおよびエクソン配列を含む。本発明の1つの側面において、当該標的配列はE3ユビキチンリガーゼをコードする。他の側面において、E3ユビキチンリガーゼはBmi1および/またはRING1である。更なる側面において、当該E3ユビキチンリガーゼはsiRNAにより標的化される。
本発明の核酸は、siRNAおよびそれらをコードする核酸を含み、例えば、cDNAライブラリーのクローニングおよび発現、メッセンジャー若しくはゲノムDNAのPCRによる増幅などにより製造、単離および/または操作され得る。本発明の方法の実行において、相同的な遺伝子は、ここで記載された通りに、テンプレート核酸を操作することにより修飾され得る。本発明は、当該技術分野において公知の何れの方法またはプロトコールまたは装置との協同において実行されてよく、それらは科学文献および特許文献において十分に記載されている。
、および種々の分離技術は公知のものであり、一般的に当業者に使用されている。多くの標準的技術は以下に記載されている;Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes , Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993); Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; and Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York。使用される略語および命名法は、当該分野における標準的であると思われ、ここで引用される文献などの専門雑誌において一般的に使用される。
5) Biotechnology 13:563-564。
本発明はまた、その遺伝子発現が本発明の方法または組成物を使用してサイレンシングされた細胞を提供する。本発明の1つの側面において、細胞は、転写性にサイレンシングされた遺伝子発現を有する。遺伝子が転写性にサイレンシングされた当該細胞は動物細胞を含む。動物細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞を含む。例示的な動物細胞は、インビトロ、エキソビボまたはインビボの何れかのCHO、COS、HeLa、HT29または何れかのマウスまたはヒト細胞株を含む。適切な宿主の選択は、当業者の能力で行なえる。
ここにおいて提供される方法において使用されるsiRNAは、ここで記載されるように、種々の供給源から得られ得る。siRNAは、約1〜約200ヌクレオチド、約5 〜約100 ヌクレオチド、約10 〜約 50 ヌクレオチド、約15 〜約30 ヌクレオチド、または約 19 〜約25 ヌクレオチドを含み得る。
本発明の一側面において、ターゲット配列特異的siRNAは、核膜に侵入(通過)するよう設計され、これによって遺伝子発現がサイレンシングされる。本発明の方法および組成物の様々な側面において、核への侵入は、核膜を通る巨大分子輸送プロセス、核酸を核内に輸送可能なベクターによって達成され、例えば、レンチウイルスベクターといったウイルスベクター、核輸送介在ペプチド、エレクトロポレーション、脂質小胞、MPGまたはこれらの組み合わせ、当該分野で既知の全ての技術(例えば、Morris, M. C., Vidal, P., Chaloin, L., Heitz, F. & Divita, G. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res 25, 2730-6 (1997)参照)、当該分野で既知のいずれかの形質移入薬剤(例えば、Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986))によって達成できる。
核膜を通る巨大分子輸送プロセスは当該分野で既知であり、核移入または核移出のいずれかを介在する可溶性輸送受容体が多く同定されている。これらの受容体の大部分は、1つの大きなタンパク質のファミリーに属し、その全ては、タンパク質移入受容体インポーチンβ(importinβ)(カリオフェリンβ(karyopherinβ)としても知られる)との相同性を共有している。このファミリーのメンバーは、それらが積荷を運ぶ方向に基づいて、インポーチンまたはエクスポーチン(exportin)と分類されている。最近までに、当該ファミリーは、酵母サッカロマイセス・セレビジエにおいて14のメンバーを含み、ヒトにおいて少なくとも22のメンバーを含んでいる。
巨大分子輸送組成物として、インポーチンβ(カリオフェリンβとしても知られる)を含むことに加えて、本発明のある側面は、SV40 T抗原核局在シグナル、ヒトLEDGF/p75タンパク質、ヌクレオポリン(nucleoporins)及び輸送因子またはいずれかのその他の巨大分子輸送プロセスを含み得る(例えば、Yasuhara, Exp Cell Res. 2004 Jul 1;297(1):285-93; Maertens, J Biol Chem. 2004 May 25; Zolotukhin, J Virol. 1999 Jan;73(1):120-7参照)。
