JP2011528560A - 新規キナーゼ阻害剤足場の迅速なスクリーニングおよび同定のための蛍光標識またはスピン標識キナーゼ - Google Patents

新規キナーゼ阻害剤足場の迅速なスクリーニングおよび同定のための蛍光標識またはスピン標識キナーゼ Download PDF

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Abstract

本発明は、キナーゼの活性化ループ中に天然に存在するか、もしくはその中に導入された、遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸部位で、(a)その環境における極性変化に対して感受性であるチオールもしくはアミノ反応性フルオロフォア；または(b)チオール反応性スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化されたチオールもしくはアミノ反応性標識で標識されたキナーゼであって、該フルオロフォア、スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化された標識が、キナーゼの触媒活性を阻害せず、キナーゼの安定性に干渉しない、前記キナーゼに関する。本発明はさらに、本発明のキナーゼを用いてキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法、キナーゼ阻害剤のリガンド結合の速度および／または解離の速度を決定する方法ならびにキナーゼ阻害剤のスクリーニングにとって好適な突然変異キナーゼを作製する方法に関する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、キナーゼの活性化ループ中に天然に存在するか、もしくはその中に導入された、遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸の部位で、(a)その環境中の極性変化に対して感受性であるチオールもしくはアミノ反応性フルオロフォア、または(b)チオール反応性スピン標識、アイソトープまたはアイソトープ富化チオールもしくはアミノ反応性標識を用いて標識されたキナーゼであって、前記フルオロフォア、スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化標識が、キナーゼの触媒活性を阻害せず、キナーゼの安定性に干渉しない、前記キナーゼに関する。本発明はさらに、本発明の標識されたキナーゼを用いたキナーゼ阻害剤のスクリーニング方法、キナーゼ阻害剤のリガンド結合および／または解離の速度を決定する方法ならびにキナーゼ阻害剤のスクリーニングにとって好適な突然変異キナーゼを作製する方法に関する。
本明細書では、特許出願および製造業者のマニュアルなどのいくつかの文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許性と関連するとは考えられないが、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。より具体的には、全ての参考文献は、あたかもそれぞれ個々の文書が具体的かつ個別に参照により組み入れられると指示されたのと同程度に参照により本明細書に組み入れられるものとする。
タンパク質キナーゼは、細胞機能の多くの態様の調節において重要な役割を果たしている。この理由から、それらは治療的薬剤開発のための最も魅力的な標的であると広く考えられている。現在まで、キナーゼを阻害するための戦略は主に、天然の基質(すなわち、ATP)結合部位に直接結合するように設計された化合物に基づいてきた。これらのものは、I型阻害剤とも呼ばれるATP競合阻害剤として知られる。最近、ATP結合ポケットに隣接する部位にのみ結合し、それによってタンパク質中での不活性化コンフォメーション変化を誘導する阻害剤が発見された。これらの化合物は、アロステリック、またはIII型阻害剤として知られる。このアロステリック部位に結合するだけでなく、キナーゼのATP結合ポケット中にも伸長するアロステリック阻害剤も公知であり、II型阻害剤と呼ばれている。後者の例は、イマチニブ(Gleevec)、ソラフェニブ(Nexavar)およびBIRB-796である。
異常調節されたキナーゼは、多くの疾患において原因的な役割を果たし、望ましくないキナーゼ活性を調節するための戦略は、ATP競合(I型)阻害剤の使用である。しかしながら、単一の特異的キナーゼに結合する薬剤の開発は、そのような阻害剤の低い特異性をもたらす、あらゆるキナーゼのATP結合ポケットにおける高い配列および構造相同性により妨げられてきた。ATP結合部位に隣接する保存性の低い疎水性ポケットは、p38α MAPキナーゼ(Pargellisら、2002)およびMEKキナーゼ(Ohrenら、2004)において初めて同定され、アロステリック結合部位であることがわかった。以来、この部位での阻害は、Aurora、EGFR、Src、Ablなどのいくつかの他のキナーゼにおいても判明した。キナーゼは典型的には、活性化ループが開き、伸長した活性コンフォメーション(DFG-in)にあり、ATPおよび他の分子が結合することができる。あるいは、隣接するアロステリック部位は、活性化ループがコンフォメーションをシフトさせ、ATPポケットに結合するATPと、アロステリック結合部位に結合する基質の両方を阻害する不活性コンフォメーション(DFG-out)においてのみ利用可能である。様々なタイトな結合阻害剤が、アロステリックポケットにおいてのみ結合する(III型)か、またはこのポケットからATP結合部位に伸長する(II型)p38αについて最近開発されてきた。これらのキナーゼの不活性状態に関する構造情報の利用可能性は、高い親和性かつ高い特異性でこの部位に結合する新規薬剤足場の検索を強化してきた。各部位中で結合する化合物間を識別する方法は現在限られている(Annisら、2004；Vogtherrら、2006)。さらに、I型、II型およびIII型阻害剤の同定のための迅速かつ実行可能な高効率スクリーニング方法は未だ利用可能ではない。
タンパク質へのフルオロフォアの結合は、リガンド結合に応答するタンパク質構造におけるコンフォメーション変化を検出するのに用いられるよく確立された手法である。バッファー中の未結合の脂肪酸の濃度を測定する市販のプローブであるアクリロダン標識脂肪酸結合タンパク質(ADIFAB；Molecular Probes)(Richieriら、1999)に加えて、この手法は、アセチルコリン結合タンパク質(Hibbsら、2004)、インターロイキン-1β(Yemら、1992)ならびに様々な糖およびアミノ酸結合タンパク質(de Lorimierら、2002)などの様々な他のタンパク質に適用されてきた。特異的キナーゼ阻害剤のスクリーニングのための多用途の手段および方法を有することが望ましいであろうことは上記の考察から生じる。この技術的問題に対する解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態を提供することにより達成される。
従って、本発明は、キナーゼの活性化ループ中に天然に存在するか、もしくはその中に導入された、遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸の部位で、(a)その環境中の極性変化に対して感受性であるチオールもしくはアミノ反応性フルオロフォア、または(b)チオール反応性スピン標識、アイソトープまたはアイソトープ富化チオールもしくはアミノ反応性標識を用いて標識されたキナーゼであって、前記フルオロフォア、スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化標識が、キナーゼの触媒活性を阻害せず、キナーゼの安定性に干渉しない、前記キナーゼに関する。
p38αを、その活性状態(DFG-in)および不活性状態(DFG-out)で結晶化させた(A)。ピラゾロ-ウレア化合物BIRB-796は、p38αのATPとアロステリック結合部位の間に伸長するII型阻害剤である。活性化ループ中の選択されたCys(B)突然変異へのアクリロダン(本明細書ではトリプトファンとしてモデル化される)の結合は、II型およびIII型阻害剤の結合の結果生じるコンフォメーション変化を検出するべきである(C)。結合の際に、BIRB-796は活性化ループのコンフォメーションを変化させる(赤色)(D)。 アロステリック阻害剤の結合は、468 nmでのアクリロダン放出の大きな低下と、リガンド結合(不活性)状態での514 nmへの特徴的な赤色シフトをもたらす。 活性化ループ上で標識されたac-p38αを用いるリアルタイムおよびエンドポイント蛍光測定を示す。468 nmでのアクリロダン放出は、BIRB-796の結合の際に用量依存的様式で低下する(AおよびC)。蛍光トレースは一次崩壊動力学に従い、これをプロットしてBIRB-796のkonおよびkoffを決定することができる(BおよびD)。エンドポイント平衡測定を行って、結合のKdを得ることもできる。生の蛍光データ(R＝514 nm/468 nm)をプロットしたところ、不活性状態の飽和を示した(EおよびG)。Rおよび部分占有に対してプロットされた対数尺度を用いることにより、Kdを決定した(FおよびH)。 図３−１の続きである。 ソラフェニブ(b-Rafおよびp38αの阻害剤)、ラパチニブ(EGFRおよびHER2の阻害剤)(Abl、c-Kitの阻害剤)およびイマチニブのac-p38αによる滴定を示す。蛍光タグ付p38αを様々な阻害剤濃度で一晩インキュベートした後、エンドポイント測定を行った(左側)。イマチニブおよびラパチニブは、試験した濃度範囲ではac-p38αに結合しなかったが(予想通り)、ソラフェニブは約56 nMのKdで固く結合した。各阻害剤の構造も示す(右側)。 ac-p38αからのBIRB-796および1、RL8(MG001)の解離ならびにkoffの直接的測定を示す。BIRB-796または1、RL8を、1:1の比でac-p38α(0.1μM)と混合した(本発明において用いた全化合物の相互参照指数については、以下の表7を参照されたい)。十分なインキュベーション時間の後、1μMの未標識p38αを、急速に攪拌しているキュベットに添加して、阻害剤の解離を誘導した。アクリロダン蛍光を468 nmでモニターした。これらの条件下で、BIRB-796(左側)および1、RL8(右側)のkoffは、それぞれ、4.54 x 10-5s-1および1.08 x 10-2s-1であると測定された。 ac-p38αへのBIRB-796および1、RL8の結合ならびにkonの直接的測定を示す。BIRB-796または1、RL8を様々な比率(1-4:1の阻害剤：タンパク質)でac-p38α(0.1μM)と混合した。急速に攪拌しているキュベットに阻害剤を添加した後、アクリロダン蛍光を468 nmでモニターした。これらの条件下で、BIRB-796(左側)および1、RL8(右側)のkobsを各用量で測定し、これを用いて、それぞれ4.46 x 103M-1s-1および9.27 x 103M-1s-1のkon値を決定した。 ac-p38αへのBIRB-796、スタウロスポリンおよびSB203580の結合を示す。p38αの高親和性ATP競合阻害剤であるSB203580は、約15 nMのKdで結合するが、スタウロスポリンは検出されない(左側)。各阻害剤を50 nMのac-p38αと共に一晩インキュベートして、結合曲線に関するデータを得た。リアルタイム動的測定のために、単一用量の各阻害剤(10μM)をac-p38α(0.1μM)に添加した。ATP競合阻害剤は蛍光の即時変化をもたらす(右側)。より弱く結合するATP競合阻害剤(Kd>20 nM)は、より小さい変化(より小さい規模)を誘導するか、または全く変化を誘導しなかった(示さず)。 異なるHTS形式でのac-p38αへのBIRB-796の結合を示す。BIRB-796をac-p38αと共に一晩、4℃でインキュベートした。96穴プレート中では、1 nM〜2μMの阻害剤を用いたが、384穴プレート中では10 nM〜20μMの阻害剤を用いた。これらの条件下で、BIRB-796のKdは、96穴形式(左側)では約27 nMであり、384穴形式(右側)では約76 nMであった。 時間依存的阻害を決定するためのBIRB-796およびac-p38αの結合実験を示す。タンパク質リガンド混合物を、4℃で24時間インキュベートし、蛍光測定値を様々な時間間隔で取得した。プロットした結合曲線は、BIRB-796阻害の予想された時間依存性を示している。 用いたDFG-outライブラリー中の化合物のコア構造を示す。これらの化合物の提唱される結合様式も示し(左側)、比較のためにBIRB-796と方向を合わせた(右側)。ATP部位およびアロステリック部位に伸長する領域は可変である。 DFG-out化合物ライブラリーヒットの特性評価を示す。85-C8の構造を、(a)強調された全てのヒットが有する保存された部分と共に示す(赤色＝)。キュベット方法を用いて、100 nMのac-p38αを、10〜100μMの85-C8と共に一晩インキュベートし、放出スペクトルを収集し(B)、結合曲線を作製した(C)。また、468 nmでのアクリロダンの放出をモニターし、単一用量の85-C8(5〜30μM)を添加することにより、リアルタイム蛍光測定を行った(D)。これらの化合物の添加は、初期の急速な蛍光変化と共に混合した蛍光応答、次いで、遅い一次崩壊をもたらした。速い(E)および遅い(F)段階は両方とも用量依存的である。 DFG-out化合物ライブラリーヒットの結合様式を予測するためのac-p38αアッセイの使用を示す。構造的に類似する化合物(A)、ダサチニブとINH-29の結合様式は、キナーゼのヒンジ領域への水素結合の結果として、主にATP競合的である。87-F9、2(オレンジ色)とダサチニブ(マゼンタ色)のアラインメントは、キナーゼのヒンジ領域と相互作用する薬剤足場中のいくつかの水素結合の供与体または受容体の強い保存を示している(B)。ライブラリーヒット構造の長い伸長は、それをアロステリックポケットに進入させることができる(C)。ダサチニブはこの特徴を欠き、ac-p38αに添加した場合に即時的な蛍光変化をもたらすに過ぎないが、これは全体としてATP競合的結合を示す。ダサチニブ、INH-29の結合様式はAndersenらから適合させたものである(6)。(D)p38αへの化合物ライブラリーヒットの親和性、(E)p38αに結合したヒット87H9の結晶構造、(F)35,000個の化合物の化合物ライブラリーに適用されたスクリーニングスキーム、(G)一次HTSスクリーニングのレシオメトリック値のモニタリング、(H)HTS14およびHTS15ならびに誘導体HTS14a-eおよびHTS15a-cに関するIC50の決定およびSAR試験、(I)HTS12およびHTS13の動的測定、(J)アクリロダン標識されたp38αへのリガンドHTS12の結合様式を示す。 図１２−１の続きである。 図１２−２の続きである。 図１２−３の続きである。 (A)いくつかのキナーゼの活性化ループのアミノ酸配列アラインメントを示す。残基をその類似する特性に従って着色する；疎水性／非荷電(赤色)、極性／酸性(青色)、極性／塩基性(ピンク色)、極性／非荷電(緑色)。ループの長さは、各配列の終わりに出現する。特異的モチーフを囲み、標識し、本文中に記載する。標識している位置を、p38αについて選択された位置に従って印を付ける(*)。DFGモチーフに最も近い活性化ループの最初の半分は、p38αにおいては長さが最も短い。より長い活性化ループを有する他のキナーゼに関する構造情報は、DFGモチーフ(#)の直後の残基はac-p38αに関して選択された部位と良好に整列することを示している。(B)いくつかのキナーゼ活性化ループの配列アラインメントは、DFG+1およびDFG+2位置(太字)の標識を導く。アラインメントを、Clustal W(Larkinら、2007)を用いて行った。高度に保存されたか、またはキナーゼの構造安定性もしくは酵素活性にとって重要である領域を示す(囲み領域)。パネルAと比較した場合のこのアラインメントにおける観察された差異は、このアラインメントにおける異なるキナーゼの使用に起因する。両パネルにおける囲み領域を、記載の活性化ループの対応する機能的領域の周囲に適宜配置した。 フルオロフォア結合部位を決定するためのキナーゼとp38αの構造的アラインメントを示す。cAblキナーゼを活性(A)および不活性(B)p38αと整列させて、長い活性化ループにより採用されたコンフォメーションを示し、これはDFGモチーフの後ろの最初の位置がそのようなキナーゼにおける標識にとって最良であることを示唆している。この残基を、DFGモチーフからさらに遠い1個の残基であるp38α中の標識された部位と最も類似するように配置する。EGFRにおいては、DFG-outコンフォメーションにおける配置を用いて、DFGモチーフから非常に遠いユニークな位置を選択した(C)。ユニークな不活性状態のEGFRの形成後、この残基を不活性p38αの標識部位と最も類似するように配置する。 II型阻害剤ソラフェニブとの複合体中のac-p38αの共結晶構造を示す。ソラフェニブ(ピンク色)およびアクリロダン(白色)の電子密度マップを、1σで形成させる。可能な水素結合相互作用を点線で強調する(a)。ac-p38α-ソラフェニブ複合体とb-Raf-ソラフェニブ複合体の構造アラインメントを示す。 a〜c：アクリロダン標識されたニワトリcSrcキナーゼドメインのHPLCおよび質量分析を示す。所望の標識されたペプチドの予測される断片質量(839 Da)を、ソフトウェアプログラムPeptide Cutter (www.expasy.org/tools/peptidecutter)を用いて決定した。所望の断片のアミノ酸配列はN'-VADFGCAR-C'であり、839 Daの予想された質量を有する(またはアクリロダンをCysにコンジュゲートさせる場合は1064 Da)。(a)m/z 839.0の一価イオン([M+H]+)質量クロマトグラム、未標識ペプチド断片。この予想された断片を含む高い強度ピークが25.51分の後に出現し、このピークは未標識のcSrcキナーゼドメインについてのみ観察された。(b)m/z 1064.0の一価イオン([M+H]+)質量クロマトグラム、標識されたペプチド断片。この予想された標識された断片を含む高い強度ピークは40.90分の後に出現し、このピークは標識されたcSrcキナーゼドメインについてのみ観察された。同時に、両方の結果は、予想された質量が予想されたキナーゼにおいてのみ観察されたため、所望のCys残基の100％の標識を示唆している(標識または未標識)。(c)標識されたbおよびyシリーズ(Roepsdorff命名法)を有する標識されたcSrc断片(m/z=532.9)の二重に荷電したイオンのMS/MSスペクトル。