JP2016523517A - ユビキチンリガーゼのモジュレーターを同定するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年1月27日に出願された米国特許出願第61/932,139号及び2013年5月2日に出願された米国特許出願第61/818,796号の§119(e)に基づく優先権の恩典を主張する。以前の出願の開示は、本出願の開示の一部と考えられ、参照によりその全体が本出願の開示に組み込まれる。
本発明は概してタンパク質の修飾に関し、より具体的には、ユビキチン経路酵素をモジュレートする化合物を同定するための方法に関する。
添付の配列表中の材料は参照により本出願に組み込まれる。E3X1100_3WO_Sequence_Listing_ST25という名称の添付の配列表テキストファイルは、2014年5月2日に作成され、3KBである。該ファイルは、Windows OSを使用するコンピュータにあるMicrosoft Wordを使用して評価され得る。
ユビキチン(Ub)は、76個のアミノ酸からなるタンパク質である。多くの生化学的経路は、Ub及びユビキチン様(UbL)分子を用いたタンパク質の翻訳後修飾によって部分的に調節されている。ユビキチン化として知られるプロセスである、Ubによるこのタンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質分解、遺伝子転写、細胞周期進行、DNA修復、アポトーシス、ウイルス出芽及び受容体エンドサイトーシスなどの、生物学的プロセスの調節に関与する。Ub/UbL特異的結合酵素及び脱結合酵素の相対する作用を通して精密な調節が達成される。Ub及びUbLタンパク質ファミリーのメンバーには、Ub、SUMO、NEDD8、ISG15、URM1、FAT10、UFM1、LC3、GATE−16、GABARAP及びATG12が含まれる。これらの関連するタンパク質は構造的に類似し、Ubの機構に類似した機構において活性化され、結合し、及び結合体から放出される。一つを超える種類の修飾因子によって標的とされるようになるいくつかの基質タンパク質との結合経路間でクロストークがある。Ubは、Ubが強い配列保存を示す真核生物においてのみ見出される。
本発明は、HECT及びRBRファミリーを含むがこれらに限定されないE3Ubリガーゼの活性部位システインチオール残基を、特異的に及び共有結合的に修飾する、機構に基づいた活性プローブを利用するスクリーニングを提供する。活性プローブは、E3Ubリガーゼの活性化因子及び阻害因子についてスクリーニングするため、及びヒト疾患におけるE3Ubリガーゼの機能状態を調べるために使用される。
1.ユビキチン結合酵素ペプチド、具体的には、E2−E3相互作用ドメインを形成するE2ペプチド;
2.E3リガーゼの活性部位システインと反応するように設計された反応性化学部分;及び
3.ユビキチンペプチド;具体的にはUbのc末端を形成し、E3−Ub相互作用ドメインを含有するのに十分な距離をN末端に延ばすUbペプチド。
ユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターを同定するためのアッセイ
ユビキチンリガーゼのモジュレーターを同定するために、E3Ubリガーゼをアッセイ緩衝液(50mM HEPES、50mM NaCl、0.01%NP40、pH6.8)に希釈し、マルチウェル非結合プレートのウェルに添加する。化合物を各ウェルに添加した後、少なくとも30分間インキュベートする。活性プローブ(Ub−ビニルスルホン(Ub−VS)など)を添加し、室温で反応を進行させる。ユウロピウム(III)クリプテートまたはニッケルキレートアクセプタービーズなどのドナーとコンジュゲートしたE3Ubリガーゼのエピトープタグ(例えばHis)に対する抗体をウェルに添加する。XL665などのアクセプターとコンジュゲートしたUb−VSのエピトープタグ(例えばHA)に対する抗体、またはビオチン標識されたUb抗体(ストレプトアビジンドナービーズとコンジュゲートした)を停止緩衝液中のウェルに添加し、及び混合物を、決定された最適化された時間にわたってインキュベートする。
E3リガーゼの構造及び触媒活性の決定
ParkinはE3リガーゼの一例である。1.58Å構造のParkin R0RBRが表され、それは、4つのRINGドメインの折り畳み構造(fold architecture)及びいくつかの予期せぬ境界面を明らかにする。Parkin活性部位の検査は、触媒ネットワークがC431及びH433からなることを示唆する。細胞では、C431の変異がミトコンドリアのParkin触媒性分解を消失させ、ユビキチンオキシエステルの捕捉がC431をParkinの細胞活性部位として確証させた。本発明者らのデータは、ParkinがRING/HECTハイブリッド型であること、及び原子分解能でのRBR E3リガーゼの最初の結晶構造であることを確かにし、この疾患に関連するタンパク質に対する見識を提供する。Parkinのドメイン構成及びParkinリガーゼ活性の調節に対する見識を得るためには、高分解能でParkinの結晶構造を得ることが求められた。この1.58Å構造は、Parkinが複数の予期せぬドメイン境界面を有する比較的コンパクトな全体構造を形成することを明らかにする。これらの境界面は、Parkinについての潜在性及び活性化状態の理解のための基盤を形成し、ならびに活性部位システインC431の役割及び触媒作用を促進するC431に近接する残基のネットワークに対する見識を提供する。