遺伝子サイレンシングの適用
本発明は、疾病治療のための、ターゲット配列または遺伝子の遺伝子発現を阻害する組成物または方法を提供する。本発明による組成物または方法を使用して阻害できる対象となる遺伝子は、癌に関与する遺伝子または癌治療への応答に関与する遺伝子を含むが、これらに限定されない。一側面において、癌治療への応答に関与する遺伝子は、E3ユビキチンリガーゼ(例えば、Bmi1および/またはRING1であるが、こられに限定されない)をコードする。したがって、本発明は、また、癌治療への応答に関与する遺伝子をターゲットとするsiRNAを提供する。本願によって提供される方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで実施されてよい。
本発明の一側面において、siRNAは、E3ユビキチンリガーゼをサイレンシングする。別の側面において、siRNAは、E3ユビキチンリガーゼであるBmi1および/またはRING1をサイレンシングする。ヒトBmi1のヌクレオチド配列は、NM_005180.5に見つかり、ヒトRING1のヌクレオチド配列は、NM_002931.3に見つかる。したがって、例示的なsiRNAは、(a)配列番号:3に示される配列を含む第1の鎖と、配列番号:4に示される配列を含む第2の鎖とを有するdsRNA分子;(b)配列番号:5に示される配列を含む第1の鎖と、配列番号:6に示される配列を含む第2の鎖とを有するdsRNA分子;(c)配列番号:7に示される配列を含む第1の鎖と、配列番号:8に示される配列を含む第2の鎖とを有するdsRNA分子;(d)配列番号:9に示される配列を含む第1の鎖と、配列番号:10に示される配列を含む第2の鎖とを有するdsRNA分子;および(e)これらの組み合わせ、から成る群から選択されるsiRNAを含む。その他の例示的なsiRNA配列は、以下の表に示される配列(これらは、本願に示されるように、遺伝子サイレンシング活性が容易に試験される)ならびにBmi1およびRING1の断片である。
本発明は、疾病に関与する遺伝子発現をサイレンシングする組成物および方法を提供し、より好ましくは、疾病の治療に関与する遺伝子発現をサイレンシングする組成物および方法を提供する。多くの症状は、それらが関与する遺伝子(すなわち、治療すべき疾病の原因となるまたは原因の一部となる遺伝子)を有する。その他の症状において、遺伝子の発現は、化学療法といった療法に対する反応に影響する。本願によって教示されるsiRNAといった阻害性化合物は、ターゲット遺伝子の発現を阻害し、それによって疾病の病徴を軽減または治療様式に対する応答性を増大させるために使用できる。本願によって教示される阻害性化合物は、トポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせて、癌といった疾病を治療するために使用できる。
剤形および送達方法は、一般に、治療する部位および疾病に応じて最適化される。例示的な剤形は、非経口投与(例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与または皮下投与)に適したものを含むが、これらに限定されず、ミセル、リポソーム又は薬剤放出カプセル(徐放性となるよう設計された生物適用性コーティング内に取り込まれた活性薬剤)に封入された剤形;摂取可能な剤形;クリーム、軟膏及びゲルといった局所使用のための剤形;および、吸入剤、エアロゾル及びスプレーと言ったその他の剤形を含む。本発明の化合物の用量は、治療が必要な程度および重症度、投与された組成物の活性、対象の健康状態、および当業者に周知のその他の考慮すべき事項に従って、変化するだろう。
医薬組成物
本願に記載される阻害性化合物は、投与に適した医薬組成物に取り込ませることができる。そのような組成物は、典型的に、薬剤および医薬的に許容可能な担体を含む。補助的な活性化合物もまた、組成物に取り込ませることができる。
患者の治療
本発明の遺伝子サイレンシング法および組成物は、患者の治療に使用できる。一側面において、ターゲット配列は患者のゲノムに組み込まれることができ、患者は、ターゲット配列特異的siRNAにて治療され得る。インビボで細胞を形質移入する方法(例えばプロトコール)及び組成物(例えば製剤)は、本願で議論されるように、既知である。
上述の治療的アプローチは、広範囲の外科、化学療法または放射線治療レジメンの任意の1つと組み合わせることができる。一実施態様において、阻害性化合物は、トポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせることができ、任意にその他の治療レジメンを含むことができる。本発明の治療的アプローチは、化学療法(またはその他の治療)の用量の低減および/または投与頻度の低下を可能とし、全ての患者にとって、特に化学療法剤の毒性に十分耐性がない患者にとって利点となる。