完全なyシリーズに関するピークを標識し、完全なペプチド配列を確認する。bシリーズにおいては、b6のみが失われている(b1は小さすぎて検出できない)。d〜f：アクリロダン標識された、および未標識のヒトp38αのHPLCおよび質量分析を示す。所望の標識されたペプチドの予測された断片質量(1161 Da)を、ソフトウェアプログラムPeptide Cutter (www.expasy.org/tools/peptidecutter)を用いて決定した。所望の断片のアミノ酸配列はN'-ILDFGLCR-C'であり、936 Daの予想質量を有する(またはアクリロダンをCysにコンジュゲートさせる場合は11161 Da)。標識されたp38α(41422 Da)のESI-MSは、1個のアクリロダン分子によるタンパク質の標識の際に未標識のキナーゼと比較して225 Daの質量シフトを示す(d)。未標識のキナーゼは少量であるが依然として存在する(41197 Da)。m/z 1062.0の一価イオン([M+H]+)質量クロマトグラム、標識されたペプチド断片(e)。この予想された標識された断片を含む高い強度のピークは47.36分の後に出現し、このピークは標識されたp38αキナーゼについてのみ観察された。同時に、パネルdおよびeにおける結果は、所望のCys残基のほぼ完全な1:1の標識を示している。標識されたbおよびyシリーズ(Roepsdorff命名法)を有する標識されたp38α断片(m/z=581.9)の二重に荷電したイオンのMS/MSスペクトル(f)。完全なbシリーズに関するピークを標識し(b1およびb8はそれぞれ小さすぎ、大きすぎて検出できない)、完全なペプチド配列を確認する。yシリーズにおいては、y1のみが失われている(y8は大きすぎて検出できない)。さらなる詳細については「方法」を参照されたい。 図１６−１の続きである。 アクリロダン標識されたニワトリcSrcの蛍光特性評価を示す。(a)100 nMの標識されたcSrcの懸濁液3 mLを、標準的な蛍光分光計に入れ、386 nmで励起して、リガンド(実線)、11c、RL46(図面中では3cとして示される)(■)またはダサチニブ(□)の非存在下での放出スペクトルを記録した。レシオメトリック蛍光読み出しを可能にする内部蛍光参照として役立つλ445 nmでの阻害剤結合と関連する蛍光強度の変化を定量するために、λ475 nmとλ505 nmでの強度を選択した。I型足場の阻害剤(ダサチニブ)は、II型足場11cのものとは異なる蛍光応答を与える。III型結合剤はII型結合剤と同様のスペクトルをもたらした(示さず)。(b)λ445/λ475 nm(左側)およびλ475/λ505 nm(右側)の蛍光放出比(R)を用いて決定されたダサチニブに関する結合曲線。(c)λ445/λ475 nm(左側)およびλ475/λ505 nm(右側)の蛍光放出比(R)を用いて決定された11cに関する結合曲線。λ475およびλ505はDFG-out結合剤と同様に応答するため、その結果は平坦な直線である。 初期III型スクリーニングヒットおよび結合様式予測を示す。(a)化合物のスクリーニングを、「方法」の節に記載のように10および50μMの濃度で実施した。アクリロダンを386 nmで励起した。λ445、λ475およびλ505で384穴プレートを測定した後、レシオメトリック値(λ445/λ475)を算出し、cSrcの公知のDFG-out結合剤であるイマチニブの飽和濃度から得られた応答と比較した。R値を(3-7)について示す(図面中で、それぞれ1a-eとして列挙されている)。(3、RL57)および(6、RL35)のみが10μMで検出されたが、(3-6)は以下の低下する親和性ランキングで50μMで検出された：(3、RL57/6、RL35)＞(5、RL38)＞(4、RL37)。これらの化合物はいずれも、50μMでのイマチニブの最大蛍光変化の50％にも達しない。蛍光比は任意の濃度で(7、RL19)に応答しなかったが、これはそれがcSrcのアロステリックポケットに結合するには嵩が高すぎるように設計されているためである(また、p38αについては、図19を参照されたい)。(b)阻害剤の型を、R＝λ475/λ505を用いてアクリロダン標識されたcSrcにより識別することができる。リガンド(apo cSrc)の非存在下での標識されたcSrcのR＝λ475/λ505の平均値は1.013である(直線)。同じ値を、最大に引き出された応答でI型、II型およびIII型阻害剤の全部について算出し、各阻害剤の型について平均値±標準偏差としてプロットする。 ピラゾロウレアのフォーカスライブラリーのスクリーニングは、cSrc、薬剤耐性cSrc-T338Mおよびp38αへの結合を示す。(a)ピラゾロウレア(3-7)(図面中ではそれぞれ1a-eとして列挙される)および4-アミノキナゾリン(8、RL55; 9、RL56; 10,RL6)(図面中ではそれぞれ2a-cとして列挙される)の構造を示す。(b)野生型(cSrc)および薬剤耐性cSrc(cSrc-T338M)に対する阻害剤の一団に関する阻害された酵素活性のIC50値(μM)。記載の蛍光の基づく結合アッセイを用いて測定されたcSrcおよびp38αにおけるピラゾロウレアの同じ一団のKd値(μM)。ピラゾロウレア(3-6)はp38αの強力な阻害剤である。阻害剤(3、RL57)は、野生型および薬剤耐性cSrc-T338Mの阻害の平衡を示す。嵩高いナフチル誘導体(5、RL38)はcSrcを弱く阻害するが、十中八九、より大きいゲートキーパー(門番)残基との立体的衝突に起因して、cSrc-T338Mを阻害することができない。立体的要求(7、RL19)はsSrcまたはp38αのアロステリック部位に適合せず、陰性結合対照として働く。キナゾリン(8-10)は、キナーゼのヒンジ領域に結合し、また、cSrcにおける蛍光アッセイを用いて検出された(が、蛍光p38αにおいては非常に弱く感知された)cSrcの弱いI型阻害剤である。大きいブロモ-フェニル部分は薬剤耐性cSrc-T338M中の門番側鎖と衝突し、親和性の有意な低下をもたらす(Michalczykら、2008)。また、ダサチニブについても同様の衝突が起こるが、門番から遠くで結合するスタウロスポリンについては起こらない。[注記：(*)は、固有の化合物蛍光による高い干渉に起因してKd値が測定可能ではない(nm)化合物を指し、(**)は、10μMで結合しない(nb)か、またはアクリロダン標識されたp38αにより弱く感知される(以前に報告されたものよりも10倍高いKd)I型化合物を指す。蛍光p38αは、蛍光cSrcと違って、I型結合剤に対する不感受性を示すが、両方の蛍光キナーゼはDFG-out結合剤のための優れたセンサーとして役立つ]。 cSrcキナーゼの強力なII型ハイブリッド阻害剤の構造に基づく設計を示す。(a)III型阻害剤との複合体にあるcSrc(4、RL37)。cSrc(灰色)および(4、RL37)(赤色)の電子密度マップ(2 Fo-Fc)を1σで形成させる。阻害剤と、DFGモチーフ(オレンジ色)およびへリックスC(青色)との水素結合相互作用を点線で強調する。キナーゼドメイン(M341により表される)のヒンジ領域(ピンク色)は阻害剤により接触しない。(b)ATP競合的4-アミノキナゾリン(緑色)(PDBエントリー2QLQ16)との複合体にあるcSrcの構造と整列させた、III型阻害剤(3、RL57)(灰色)との複合体にあるcSrcの共結晶構造は、構造に基づく薬剤設計の理論的根拠を提供した。キナゾリンコアはキナーゼのヒンジ領域に結合するが、ピラゾロウレアはキナーゼのアロステリック部位にのみ結合する。両阻害剤のフェニル部分の平面は、ニワトリcSrc中の門番残基、Thr338と隣接して整列する。(c)cSrcに結合したI型4-アミノキナゾリンおよびIII型ピラゾロウレアの結合様式に基づいて合理的に設計されたII型阻害剤。断片に基づく薬剤探索の概念に従って(Shukerら、1996；Nienaberら、2000)、2個の弱い結合剤を化学的に結合させることは、有意により高い結合親和性をもたらすべきである。 合理的に設計されたII型阻害剤のフォーカスライブラリーを示す。(a)1,4-結合した11a-c(図面中では3a-cとして示される)および1,3-結合した11d-e(図面中では3d-eとして示される)キナゾリン-ピラゾロウレアハイブリッド化合物を示す。(b)cSrc野生型、薬剤耐性cSrc-T338Mおよびp38αに対する一団の阻害剤のIC50およびKd値(μM)。1,4-置換されたハイブリッドは、cSrc野生型およびcSrc-T338Mに関する効力および選択性の最良の平衡を示す。キナゾリンコアの位置6におけるR1置換はcSrcにおける効力の重要な決定因子であり、cSrc野生型および薬剤耐性cSrc-T338Mの両方について最も強力なハイブリッド化合物である11c、RL46によって透明なSARにする。11d-eの阻害剤コアの1,3-融合物は、p38αに対する選択性を指向し、薬剤耐性cSrc-T338Mに対する親和性を有意に低下させる。 1,3-および1,4-置換されたハイブリッド化合物の化学合成を示す。i)酢酸ホルムアミジン、2-メトキシエタノール、132℃；ii)4-ヒドロキシ-6-ニトロキナゾリン(9)、SOCl2、cat. DMF、還流；iii)ピラゾロウレア-フェニレンジアミン(5)、DIPEA、DCM、室温；iv)ギ酸アンモニウム、Pd/C、EtOH、還流；v)塩化プロピオニル、DIPEA、THF、0℃。注記：図面中に3a-cと示される化合物は、本出願を通して用いられる化合物11a-cであるが、3d-eと示される化合物は本出願を通して用いられる化合物11d-eである。 野生型ニワトリcSrcおよび薬剤耐性cSrc-T338Mとの複合体にある1,4-置換されたハイブリッド化合物11b、RL45(図面中では3bとして示される)は、異なる結合様式を示す。2.6Å解像度でのcSrc-RL45(a)およびcSrc-T338M-RL45(b)の実験電子密度の立体ダイアグラム(リガンドは赤色、タンパク質は灰色)を示す(1σで形成された2 Fo-Fcマップ)。阻害剤と、へリックスC(青色)、DFGモチーフ(オレンジ色)およびヒンジ領域(ピンク色)との水素結合相互作用を、赤色の点線で示す。キナーゼドメインは、不活性コンフォメーションにあり、ピラゾロウレア部分はへリックスCとDFGモチーフにより隣接したアロステリック部位に存在する。キナゾリンのN1は、M341の主鎖アミドとの直接的水素結合を作り、これはアニリノ-キナゾリンといくつかの他のタンパク質キナーゼドメインのヒンジ領域との間に形成される一般的な相互作用である。両複合体において、キナゾリン足場をピラゾロウレア断片に連結させる中心のフェニル部分は、好ましいedge-to-face方向でF405(DFGモチーフ)の側鎖と相互作用する。(c)阻害剤のvan der Waals半径(メッシュ)、門番残基T338/M338(ピンク色の球体)およびF403の側鎖(オレンジ色の球体)は、M338の側鎖との立体衝突をバイパスして、(11b、RL45)が薬剤耐性cSrc-T338Mに結合することができる阻害剤の中心フェニル部分のコンフォメーション変化を説明する。(d)門番位置でのより大きい側鎖は、阻害剤の中心フェニル部分の90°の反転をもたらす。同様に、保存された両方のπ電子系の静電的に好ましいedge-to-face方向を維持するために、F405の側鎖を90°回転させる。 薬剤耐性cSrc-T338Mにドッキングされた1,3-置換されたハイブリッドを示す。化合物11e、RL62(図面中では3eと示される)を、野生型cSrc-RL45(a)および薬剤耐性cSrc-T338M-RL45(b)複合体の構造中に手動でドッキングさせた。キナゾリンN1と、ヒンジ領域の骨格との必須の水素結合相互作用およびピラゾロウレア部分によるアロステリック部位の占有を保存するために注意を払った。阻害剤は、小さい門番残基(T338)によりよく許容される結合様式を採る。(c)薬剤耐性cSrc-T338Mにおいては、11a-c(図面中では3a-cと示される)の中心的な1,4-置換されたフェニルエレメントは自由に回転して、より大きい門番残基を採ることができる。(d)1,3-置換されたハイブリッド化合物におけるこの重要なエレメントの自由回転は好ましくなく、骨格水素結合の喪失またはアロステリック部位からのピラゾロウレアの置換をもたらすであろう。阻害剤の可撓性の低下は、薬剤耐性cSrc-T338Mに対する11d、RL61(図面中では3dと示される)および11eの結合が有意に損傷する理由を説明するのに役立つ。 (11c、RL46)によるPC3およびDU145細胞中での細胞間接触および細胞増殖の低下を示す。(a)PC3およびDU145細胞を、(11c、RL46)(1、2、5および10μM)、ダサチニブ(100 nM)、またはビヒクル(DMSO)で5時間処理した。細胞を溶解させ、指示されたタンパク質についてブロットした。pSrcおよびpFAKレベルは、(11c、RL46)およびダサチニブ(左側パネル)による処理に応答して顕著に低下した。FAKの合計発現は変化しなかったが、cSrc発現は両細胞系において増加した。(b)10倍の倍率での光学顕微鏡により可視化された細胞間接触を示す。PC3およびDU145細胞は、(11c、RL46)(10μM)またはダサチニブ(100 nM)による24時間の処理後に細胞間接触の顕著な低下およびより少ない無傷の細胞を示す。 ハイブリッド化合物(11b、RL45)に関するキナーゼ選択性のヒートマップを示す。(11b、RL45)(5μM)を、64種のキナーゼ(Ambit Biosciences)の一団に対してスクリーニングし、その結合強度を上記に示されたカラースケールに従ってスコア化した(強い結合は緑色、結合なしは赤色)。その結果は、(11b、RL45)に関するチロシンキナーゼ(TK)の明確な選択性を示した。大きい疎水性門番を有するTKは阻害剤に対応することができる。スクリーニング中の多くのセリン-トレオニンキナーゼ(STK)は(11b、RL45)に結合しなかったが、これはおそらく、1,4-置換されたハイブリッドに関する不完全な結合部位形状に起因するものであろう。門番残基の配列アラインメント分析は、これらの非CMGC STKのいくつかも大きい疎水性門番を含有し、CMGCファミリーSTKにおいてあまり顕著ではなく、(11b、RL45)に対する選択性を示したことを示している。ソフトウェアGenePattern (Reichら、2006)を用いて、その阻害プロフィールに従ってキナーゼをクラスター化した。データを正規化しなかった；クラスター化は階層的であり、Euclidian距離に基づく。キナーゼドメイン配列をClustalW (Larkinら、2007)と整列させて、図面の上部に分岐図を作成した(Andrew RambautによるFigTreeを用いて描画)。それぞれの門番を、この門番を有するキナーゼによる11b、RL45について得られたAmbitスコアの平均に対して色分けする。セリン／トレオニンキナーゼ型を灰色で強調する。 アクリロダン標識されたcSrc中での(11a、RL44)の結合および解離速度を示す。アクリロダン標識されたcSrc(50 nM)を、アクリロダン蛍光をモニターしながら、ミニ攪拌棒を急速攪拌しているキュベット中に入れた(左側パネル)。単回用量の(11a、RL44)(300 nM)を、サンプル上の注入ポートを用いてサンプルに添加し、蛍光減少を誘発させ、一次崩壊関数(結合のkobs=0.087 s-1;t1/2=7.95秒)に良好に適合させた。サンプルを平衡に到達させた後、10倍過剰量の未標識cSrcを添加して、標識されたcSrcから結合した(11a、RL44)を抽出した。過剰の未標識キナーゼの添加は、その初期レベルまで蛍光を増加させ、これも一次崩壊関数(解離のkobs=0.045 s-1;t1/2=15.32秒)に良好に適合させた。単回用量の(11a、RL44)(300 nM)を同様の条件下でアクリロダン標識されたp38αに添加したところ、比較によりリガンドのより遅い結合が得られた(右側パネル)。cSrcに関する結果は、DFG-out結合剤が結合速度より遅い解離速度を有し、それによってキナーゼに対するそのより高い親和性に寄与するという公開された観察を指示している。p38α中での(11a、RL44)のより遅い結合速度は、cSrcなどのチロシンキナーゼ中でのより高い可撓性のへリックスCに帰し、かくして、アロステリックポケットを、リガンドにより接近可能にする。蛍光応答の可逆性の性質はまた、アッセイが阻害剤の結合および解離により誘発されるDFG-inとDFG-outコンフォメーション間の可逆的平衡に応答することを示している。 ac-p38αによるイミダゾール誘導体SB203580およびSKF86002の結合の検出を示す。p38αの高親和性ATP競合阻害剤であるSKF86002は、結合時に阻害剤自体の蛍光放出の変化に従って約78 nM(□)のKdで結合するが(左軸)、アクリロダンのレシオメトリック蛍光(右軸)は721 nMのKdを報告している(■)(A)。SB203580は、SKF86002と同様の構造部分(赤色)を有し、ac-p38αに添加した場合、15 nMのKdを有する結合曲線をもたらす(B)。本発明者らは、SB203580の結晶構造を2.3Åまで解像し、SB203580(赤色)およびp38α(灰色)の電子密度マップを1σに合わせた。可能な水素結合相互作用を点線で強調する。阻害剤のピリジン環はキナーゼのヒンジ領域(Met109)と必須の水素結合を形成する。近接したフェニル置換基は、それぞれDFGモチーフ(オレンジ色)のPhe169の側鎖と、P-ループ(緑色)のTyr35の側鎖との間に完全に挟まれている。メチルスルフィニル置換基フェニルは電子に富み、Tyr35とPhe169の側鎖とのエネルギー的に好ましいπ-π相互作用を形成し、「out」コンフォメーションでDFGモチーフを安定化させる可能性が高い。さらに、水分子W1は、阻害剤のイミダゾールのN3と、Leu167の主鎖カルボニル(赤色)との間で水素結合を架橋し、これはDFG-outコンフォメーションの安定化に寄与するようである(C)。さらなる考察については実施例9の「スクリーニングにおける強力なATP競合阻害剤の検出／偽ヒットの同定」を参照されたい。 活性化ループ上で標識されたIAEDANS-p38αを用いるリアルタイムおよびエンドポイント蛍光測定を示す。463 nmでのIAEDANS放出は、BIRB-796の結合の際に低下するが、レシオメトリック蛍光データ(R＝511 nm/463 nm)は、リガンドがDFG-outコンフォメーションに結合する際に増加する(A)。360分のインキュベーション後のレシオメトリックデータのエンドポイント平衡測定を用いて、BIRB-796について19.9 nMの結合Kdを確実に取得した(B)。