一般試薬及びDNA構築物
全てのParkin構築物についてのDNA鋳型は、NM_004562及びNM_004562.1であった。細菌での発現のために、完全長Parkin(1〜465)、R0RBR(141〜465)及びRBR(238〜465)を、Champion pET SUMOベクターへと製造業者の説明書(Invitrogen)に従ってクローニングした。哺乳類での発現のために、Parkin(タグ付けされていない完全長)を、pcDNA3.1へとクローニングした。全ての変異は、QuikChange部位特異的突然変異誘発キット(Agilent Technologies)を使用して作製された。ウェスタンブロット法のために、製造業者の推奨に従い、全ての抗体を1:1000で使用した。抗Parkin抗体(Prk8)はSigma製であった。抗Parkin抗体(HPA1A)は、ParkinのN末端ペプチド(a.a.85〜96)に対して生じたウサギポリクローナル抗体であった。抗GAPDH抗体は、Millipore製であった。抗Ub抗体(FK2)は、Enzo Life Sciences製であった。ウサギ抗Tom20抗体は、Santa Cruz製であった。Alexa594及びDapiは、molecular probes(Invitrogen)製であった。マウス抗HA抗体は、Covance製であった。CCCPは、Sigma製であった。El、UbcH7、UbcH8、Ub、Mg−ATP溶液は、全てBoston Biochem製であった。HA−UbVS及び全ての他のUb様VSは、Boston Biochem製であった。抗FLAG M2アガロース樹脂及び3X FLAGペプチドはSigma Aldrichから得た。プロテインAビーズはRepligen製であった。
細菌発現構築物を、BL21 DE3大腸菌(Invitrogen)へと形質転換した。新鮮なコロニーから播種された一晩培養したものを、2%グルコース及び50μg/mlのカナマイシンを含有するTerrific broth培地にて37℃で増殖させた。翌朝、一晩培養したものをOD600 0.1まで希釈し、OD600が0.4に達するまで37℃で振とうし続け、次いでフラスコを16℃に移し、OD600が0.8から0.9の際に、培養物に、50μMの塩化亜鉛を補充した0.1mM IPTGを導入し、発現を18〜20時間にわたって16℃で進行させた。次いで、細胞を遠心分離により回収し、−80℃で凍結した。
高性能Ni sepharose、Mono Q HR10/10陰イオン交換カラム、及びHiLoad26/60Superdex200カラムは全てGE Life sciences製であった。AKTA FPLCシステムでFPLCを行った。紫外可視吸光度読み取り値をNanodrop分光光度計で取得した。タンパク質を、変性条件下で10%Bis−Tris NuPAGEゲル上でMESランニングバッファー(Invitrogen)を用いてSDS−PAGEによって分析した。変性させたタンパク質についての吸光係数を、e=5690cm−1M−1×(trpの数)+1280cm−1M−1×(tyrの数)+120cm−1M−1×(cysの数、ここでcys=システインまたはジスルフィド結合)に従って、一次配列から決定した。
25mM HEPES(pH8.0)、50mM NaCl、及び1mM TCEP中にそれぞれ0.3μLの12.5mg/mLのタンパク質及び0.1M HEPES(pH7.5)、20%PEG 4K、10%イソプロパノール、10mMのBaCl2のリザーバーを含有するシッティングドロップ法においてParkin R0RBR−P223タンパク質結晶を10℃で成長させた。より高品質の結晶を得るためにシーディング法を使用し、結晶は概して4〜7日でフルサイズに達した。結晶を、液体窒素内で瞬間冷却する前にリザーバー溶液中の15%エチレングリコールに移した。結晶は、空間群C2221(a=86.96Å、b=133.16Å、c=65.39Å)に属し、非対称単位あたり1分子を含有する。Znの異常や分散信号を測定するためにシンクロトロンX線データを、ピーク/屈折妥協点(peak/inflection compromise)及び遠隔波長で単一の結晶について収集した。回折データをMOSFLMで統合し、SCALAでスケーリングした。9つの異常部位がSHELXDによって発見され、位相をMLPHAREで精密化した。DMを使用して1.1159Åで収集された高分解能データ(1.58Å)に対して溶媒平滑化(solvent flattening)を行い、明確に解釈可能な電子密度図を得た。平均性能指数は、MLPHARE後に0.217、溶媒平滑化後に0.715であった。モデルを手動でプログラムCootを使用してこの図に組み込んだ。異常部位の1つは、配位リガンドの特徴に基づいてバリウムとしてモデル化された。構造は、REFMACを使用して高分解能に対して精密化され、306aa残基及び267水分子を含有する。両方の構造は、pdbコード411F(Parkin R0RBR−P223)及び411H(Parkin R0RBR−5223)で蛋白質構造データバンクに寄託されている。