特定の阻害性化合物またはそのような化合物の組み合わせの抗腫瘍活性は、単独でまたはトポイソメラーゼ阻害剤との組み合わせで、または、低濃度のグルコースの存在下で、様々なインビトロおよびインビボアッセイシステムを使用して評価することができる。治療活性を評価するインビトロアッセイは、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび腫瘍促進活性を示すその他のアッセイ、および、阻害性化合物がトポイソメラーゼの分解を低下させる程度を決定できる分解アッセイ、および、化合物がトポイソメラーゼDNA複合体を安定化させる程度を決定できる結合アッセイを含む。
本発明はまた、阻害性化合物を使用し、および、基質(例えばトポイソメラーゼ、しかしこれに限定されない)のE3リガーゼユビキチン化に対する効果を試験する、スクリーニング方法を提供する。
本発明は、細胞、阻害性化合物、ターゲット配列、形質移入剤、誘導剤、 (本発明の方法に関する)説明書、治療剤(例えばトポイソメラーゼ阻害剤、しかしこれに限定されない)またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明の組成物および方法を含むキットを提供する。
例1
E3ユビキチンリガーゼのサイレンシングは薬剤毒性を増大する
77の候補遺伝子を特異的に標的とするRNAiオリゴマーを設計した。重要なE3ユビキチンリガーゼのサイレンシングは、薬剤毒性を増大させるとの仮定の下、1つの遺伝子当たり2つのRNAiオリゴマーを、HeLa細胞における毒性アッセイにて試験した。オリゴマーはIDT DNA (IL USA)から入手した。スクリーニングを、半毒性濃度のCPT (Camptothecin, Sigma, Israel)、TOPI薬剤およびVM26 (Teniposide, Alexis Biochemicals Corp., CA, U.S.A.)、TOPII薬剤の存在下、行った。
Bmi1のsiRNAサイレンシングは、TOPIおよびTOPIIαの分解を安定化させた
例1に記載される条件を使用して、HeLa細胞に、Bmi1 X63およびX165 RNAiオリゴマーまたはスクランブル(scrambled)RNAiオリゴマーを形質移入した。形質移入から48時間後、細胞を、100μMのVM26で0、3又は5時間処理し、または、25μMのCPTの存在下0、4.5または6時間処理した。スクランブルオリゴマーで処理した細胞の一部を、25μMのプロテアーゼ阻害剤MG132(Sigma, Israel)で処理した。細胞を回収し、アルカリ抽出し、S7 DNAse(Roche, Germany)で処理して、DNAからTOPIIを取り出した。
Bmi1のsiRNAサイレンシングは、TOPIIα-DNA分解を安定化した
例1に記載されるように、コントロール(スクランブル)またはX63 Bmi1 RNAiオリゴマーをHeLa細胞に形質移入した。図5に示されるように、形質移入の24時間後、様々な時間で、DMSO、100μMのVM26および25μMのMG132で細胞を処理した。
Bmi1のsiRNAサイレンシングは、低グルコース条件においてTOPIおよびTOPIIαの分解を安定化させた
HeLaおよびHT29細胞株を、本質的に例1に記述されるとおりに、コントロールおよびX63 Bmi1 RNAiオリゴマーで処理した。形質移入から4時間後、組織培養培地を、標準濃度のまたは低濃度のグルコースのどちらかを含む(または本質的にグルコースを含まない)新鮮な培地に取替え、更に44時間培養した。
RING1のsiRNAサイレンシングはTOPIIα分解を安定化させた
RING1は、例1において候補として同定された。RING1のサイレンシングは、TOPIIαの薬剤誘導型分解を阻害したが、RING1Bでは阻害しなかった。
Bmi1のsiRNAサイレンシングおよびトポイソメラーゼ処理は、相乗的に様々な癌細胞の生存度を低下させる
A549およびHeLa細胞をDMEMおよび10%FBSとともに培養した。DU145細胞をMEM-Eagleおよび10%FBSとともに培養した。-MDA-MB-231細胞をRPMIおよび10%FBSとともに培養した。
RING1/Bmi1ユビキチン化活性の修飾因子の同定
Bmi1との複合体としてのE3リガーゼRING1のユビキチン化活性を測定するアッセイを行う。商業的に利用できるユビキチン誘導体は蛍光ドナー分子として利用でき、一方、フルオロフォア融合抗体は、フルオロフォアアクセプターとして使用される。基質タンパク質のユビキチン化は、ドナーの励起後、ドナー(ユビキチン結合)フルオロフォアから放出される光子によって励起される(抗原-抗体相互作用により、基質タンパク質に特異的に結合した)アクセプター抗体の発光によって検出される。ユビキチンの連結は、効果的なエネルギー移動に十分な距離に両フルオロフォアを接近させるため、この反応は、均一な反応条件において行うことができる。ユーロピウムクリプタートドナーフルオロフォアは、ほとんどの通常のフルオロフォアに比べて、非常に長い期間蛍光を発するため、環境から生じる可能性のある自己蛍光分子による干渉を除去する時間分解型の様式で検出される反応が可能となる。