阻害剤濃度の対数尺度に対して蛍光データをプロットすることにより、Kdを決定した。また、蛍光トレースを単一の波長(463 nm)でリアルタイムで測定して、様々な動的速度定数を決定した(C)。時間＝0秒で等量のIAEDANS-p38αに100 nMのBIRB-796を添加した結果生じる蛍光崩壊を、一次崩壊関数に適合させて(灰色の線)、結合のkobsを決定した。10倍過剰量の未標識p38αを用いるIAEDANS-p38αからのBIRB-796の抽出により、koffの直接的決定が可能になり、これも一次関数に適合させた(灰色の線)(D)。上記に提示されたデータは、IAEDANS-p38αを用いてBIRB-796に関して実行された典型的なセットの実験の代表例である。解離および結合に関するkobsの比を用いて、これらの実験条件下でのBIRB-796の平衡定数(Keq)を算出した(Keq=koff/kobs,on)。 活性化ループ上で標識された様々なp38α-フルオロフォアコンジュゲートを用いるリアルタイム蛍光測定を示す。535 nmでのNBD放出(A)、520 nmでのフルオレセイン放出(B)、535 nmでのピレン放出(C)および697 nmでのAtto680放出(D)は全て、BIRB-796の結合の際に低下する(左側パネル)。レシオメトリック蛍光測定はこれらのフルオロフォアを用いる場合不可能であったため、安定なエンドポイント平衡測定は結合のkdの決定にとって理想的ではなかった。蛍光トレースを、報告された単一の波長でリアルタイムで測定して、様々な動的速度定数を決定することができた。時間＝0秒での等量の各蛍光標識p38αコンジュゲートへの100 nMのBIRB-796の添加の結果生じる蛍光崩壊を一次崩壊関数に適合させて(灰色の線)、結合のkobsを決定した(中央のパネル)。10倍過剰量の未標識p38αを用いる各蛍光標識p38αコンジュゲートからのBIRB-796の抽出により、koffの直接的決定が可能になり、これも一次関数に適合させた(灰色の線)。上記に提示されたデータは、各蛍光標識p38αコンジュゲートを用いてBIRB-796について実行された典型的なセットの実験の代表例である。解離および結合に関するkobsの比を用いて、図2で報告されたこれらの条件下でのBIRB-796に関する平衡定数(Keq)を算出した(Keq=koff/kobs,on)。 図３０−１の続きである。 ピラゾロウレアのフォーカスライブラリーの測定されたKd値およびSARを示す。全てのピラゾロウレア誘導体の合成および特性評価を、「支援情報」に記載する。全化合物を、1 nM〜20μMの濃度範囲にわたってac-p38α(50 nM)に対して滴定して、p38αのDFG-outコンフォメーションへの結合の際に観察されたレシオメトリック蛍光変化(R＝514 nm/468 nm)を用いて結合曲線を作製した。次いで、各化合物のKd値を、結合曲線から直接得た。全ての報告された値は、少なくとも3回の独立した滴定から得た平均±s.d.である。 p38αに結合したII型ハイブリッドキナーゼ阻害剤11b、11eおよび11lの結晶構造を示す。それぞれ、2.0Å、2.3Åおよび2.1Å解像度での1,4-パラキナゾリン-ピラゾロウレアハイブリッドII型阻害剤11b、RL45(A)ならびに1,3-メタキナゾリン-ピラゾロウレアハイブリッドII型阻害剤11e、RL62(B)および11l、RL48(C)の実験的電子密度(リガンドは赤色；タンパク質は灰色)を示す(1σで形成させた2 Fo-Fcマップ)。阻害剤と、へリックスC(青色)、DFG-モチーフ(オレンジ色)およびヒンジ領域(ピンク色)との水素結合相互作用を、赤色の点線で示す。キナーゼドメインは不活性コンフォメーションにあり、ピラゾロウレア部分はへリックスCおよびDFG-モチーフにより隣接するアロステリック部位中にある。キナゾリンのN1は、一般的にはアミノ-キナゾリンといくつかの他のタンパク質キナーゼドメインのヒンジ領域との間で形成される相互作用である、M109の主鎖アミド(ヒンジ領域)との直接的水素結合を作る(Blairら、2007；Michalczykら、2008)。キナゾリンのN3は、門番T106の側鎖と水素結合を形成する。p38α-RL45複合体においては、ピラゾールのN2はD168の側鎖(DFG-モチーフ)と水(W1)を介する水素結合を形成する。キナゾリンとピラゾロウレア足場を連結する中心フェニル部分は、F169の側鎖(DFG-モチーフ)と相互作用するが、p38α-RL62およびp38α-RL48複合体においては、キナゾリンコアの4位の二次アミンと6位の一次アミンはそれぞれ、DFG-モチーフの主鎖との水(W2およびW3)を介する水素結合を形成する。DFG-モチーフはキナゾリンの10員環のより近くに引かれ、両方のπ電子系(キナゾリンとF169側鎖)の静電的に好ましいedge-to-face相互作用(HunterおよびSingh, 1991)の形成を可能にする。DFG-モチーフへの水を介する水素結合ならびにp38α-RL61およびp38α-RL48中のπ-π相互作用は、DFG-outコンフォメーションを安定化し、メタ置換キナゾリン-ピラゾロウレアのより固い結合に寄与する可能性が最も高い。p38α-RL45およびp38α-RL48複合体においては、キナゾリンの6位の一次アミンはV30の主鎖に対して水素結合距離の範囲内にある。ピラゾールのN1に結合したメタ-トロイル部分は、p38α-RL62複合体と比較した場合、p38α-RL45複合体において180°反転し、アロステリックポケットの周辺でリガンドの異なる可撓性を示す。ピラゾロウレアおよびキナゾリン／キノリン足場のII型ハイブリッド阻害剤のフォーカスライブラリーの測定されたKd値を示す(D)。全化合物を1 nM〜20μMの濃度範囲にわたってac-p38α(50 nM)に対して滴定して、各化合物のKdの決定のための結合曲線を作製した。全ての報告された値は、少なくとも3回の独立した滴定の結果である。さらなる考察については、実施例27の「さらなるII型ハイブリッド阻害剤のSAR」を参照されたい。
用語「キナーゼ」は、当業界でよく知られており、ATPなどの高エネルギー供与体分子から、タンパク質などの特異的標的分子にリン酸基を転移させる酵素の型を指す。キナーゼは、酵素番号(EC)2.7の下で分類される。特異性に応じて、タンパク質キナーゼを、セリン／トレオニンキナーゼ(EC 2.7.11、例えば、p38α)、チロシンキナーゼ(EC 2.7.10、例えば、EGFRキナーゼドメイン)、ヒスチジンキナーゼ(EC 2.7.13)、アスパラギン酸／グルタミン酸キナーゼおよび2種以上の特異性を有する混合キナーゼ(EC 2.7.12)(例えば、MEKはセリン／トレオニンおよびチロシンに特異的である)に分割することができる。
本発明の改変キナーゼは、遊離チオールおよび／またはアミノ基を有するアミノ酸の部位で標識されている。アミノ酸は、カルボキシルおよびアミノ官能基を有する有機分子と定義される。それらはタンパク質の必須構成要素である。遊離チオール基を有するアミノ酸の例は、20種の標準アミノ酸に属するシステイン、および天然アミノ酸配列中に稀に存在する非標準アミノ酸であるアセチル-システインである。遊離アミノ基を有する標準アミノ酸は、リジン、ヒスチジンまたはアルギニンおよびトリプトファンなどの芳香族アミンであるアミノ酸である。ピロリジン、5-ヒドロキシリジンまたはo-アミノチロシンは、遊離アミノ基を有する非標準アミノ酸である。アミノ酸アスパラギンおよびグルタミンは遊離アミノ基を有するが、それらは標識剤と反応しないため本発明においては好適ではなく、かくして排除される。
トリプトファンは、そのインドール環中にアミノ基を有する芳香族アミノ酸である。芳香族アミンは弱塩基であり、かくしてpH 7で非プロトン化されている。しかしながら、イソチオシアネート、塩化スルホニルまたは酸ハロゲン化物などの高反応性試薬を用いて、それらを依然として改変することができる。用語「遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸部位で標識された」は、所望の位置に、すなわち、活性化ループ中に遊離チオールもしくはアミノ基を有し、該アミノ酸部位で標識されたアミノ酸を有するキナーゼを記述する。標識の間に、前もって遊離チオールもしくはアミノ基は標識されたアミノ酸と項目(a)および(b)に従う標識との間での共有結合の形成に関与する。換言すれば、用語「キナーゼの活性化ループ中に天然に存在するか、またはその中に導入された、遊離チオールまたはアミノ基を有するアミノ酸の部位で標識されたキナーゼ」は、用語「標識がアミノ酸の遊離チオールまたはアミノ基で行われる、キナーゼの活性化ループ中に天然に存在するか、またはその中に導入されたアミノ酸を有するキナーゼ」と互換的に用いられる。
標識される前記アミノ酸は、キナーゼの活性化ループ中に位置する。これは、活性化ループまたはそれと等価な構造を有するキナーゼのみが、本発明の範囲内にあることを意味する。活性化ループは、多くのキナーゼの基質結合切断部を形成する活性部位への入り口の近くの可撓性断片であり、1個以上のアミノ酸上でリン酸化されて、タンパク質キナーゼスーパーファミリーを介する重要な調節機構を提供することができる(JohnsonおよびLewis, 2001; TaylorおよびRadzio-Andzelm, 1994; Johnsonら、1996)。活性化ループは、ATP結合部位中の高度に保存されたアスパラギン酸-フェニルアラニン-グリシン(DFG)モチーフで始まり、キナーゼのNおよびC突出部の間に伸長する多くのキナーゼにおいて可撓性であるループを形成するいくつかのアミノ酸からなる。活性化ループは、酵素キナーゼ活性にとって極めて重要な構造成分である。それは基質結合切断部の一部であり、特異的基質の認識を助けるいくつかのアミノ酸残基を含み、また、リン酸化することができるセリン、トレオニンまたはチロシンをも含む。活性化ループのコンフォメーションは、DFG-in(活性キナーゼ)とDFG-out(不活性キナーゼ)コンフォメーションの間で力学的な平衡にあると考えられる。相互作用パートナー(他のタンパク質もしくはDNA)のリン酸化および／または結合は、平衡のシフトをもたらす。DFG-inコンフォメーションにおいては、モチーフに含まれるアスパラギン酸はATP結合部位に向かい、隣接するフェニルアラニンはATP部位から隣接するアロステリック部位に向かう。活性化ループの保存されたDFGモチーフ形成部分がinコンフォメーションを採用する場合、ATP競合阻害剤(I型阻害剤)はキナーゼに結合することができる。DFG-outコンフォメーションにおいては、これらの残基の位置は、向きが180°反転している。活性化ループのoutコンフォメーションはATPと基質の結合を阻害する。inからoutコンフォメーションへの活性化ループのコンフォメーション変化を引き起こす化合物は、ATP部位(ヒンジ領域)に結合し、ATP結合部位に隣接するアロステリックポケット中に伸長するII型阻害剤、またはアロステリックポケットにのみ結合するIII型阻害剤である。
目的のキナーゼ中に天然に存在し、溶媒に露出したシステインを、活性化ループの外側に、または活性化ループ配列内に位置させることができる。これは遊離アミノ基を有するアミノ酸にも同等に適用される。
本発明の改変キナーゼを、活性化ループ中に天然に存在するか、またはその中に導入されたアミノ酸の部位で標識する。好適なアミノ酸、すなわち、遊離チオールもしくはアミノ基を有するものが活性化ループ中に存在しない場合、当業界でよく知られた技術により、それを付加するか、または存在するアミノ酸を置換することにより、前記アミノ酸を導入、すなわち、挿入することができる。いずれの場合も、疑いを避けるために、アミノ酸を標識試薬との反応により標識しようとする場合、活性化ループ中へのその導入後にのみアミノ酸が標識されることが理解されるべきである。これらの技術は、部位特異的突然変異誘発ならびに他の組換え、合成または半合成技術を含む。非標準アミノ酸をキナーゼに導入しようとする場合、前記アミノ酸を含むアミノ酸ストレッチを化学的に合成した後、組換え的または合成的に作製されたキナーゼの残りの部分に接続することができる。
標識のプロセスは、キナーゼ、例えば、本発明の突然変異キナーゼ(例えば、活性化ループ中にシステインが導入されたキナーゼ)と、チオールもしくはアミノ反応性標識との、活性化ループ中の所望の位置での突然変異キナーゼの標識をもたらす穏和な条件下でのインキュベーションを含む。穏和な条件とは、バッファーのpH(例えば、チオール反応性プローブについてはpH約7)、標識とキナーゼの比率、インキュベーション工程の温度および長さ(チオール反応性プローブについては、例えば、暗室中、4℃で一晩)を指し、それらは当業者には公知であり、チオールおよびアミノ反応性プローブの提供者の説明マニュアルと共に提供される。そのような条件は、前記キナーゼの標識が所望の標識部位に特異的であることを確保するために、選択されたチオールもしくはアミノ反応性標識の反応を減速させるように最適化する必要がある。フルオロフォア標識の場合、暗室中でインキュベーションを実行する必要がある。光曝露の増加はフルオロフォアの漂白および低強度の蛍光放出をもたらす。標識後、標識されたキナーゼを濃縮し、ゲル濾過実験により精製するか、または過剰の未反応標識を除去するためのバッファーで数回洗浄するのが好ましい。洗浄バッファーは、典型的には、標識されたキナーゼを保存するのに用いられるバッファーであり、所望の測定を行うバッファーであってもよい。
用語「フルオロフォア」は、特定の波長の光子などのエネルギーを吸収し、エネルギー、すなわち、化学反応の関与なしに(生物発光の場合)吸収時に即座に(リン光の場合と違って)異なる(しかし同等に特異的な)波長で光(蛍光)を放出する分子または分子内の官能基を指す。通常、吸収された光子の波長は、紫外線の範囲にあるが、赤外線の範囲に到達してもよい。放出された光の波長は通常、可視光線の範囲にある。放出されたエネルギーの量および波長は主に、フルオロフォアの特性に依存するが、フルオロフォアの周囲の化学的環境により影響されてもよい。いくつかのフルオロフォアが、その環境における変化に対して感受性である。これは、極性、電荷および／またはそれらが結合した分子のコンフォメーションの変化を含む。蛍光は、分子が電気的に励起された後にその基底状態に弛緩する時に生じ、一般的に用いられる蛍光化合物については、UVから近赤外線までのエネルギーを有する光子を放出し、0.5〜20ナノ秒の範囲で起こる。
用語「チオールもしくはアミノ反応性」とは、遊離チオールもしくはアミノ基と特異的に反応する化合物、例えば、フルオロフォアの特性を指す。これは、チオールもしくはアミノ基との特異的反応を指令する前記化合物中に存在する官能基に起因する。これらの官能基を、フルオロフォア、スピン標識またはアイソトープ富化分子などの分子に結合させて、遊離チオールもしくはアミノ基に結合可能な特異的標識を提供することができる。チオール特異的化合物の例は、例えば、ヨードアセタミドなどのハロアルキル化合物、マレイミド、Hg-Link(商標)フェニル水銀化合物またはTS-link(商標)試薬(両方ともInvitrogen)である。ハロアルキル化合物は、pHに応じてチオールまたはアミノ基と反応する。
用語「スピン標識」(SL)とは、通常は窒素原子上に、非対電子を有し、別の分子に結合する能力を有する分子、一般的には、有機分子を指す。スピン標識は、EPR分光法を用いてタンパク質をプローブ化するための道具として用いられる。部位特異的スピン標識(SDSL)技術により、タンパク質のコンフォメーションおよび力学をモニターすることができる。そのような試験においては、アミノ酸特異的SLを用いることができる。
部位特異的スピン標識は、電子スピン共鳴を用いてタンパク質局所力学を調査するための技術である。SDSLは、スピン標識とアミノ酸との特異的反応に基づく。タンパク質構造中で構築されたスピン標識を、EPR分光法により検出することができる。SDSLにおいては、天然に存在しない場合、チオールもしくはアミノ基などのスピン標識の結合のための部位を、部位特異的突然変異誘発により組換え発現されたタンパク質に導入する。スピン標識内に含まれる官能基は、その特異性を決定する。中性のpHでは、タンパク質のチオール基はメタンチオスルホナート、マレイミドおよびヨードアセタミドなどの官能基と特異的に反応し、アミノ酸システインとの共有結合を作る。スピン標識は、それらが常磁性体である、すなわち、それらが非対電子を含むという点で、ユニークな分子リポーターである。窒素酸化物スピン標識は、その安定性および単純なEPRシグナルのため、大分子構造および力学の研究に広く用いられている。ニトロキシルラジカル(N-O)は通常、ピロリジンなどの複素環に組込まれ、非対電子は主にN-O結合に局在化する。一度、タンパク質中に組込まれたら、スピン標識の運動はその局所環境により影響される。スピン標識は運動に対して非常に敏感であるため、これはタンパク質に結合したスピン標識のEPRスペクトルに対する強い効果を有する。
非対電子から生じるシグナルは、互いに、および外部の磁界に関する、サンプル中の非対電子の運動、距離、および向きに関する情報を提供することができる。溶液中で自由に運動する分子については、EPRはNMR(核磁気共鳴分光法)よりも非常により速い時間尺度で動作し、従って、非常により速い、すなわち、NMRについてはマイクロ秒であるのに対して、ナノ秒で分子運動の詳細を示すことができる。電子の磁気回転比は、NMRにおいて一般的に用いられる核のそれよりも数桁大きく、従って、この技術はより感度が高いが、それにはスピン標識が必要である。
用語「アイソトープ」は、化学元素の最も豊富な種とは異なる原子質量(質量数)を有する該元素の化学種を指す。元素のアイソトープは、同じ数のプロトン(同じ原子番号)を有するが、異なるニュートロン数を有する核を有する。
EPRまたはNMRにとって好適なアイソトープは、非ゼロ核スピンを有する必要がある。現在用いられている最も一般的なアイソトープは、1H、2D、15N、13C、および31Pである。
チオール反応性スピン標識で標識されたキナーゼも、アイソトープで標識するのが好ましい(以下にさらに詳細に説明する)。
用語「アイソトープ富化」とは、化合物、例えば、チオールもしくはアミノ反応性標識が、アイソトープが該化合物中に導入されるように、該アイソトープを用いて合成されたか、またはそれと反応したことを指す。この化合物は、1種以上の異なる種の1種以上のアイソトープを含んでもよい。