Parkinの自己ユビキチン化反応は、一般的には、50mM HEPES、50mM NaCl、pH8.0の反応緩衝液中の25μlの反応体積中で、1時間にわたって37℃でE1(250nM)、E2(5μM)Ub(23.5μM)、Mg−ATP溶液(10mM)及びParkin種(0.46μM)を用いて実行された。反応はSDSローディングバッファーの添加によって終了した。
細胞を一般的に24ウェルのプラスティック皿で増殖させたことを除いて以前報告したように細胞を染色した。Tom20ミトコンドリア染色を含有する細胞の割合(%)を定量化するためにTarget Activation BioApplicationを使用して画像をCellomics ArrayScan VTiプラットフォーム(Thermo Scientific)上で取得した。細胞フィールドを10倍対物レンズを使用して撮像し、フィールド当たり平均して250個の細胞が検出された。データを少なくとも2000個/ウェル(96ウェルプレート)の細胞から収集した。細胞アッセイの読み出しパラメータは、平均蛍光強度及びTom20染色をほとんどまたは全く示さない細胞の割合(%)であった。完全長野生型Parkinに対するTom20損失の割合(%)を、CCCP処置後の完全長野生型Parkinが誘発したTom20損失を100%に設定して算出した。示されるデータは、3つから4つの独立した実験を表す(エラーバーは標準誤差を表す)。
3つのアスタリスクはP<0.005を示し、2つのアスタリスクはP<0.01を示し、1つのアスタリスクはP<0.05を示す。有意水準を、両側検定の不等分散性のスチューデントのT検定を用いて決定した。タグ無し完全長Parkin(または変異体)をHA−Ubと一緒にそれぞれ1:10のDNA比で使用して製造業者のプロトコル(Roche)に従ってXtremeGeneで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは48時間で、24時間後に培地交換とCCCP(10μM最終)の添加を行った。EDTAを含まないCompleteプロテアーゼインヒビター(Roche)を有する、20mM HEPES、150mM NaCl、10%グリセロール、1%トリトン−X−100、pH7.2中で氷上で30分間溶解した。溶菌液を4℃で10分間16,000×gで卓上微量遠心機で清澄化した。タンパク質をBCA(Thermo Fisher Scientific)を使用して定量化した。Parkin及びオキシエステル連結Parkinの十分な分離を得るために、試料を、典型的には、10%トリス−グリシンゲル(Invitrogen)上で2時間泳動(run)させた。オキシエステル連結Parkinの免疫沈降については、1mgのタンパク質抽出物(プロテインAビーズ単独で前もって1時間清澄化した後)をプロテインA樹脂及びHPA1A(5μM)とともに一晩回転させながら4℃でインキュベートした。翌日、試料を溶解バッファーで3回洗浄し、その後SDSローディング色素を添加した。次いで反応物を、沸騰させる前にNaOH(0.14mol/L)またはバッファー対照とともに20分間37℃でインキュベートした。
Parkin−C431−UbVS修飾されたペプチドのLC−MS/MS同定のために、HA−UbVSと反応させたParkinのトリプシン消化物を、ABSciex 5600 qTOF質量分析計上で、各サーベイMSスキャンの後にMSスペクトルにおける30の最も高いピークのMS/MS分析を行う方法を使用して分析した。ペプチドの同定を、ペプチドマストレランス(peptide mass tolerance)について10ppm、及びMS/MSトレランス(tolerance)について0.1DaでMascot version2.4を使用して行った。ペプチド同定を決定するために、酸化(M±15.9949Da)、脱アミド(1\1Q±0.9840Da)、カルバミドメチル化(C±57.0214Da)、及びGG−ビニルスルホンレムナント(C±192.0569Da)を不確定の修飾(variable modifications)として使用してUniprotデータベースを検索した。
Claims (29)
- a)ユビキチンリガーゼを化合物と接触させること;
b)a)の混合物を、標識を含む活性プロ−ブと接触させること;及び
c)前記リガーゼ上のプローブ標識を測定すること
を含む、ユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターを同定する方法であって、対照と比較したときの前記リガーゼ上のプローブ標識の増加または低減が、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性のモジュレーターとして同定する、前記方法。 - 前記リガーゼがE3リガーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記E3リガーゼがHECTまたはRBRファミリーリガーゼである、請求項2に記載の方法。