1. E1ユビキチン活性化酵素(0.6 mg/ml, 6μM, Proteologics, Israel)
2. UBCH5a-(Cat # E2616 (50μM), Boston Biochem Inc., MA, U.S.A.)
3. 組換えRING1/Bmi1タンパク質複合体(GST,またはその他の固有のエピトープタグ, Proteologics, Israel)
4. ユビキチン1mg/ml溶液(HPLC水中)
5. ユビキチン-クリプタート - (cat# 61UBIKLB, CisBio, MA, U.S.A.)
6. 鎖伸長を検出する場合、(任意)ビオチン-ユビキチン(または同様のタグ)
7. 抗GST-XL665-(cat# 61GSTXLB, CisBio, MA, U.S.A.,または、RING1/Bmi1中のエピトープタグに対応する同様の試薬)
8. (任意)ストレプトアビジン-XL665-(cat# 61SAXLB, CisBio, MA, U.S.A.-(または相当する試薬),鎖伸長を検出する場合)
9. オボアルブミン100mg/ml溶液(HPLC水中)
10. ATP - 0.1 M
11. MgCl2 - 1 M, Sigma
12. EDTA- 0.5 M, pH=8.
13. Tris 1M pH = 7.6 - Sigma Biotechnology Grade
14. Tween 20 - 6% 溶液(HPLC水中)
15. KF緩衝液(0.8M KF; 2mg/ml BSA; および200mMリン酸緩衝液, pH = 7.0)
16. DTT - 0.1M溶液(HPLC水中)。
反応は、Costar PS black 96ウェルプレートで行い、BMG RubStarプレートリーダー(または同等のもの)を使用して検出する。
1. E1ユビキチン活性化酵素(0.6 mg/ml, 6μM, Proteologics, Israel)
2. UBCH5a (cat # UW9050-0100, Biomol, PA, U.S.A)
3. 組換えRING1/Bmi1タンパク質複合体(GST,またはその他の固有のエピトープタグ, Proteologics, Israel)
4. 抗FLAG-クリプタート(cat# 61FG2KLB, CisBio, MA, U.S.A.)
5. 抗FLAG-XL665-(cat # 61FG2XLB, CisBio, MA, U.S.A.)
6. オボアルブミン100mg/ml溶液(HPLC水中)
7. ATP - 0.1M
8. MgCl2 - 1M, Sigma
9. EDTA - 0.5M, pH = 8.
10. Tris 1M pH = 7.6 - Sigma Biotechnology Grade
11. Tween20-6%溶液(HPLC水中)
12. KF緩衝液(HPLC水中1.6M塩化カリウム)
13. DTT-0.1M溶液(HPLC水中)
次の溶液を用意する:希釈緩衝剤(25mM Tris, pH = 7.6; 0.006% Tween 20; 0.1mM DTT;および0.5 mg/mlオバルブミン); 4X反応混合物; (8mM ATP, 20mM MgCl2; 1000nM FLAG-ユビキチン(Boston Biochem Inc., MA, U.S.A.); 400nM UBC5A); 4X E1溶液(冷却した希釈化緩衝液中20nM E1); 4X RING1A/GST-Bmi1溶液(冷却した希釈化緩衝剤中80nM RING1/Bmi1、氷上に維持); 試験化合物溶液(試験化合物は、4% DMSOおよび4% PEG-400中に室温で希釈); 抗体溶液(1.4% (v/v)抗FLAG-XL665, 1%(v/v)抗FLAG-ユーロピウムクリプタート; 50%(v/v) 1.6M KF; 47.6%(v/v)希釈化緩衝液)。反応混合物は、冷却した希釈化緩衝液中で作製し、氷上に維持する。試験化合物溶液は室温に維持する。
反応は、Costar PS black 96ウェルプレートで行い、BMG RubStarプレートリーダー(又は同等のもの)を使用して検出する。
トポイソメラーゼユビキチン化の修飾因子の同定
Bmi1との複合体としてのE3リガーゼRING1の活性による、TOPIIαのユビキチン化を測定するアッセイを行う。商業的に利用できるユビキチン誘導体は蛍光ドナー分子として利用でき、一方、フルオロフォア融合抗体は、フルオロフォアアクセプターとして使用される。基質タンパク質のユビキチン化は、ドナーの励起後、ドナー(ユビキチン結合)フルオロフォアから放出される光子によって励起される(抗原-抗体相互作用により、基質タンパク質に特異的に結合した)アクセプター抗体の発光によって検出される。ユビキチンの連結は、効果的なエネルギー移動に十分な距離に両フルオロフォアを接近させるため、この反応は、均一な反応条件において行うことができる。ユーロピウムクリプタートドナーフルオロフォアは、ほとんどの通常のフルオロフォアに比べて、ずっと長い期間蛍光を発するため、環境から生じる可能性のある自己蛍光分子による干渉を除去する時間分解型の様式で検出される反応が可能となる。