標識がキナーゼの触媒活性を阻害せず、その安定性とも干渉しないように、標識を配置しなければならない。原理的には、本発明のアッセイは本発明の標識されたキナーゼの触媒活性の測定には依存しない。しかしながら、本質的には触媒活性への干渉が起こらず、潜在的な阻害剤と、本発明の標識されたキナーゼおよびそれが誘導された野生型キナーゼとの結合活性の比較を可能にするのが好ましい。アミノ酸、例えば、システイン上でアイソトープ標識され、配列中に既に組込まれたアイソトープ標識されたアミノ酸を含むキナーゼを発現している宿主生物を増殖させることにより作製されたキナーゼの場合、キナーゼの活性の阻害またはその安定性への干渉はありそうにない。他方、標識を導入しようとする活性化ループ中の位置を選択する時には注意を払わなければならない。選択位置に好適なアミノ酸が存在しない場合、その位置に存在するアミノ酸を、遊離チオールまたはアミノ基を含むアミノ酸と置換しなければならない。アミノ酸の置換の前後でのキナーゼの活性および安定性を評価する方法の試験は、当業者にはよく知られており、精製タンパク質の視覚的検査、円偏光二色性(CD)分光法、結晶化および構造決定、酵素活性アッセイ、タンパク質融解曲線、示差走査熱量測定ならびにNMR分光法が挙げられる。
これに関して、キナーゼ、好ましくはその活性状態にある野生型キナーゼの少なくとも90％の触媒活性、好ましくは95％、より好ましくは98％の触媒活性が保持される場合、触媒活性の阻害は存在しない。キナーゼの触媒活性が完全に保持されるのが最も好ましい。かくして、用語「触媒活性を阻害しない」は、触媒活性量が100％未満であるいくつかの実施形態においては、「触媒活性に本質的に干渉しない」と同等であり、その意味を有する。本発明の標識されたキナーゼ中の阻害剤のIC50値と、それが誘導された未標識のキナーゼ中の阻害剤のIC50値とを比較することにより、触媒活性を間接的に決定することができる。IC50値が同じ範囲内にある場合、すなわち、それらが5倍以上異ならない場合、これは、触媒活性が本質的には同じである(およびキナーゼに対する改変が該キナーゼに対する阻害剤の親和性を変化させなかった)ことを示唆する。本発明の標識されたキナーゼと未標識キナーゼは、4倍以下、より好ましくは3倍以下、さらにより好ましくは2倍以下異なるのが好ましい。当業者であれば、最大5倍の両IC50値間の差異が、これらの測定値と関連する通常の相違の範囲内にあることを知っているであろう。そのようなIC50値は、両キナーゼの触媒活性が本質的には同じであることを確保する。安定性に関しては、導入されたアミノ酸は、タンパク質の構造安定性を確保する本質的な分子内接触と干渉せず、従ってそのキナーゼは本明細書に記載の生物学的機能を実行することができる。
現存するスクリーニング方法の欠点を克服するために、本発明は、(i)キナーゼ阻害剤の結合に対して高感度であり、(ii)リアルタイムでリガンドの結合および解離の速度を測定するのに用いることができ、(iii)これらのリガンドのKdを直接測定するのに用いることができ、ならびに(iv)迅速、強固であり、再現可能であり、高効率スクリーニング方法に適合可能である蛍光タグ付キナーゼを作製するための標識戦略を含む。
従来技術とは対照的に、また添付の実施例で証明されるように、本発明は、少ない努力および材料ならびに優れた信頼性で特異的阻害剤のスクリーニングを可能にするキナーゼおよびこれらのキナーゼを用いるスクリーニング方法を提供する。これは本質的には、標識が、例えば、キナーゼの活性化ループ中のコンフォメーション変化により引き起こされる環境の変化と反応してその振舞いを変化させるように、キナーゼの標識戦略を提供することにより達成される。
キナーゼ活性のモジュレーターのスクリーニングのための従来のキナーゼアッセイとは別に、様々な手法が最近開発されている。しかしながら、これらの手法の多くは大きな欠点に悩まされている。例えば、Annisら(2004)は、親和性選択-質量分析(AS-MS)を用いる手法を記載している。この方法は、高効率スクリーニングにとって好適であると記載されている。しかしながら、各プローブの試験の前にサイズ排除クロマトグラフィー工程を適用しなければならず、これは時間消費的であり、大量の材料を必要とする。
De Lorimierら(2002)は、様々な環境感受性フルオロフォアで改変および標識された小分子リガンドに結合する細菌タンパク質に基づくバイオセンサーのファミリーを記載している。リガンド結合の際に、フルオロフォアはその放射波長および／または強度を変化させ、かくして、プローブに結合した特異的リガンドの存在および／または濃度を示す。しかしながら、キナーゼの標識および特異的阻害剤のスクリーニングにおける前記キナーゼの使用は、開示も示唆もされていない。
好ましい実施形態においては、前記キナーゼはセリン／トレオニンキナーゼまたはチロシンキナーゼである。
別の好ましい実施形態においては、前記キナーゼはp38α、MEKキナーゼ、CSK、Auroraキナーゼ、GSK-3β、cSrc、EGFR、Abl、DDR1、LCKまたは別のMAPKである。
マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼ(EC 2.7.11.24)は、細胞外刺激(マイトジェン)に応答し、遺伝子発現、有糸分裂、分化、および細胞生存／アポトーシスなどの様々な細胞活性を調節するセリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼである。細胞外刺激は、MAPキナーゼ、MAPキナーゼキナーゼ(MKKもしくはMAP2K)およびMAPキナーゼキナーゼキナーゼ(MKKKもしくはMAP3K、EC 2.7.11.25)から構成されるシグナル伝達カスケード(「MAPKカスケード」)を介してMAPキナーゼの活性化を誘導する。
細胞外刺激により活性化されたMAP3Kは、そのセリンおよび／またはトレオニン残基上でMAP2Kをリン酸化した後、このMAP2Kはそのセリンおよび／またはチロシン残基上でリン酸化を介してMAPキナーゼを活性化する。このMAPキナーゼシグナル伝達カスケードは、酵母から哺乳動物まで進化的に高度に保存されている。
現在まで、MAPKの6種の異なる群が哺乳動物において特性評価されている。
1. 細胞外シグナルにより調節されるキナーゼ(ERK1、ERK2)。ERK(古典的MAPキナーゼとしても知られる)シグナル伝達経路は、増殖因子およびホルボールエステル(腫瘍プロモーター)に応答して優先的に活性化され、細胞増殖および細胞分化を調節する。
2. ストレス活性化タンパク質キナーゼ(SAPK)としても知られる、c-Jun N末端キナーゼ(JNK)(MAPK8、MAPK9、MAPK10)。
3. p38アイソフォームは、p38α(MAPK14)、p38β(MAPK11)、p38γ(MAPK12もしくはERK6)およびp38α(MAPK13もしくはSAPK4)である。JNKおよびp38シグナル伝達経路は両方とも、サイトカイン、紫外線照射、熱ショック、および浸透圧ショックなどのストレス刺激に応答し、細胞分化およびアポトーシスに関与する。p38αMAPキナーゼ(MAPK)は、RKまたはCSBPとも呼ばれ、サイトカインおよびストレスに対する細胞応答を制御するシグナル伝達カスケードに参加する酵母HOGキナーゼの哺乳動物相同分子種である。SAPK/JNK経路と同様、p38 MAPキナーゼは、浸透圧ショック、炎症性サイトカイン、リポポリサッカリド(LPS)、紫外線および増殖因子などの様々な細胞ストレスにより活性化される。p38 MAPキナーゼは、Thr180およびTyr182でのリン酸化により活性化される。
4. 最近発見されたERK5(MAPK7)は、増殖因子およびストレス刺激の両方により活性化され、細胞増殖に関与する。
5. ERK3(MAPK6)およびERK4(MAPK4)は、活性化ループ中にSEG(セリン-グルタミン酸-グリシン)モチーフを有し、C末端伸長においてのみ大きな差異を示す構造的に関連する特殊なMAPKである。
6. ERK7/8(MAPK15)は、MAPKファミリーの最も最近発見されたメンバーであり、ERK3/4と同様に振舞う。
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼをリン酸化するキナーゼのファミリーを形成する。それらはMAP2Kとしても知られ、EC 2.7.12.2として分類される。7個の遺伝子が存在する。これらの遺伝子は、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K5(MKK5)、MAP2K6(aka MKK6)、MAP2K7(MKK7)をコードする。p38(MKK3およびMKK4)、JNK(MKK4)、およびERK(MEK1およびMEK2)の活性化因子は、独立したMAPキナーゼシグナル伝達経路を規定する。
AuroraキナーゼA(Aurora、Aurora-2、AIK、AIR-1、AIRK1、AYK1、BTAK、Eg2、MmIAK1、ARK1およびSTK15としても知られる)、B (Aurora-1、AIM-1、AIK2、AIR-2、AIRK-2、ARK2、IAL-1およびSTK12としても知られる)およびC (AIK3としても知られる)は、サイトカイン生成および脱調節された染色体断片化などのいくつかの生物学的プロセスに関与する。有糸分裂のこれらの重要な調節因子は、多様な固形腫瘍において過剰発現される。セリン／トレオニンキナーゼのこのファミリーの1つのメンバーであるヒトAurora Aは、膵臓癌における薬剤標的として提唱されている。Aurora Aの三次元構造の最近の決定は、Auroraキナーゼが活性化ループ領域の周辺でユニークなコンフォメーションを示すことを示している。この特性は、新規抗発癌因子としても機能し得るAuroraキナーゼの阻害剤の探索および開発を促進させてきた。
グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)は、セリン／トレオニンキナーゼ活性に加えて、チロシン残基上で自己リン酸化するユニークな能力を有するセリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。GSK-3による標的タンパク質のリン酸化は通常、その活性を阻害する(グリコーゲンシンターゼおよびNFATの場合)。GSK-3は、通常は標的タンパク質を最初にリン酸化した後、GSK-3が標的タンパク質をさらにリン酸化することだけができる「プライミングキナーゼ」を必要とする点で特殊なキナーゼである。哺乳動物においては、GSK-3は2個の公知の遺伝子、GSK-3αおよびβによりコードされる。胚発生の間のパターン形成および細胞増殖における役割とは別に、細胞分裂およびアポトーシスの調節を介する腫瘍形成における役割に関する最近の証拠が存在する。ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β(GSK3β)は、肥満、糖尿病、アルツハイマー病および双極性障害などのいくつかの病態生理学的状態にも関連する。
癌原性チロシンキナーゼのSrcファミリーは、細胞運動および増殖にとって中心的なインテグリン依存的シグナルを伝達する。Srcファミリーは9個のメンバー：Src、Lck、Hck、Fyn、Blk、Lyn、Fgr、Yes、およびYrkを含む。これらのキナーゼは、細胞増殖および分裂が脱調節された疾患としての癌に関する現代の理解にとって役立ってきた。cSrc癌原遺伝子は、cSrcチロシンキナーゼをコードする。そのキナーゼドメインとは別に、cSrcはさらにSH2ドメインとSH3ドメインから構成され、Srcキナーゼドメインとの多酵素複合体の形成のためのアダプタータンパク質として働く。これらのドメインは、cSrcキナーゼドメインの自己阻害にも関与する。この遺伝子における突然変異は、癌細胞の悪性進行に関与し得る。このタンパク質は、負に調節する部位として働くヒト白血球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(Lck)上のTyr-504残基を特異的にリン酸化する。それはまた、LynおよびFynキナーゼ上でも働くことができる。
白血球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(Lck)は、T細胞などのリンパ球の内部に認められるタンパク質である。Lckは、リンパ球の細胞内シグナル伝達経路に関与する特定のタンパク質のチロシン残基をリン酸化するチロシンキナーゼである。LckのN末端尾部はミリストイル化およびパルミトイル化されており、タンパク質を細胞の原形質膜に繋ぐ。このタンパク質はさらにSH3ドメイン、SH2ドメインおよびC末端部分にはチロシンキナーゼドメインを含む。Lckにより開始されたチロシンリン酸化カスケードは、カルシウムイオン(Ca2+)の細胞内移動およびリンパ球内の重要なシグナル伝達カスケードの活性化に終わる。これらのものとしては、NFAT、NFκB、およびAP-1などの特定の転写因子を活性化するようになり、次いで、過剰の遺伝子産物、最も顕著には、活性化リンパ球の長期増殖および分化を促進するインターロイキン-2などのサイトカインの産生を調節するRas-MEK-ERK経路が挙げられる。Lckの異常な発現は、胸腺腫瘍、T細胞白血病および結腸癌と関連してきた。
Srcファミリーのチロシンキナーゼの触媒活性は、C末端Srcキナーゼ(Csk)により触媒される、C末端近くに位置するチロシン残基(cSrc中のTyr527)上でのリン酸化により抑制される。多くのチロシンキナーゼの乱雑さを考慮すれば、SrcファミリーキナーゼのC末端尾部がCskの唯一の公知の標的であることは注目に値する。CskとcSrcとの相互作用は、srcキナーゼにとっても最も代表的である可能性が高く、Cskの活性部位の端のcSrcのC末端尾部に位置する。Cskは、基質を認識する多くのチロシンキナーゼにより用いられる従来の基質結合部位が、活性化ループ中の欠失によりCsk中で脱安定化されるため、このドッキング機構を欠く基質をリン酸化することができない(Levinson, 2008)。
上皮増殖因子受容体(EGFR；ErbB-1；ヒトにおいてはHER1)は、上皮増殖因子ファミリー(EGF-ファミリー)の細胞外タンパク質リガンドのメンバーのための細胞表面受容体である。上皮増殖因子受容体は、4種の密接に関連するチロシンキナーゼ：EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)およびHer4(ErbB-4)のサブファミリーであるErbBファミリーの受容体の一員である。活性EGFRはダイマーとして生じる。EGFRダイマー化は、細胞外受容体ドメインに結合するリガンドにより誘導され、その固有の細胞内タンパク質-チロシンキナーゼ活性を刺激する。結果として、EGFRのC末端(細胞内)ドメイン中でのいくつかのチロシン残基の自己リン酸化が起こる。この自己リン酸化は、それ自身のホスホチロシン結合SH2ドメインを介してリン酸化されたチロシンと結合するいくつかの他のタンパク質による下流の活性化およびシグナル伝達を引き出す。EGFRのキナーゼドメインはまた、それが凝集した他の受容体のチロシン残基を交叉リン酸化することができ、それ自身、その様式で活性化することができる。EGFRシグナル伝達カスケードは、いくつかの下流のシグナル伝達タンパク質を活性化し、次いで、いくつかのシグナル伝達カスケード、主にMAPK、AktおよびJNK経路を開始させ、DNA合成および細胞増殖を誘導する。そのような経路は、移住、接着、および増殖などの表現型を調節する。EGFR過剰発現(上方調節として知られる)または過剰活性をもたらす突然変異は、いくつかの癌と関連してきた。結果として、EGFRの突然変異はいくつかの型の癌において同定され、それは拡張クラスの抗癌療法の標的である。
ABL1-癌原遺伝子は、細胞分化、細胞分裂、細胞接着およびストレス応答のプロセスに関与する細胞質および核のタンパク質チロシンキナーゼをコードする。c-Ablタンパク質の活性は、そのSH3ドメインにより負に調節される。SH3ドメインの遺伝子欠失は、ABL1を癌遺伝子に変化させる。(9;22)遺伝子転座により引き起こされるこの遺伝子欠失は、慢性骨髄性白血病の多くの事例に存在するBCR(MIM:151410)とABL1遺伝子の頭部-尾部融合をもたらす。普遍的に発現されるABL1チロシンキナーゼのDNA結合活性は、CDC2を介するリン酸化により調節され、ABL1に関する細胞周期機能を示唆している。
DDR1またはCD167a(分化167aのクラスター)としても知られる、ジスコイジンドメイン受容体ファミリーメンバー1は、正常な上皮細胞および形質転換された上皮細胞において広く発現され、様々な型のコラーゲンにより活性化される受容体チロシンキナーゼ(RTK)である。このタンパク質は、その細胞外ドメイン中のジクチオステリウム・ジスコイデウム(Dictyostelium discoideum)タンパク質ジスコイジンIと類似する相同領域を有するチロシンキナーゼ受容体のサブファミリーに属する。その自己リン酸化は、今まで試験した全てのコラーゲン(I型からVI型まで)により達成される。in situ試験およびノーザンブロット分析により、このコードされたタンパク質の発現が、特に、腎臓、肺、胃腸管、および脳中の上皮細胞に限定されることが示された。さらに、このタンパク質は、乳腺、卵巣、食道、および小児の脳に由来するいくつかのヒト腫瘍において有意に過剰発現される。
上記のキナーゼは、その全部が、現在では好適な治癒が得られないか、または治療計画の改良が望まれる癌などの疾患の発生に関与するため、好ましい実施形態である。
構造情報が入手可能であったキナーゼであるp38αを用いて、本発明者らは、スクリーニング目的での本発明の標識されたキナーゼの適用可能性を証明した。予想外にも、このキナーゼを、最少の努力で標識するために調製することができただけでなく、標識されたキナーゼが所望の特性を示す、すなわち、導入された標識が特異的阻害剤、この場合、公知の阻害剤であるBIRB-796およびいくつかのより小さいBIRB-796類似体の結合により誘導されたコンフォメーション変化の検出にとって好適であることがわかった。
本発明に従うその標識された形態で特異的阻害剤のためのスクリーニングに適用することができるさらなるキナーゼは、cSrcである。cSrcのためのII型およびIII型阻害剤が両方とも同定され、その薬理学的プロフィールを改良して、実施例に詳述されるようなより強力な阻害剤を取得することができた。
まとめると、チロシンおよびセリン／トレオニンキナーゼなどの様々なクラスのキナーゼと共に作用する本発明の標識原理の適用可能性が、本発明者らにより示された。
別の好ましい実施形態においては、遊離チオールまたはアミノ基を有するアミノ酸は、システイン、リジン、アルギニンまたはヒスチジンである。
システインは遊離チオール基を有するが、リジン、アルギニンまたはヒスチジンはそれぞれ少なくとも1個の遊離アミノ基を有する。