- 前記化合物が小分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記活性プローブが、ユビキチン結合ペプチド、反応性化学部分、ユビキチンペプチド及び標識を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ユビキチン結合ペプチドがE2である、請求項5に記載の方法。
- 前記標識が、蛍光、酵素または放射性標識である、請求項5に記載の方法。
- 前記反応性化学部分が、アクリル酸、ビニルスルホニル、アシルオキシメチルケトン、β−ラクトン、シアナミド、αアミノニトリル及びエポキシコハク酸からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記活性プローブがエピトープタグをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 標識の前記低減または増加が、FRET、HTRF、及びELISAからなる群より選択される方法によって決定される、請求項1に記載の方法。
- 前記リガーゼ上のプローブ標識の低減が、前記リガーゼの阻害因子を示す、請求項1に記載の方法。
- 前記リガーゼ上のプローブ標識の増加が、前記リガーゼの活性化因子を示す、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって同定される、ユビキチンリガーゼの小分子阻害因子。
- 請求項1に記載の方法によって同定される、ユビキチンリガーゼの小分子活性化因子。
- a)ユビキチン結合ペプチド;
b)反応性化学部分;及び
c)ユビキチンペプチド
を含む、活性プローブ。 - 標識をさらに含む、請求項15に記載の活性プローブ。
- エピトープタグをさらに含む、請求項15に記載の活性プローブ。
- 前記ユビキチン結合ペプチドがE2ペプチドである、請求項15に記載の活性プローブ。
- 前記E2ペプチドがE2−E3相互作用ドメインを形成する、請求項16に記載の活性プローブ。
- 前記化学部分がユビキチンリガーゼの活性部位システインと反応する、請求項15に記載の活性プローブ。
- 前記化学部分が、アクリル酸、ビニルスルホニル、アシルオキシメチルケトン、β−ラクトン、シアナミド及びエポキシコハク酸からなる群より選択される、請求項15に記載の活性プローブ。
- 前記ユビキチンペプチドがE3−ユビキチン相互作用ドメインを含有する、請求項15に記載の活性プローブ。
- 前記ユビキチン結合ペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号5からなる群より選択される、請求項15に記載の活性プローブ。
- 前記ユビキチンペプチドが、配列番号6、配列番号7及び配列番号8からなる群より選択される、請求項15に記載の活性プローブ。
- a)病原体由来のユビキチンリガーゼを化合物と接触させること;
b)a)の混合物を、標識を含む活性プローブと接触させること;及び
c)前記リガーゼ上のプローブ標識を測定すること
を含む、病原体由来のユビキチンリガーゼを阻害する化合物を同定する方法であって、対照と比較したときの前記リガーゼ上のプローブ標識の低減が、前記化合物をユビキチンリガーゼ活性の阻害因子として同定する、前記方法。 - 前記ユビキチンリガーゼが、SopA及び新規E3リガーゼファミリー(NEL)からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記病原体が、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、大腸菌(E. coli)、赤痢菌(Shigella)及びシュードモナス(Pseudomonas)からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- a)ユビキチンリガーゼを含有する腫瘍試料を、標識を含む活性プローブと接触させること;及び
b)前記リガーゼ上のプローブ標識を測定すること
を含む、腫瘍内で増強された酵素活性を有するユビキチンリガーゼを同定する方法であって、対象と比較したときの前記リガーゼ上のプローブ標識の増加が、増強された酵素活性を有するユビキチンリガーゼを同定する、前記方法。 - 前記腫瘍が、リンパ腫、CLL、小リンパ球性リンパ腫、辺縁細胞B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、大腸癌、乳癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、及び頭頸部癌からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
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