1. E1ユビキチン活性化酵素(0.6mg/ml,6μM, Proteologics, Israel)
2. UBCH5a- (Cat# E2616 (50μM), Boston Biochem Inc., MA, U.S.A.)
3. RING1/Bmi1 (Proteologics, Israel)
4. ユビキチン1mg/ml溶液(HPLC水中)
5. ユビキチン-クリプタート-(cat# 61UBIKLB,CisBio, MA, U.S.A.)-鎖伸長を検出する場合、(任意)ビオチン-ユビキチン(又は同様のタク゛)
6. 抗FLAG-XL665-(cat # 61FG2XLB, CisBio, MA, U.S.A.,またはトポイソメラーゼIIα中のエピトープタグに対応する同様の試薬)
7. (任意)ストレプトアビジン-XL665-(cat# 61SAXLB, CisBio, MA, U.S.A.-(または相当する試薬),鎖伸長を検出する場合)
8. プラスミド-pcDNA3.1、または等価物(Invitrogen, CA, U.S.A.)
9. オボアルブミン100mg/ml溶液(HPLC水中)
10. ATP - 0.1 M
11. MgCl2 - 1M, Sigma
12. EDTA - 0.5M, pH = 8.
13. Tris 1M pH = 7.6 - Sigma Biotechnology Grade
14. Tween 20-6%溶液(HPLC水中)
15. KF緩衝液(0.8M KF; 2mg/ml BSA;および200mMリン酸緩衝液, pH = 7.0)
16. DTT-0.1M溶液(HPLC水中)。
反応は、Costar PS black 96ウェルプレートで行い、BMG RubStarプレートリーダー(または同等のもの)を使用して検出する。
1.E1ユビキチン活性化酵素(0.6 mg/ml, 6μM, Proteologics, Israel)
2.UBCH5a (cat # UW9050-0100, Biomol, PA, U.S.A)
3.組み換えRing1/Bmi1タンパク質複合体(GST, または他の独特のエピトープ-タグ, Proteologics, Israel)
4.抗FLAGクリプタート(cat# 61FG2KLB, CisBio, MA, U.S.A.)
5.抗FLAG-XL665 - (cat # 61FG2XLB, CisBio, MA, U.S.A.)
6.卵白アルブミン100 mg/ml溶液、HPLC水中
7.ATP - 0.1M
8.MgCl2 - 1M, Sigma
9.EDTA - 0.5M, pH=8.