別の好ましい実施形態においては、活性化ループの外側に存在する1個以上の溶媒露出されたシステインが欠失または置換されている。
遊離チオールまたはアミノ基を有する2個以上のアミノ酸が目的のキナーゼ中に存在する場合、活性化ループ中のアミノ酸の特異的標識は可能でなくてもよい。従って、上記で考察されたように、遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸を、欠失させるか、またはそれらが溶媒露出されると予測されるか、もしくは示される場合、遊離チオールもしくはアミノ基を有さない別のアミノ酸で置換すべきである。目的のキナーゼ中に天然に存在し、溶媒露出したシステインを、活性化ループの外側に配置することができ、その場合、それらを欠失させるか、または遊離チオール基を有さない別のアミノ酸で置換すべきである。これは遊離アミノ基を有するアミノ基にも同等に適用され、次いで、反応性の遊離アミノ基を有さないアミノ酸で置換すべきである。遊離アミノ基を有する2個以上のアミノ酸が既に活性化ループ中に存在する場合、標識しようとするアミノ酸に加えて、遊離アミノ基を有し、活性化ループ中に存在するアミノ酸を置換または欠失させるべきであり、キナーゼに対するこれらの突然変異のいずれもその触媒活性を阻害しないか、またはその安定性に干渉しない。
用語「溶媒露出」とは、それが一部であるタンパク質の三次元構造の文脈におけるアミノ酸の位置を指す。タンパク質本体内に埋まっているアミノ酸は他のアミノ酸により完全に取り囲まれており、かくして溶媒と全く接触しない。対照的に、溶媒露出したアミノ酸は、周囲の溶媒に部分的または完全に露出しており、かくして、それらを潜在的に改変することができる化合物に接近可能である。これは、例えば、遊離チオールまたはアミノ基を有する溶媒露出したアミノ酸と反応することができる本発明において用いられるチオールまたはアミノ反応性標識にも適用される。
用語「欠失」とは、アミノ酸を別のアミノ酸と置換することなく、そのアミノ酸を切り出すことを指すが、用語「置換」とはアミノ酸の別のアミノ酸との置換を指す。アミノ酸を別のアミノ酸と置換するか、または欠失させる場合、置換または欠失させようとするアミノ酸を、欠失または置換されたアミノ酸が、触媒活性が阻害されたキナーゼをもたらさず、得られるキナーゼの安定性にも干渉しないように選択するのが好ましい。
より好ましい実施形態においては、キナーゼはp38αであり、システインを配列番号1の位置172に導入し、好ましくは、配列番号1の位置119および162のシステインを、セリンなどの遊離チオール基を有さない別のアミノ酸と置換する。配列番号1の位置172に導入される前記システインは、標識しようとするアミノ酸である。
別のより好ましい実施形態においては、キナーゼはcSrcであり、システインを配列番号2の位置157(野生型cSrcの位置407)に導入し、好ましくは、配列番号2の位置27、233および246(野生型cSrcの位置277、483および496)のシステインを、別のアミノ酸と置換する。配列番号2の位置157に導入される前記システインは、標識しようとするアミノ酸である。
一般的には、アミノ酸置換は保存的であるべきである。システインについては、これは、それをセリンと置換するのが好ましいことを意味する。一般的には、アミノ酸の異なるアミノ酸との置換を、PAM250スコアリングマトリックスを用いて、それらが保存的であるかどうかを評価することができる。このマトリックスは、整列されたペプチド配列をスコア化して、これらの配列の類似性を決定するのに用いられることが多い(Pearson, 1990)。
上記のように、天然に存在しない場合、遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸を、キナーゼの活性化ループ中に導入しなければならない。p38αの場合、活性化(DFG-in)および不活性化(DFG-out)状態の両方におけるp38αの利用可能な結晶構造を用いて、構造研究を実行した。p38αは活性化ループ中にシステインを有さない。上記の構造研究により、活性化ループ中に位置する、位置172でのアラニンのシステインによる置換が、キナーゼの触媒活性または安定性に影響しないことが示唆された。
同じ研究により、配列番号1の位置119および162の2個のシステインが両方とも溶媒露出していることが示された。活性化ループ中に位置しない2個のさらなるシステインについて記録されたシグナルの潜在的な干渉を回避するために、これらの2個のシステインを、別のアミノ酸、好ましくは、セリンなどの、サイズおよび構造が類似したアミノ酸と置換するのが好ましい。
p38αと相同なキナーゼを用いる場合、システインと置換しようとするアミノ酸の位置は、配列番号1の位置172と一致してもよい。キナーゼ中の位置が配列番号1の位置172に一致することを決定するために、配列番号1と用いられるキナーゼの配列アラインメントを、例えば、CLUSTALWなどの公共的に利用可能なプログラムを用いて行うことができる(Larkinら、2007)。
別の好ましい実施形態においては、チオールまたはアミノ反応性フルオロフォアは、2個の置換基のうちの1個がチオールまたはアミノ反応部分である環境的に感受性の二置換ナフタレン化合物である。用語「環境的に感受性」とは、1種以上の波長でのその蛍光放出における変化またはその完全な放出スペクトルで表されるその環境における状態に対するフルオロフォアの感受性を示す。そのような変化を引き起こす状態は、例えば、活性化ループ中の極性の変化またはコンフォメーション変化である。
上記の型のフルオロフォアは、典型的には、周囲の環境の極性に応じて、放出波長における強度およびシフトの両方の変化を示す。このクラスのフルオロフォアの例としては、6-アクリロイル-2-ジメチルアミノナフタレン(Acrylodan)、6-ブロモアセチル-2-ジメチルアミノ-ナフタレンバダン(Badan)、2-(4'-(ヨードアセタミド)アニリノ)ナフタレン-6-スルホン酸、ナトリウム塩(IAANS)、2-(4'-マレイミジルアニリノ)ナフタレン-6-スルホン酸、ナトリウム塩(MIANS)、5-((((2-ヨードアセチル)アミノ)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸(1,5-IAEDANS)および5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホニルアジリジン(ダンシルアジリジン)またはその誘導体が挙げられる。
その環境感受性のために用いることができる他のフルオロフォアは、クマリンに基づく化合物、ベンゾキサジアゾールに基づく化合物、ダポキシルに基づく化合物、ビオサイチンに基づく化合物、フルオレセイン、スルホン化ローダミンに基づく化合物、例えば、AlexaFluor染料(Molecular Probes)、Attoフルオロフォア(Atto Technology)またはLucifer Yellowである。クマリンに基づくフルオロフォアは、環境に対して中程度に感受性であり、7-ジエチルアミノ-3-(4'-マレイミジルフェニル)-4-メチルクマリン(CPM)が一例である。ベンゾキサジアゾールフルオロフォアも、タンパク質-フルオロフォアコンジュゲートを形成させるために一般的に用いられ、例えば、7-フルオロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-スルホンアミド(ABD-F)およびN-((2-(ヨードアセトキシ)エチル)-N-メチル)アミノ-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾールエステル(IANBD)と共に強い環境依存性を有する。PyMPOマレイミド(チオール用)またはスクシンイミドエステル(アミン用)および様々な他のダポキシル染料は、良好な吸収性および例外的に高い環境感受性を有する。その例は、1-(2-マレイミジルエチル)-4-(5-(4-メトキシフェニル)オキサゾール-2-イル)ピリジニウムメタンスルホナート(PyMPO-マレイミド)、1-(3-(スクシンイミジルオキシカルボニル)ベンジル)-4-(5-(4-メトキシフェニル)オキサゾール-2-イル)ピリジニウムブロミド(PyMPO-スクシンイミジルエステル)およびダポキシル(2-ブロモアセタミドエチル)スルホンアミドである。しかしながら、そのより長く、より可撓性の構造に起因して、これらのプローブは選択された標識部位に応じて活性化ループ移動を行うことができる。添付の実施例に示されるように、ピレンを標識として用いることができるが、それは好ましいものであると証明できなかった。上記物質の適用可能性は個々のキナーゼおよび標識しようとするアミノ酸の位置に依存し、それらは原理的には標識として、同様に、それらが本発明の方法における感度の低下を引き起こし得るいくつかの場合でも適用することができる。上記物質と好適なキナーゼとの合致化を、
本発明の教示と共に日常的な手順を用いて当業者によって実施することができる。一般的には、それがキナーゼの触媒活性を阻害せず、またはその安定性に干渉しない限り、任意のフルオロフォアを用いることができる。
さらに好ましい実施形態においては、チオール反応性スピン標識は、窒素酸化物ラジカルである。
スピン標識を用いてタンパク質配列を部位特異的に標識するための有力な方法は、スピン標識されたシステイン側鎖、CYS-SL：
MeS(O)2SSR + R'SH ---> R'SSR + MeS(O)2SH
(式中、Rは窒素酸化物基であり、R'SHはシステインスルフヒドリルを有するタンパク質であり、R'SSRはスピン標識されたタンパク質である)
を与える、メタンチオスルホナートスピン標識とシステインとの反応である。標識のためのシステインを、固相技術または標準的な組換えDNA技術を介して所望の配列位置に入れる。
本発明はさらに、(a)本発明に従う蛍光もしくはスピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼを提供すること；(b)該蛍光もしくはスピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼと、候補阻害剤とを接触させること；(c)励起の際に工程(a)および工程(b)の蛍光標識されたキナーゼの1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルを記録すること；または(c)'工程(a)および工程(b)のスピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼの電子常磁性共鳴(EPR)もしくは核磁気共鳴(NMR)スペクトルを記録すること；ならびに(d)工程(c)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルまたは工程(c)'で記録されたEPRもしくはNMRスペクトルを比較することを含み、工程(c)で得られた蛍光標識されたキナーゼの少なくとも1個の波長、好ましくは、最大放出での蛍光強度の差異および／もしくはスペクトル中の蛍光放出波長におけるシフト、または工程(c)'で得られたスピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼのEPRもしくはNMRスペクトルにおける変化が、候補阻害剤がキナーゼ阻害剤であることを示す、キナーゼ阻害剤のスクリーニングのための方法に関する。
キナーゼ阻害剤は、キナーゼの活性を阻害することができる物質である。例えば、それらがアロステリック阻害剤(III型)であるか、またはATP結合部位に隣接するアロステリック部位に結合し、ATP結合ポケット中に到達するもの(II型)である場合、それらは単一のキナーゼの作用をより特異的に阻害することができる。あるいは、特に、阻害剤が、タンパク質キナーゼ間で非常に保存されるATP結合ポケットにのみ結合する場合(I型)、その阻害剤は、いくつかのタンパク質キナーゼの作用を阻害することができる。
候補阻害剤は、小さい有機もしくは無機分子、タンパク質もしくはペプチド、DNAもしくはRNAなどの核酸などの様々なクラスの化合物に属してもよい。そのような化合物は、分子ライブラリー中に存在するか、またはスクラッチから設計することができる。本発明に従う小分子は、最大で2000 Da、好ましくは最大で1500 Da、より好ましくは最大で1000 Daおよび最も好ましくは500 Daの分子量を有する分子を含む。
通常、1個以上の波長での蛍光放出シグナルまたはスペクトルの記録を、蛍光分光計または蛍光光度計を用いて達成する。蛍光分光法もしくは蛍光光度法もしくは蛍光分光分析は、サンプルに由来する蛍光、または他の放出された光を分析する電磁気学的分光法の型である。それは、特定の分子中の電子を励起し、それらに弛緩の際により低いエネルギーの光、典型的には、必須ではないが、可視光線を放出させる、光、通常は紫外線のビームを用いることを含む。
2つの一般的な型の装置が存在し、両方とも本発明の方法において用いることができる：濾過蛍光光度計は、フィルターを使用して入射光と蛍光を単離するが、蛍光分光計は回折格子モノクロメーターを使用して入射光と蛍光を単離する。両方の型とも以下のスキームを用いる：励起源に由来する光はフィルターまたはモノクロメーターを通過し、サンプルを打つ。入射光の一部はサンプルにより吸収され、サンプル中のいくらかの分子は蛍光を発する。蛍光はあらゆる方向に放出される。この蛍光のいくらかは、2番目のフィルターまたはモノクロメーターを通過し、通常は、検出器に到達する入射光の伝送または反射の危険性を最小化するために入射光ビームに対して90°に置かれた検出器に到達する。レーザー、光ダイオード、およびランプ；特に、キセノンおよび水銀蒸気ランプなどの様々な光源を励起源として用いることができる。検出器は単チャンネルであっても多チャンネルであってもよい。単チャンネル検出器は、同時に1個の波長の強度を検出することができるだけであるが、多チャンネル検出器はあらゆる波長の強度を同時に検出し、放出モノクロメーターまたはフィルターを必要としない。様々な型の検出器は利点も欠点も有する。2個のモノクロメーターと連続励起光源を備えた最も多用途の蛍光光度計は、励起スペクトルと蛍光スペクトルの両方を記録することができる。蛍光スペクトルを測定する場合、励起光の波長を、好ましくは高吸収の波長で一定に保持し、放出モノクロメーターがスペクトルを走査する。励起スペクトルを測定するためには、放出フィルターまたはモノクロメーターを通過する波長を一定に保持し、励起モノクロメーターが走査する。一般的には、励起スペクトルは吸収スペクトルと同一であるが、これは蛍光強度が吸光度に比例するからである(概論については、Rendell, 1987; SharmaおよびSchulman, 1999；GauglitzおよびVo-Dinh, 2003; Lakowicz, 1999を参照されたい)。
核磁気共鳴(NMR)は、原子核の量子力学的磁気特性に基づく物理的現象である。奇数のプロトンまたはニュートロンを含む全ての核は、固有の磁気モーメントと角運動量を有する。最も一般的に測定される核は、水素(1H)(天然存在度で最も受容的なアイソトープ)および炭素(13C)であるが、多くの他の元素のアイソトープ(例えば、113Cd、15N、14N、19F、31P、17O、29Si、10B、11B、23Na、35Cl、195Pt)に由来する核も観察することができる。特定の物質に関するNMR共鳴振動数は、ラーモア歳差周波数に関する式に従って、印加された磁界の強度に正比例する。NMRは、磁性核と印加された一定の磁界とを整列させ、直交する変化する磁界を用いてこのアラインメントを摂動させることにより磁性核を測定する。摂動する磁界に対する得られる応答は、NMR分光法および磁気共鳴画像化において活用される現象であり、非常に強力な印加された磁界を用いて、高いスペクトル解像度を達成する(その詳細はthe chemical shift and the Zeeman Effectにより記載されている)。
本発明においては、活性化ループ中の好適なアミノ酸を、アイソトープまたは富化されたアイソトープを含むチオール／アミン反応性小分子で標識することができる。この場合、唯一のシグナルは活性化ループ上の富化された分子から生じ、これは選択された標識部位に応じてタンパク質コンフォメーションに感受性である。
好ましいアイソトープは、1Dまたは2D NMRスペクトルとして測定することができる13C、15Nなどである。例えば、阻害剤の結合に起因するタンパク質コンフォメーションの変化は、標識に対応するNMR化学シフトのシフトをもたらすであろう。
上記で簡単に説明された、電子常磁性共鳴(EPR)または電子スピン共鳴(ESR)分光法は、有機および無機フリーラジカルまたは遷移金属イオンを有する無機複合体などの1個以上の非対電子を有する化学種を研究するための技術である。EPRの基本的な物理的概念は、核磁気共鳴(NMR)のものと同様であるが、それは原子核のスピンの代わりに励起される電子スピンである。最も安定な分子は全てその電子対を有するため、EPR技術はNMRよりもあまり広くは用いられていない。しかしながら、常磁性体種に対するこの制限は、通常の化学溶媒およびマトリックスはEPRスペクトルを生じないため、EPR技術が非常に高い特異性のものであることをも意味する。
EPR技術はスピン標識を利用する。この場合、試験しようとするキナーゼを、13Cおよび15Nなどのアイソトープの存在下で細菌または他の好適な宿主細胞中で発現させ、それが発現される時に全タンパク質を通したこれらのアイソトープの取込みをもたらす。アイソトープ富化されたタンパク質を精製した後、スピン標識を上記のように活性化ループに結合させる。この場合、タンパク質中のアイソトープの2D NMRスペクトルを記録する。活性化ループおよびスピン標識がコンフォメーションを変化させるため、スピン標識は取り込まれたアイソトープから生じるいくらかのタンパク質シグナルの変化を誘導し、阻害剤が結合するにつれて活性化ループまたはスピン標識とより近くで接触するようになるであろう。ピークはスピン標識が近づくにつれてより広くなるであろう。
工程(c)もしくは(c)'で得られた異なるEPRスペクトルもしくは1個以上の波長、好ましくは最大放出での異なる蛍光放出シグナル、または異なる蛍光放出スペクトルは、候補化合物の結合により引き起こされたキナーゼのコンフォメーション変化を示す。これは、ATP結合ポケットに隣接するアロステリック部位、およびいくつかの場合、ATP結合ポケット自体への化合物の結合が、DFGモチーフの摂動、活性化ループのコンフォメーション変化、極性変化および／または結合したスピン標識中の自由電子と、隣接する原子の核との相互作用の変化をもたらすという事実に起因する。EPRもしくはNMRスペクトルまたは蛍光放出の比較の際に、本発明の方法は、候補化合物が、好適なキナーゼ阻害剤、例えば、高親和性の阻害剤だけでなく、1つのキナーゼの活性を特異的に阻害するものとして適しているかどうかを示す。候補阻害剤を用いずにキナーゼについて記録されたデータと、前記候補阻害剤と接触させたキナーゼについて記録されたデータとを比較する。蛍光放出シグナルの場合、1個以上の特定の波長でのシグナルを記録および比較し、特定の波長でのシグナルの強度の変化の検出を可能にすることができる。あるいは、完全なスペクトルを記録および比較し、最大放出波長の変化の観察についても可能にすることができる。
好ましくは、前記方法を高効率形式で行う。高効率アッセイは、生化学アッセイ、細胞アッセイまたは他のアッセイとは無関係に、一般的には、各プレートが96、384または1536個のウェルを含んでもよいマイクロタイタープレートのウェル中で実施することができる。本発明の標識されたキナーゼを含有するアッセイ混合物と共に、周囲温度以外の温度でのインキュベーション、および試験化合物、この場合、推定阻害剤との接触などのプレートの取り扱いは、ピペッティング装置などの1個以上のコンピューター制御されたロボット系により行うのが好ましい。試験化合物の大きいライブラリーをスクリーニングし、および／またはスクリーニングを短時間で行おうとする場合、例えば、10、20、30、40、50または100種の試験化合物の混合物を各ウェルに添加することができる。ウェルが阻害活性を示す場合、試験阻害剤の前記混合物を脱複雑化して、前記活性を生じる前記化合物中の1個以上の試験阻害剤を同定することができる。
あるいは、各試験阻害剤を異なる濃度で適用する、ただ1個の阻害剤をウェルに添加してもよい。例えば、試験阻害剤を、異なる濃度で2、3または4個のウェル中で試験することができる。この初期スクリーニングにおいて、濃度は広範囲、例えば、10 nM〜10μMを含んでもよい。初期スクリーニングは、ヒット、すなわち、適用された少なくとも1種の濃度、好ましくは、2種、より好ましくは、全ての濃度で阻害活性を示す試験阻害剤であって、阻害活性を検出することができる濃度がより低い範囲にある場合、ヒットがより有望である前記ヒットを発見するのに役立つ。この代替法は、本発明に従う1つの好ましい実施形態として役立つ。
次いで、ヒットと考えられる試験阻害剤を、さらにより広い範囲の阻害剤濃度、例えば、10 nM〜20μMを用いてさらに試験することができる。これらの測定のために適用される方法を以下で説明する。
本発明はさらに、キナーゼ阻害剤のリガンド結合および／または結合もしくは解離の速度を決定する方法であって、(a)本発明に従う蛍光標識されたキナーゼと、様々な濃度の阻害剤とを接触させること；または(a)'阻害剤に結合した本発明に従う蛍光標識されたキナーゼと、様々な濃度の未標識のキナーゼとを接触させること；(b)励起の際に各濃度の阻害剤および／もしくは未標識のキナーゼについて、蛍光標識されたキナーゼの1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルを記録すること；(c)工程(b)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルから、各濃度についての速度定数を決定すること、または(c1)各濃度の阻害剤について、工程(b)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルからKdを決定すること；または(c2)各濃度の未標識のキナーゼについて、工程(b)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルから、KaもしくはKdの逆数を決定すること；(d)工程(b)で得られた異なる濃度の阻害剤についてのシグナルもしくはスペクトルから、工程(c)で決定された速度定数からkonを直接決定すること、および／もしくはkoffを外挿すること；または(d)'工程(b)で得られた異なる濃度の未標識のキナーゼについてのシグナルもしくはスペクトルから、工程(c)で決定された速度定数からkoffを直接決定すること、および／もしくはkonを外挿すること；ならびに必要に応じて、(e)工程(d)もしくは(d)'で得られたkonおよびkoffから、Kdおよび／もしくはKaを算出することを含む前記方法に関する。
標識されたキナーゼを様々な濃度の阻害剤と接触させた後、適用された各濃度について蛍光放出を決定することにより、阻害剤の結合親和性を測定することができる。各濃度について、結合した阻害剤と未結合の阻害剤の比率は異なっているであろうが、これは阻害剤の濃度だけでなく、前記阻害剤の前記キナーゼへの特異的結合親和性の増加を反映している。
結合した阻害剤を含む標識されたキナーゼを、阻害剤が結合していない未結合のキナーゼを用いて滴定することにより、反対の手法を行うことができる。
化学反応速度論においては、速度定数κは、化学反応の速度を定量化する。物質AおよびBが反応してCを生成する化学反応については、反応速度は式：
Figure 2011528560
(式中、k(T)は温度に依存する反応速度定数である)
を有する。
[A]および[B]はそれぞれ、溶液の体積あたりのモルで表される物質AおよびBの濃度であり、この反応が溶液の体積を通して起こっていると仮定している。指数mおよびnは次数であり、反応機構に依存する。それらを実験的に決定することができる。
また、一段階反応を、式：
Figure 2011528560
のように記載することもできる。
Eaは活性化エネルギーであり、Rは気体定数である。温度Tで、分子はBoltzmann分布に従うエネルギーを有するため、e-Ea/RTと共に変化するEaより大きいエネルギーでの衝突の割合を予想することができる。Aは指数前因子または頻度因子である。
konおよびkoffは、非共有平衡結合を記載する定数である。リガンドが受容体と相互作用する場合、または基質が酵素と相互作用する場合、結合は質量作用の法則に従う。
Figure 2011528560
この式においては、Rは遊離受容体の濃度であり、Lは遊離リガンドの濃度であり、RLは受容体-リガンド複合体の濃度である。酵素反応速度論の場合、Rは酵素であるか、またはこの場合、タンパク質キナーゼであり、Lは基質であるか、またはこの場合、候補もしくは既知の阻害剤である。結合速度定数konは、M-1秒-1の単位で表される。RL形成の速度は、R x L x konに等しい。解離速度定数koffは秒-1の単位で表される。RL解離の速度は、RL x koffに等しい。平衡では、後方(解離)反応は、前方(結合)反応に等しい。結合試験は、RLの尺度である特異的結合を測定するものである。酵素反応速度アッセイは、酵素-基質複合体の濃度であるRLに比例する酵素速度を評価するものである。
Figure 2011528560
平衡解離定数Kdは、モル濃度単位で表され、
Figure 2011528560
に到達する等しいkoff/konと定義される。
解離定数(Kd)は、特定のタンパク質上の結合部位が半分占有されるリガンドの濃度(L)、すなわち、リガンドが結合したタンパク質の濃度(RL)がリガンドが結合していないタンパク質の濃度(R)と等しいリガンドの濃度と一致する。解離定数が小さくなるほど、リガンドにより固く結合するか、またはリガンドとタンパク質の親和性が高くなる。
従って、Kdの逆数とも呼ばれる結合定数Kaは、1/kdと定義される。特定のリガンド-タンパク質相互作用に関する解離定数は、溶液の状態(例えば、温度、pHおよび塩濃度)と共に有意に変化し得る。
順序立った工程を本発明の上記方法で行うかに応じて、KdまたはKaを直接的または間接的に測定することができる。
KdまたはKaを直接測定するためには、それぞれ、この型の測定のための最後の工程である工程(c1)または(c2)が工程(b)に続く。この型の測定をエンドポイント測定と呼び、添付の実施例にも例示される。速度定数を用いる計算によってKdまたはKaを間接的に決定するのと違って、時間にわたる蛍光変化よりもむしろ、平衡における最終的な蛍光放出を測定する。これらの測定値を用いて、異なる阻害剤濃度(Kdの決定のため)または未標識のキナーゼの濃度(Kaの決定のため)を用いて結合曲線を作製することができる。これらの曲線から、KdまたはKaを直接取得することができる。
KdまたはKaを間接的に取得するためには、工程(b)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルまたはスペクトルに由来する速度定数を、工程(c)で行われるように各濃度について決定しなければならない。滴定の型に応じて、すなわち、阻害剤を用いる標識されたキナーゼの滴定または未標識のキナーゼを用いる阻害剤に結合した標識されたキナーゼの滴定に応じて、konまたはkoffを、測定された速度定数から直接決定することができる。konを決定するために、koffの外挿も可能にする工程(d)を適用する。従って、順にkonの外挿を可能にするkoffを直接決定するために、工程(d)'を適用する。工程(d)または(d)'で得られたkonおよび／またはkoffから、Kdおよび／またはKaを、上記で考察された式に従って算出することができる。
上記方法を、高効率スクリーニングにおいて適用することもできる。キナーゼに対する阻害活性を示す化合物を、例えば、本発明のキナーゼ阻害剤のスクリーニング方法を用いて同定した場合、本発明の方法を用いて前記阻害剤をさらに特性評価することができる。例えば、高効率形式を用いて、複数の異なる濃度の阻害剤(変形(a)もしくは、未標識のキナーゼ(変形(b))について1個以上の波長での蛍光放出シグナルからKaまたはKdを決定することができる。試験しようとする濃度範囲は、例えば、10 nM〜20μMに達し、濃度間で1、2および5回の反復(すなわち、10、20、50、100、200、500 nMなど)を評価する。
異なる実施形態において、本発明は、キナーゼ阻害剤の解離または結合を決定する方法であって、(a)本発明に従うスピン標識された、もしくはアイソトープ標識されたキナーゼと、様々な濃度の阻害剤とを接触させること；または(a)'阻害剤に結合した本発明に従うスピン標識された、もしくはアイソトープ標識されたキナーゼと、様々な濃度の未標識のキナーゼとを接触させること；(b)各濃度の阻害剤および／もしくは未標識のキナーゼについて、前記スピン標識された、もしくはアイソトープ標識されたキナーゼのEPRもしくはNMRスペクトルを記録すること；ならびに(c)様々な濃度の阻害剤について、工程(b)で記録されたEPRもしくはNMRスペクトルからKdを決定すること；または(c)'様々な濃度の未標識のキナーゼについて、工程(b)で記録されたEPRもしくはNMRスペクトルからKaを決定することを含む、前記方法に関する。
蛍光標識されたキナーゼを用いる速度定数の決定に関してさらに上記で開示された方法と同様、本発明の方法は、キナーゼおよび阻害剤の反応に関する結合または解離定数の直接的決定を可能にする。蛍光標識されたキナーゼと違って、装置的な限界およびNMRおよびEPR測定値を収集するのに必要な時間は、多くの場合、阻害剤結合の速い時間規模と適合性ではなく、konまたはkoffの直接的決定を可能にしない。キナーゼに結合するのに数時間必要とする化合物の決定も可能であってよい。
動力学データの決定に関する本発明の方法を、高効率形式に適用することもできる。例えば、上記の本発明のスクリーニング方法を用いて同定された潜在的な阻害剤を、様々な濃度の前記阻害剤をキナーゼに適用して、Kdを決定する点でさらに特性評価することができる。限定されるわけではないが、好適な阻害剤の濃度範囲は、10 nM〜20μMである。
高効率形式で適用されるより集中的な濃度範囲は、例えば、konおよびkoffを決定することにより、添付の実施例で行われるようなキュベット手法およびリアルタイム速度測定を用いて、より高感度のKd測定値を得るのに役立ち得る。
本発明はさらに、キナーゼ阻害剤のスクリーニングにとって好適な突然変異キナーゼを作製する方法であって、(a)存在する場合、活性化ループの外側に目的のキナーゼ中に存在する遊離チオールもしくはアミノ基を有する溶媒露出したアミノ酸、または活性化ループ内の好適でない位置に遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸を、遊離チオールもしくはアミノ基を有さないアミノ酸と置換すること；(b)遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸が活性化ループ中に存在しない場合、目的の前記キナーゼの活性化ループ中のアミノ酸を、遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸に突然変異させること；(c) フルオロフォア、スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化された標識がキナーゼの触媒活性を阻害せず、および／もしくはその安定性に干渉しないように、目的のキナーゼを、その環境における極性変化に対して感受性のチオールもしくはアミノ反応性フルオロフォア、チオール反応性スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化されたチオールもしくはアミノ反応性標識で標識すること；(d)工程(c)で得られたキナーゼと、該キナーゼの既知の阻害剤とを接触させること；ならびに(e)励起の際に工程(c)および(d)の蛍光標識されたキナーゼの1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルを記録すること、または(e)'工程(c)および(d)のスピン標識されたキナーゼのEPRもしくはNMRスペクトルを記録すること；ならびに(f)工程(e)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルまたは工程(e)'で記録されたEPRもしくはNMRスペクトルを比較することを含み、工程(e)で得られた蛍光標識されたキナーゼの少なくとも1個の波長、好ましくは最大放出での蛍光強度の差異および／もしくはスペクトルにおける蛍光放出波長のシフト、または工程(e)'で得られたスピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼのEPRもしくはNMRスペクトルの変化が、前記キナーゼがキナーゼ阻害剤のスクリーニングにとって好適であることを示す、前記方法に関する。
高効率形式に適用して、複数のキナーゼまたは同じキナーゼの異なるように標識された変形をスクリーニングすることができる。
本発明に従う用語「好適でない位置」とは、本発明に従って標識されたアミノ酸にとって好適ではないことが示された活性化ループ中の位置を指す。これは、その環境中での変化に対する標識の感度の低下または前記位置が感度が低下した標識を有するキナーゼをもたらす構造的考慮に基づく予測に起因し得る。この用語はまた、潜在的に好適な位置に位置するアミノ酸であって、異なる位置がより好適であると見なされる前記アミノ酸も包含する。活性化ループ中の遊離チオールまたはアミノ基を有するアミノ酸数が1を超えるとすぐに、好適でないと見なされるアミノ酸を突然変異させるべきである。
アミノ酸を突然変異させることは、その突然変異が阻害された触媒活性または得られるキナーゼの安定性との干渉をもたらさないという条件で、該アミノ酸を欠失させること、または該アミノ酸を別のアミノ酸と置換することを含む。遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸が目的の前記キナーゼの活性化ループ中に存在しない場合、工程(b)を実行する。挿入されたか、または別のアミノ酸と置換するアミノ酸は、標識されるためには遊離チオールまたはアミノ基を有する必要がある。
本発明の方法の好ましい実施形態においては、前記キナーゼ阻害剤は、キナーゼのATP結合部位に隣接するアロステリック部位にのみ結合するか、またはアロステリック部位からATP部位に向かって伸長する。これらの型の阻害剤はまた、それぞれ、III型またはII型阻害剤とも呼ばれる。それらは、あらゆるキナーゼ間で構造において高度に保存された、キナーゼのATPポケットに結合するI型阻害剤と比較して、より高い特異性でキナーゼに結合する。
実施例に示されるように、本発明は、特異的阻害剤の迅速な選択を可能にする、ATP競合阻害剤と非ATP競合阻害剤とを区別するための手段を提供する。本発明は、キナーゼの活性化ループの動きを検出するように設計され、従って、全てのII型およびIII型阻害剤に対して感受性である。特定のI型阻害剤は全く検出されないか、または高濃度でのみ弱く検出されるが、これらの阻害剤のいくらかは強固な蛍光変化を誘導した。時間にわたる蛍光変化の唯一の測定(すなわち、エンドポイント測定ではない)は、I型阻害剤を識別できる。以下の実施例の1つに提示されるように、検出されたATP競合阻害剤は、即時的な蛍光変化(典型的には5〜10秒未満)をもたらすが、II型およびIII型阻害剤は非常によりゆっくり結合する(数秒から数分)。
本発明の方法のキナーゼの別の好ましい実施形態においては、キナーゼを、活性化ループ中に天然に存在するかまたは導入したシステインで標識する。タンパク質中のシステインの量は通常非常に低く、本発明のキナーゼを、活性化ループ中のアミノ酸をシステインと置換し、必要に応じて、溶媒露出したシステインを他のアミノ酸と置換することにより直接的な様式で調製することができる。ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンまたはその誘導体などの反応性アミンを含むアミノ酸は、非常により豊富であり、それらが周囲の溶媒と接触するタンパク質表面に容易に見出される。かくして、導入されたシステインと特異的に反応することができるチオール反応性標識を用いるのが好ましい。
より好ましい実施形態においては、キナーゼ阻害剤のスクリーニング方法または突然変異キナーゼの作製方法はさらに、工程(c1)工程(c)で記録された2個の波長の蛍光強度比を測定し、平均強度変化に対する正規化強度変化の比(ΔIstd)を取得することを含む。さらに、またはあるいは、結合した阻害剤を含む本発明に従って標識されたキナーゼと、阻害剤を含まないものとの最大標準強度変化(ΔRmax)を評価することができる。(ΔIstd)が0.25より大きい、および／または(ΔRmax)が0.75より大きい、ならびにZ因子が0.5より大きい場合、候補化合物をキナーゼ阻害剤と考えるか、または蛍光標識されたキナーゼをキナーゼ阻害剤のスクリーニングにとって好適であると考える。この実施形態は、上記の高効率スケールへの本発明の方法の拡張に関する。