10.Tris 1M pH=7.6 - Sigma Biotechnology Grade
11.Tween 20 - 6%の溶液、HPLC水中
12.KF 緩衝液 (HPLC水中の1.6M フッ化カリウム)
13.DTT - 0.1M 溶液、HPLC水中。
化合物1およびTOPII薬物は共同的に作用してA549細胞の生存度を減少する
A549細胞をDMEMおよび10%のFBSで培養した。当該細胞を異なる濃度の化合物1で、TOPII薬物、VM26 (図10A)またはTOPII 薬物なし、Taxol(登録商標) (paclitaxel) (Sigma, Israel) (図10B)ありまたはなしで処理した。
HeLa細胞における化合物1によるTOPIIα分解の阻害
HeLa細胞はDMEMおよび10%FBSと培養した。当該細胞を1時間溶媒 (50% DMSO, 50% PEG400)または50μM または100μM の化合物1で処理し、次に100μMのVM26でインキュベートした。
化合物1はHeLa細胞におけるRing1-Bmi1 ユビキチン化活性を阻害する
HeLa細胞をDMEMおよび10%FBSで培養した。当該細胞をHA-ユビキチン、Bmi1-フラッグおよびRING1Aをコードするプラスミドでトランスフェクトした。他に断りのない限り、リポフェクチミン2000トランスフェクション試薬(Lipofectamine2000 transfection reagent ((Invitrogen, CA, U.S.A.))を使用して指示する。
種々の癌細胞での化合物1のLD50
549細胞(肺癌)およびHeLa細胞(卵巣癌)をDMEMおよび10%のFBS(図13A)で培養した。MDA-MB-231 およびMDA-MB-468細胞(乳癌), HCT116細胞(大腸癌)およびPanc02.03 細胞(膵臓癌)をRPMI および10% FBS (図13B)で培養した。当該細胞を異なる濃度の化合物1で処理した。当該細胞の生存度をWST-1試薬(Roche, Germany)を使用して処理後72時間試験した。当該LD50はプリズムソフトウェア(Prism software (Graphpad, CA, U.S.A.))を使用して算出した。
上記の例は、siRNAによるBmi1またはRING1AのサイレンシングがVM26(テノポシド, TOPII 薬物)で誘導されるTOPIIα分解を阻害し、毒性試験でのその効果を増大することを示す。Bmi1およびRING1Aはポリコーム抑制複合体(Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1))と称されるタンパク質複合体の成分である。ワンらは(Wang, H., et al. 2004. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431:873-8.)、ヒストンH2Aユビキチンリガーゼとして機能するRing1A (RNF1), Ring1B (RNF2), Bmi1 および HPH2よりなるPRC1様複合体を同定した。Ring1A, Ring1BおよびBmi1は、全てRINGドメイン(E3ユビキチンリガーゼドメインの特性を示す)を含む。彼らはこれらの3つのタンパク質単独の各々をH2Aユビキチン化アッセイで試験し、Ring1BのみがH2Aユビキチン化活性を有することを明らかにした。これらの結果に基づいて、彼らは、当該Ring1bがこの複合体でのユビキチンリガーゼ触媒タンパク質であることを報告した。カオらは(Cao, R., et al. 2005. Role of Bmi-1 and Ring1A in H2A ubiquitylation and Hox gene silencing. Mol Cell. 20:845-54.)、Bmi1およびRing1Aの両方がRing1B H2Aユビキチン化活性の効果を増大することを示した。
Claims (69)
- 細胞増殖を調節するための方法であって、細胞とE3ユビキチンリガーゼ阻害剤の有効量とを接触することと、並びに当該細胞とトポイソメラーゼ阻害剤の有効量とを接触することとを含み、それによって、当該E3ユビキチンリガーゼ阻害剤とトポイソメラーゼ阻害剤が、トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された対応する細胞に比べてより大きい程度に細胞増殖を調節する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、当該細胞がヒト細胞である方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、当該細胞が癌細胞である方法。
- 請求項3に記載の方法であって、当該癌細胞が、心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞である方法。
- 請求項4に記載の方法であって、当該細胞増殖が阻害される方法。
- 請求項1に記載の方法であって、当該トポイソメラーゼ阻害剤が、カンポテシン、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシン、テニポシド、エトポシドおよびその類似体、誘導体および組み合わせからなる群より選択される方法。
- 請求項1〜6の何れか1項に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼの阻害剤が以下の構造を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法:
X1およびX2は独立して酸素または硫黄である;および
R3,R4,R5およびR6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。 - 請求項7に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼの阻害剤が、以下の構造を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法:
R3,R4,R5およびR6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。 - 請求項8に記載の方法であって、R3が水素である方法。
- 請求項8に記載の方法であって、R4が水素である方法。
- 請求項8に記載の方法であって、R5が水素である方法。
- 請求項8に記載の方法であって、R6が水素である方法。
- 請求項8に記載の方法であって、R3およびR6が水素である方法。
- 請求項8に記載の方法であって、R4およびR5が水素である方法。
- 請求項7に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼの阻害剤が以下の構造を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法;
R3,R4,R5およびR6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。 - 請求項17に記載の方法であって、R3が水素である方法。
- 請求項17に記載の方法であって、R4が水素である方法。
- 請求項17に記載の方法であって、R5が水素である方法。
- 請求項17に記載の方法であって、R6が水素である方法。
- 請求項17に記載の方法であって、R3およびR6が水素である方法。
- 請求項17に記載の方法であって、R4およびR5が水素である方法。
- 細胞においてトポイソメラーゼを安定化する方法であって、当該細胞とE3ユビキチンリガーゼの阻害剤の有効量とを接触することを具備する方法。
- 請求項26に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼが以下の構造の化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法;
X1およびX2は独立して酸素または硫黄である;および
R3,R4,R5およびR6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。 - E3ユビキチンリガーゼ阻害剤を識別する方法であって、当該方法が以下を具備する方法;
a) 試験薬剤を用意すること;