ΔIstdは、正規化された強度変化と、蛍光放出の平均強度の比である。Lorimierら(2002)に従えば、ΔIstdは、高感度蛍光分光法にとって好適であるとして蛍光タンパク質コンジュゲートを特性評価するための最も重要な基準の1つである。理想的には、ΔIstdは0.25を超える値を有するべきであり、
Figure 2011528560
(式中、λstd＝(λmax、未結合＋λmax、飽和)／2であり、I1、I2はそれぞれ各スペクトルのλstdでの蛍光強度である)
により算出される。
ΔRmaxは、飽和および不飽和キナーゼ間の蛍光放出の最大標準強度変化である(REF)。de Lorimierら(2002)に従えば、ΔRmaxは、高感度蛍光分光法にとって好適であるとして蛍光タンパク質コンジュゲートを特性評価するための別の重要な基準である。理想的には、ΔRmaxは1.25を超える値を有するべきであり、
Figure 2011528560
(式中、oA1、oA2は、リガンドの非存在下での面積であり、∞A1、∞A2は飽和リガンドの存在下での面積である)
により算出される。コンピュータープログラムを用いて、2個のスペクトル中の波長バンドの全ての可能な対についてΔRを数えて、最適な検出条件を同定し、ΔRの最大値と定義する。
Z因子は、高効率スクリーニング(HTS)アッセイの質または力の統計学的尺度である。HTSキャンペーンにおいては、未知のサンプルの多数の単一の尺度を、よく確立された陽性および陰性対照サンプルと比較して、存在する場合、単一の尺度が陰性対照と有意に異なるかどうかを決定する。大規模なスクリーニングキャンペーンを開始する前に、多くの作業を行って、より小さい規模でアッセイの質を評価し、アッセイが高効率設定において有用であるかどうかを予測する。Z因子は、アッセイが数百万のサンプルにスケールアップした場合に有用なデータを予想することができるかどうかを予測する。Z因子は、
Figure 2011528560
(式中、陽性(p)および陰性(n)対照の両方の平均(μ)および標準偏差(σ)の両方(それぞれμp、σp、μn、σn)を考慮する)
により算出される。
ΔIstdおよびΔRmaxの測定ならびにZ因子の決定は、選択された標識が阻害剤のスクリーニングにおいて好適であるかどうかを決定するのに有用であることがわかっている。De Lorimierは、測定された動力学および蛍光タグ付タンパク質を用いて得られたKdが、用いたタンパク質、リガンドおよびフルオロフォアに依存するであろうと考察している。従って、同じキナーゼに結合する同じ阻害剤でも、用いた標識に応じて異なるKd値を与えることがある。上記値の決定は、選択された標識が好適であるかどうか、または異なる標識を用いるべきであるかどうかを示唆し得る。
さらに好ましい実施形態においては、フルオロフォアまたはスピン標識は、標識されたキナーゼ中に存在することが知られるか、または予測されるリン酸化部位に、またはその近くに位置しない。これは、標識が活性化ループの力学またはリン酸化および脱リン酸化により大きく影響されるキナーゼの正常な活性および調節と干渉しないことを確保する。
別の好ましい実施形態においては、活性化ループ中の前記候補アミノ酸を、前記キナーゼについて利用可能な構造および／または配列データに基づいて同定する。いくつかのキナーゼについては、例えば、結晶またはNMR構造の形態の構造データが利用可能であり、ここでキナーゼは活性化および／または不活性化された状態で捕捉される。そのようなデータがキナーゼについて利用可能である場合、これにより、標識目的のために置換しようとする活性化ループ中のアミノ酸位置の選択が容易になる。実際の選択は、キナーゼのアロステリック部位からの位置の距離ならびに前記位置のアミノ酸と他のアミノ酸との接触に基づく。前記接触がキナーゼの触媒活性または安定性にとって必須であると見なされる場合、その位置は多くの場合、置換にとって好適ではない。さらに、この選択は、特定のアミノ酸が、より大きい距離が環境変化を検出する機会を増加させるような、タンパク質変化コンフォメーションとして移動する距離に基づく。しかしながら、移動した距離は、特定の位置が標識にとって有用であるかどうかの指示因子ではあるが、それは結合した標識により検出される観察された変化と直接相関するであろう環境における実際の変化である。
好ましい実施形態においては、阻害剤のスクリーニング、結合および解離などの動的パラメーターの決定ならびに突然変異キナーゼの作製に関する本発明の方法を組合わせて、異なるキナーゼに関する特異的阻害剤を取得するための直接的方法を取得する。これに関して、本発明の方法の任意の好ましい実施形態を、本発明の他の方法の(好ましい)実施形態と組合わせることができる。この態様のより好ましい実施形態においては、初期スクリーニングを、キナーゼ阻害剤に関する高効率スクリーニングの方法を用いて実行した後、リガンド結合および／または結合もしくは解離の速度を決定するための本発明の方法と共に様々な濃度の阻害剤を用いてスクリーニングする。特に、後者の工程を実行して、KdおよびKa値の示唆を得る。KdまたはKaのより正確な測定のためには、より集中的な濃度範囲を用いて測定を実行することにより、この工程を再度反復する。これらの測定を、キュベット手法(実施例に記載)を用いる連続滴定および／またはキュベット中でのリアルタイム動的測定(konおよびkoff)として実行して、それぞれの阻害剤をさらに特性評価することができる。必要に応じて、この一連の方法を、他のキナーゼまたは示差的に標識された同じキナーゼに移す。この実施形態を、高効率スクリーニングが、複数のキナーゼまたは示差的に標識された同じキナーゼの変異体において多数の阻害剤をスクリーニングし、特性評価することができるように設計する。
より具体的には、そのような組合せ方法は、キナーゼのATP結合部位に隣接するアロステリック部位に部分的または完全に結合するキナーゼ阻害剤を同定する方法であって、(a)本発明のキナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法に従って阻害剤をスクリーニングすること、および(b)工程(a)で同定された阻害剤の速度定数を決定することを含み、工程(b)で決定された0.140 s-1未満の速度定数が、同定されたキナーゼ阻害剤がキナーゼのATP結合部位に隣接するアロステリック部位に部分的または完全に結合することを示す前記方法である。0.140 s-1未満の速度定数は、同定されたキナーゼ阻害剤が、ATP結合部位中に結合し、隣接するアロステリック部位に伸長していないことを示す。速度定数は、反応時間(結合の速度)t1/2と相関する：t1/2＝In(2)/kobs。従って、0.140 s-1未満の速度定数(kobs)は、5秒未満の反応時間t1/2に相当する。
速度定数または結合速度を、本発明の標識されたキナーゼの特性を用いて決定するのが好ましい。例えば、本発明のキナーゼを阻害剤と接触させ、標識に応じて、1個以上の波長での蛍光標識されたキナーゼの蛍光放出シグナルまたはスピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼの電子常磁性共鳴もしくは核磁気共鳴スペクトルを時間に対して記録することができる。これは、本発明のキナーゼ阻害剤のリガンド結合および／または結合もしくは解離の速度を決定する方法の工程(a)〜(c)または本発明のキナーゼ阻害剤の解離もしくは結合を決定する方法の工程(a)および(b)に相当する。結合の速度、すなわち、蛍光またはNMRもしくはEPRスペクトルの測定可能な変化が、阻害剤の適用後5秒未満である場合、これは阻害剤がII型またはIII型阻害剤であることを示す。
キナーゼ阻害剤のスクリーニングのための方法の別の好ましい実施形態においては、前記方法はさらに、(続いて)前記キナーゼの阻害剤として同定された候補化合物の薬理学的特性を最適化することを含む。
一般的にはリード化合物と呼ばれる、スクリーニングで同定された化合物の薬理学的特性の最適化のための方法は、当業界で公知であり、リード化合物として同定された化合物を改変して、(a)作用部位、活性スペクトル、器官特異性の改変、および／または(b)効力の改良、および／または(c)毒性の低下(治療指数の改善)、および／または(d)副作用の減少、および／または(e)治療作用の開始、効果期間の改変、および／または(f)薬物動態パラメーター(吸収、分布、代謝および排出)の改変、および／または(g)物理化学的パラメーター(溶解性、吸湿性、色、味、臭い、安定性、状態)の改変、および／または(h)一般的特異性、器官／組織特異性の改善、および／または(i)a.カルボキシル基のエステル化、もしくはb.カルボン酸によるヒドロキシル基のエステル化、もしくはc.例えば、リン酸、ピロリン酸もしくはリン酸もしくはヘミコハク酸へのヒドロキシル基のエステル化、もしくはd. 製薬上許容し得る塩の形成、もしくはe. 製薬上許容し得る複合体の形成、もしくはf. 薬理学的に活性なポリマーの合成、もしくはg. 親水性部分の導入、もしくはh.芳香族もしくは側鎖上の置換基の導入／交換、置換基パターンの変化、もしくはi.イソスターもしくはバイオイソスター部分の導入による改変、もしくはj.相同化合物の合成、もしくはk.分枝状側鎖の導入、もしくはl.環状類似体へのアルキル置換基の変換、もしくはm.ケタール、アセタールへのヒドロキシル基の誘導体化、もしくはn.アミド、フェニルカルバメートへのN-アセチル化、もしくはo. Mannich塩基、イミンの合成、もしくはp. ケトンもしくはアルデヒドのSchiff塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジンもしくはその組合せへの転換による適用形態および経路の最適化を達成する方法を含む。
上記の様々な工程は、当業界で一般的に公知である。それらは、定量的構造活性相関(QSAR)分析(Kubinyi、「Hausch-Analysis and Related Approaches」、VCH Verlag, Weinheim, 1992)、コンビナトリアル化学、古典的化学など(例えば、Holzgrabe and Bechtold, Deutsche Apotheker Zeitung 140(8), 813-823, 2000を参照)を含むか、またはそれらに依存する。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
(実施例)
好適なキナーゼの選択
本発明者らは、以下の理由でこのアッセイを開発するためにp38αを用いて作業することを選択した：i)利用可能な構造情報が豊富である、ii)その活性および不活性コンフォメーションの両方で結晶構造が利用可能である(図1A)、ならびにiii)固く結合するII型およびIII型アロステリック阻害剤が入手可能である。第一の工程においては、p38αの結晶構造を密接に試験して、アロステリック結合剤を検出する好適なフルオロフォア結合部位を同定した。この突然変異のための候補残基を溶媒露出させて、Michael付加によるフルオロフォアの結合を可能にし、リガンド結合の際に有意な移動を示さなければならない。また、タンパク質の安定性、触媒活性を維持するのに重要な残基または既知のリン酸化部位の周辺の残基を選択しないように注意を払った。活性化ループのN末端近くの位置を選択した後、システイン残基に突然変異させた(図1B、C)。その比較的小さいサイズ(トリプトファン側鎖と比較した場合)、極性変化に対するその高い感受性、その商業的な利用可能性および比較的低い価格のため、アクリロダンをフルオロフォアとして選択した。アクリロダンは強固な応答をもたらすことも知られており、アロステリック阻害剤の結合の際に活性化ループの移動を検出するべきである(図1D)。タンパク質を標識する前に、任意の他の溶媒露出したシステイン残基へのフルオロフォアの結合機会を減少させることが必要であった。再度、構造情報を用いて、p38α中に4個の減少したシステイン残基を配置した。これらのシステインのうちの2個は、タンパク質内に埋まっているが、他の2個は溶媒露出しており、セリンに保存的に突然変異させた。最後に、F327L突然変異を組込んで、必要に応じて、酵素活性アッセイにおける使用のためにアクリロダン標識されたp38α(ac-p38α)を部分的に活性化した(Askariら、2007；Avitzourら、2007)が、アッセイ自体の機能にとって必要ではない。
タンパク質標識および蛍光特性評価
タンパク質標識
合計4個の突然変異(標識のための2個のシステイン→セリン、およびシステインの導入)を含むN末端GST-p38α構築物を、BL21(DE3)大腸菌株中に形質転換し、過剰発現させ、アフィニティクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した後、純粋なタンパク質を標識のために用いた。タンパク質および遊離アクリロダンを1:1.5の比で混合し、暗室中、4℃で一晩反応させた。コンジュゲートされたタンパク質(ac-p38α)を濃縮し、分注し、-20℃で凍結した。100％のタンパク質のモノ標識をESI-MSにより検証した。正確に標識されたシステインの確認を、HPLCおよびESI-MSまたはMALDIの組合せ後、未標識および標識p38αのトリプシン断片を分析することにより現在実施している。
蛍光特性評価
標識後、プローブの蛍光特性を特性評価し、ピラゾロウレアII型アロステリック阻害剤、BIRB-796の様々な誘導体を用いて初期実験を実行した(Pargellisら、2002；Dumasら、2000(aおよびb)；Mossら、2007；Reganら、2002；Reganら、2003)。活性化ループ上で標識されたac-p38αタンパク質は、リガンド結合と共に468 nmから514 nmへの強い赤色シフトを示す(図2)。468 nmでの大きな変化は、単一波長測定を可能にする。しかしながら、2個の波長の比(R＝514 nm/468 nm)の測定は、異なるサンプル間の希釈誤差を排除することができる。これらの2個の波長を用いて、平均強度と比較した正規化された強度変化(ΔIstd)は0.50と決定され、飽和および不飽和ac-p38α間の最大標準強度変化(ΔRmax)は1.24であった。これらのものは、蛍光分光法のための最も重要な基準の2つであり(de Lorimierら、2002)、0.80のZ因子と共に両方の値は、これを蛍光アッセイにおける使用のための好適なプローブと特性評価する。以下に提示される全てのさらなる研究は活性化ループ上でタグ付けられたac-p38αに関する。
この標識戦略をp38αのP-ループ上の位置にも適用したが、このプローブの蛍光応答はアロステリック阻害剤のためのスクリーニングアッセイにおける使用にとっては理想的ではないと特性評価された。しかしながら、このプローブがリガンドの非存在下でのp38αの活性および不活性状態間の平衡に関する有用な情報を提供し得ると示唆するデータ中にいくつかの証拠がある。この標識されたタンパク質に関するさらなる実験は依然として進行中である。
キナーゼ発現および精製
p38α構築物をpOPINEベクター中にクローニングし、BL21(DE3)大腸菌中にPrecision Protease切断部位を用いてN末端Hisタグ構築物として形質転換した。培養物を0.6のOD600まで37℃で増殖させ、RTまで30分で冷却した後、1 mM IPTGで誘導し、160 rpmで振とうしながら18℃で一晩(約20時間)発現させた。細胞をバッファーA(50 mM Tris pH 8.0、500 mM NaCl + 5％グリセロール + 25 mMイミダゾール)中で溶解し、30 mLのNiカラム(自己包装)上に充填し、3 CVのNiバッファーAで洗浄した後、2 CVにわたってNiバッファーB(NiバッファーA + 500 mMイミダゾール)を用いて0〜50％線状勾配で溶出した。透析バッファー(50 mM Tris pH 7.5、5％グリセロール、150 nM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT)中、4℃で一晩、12〜30 mL容量の10-MWCO透析カセット(Thermo Scientific)中でPreScission Protease (50μg/mL最終濃度)と共にインキュベートすることにより、タンパク質を切断した。次いで、タンパク質を約13,000 rpmで15分間遠心分離して、切断工程の間に形成され得る任意の沈降物を除去した。次いで、上清を取り、陰イオンバッファーA(50 mM Tris pH 7.4、5％グリセロール、50 mM NaCl、1 mM DTT)中で少なくとも4倍に希釈し、1 mlのSepharose Q FFカラム(GE Healthcare)上に充填し、10 CVの陰イオンバッファーAで洗浄した。タンパク質を20 CVにわたって0〜100％の線状勾配の陰イオンバッファーB(陰イオンバッファーA + 600 mM Nacl)で溶出させた。タンパク質をプールし、2 mLに濃縮し、2 mL/分の流速で、サイズ排除バッファー(20 mM Tris pH 7.4、5％グリセロール、200 mM NaCl、1 mM DTT)で平衡化させたSephadex HiLoad 26/60 Superdex 75カラムを通過させた。次いで、溶出したタンパク質を約10 mg/mLに濃縮し、分注し、-80℃で凍結した。
ニワトリcSrc遺伝子(残基251-533；配列番号2)を細菌発現のためにコドン使用最適化し、合成した(Geneart AG, Regansburg, Germany)。ニワトリcSrc遺伝子をpOPINFベクター中にクローニングし、PreScission Protease切断部位を含むN末端Hisタグ構築物を作製した。プラスミドを発現のためにBL21(DE3)コドン+RIL大腸菌中に形質転換した。簡単に述べると、200 rpmで振とうしている培養物を、約0.2のOD600に達するまでTB培地(1％w/vグルコース、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを含む)中で増殖させた。次いで、培養物を1時間、20℃に冷却した後、0.3 mM IPTGで誘導した。発現を20℃で一晩(約20時間)継続させた。タンパク質を、PreScission Protease(50μg/mL最終濃度)を用いてN末端Hisタグを切断する以外は、以前に記載のもの(Gschwindら、2004)と同様のプロトコルを用いて精製した。サイズ排除後、溶出したタンパク質を、サイズ排除バッファー(50 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl、5％v/vグリセロール、1 mM DTT)中で約10 mg/mLに濃縮し、分注し、-80℃で凍結した。