b) E3ユビキチンリガーゼをユビキチン活性化酵素、E3ユビキチンリガーゼの基質およびユビキチンと当該試験薬剤の存在または非存在において接触すること;および
c) 当該基質のユビキチン化が当該試験薬剤の存在において減少するか否かを決定すること;ここで、当該基質のユビキチン化が当該試験薬剤の存在において減少した場合に、当該試験薬剤がE3ユビキチンリガーゼ阻害剤であると識別される。 - 請求項28に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼがRING1、Bmi1および/またはその組み合わせである方法。
- 請求項28に記載の方法であって、当該基質のユビキチン化は蛍光により決定される方法。
- 請求項28に記載の方法であって、当該接触する工程は細胞内で生じる方法。
- 請求項28に記載の方法であって、当該基質はRING/Bmi1複合体である方法。
- 請求項28に記載の方法であって、当該基質はトポイソメラーゼである方法。
- 請求項28の方法により識別された阻害性化合物。
- E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化を阻害する化合物を製造する方法であって、以下を具備する方法;
a) 当該方法が請求項28に記載の方法を実施してE3ユビキチンリガーゼによるE3ユビキチンユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化を阻害する当該試験薬剤を識別すること;および
b) 当該試験薬剤を製造すること。 - 細胞をトポイソメラーゼ阻害剤に対して再感受性化する化合物を識別する方法であって、当該方法が以下を具備する方法;
a) 試験薬剤を提供すること;
b) 細胞を試験薬剤の有効量と接触すること、および当該細胞をトポイソメラーゼ阻害剤の有効量と接触すること;および
c) トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された細胞と比較して、当該試験薬剤とトポイソメラーゼ阻害剤とでの処理が、細胞増殖を調節するか否かを決定すること;
ここで、当該細胞増殖が低下した場合に、当該試験薬剤が、細胞を当該トポイソメラーゼ阻害剤に対して再感受性化する化合物である識別する。 - 請求項36に記載の方法であって、当該細胞がヒト細胞である方法。
- 請求項36に記載の方法であって、当該細胞が癌細胞である方法。
- 請求項36に記載の方法であって、当該癌細胞が心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞である方法。
- 請求項36〜39の何れか1項に記載の方法であって、当該細胞増殖が阻害される方法。
- 請求項36に記載の方法であって、当該試験薬剤がトポイソメラーゼを安定化する方法。
- 請求項36に記載の方法であって、カンポテシン、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシン、テニポシド、エトポシドおよびその類似体、誘導体および組み合わせからなる群より選択される方法。
- 請求項36の方法により識別された阻害性化合物。
- E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化を阻害する化合物を製造する方法であって、当該方法が、以下を具備する方法;
a) 請求項36の方法を実施して、当該E3ユビキチンリガーゼによるE3ユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化を阻害する試験薬剤を認識すること;および
b) 当該試験薬剤を製造すること。 - 単離された二重鎖リボ核酸(dsRNA)分子であって、NM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同な第一の鎖のヌクレオチドと、当該第一の鎖と実質的に相補的な第二の鎖とを含む分子。
- 単離されたdsRNA分子であって、NM_005180.5 または NM_002931.3で示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、第一の鎖に対して実質的に相補的な配列を含むヌクレオチドの第二の鎖とを含む分子。
- NM_005180.5 または NM_002931.3で示される鎖を含む核酸によりコードされるタンパク質の発現を阻害する単離されたdsRNA分子であって、当該dsRNAの第一の鎖は、実質的にNM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同であり、当該dsRNAの第二の鎖は当該第一の鎖に実質的に相補的である分子。
- 単離された核酸分子であって、請求項47のdsRNAの1または両方の鎖のためのテンプレートであるヌクレオチド配列に可働的に結合されたプロモーターを含む核酸。
- 請求項48の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項48に記載の核酸分子であって、プロモーターが当該ヌクレオチド配列の何れかの末端に隣接し、ここで、当該プロモーターは、各個々のDNA鎖の発現を駆動し、それによりハイブリダイズし、且つ当該dsRNAを形成する2つの相補的なRNAを生じる分子。
- 請求項48のdsRNAであって、以下からなる群より選択されるdsRNA分子;
a) 配列番号3で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号4で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
b) 配列番号5で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号6で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
c) 配列番号7で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号8で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
d) 配列番号9で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号10で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
e) その組み合わせ。 - ヌクレオチドの第一および第二の鎖を有するdsRNA分子を含む医薬組成物であって、当該dsRNA分子が以下からなる群より選択される医薬組成物;
a) NM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同なヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖と実質的に相補的な第二の鎖を含むdsRNA分子;および
b) NM_005180.5 または NM_002931.3で示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖に実質的に相補的な配列を含むヌクレオチドの第二の鎖を含むdsRNA分子;
c) ここで、当該dsRNA分子は、NM_005180.5 または NM_002931.3に示される鎖を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を阻害する。 - 請求項52に記載の医薬組成物であって、当該dsRNA分子が以下からなる群より選択される医薬組成物;
a) 配列番号3で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号4で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
b) 配列番号5で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号6で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
c) 配列番号7で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号8で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
d) 配列番号9で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号10で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
e) その組み合わせ。 - トポイソメラーゼを安定化する方法であって、細胞を以下からなる群より選択される標的遺伝子の一部分に実質的に相同なdsRNA分子の有効量と接触させること;
a) NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
b) NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
c) NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
d) NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
e) それによりトポイソメラーゼを安定化すること
を含む方法。 - 請求項54に記載の方法であって、当該細胞がヒト細胞である方法。
- 請求項54に記載の方法であって、当該細胞が癌細胞である方法。
- 請求項54に記載の方法であって、当該癌細胞が、心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞からなる群より選択される方法。
- 請求項54に記載の方法であって、当該当該dsRNA分子が以下からなる群より選択される方法;
a) 配列番号3で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号4で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
b) 配列番号5で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号6で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
c) 配列番号7で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号8で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
d) 配列番号9で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号10で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
e) その組み合わせ。 - 請求項1に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼ阻害剤がDNAおよびRNAからなる群より選択される方法。
- 請求項59に記載の方法であって、当該RNAがdsRNA分子である方法。
- 請求項60に記載の方法であって、当該dsRNA分子が以下からなる群より選択された標的遺伝子に対して実質的に相同である方法;
a) NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
b) NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
c) NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
d) NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 - 請求項60に記載の方法であって、当該dsRNA分子が以下からなる群より選択される方法;
a) 配列番号3で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号4で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
b) 配列番号5で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号6で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
c) 配列番号7で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号8で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
d) 配列番号9で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号10で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
e) その組み合わせ。 - 以下の工程を含むRNA干渉のための標的を識別するための方法;
a) 標的遺伝子配列としてのE3ユビキチンリガーゼを選択すること;
b) 細胞を、当該標的遺伝子配列の一部分と実質的に相同なdsRNAと接触すること;および
c) dsRNAがトポイソメラーゼを安定化するか否かを決定すること。 - 請求項63に記載の方法であって、当該標的遺伝子配列が以下の群より選択される方法;
a) NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
b) NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
c) NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
d) NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 - 請求項63に記載の方法であって、当該トポイソメラーゼが、ヒトトポイソメラーゼI、ヒトトポイソメラーゼIIα、ヒトトポイソメラーゼIIβおよびその組み合わせからなる群より選択される。
- 請求項63に記載の方法であって、当該細胞がトポイソメラーゼ阻害剤の有効量と接触され、細胞増殖が調節される方法。
- 請求項28に記載の方法であって、当該試験薬剤がdsRNA分子である方法。
- 請求項67に記載の方法であって、当該dsRNA分子が、以下からなる群より選択される標的遺伝子の一部分と実質的に相同である方法;
a) NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチド;
b) NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
c) NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチド; および
d) NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 - 請求項67に記載の方法であって、当該dsRNAが以下からなる群より選択される方法;
a) a dsRNAa) 配列番号3で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号4で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
b) 配列番号5で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号6で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
c) 配列番号7で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号8で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
d) 配列番号9で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号10で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
e) その組み合わせ。
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