リアルタイム測定
ポリスチレンキュベット(4個の透明な側面)を用いて、100 nMのac-p38αに様々な濃度のBIRB-796を送達することにより、阻害剤結合のリアルタイム測定を実施した。ミニ攪拌棒を各キュベットの底に入れて、キュベットの上部に位置する注入ポートを通して阻害剤を送達する際の急速な混合を確保した。阻害剤の添加後、468 nmでの蛍光放出は一次動力学と共に用量依存的様式で減少した(図3AおよびC)。これらの型の実験により、速度定数(kobs)が得られ、これをプロットし、直線適合させて、各化合物のkon(傾き)およびkoff(y-切片)を得ることができる(図3BおよびD)。この手法を用いて得られたBIRB-796に関するkon(kon = 2.57 x 104 M-1s-1)は、公開された値(Pargellisら、2002；Sullivanら、2005)と類似しているが、見積もられたkoffは他の方法により測定されたもの(Pargellisら、2002；Sullivanら、2005)よりも1〜2桁速かった(koff = 3.45 x 10-4s-1)。そのような測定のための条件は現在さらに最適化されている(バッファー、温度、タンパク質および阻害剤の濃度、インキュベーションの長さ)。
そのような速度測定はこの研究において試験した全ての蛍光p38αコンジュゲートについて可能であった(実施例5および14を参照)。これらの型の測定は、蛍光応答の可逆性を証明し、DFG-inとDFG-outコンフォメーション間に存在する平衡の変化を証明している。
阻害剤と共に結合したac-p38αの懸濁液に過剰の未標識タンパク質を添加することによりkoffを直接測定する現在の試みが、現在進行中である(実施例7を参照)。また、ac-p38αと阻害剤の新しい調製物を用いて、いくつかのさらなるkon測定を実施した。
エンドポイント測定
384穴プレート形式にスケーリングする前に、条件を最適化することができるまで(バッファー、温度、タンパク質および阻害剤の濃度、インキュベーションの長さ)、キュベット中で初期Kd測定を実行した。単純な結合平衡実験を行って、p38αに結合するBIRB-796のKdを決定した。50 nMのac-p38αおよび様々な濃度のBIRB-796(1〜100 nM)を含む個々のキュベットを、4℃で一晩インキュベートし、24、48、72および96時間後に測定した。本発明者らは、BIRB-796のKdが、他で報告されたように(Pargellisら、2002)、時間依存的であり、II型阻害剤についてはより長いインキュベーション時間が必要であることを見出した。全てのIII型阻害剤は一晩のインキュベーションのみを要した。
Figure 2011528560
各サンプルの放出スペクトルを測定し、蛍光比(R)を算出し、プロットして、不活性状態におけるac-p38αの飽和を示し(図3EおよびG)、または対数尺度でプロットしてKdを決定した(図3FおよびH)。p38αのアロステリック部位に対する親和性を変化させた群において合成された15種の化合物のフォーカスピラゾロウレアライブラリーについても同様の実験を行った。それらの化合物およびそのKd値を表1に列挙する。このプローブを用いて決定されたKd値は、公開された値((Pargellisら、2002；Dumasら、2000(aおよびb)；Mossら、2007；Reganら、2002；Reganら、2003；Sullivanら、2005)から10倍も変化し、最も大きい差異は10 nM未満の公開されたKdを有する化合物について生じた。しかしながら、そのKd値は文献に認められるものと同じ傾向に従う。アッセイ中のac-p38αの濃度を低下させると最も固く結合する化合物について得られた値を改善する可能性が高いが、50 nM濃度のプローブが、高いシグナルノイズ比で再現可能なデータを取得するのに用いることができる下限であると決定された。また、これらの化合物に関する全ての公開されたKd値が速度定数(koff/kon)から算出されたものであり、直接測定されたものではないことも注目に値する。
さらなる化合物へのエンドポイント測定の拡張
いくつかのさらなるII型阻害剤を、エンドポイント測定を用いて試験して、p38αへの結合のKdを得た。これらの化合物の最も重要な特徴は、それらがアッセイを最初に特性評価するのに用いた本発明者らの多くの他の化合物のピラゾロウレア足場を共有していないことである。これは、蛍光の変化がタンパク質コンフォメーションの変化にのみ依存し、結合した薬剤足場に依存しないことを証明することに対する決定的な工程であった。
特に重要なことは、それぞれ、EGFRおよびAbl/PDGFRキナーゼの選択的で強力なII型阻害剤である薬剤ラパチニブ(Tykerb)およびイマチニブ(Gleevec)について得られた結果である。ac-p38αへのこれらの化合物の添加は、蛍光の変化またはいずれかの化合物に関する測定可能なKdをもたらさなかった。しかしながら、よく知られたbRafおよびVEGFR2阻害剤であるソラフェニブ(Nexavar)の添加は、p38αへのアロステリック結合を示唆する強い蛍光応答をもたらした。これらの化合物について得られたデータを図4に示す。
Ambit Biosciencesの科学者による最近の刊行物では、38種の既知のキナーゼ阻害剤を、317種のキナーゼの一団に対してスクリーニングし、標的でないキナーゼに結合する阻害剤を定量する試みにおいてKd値を測定した(Karamanら、2008)。彼らは、ラパチニブおよびイマチニブはp38αに結合しないが、ソラフェニブは約370 nMのKdで結合することを見出した。ソラフェニブは、このアッセイを立証するための別の薬剤足場の最初のアロステリック化合物であった。ソラフェニブのKdは、他のII型阻害剤と同様、時間依存的であり、それぞれ、6および24時間のインキュベーション時間の後に115 nMおよび56 nMのKd値をもたらすことがわかった。これらの値は、その意図されるキナーゼ標的であるbRafおよびVEGFR2に対するソラフェニブの公開されたKdと類似している。p38αへの結合に関するAmbitの研究で得られたより高いKd値は、阻害剤およびタンパク質を1時間だけインキュベートしたそのスクリーニングの標準条件の結果であるようである。
II型p38阻害剤としてのソラフェニブの検証
本発明者らの新しいアッセイ手法が、p38αのDFG-outコンフォメーションへのソラフェニブの結合を正確に報告していたことを確認するために、本発明者らは、それを野生型p38αと共結晶化させ、2.1Åの解像度まで構造を解像した。本発明者らは、ソラフェニブがDFG-outコンフォメーション中でp38αの活性化ループを有するII型結合様式を採用することを見出した。ソラフェニブのハロゲン化フェニル部分は、アロステリック部位にあり、へリックスCのGlu71は両方の尿素窒素との対称性水素結合対を形成する。Met109の主鎖NH(ヒンジ領域)とフェノキシ酸素を含む阻害剤の水素結合(2.7Å)のN-メチル-カルボキサミドは、Thr106のOγ(3.6Å)(門番残基)に接近し、Leu104(3.3Å)およびAla51(2.8Å)およびThr106のOγ(3.3Å)の主鎖カルボニルと水素結合することもできる水分子(3.4Å)を配位させる。水を介する水素結合を介するソラフェニブと門番との相互作用は他では報告されておらず、それによりさらなる阻害剤の最適化を可能にする。p38αおよびb-Rafと複合体化したソラフェニブの構造アラインメントは、この阻害剤がb-Raf中のヒンジ領域に向かってより引かれて、Cys531の主鎖(p38α中のMet109)と2個の水素結合を形成することを示している。p38α複合体においては、キナーゼのヒンジ領域は、伸長したコンフォメーションを採用し、ソラフェニブのN-メチルカルボキサミド置換ピリジン環はそのフェノキシ部分の周囲で180°回転し、ここでキナーゼのN突出部に向かい、ヒンジ領域から遠くに向かう。この移動はピリジン環をDFG-モチーフのPhe169の側鎖の近くに位置させ、静電的相互作用(両方のπ電子系のedge-to-face方向)を可能にし、これはこの相互作用に関するさらなる安定化の役割を示唆している。本明細書で提示されるp38αとの複合体にあるいくつかのII型阻害剤間のこのクロストークは、不活性キナーゼコンフォメーションを誘導するだけでなく、ATP結合部位内で直接的にPhe169と相互作用することによりそれを安定化する阻害剤の開発のためのさらなる機会を提供し得る。
蛍光の可逆性 - ATPおよび阻害剤解離の効果
キナーゼのDFG-inおよびDFG-outコンフォメーションは力学的平衡であると考えられるため、アロステリック結合剤の存在下で観察される蛍光変化の可逆性を証明することが重要であった。本発明者らは、細胞内濃度のATP(5 mM)の存在下および非存在下で1、RL8に関する滴定曲線を取得した。1、RL8は本発明者らの化合物集団中で最も弱いアロステリック結合剤であり、高濃度のATPによりキナーゼと競合する可能性が高く、キナーゼをよりDFG-inコンフォメーションに向かってシフトさせるため、それを選択した。予想通り、1、RL8の結合曲線は、ATPの存在により有意に影響を受け、1.62μMのより高く測定されたKdをもたらした。
次いで、別のセットの測定を試みて、阻害剤解離を誘導することにより蛍光変化の可逆性を証明した。アロステリック結合剤を添加し、ac-p38αと平衡化させた後、468 nmでアクリロダンの蛍光をモニターしながら、10倍過剰量の非標識p38αをキュベットに添加した。過剰のキナーゼの添加は、阻害剤の再分布を引き起こし、ac-p38αからの阻害剤の正味の解離および蛍光の増加をもたらし、これを一次関数に適合させた。10倍過剰量の未標識キナーゼは、解離速度がタンパク質からの真のkoffを反映することを確保するために用いた標準的なプロトコルである(Hibbsら、2004)。より少量の未標識キナーゼの添加は、阻害剤の解離を効率的に強制しないようであり、人工的により遅い解離速度をもたらす。通常、アロステリック阻害剤の添加は、ac-p38αの場合、蛍光の減少をもたらす。BIRB-796および1、RL8の解離の測定を図5(図面中ではRL8はMG001と呼ばれる)に示し、BIRB-796については図29および30に示す。
これらの測定されたkoff値は、BIRB-796および1、RL8の両方について、Pargellisらにより公開されたものと10倍異なる(Pargellisら、2002)。より具体的には、MG001の解離速度は、本発明者らのアッセイにおいては10倍より速いが、BIRB-796のものは10倍より遅い。本発明者らは、これらの差異が、ピラゾロウレア化合物の解離を、排除するものとして、p38α-特異的ATP競合阻害剤であるSKF86002を用いることにより測定するPargellisらにより用いられた型のアッセイの結果である。結合の際に、SKF86002は蛍光性になり、それによってBIRB-796解離をモニターする方法を提供する。しかしながら、この阻害剤は約180 nMのKdを有し(Pargellisら、2002)、従って、活性化ループをDFG-inコンフォメーションに向かってシフトさせることにより、BIRB-796(約0.1 nMの公開されたKd)よりも1、RL8(約1.16μMの公開されたKd)とより効率的に競合する。PargellisらはkonおよびkoffからKdを算出するため、SKF86002によるBIRB-796の非効率的な置換は、算出されたKd値が速度定数を得た条件により曝されるため、より低い見かけのKdをもたらすであろう。
ac-p38α、BIRB-796および1、RL8の新しい調製物を用いて、より最近の測定を実施して、各阻害剤の解離速度のいくつかの報告された測定を行った(図3および以下の表5を参照)。koffは、BIRB-796については5.1±0.5 x 10-5s-1(n=3)であり、MG001については7.1±3.2 x 10-3s-1(n=3)であることがわかった。また上記のように、BIRB-796の場合、koffは代替的な方法およびアッセイ条件を用いてBIRB-796について他の場所で公開されたもの(Pargellisら、2002)と10倍異なる。1、RL8の場合、koffは以前に報告された値(Pargellisら、2002)とは100倍異なる。図3と共に実施例4およびここで実施例7に示された速度定数の差異を、用いた異なるac-p38αタンパク質調製物により説明することができる。ac-p38αおよび(Pargellisら、2002)の方法を用いて決定された速度定数の差異は、上記のように、速度定数を得るのに用いた異なるアッセイ系(SKF86002競合アッセイ)および条件により説明される。
動力学 - k on の決定
アロステリック化合物のkoffを測定した後、本発明者らは同じ化合物のkonを測定するための条件を確立した。様々な濃度の阻害剤をac-p38αに添加し、蛍光崩壊を一次関数に適合させることにより、キュベット方法を用いてこれを達成した。次いで、特定用量の阻害剤に関する蛍光崩壊の観察された速度定数(kobs)を、阻害剤濃度に対してプロットした。確立された条件下で、阻害剤をac-p38αとモル等量で添加し(1-4:1阻害剤：タンパク質)、その結果は典型的にはR2>0.99で線状に適合させることができる直線である。これらの条件は、単一の結合部位を有するタンパク質に対するリガンドのkonを測定するために他の場所で用いられたもの(Hibbsら、2004)と同様である。この線の傾きは、キナーゼへの阻害剤の結合に関するkonを与える。BIRB-796および1、RL8に関するkonの決定を、図6に示す(図面中ではRL8をMG001と呼ぶ)。
これらの測定されたkon値は、BIRB-796および1、RL8の両方について、Pargellisらにより公開されたものと100倍異なる(Pargallisら、2002)。しかしながら、その研究で報告されたように、これらの2種の阻害剤のkonは互いに非常に類似している。本発明者らも観察し、上記したように、それらのKd値の差異は、主にkoffの差異に起因するものである。ac-p38α、BIRB-796およびMG001の新しい調製物を用いてより最近の測定を実施して、結合のいくつかの報告された測定を行った(以下の表5を参照)。konはBIRB-796および1、RL8について、それぞれ4.3±0.8 x 103M-1s-1(n=3)および6.6±1.2 x 103M-1s-1(n=3)であると決定された。実施例7に記載のkoffの最新の測定と同様、BIRB-796および1、RL8のkon値は、SKF86002置換アッセイを用いて他の場所で得られた値(Pargellisら、2002)と、それぞれ10倍および100倍異なる。
興味深いことに、本発明者らは、BIRB-796に関するSKF86002置換アッセイを実施することもできたが、Pargellisらにより得られたkon値を再現することはできなかった。しかしながら、本発明者らのac-p38αアッセイと同様の条件(タンパク質および阻害剤の量、バッファー、温度および混合条件)を用いて、ならびに同じ比率のp38α：SKF86002を用いて、本発明者らは1.00 x 103M-1s-1のSKF86002アッセイからkonを取得したが、これはac-p38αを用いて得られた値と非常に良好に比較可能である。これは、リガンドの結合および解離に関する速度定数を決定するための様々なアッセイ系の使用に関して実施例7に記載の問題を強調するものである。
konおよびkoffの決定はまた、Kd値(Kd＝koff/kon)の間接的決定／計算上の決定を可能にし、異なるリガンド親和性に寄与する因子に光を与える。ac-p38αを用いて直接測定された結合および解離に関する速度定数を用いて、本発明者らは、10.2 nMおよび1.16μMのBIRB-796および1、RL8に関するKdの計算値を取得したが、これらは本発明者らが同様の条件下でのエンドポイント測定を介して取得した値と強く一致している。さらに、ac-p38αの新鮮な調製物を用いて得られた本発明者らの最新の報告結果により、それぞれ11.9±1.3 nMおよび1.079±0.347μMのBIRB-796および1、RL8に関するKdの計算値が得られる。記載の本発明を用いて、2つの異なる方法を介して、および異なるac-p38α調製物を用いて同様の結果を達成することにより、本発明者らは、蛍光標識されたキナーゼ手法が、正確なKd測定を提供するだけでなく、タンパク質からの結合および解離に関する価値ある動的情報を提供することができると確信している。
タンパク質へのリガンドの親和性を正確に測定するための最適な方法は、本発明者らの手法を用いて証明されたように、リガンド-タンパク質複合体の形成を直接測定することである。しかしながら、本発明者らは依然として、異なるピラゾロウレアのKd値が、konよりもむしろkoffによって、より影響されることを観察することができたが、その効果はp38αの場合に文書で十分に立証されている(Pargellisら、2002)。
スクリーニングにおける強力なATP競合阻害剤の検出／偽ヒットの同定
いくつかのアロステリック阻害剤に加えて、本発明者らは、本発明者らのアッセイにおいてp38αのいくつかの既知のATP競合阻害剤も試験した。ATPなどの大部分の化合物は、ac-p38αへの結合の際にいかなる種類の蛍光変化も生成しなかった。しかしながら、多くの強力な阻害剤の場合(約1〜20 nMのKd)、蛍光変化は強固であり、結合曲線を作製することができ、得られたKd値はp38αへの結合について公開された値と同等であった。しかしながら、20 nMを超えるKdでp38αに結合する化合物、本発明者らのアッセイにおいて測定されたKd値は、公開された値から迅速に分岐し始めた。2〜3例を表2に示す。
蛍光タグ付キナーゼが、20 nMを超えるKdでATP結合化合物の結合を正確に感知する能力を失うことを確認するための単純な実験を設計した。本発明者らは、上記のATP競合阻害剤SKF86002を用いて、エンドポイント測定を行い、ac-p38αのATP結合部位への結合の際に生成された阻害剤の固有の蛍光を用いて約78 nMのKdを有する結合曲線を取得した。この値は、180 nMの公開された値よりも実際にわずかに低い(Pargellisら、2002)。SKF86002の蛍光は420 nmで測定されるため、これらの測定においてはアクリロダンに由来する干渉は存在しなかった。代替的な手法を用いて、本発明者らは、同じタンパク質および阻害剤サンプルを用いて、アクリロダン蛍光に基づいて滴定曲線を作製した。この場合、得られたKd値は、10倍より高かった(約721 nMのKd)。従って、アクリロダン標識自体は、蛍光タグ付活性化ループがこれらの型のリガンドの結合の際にコンフォメーションを変化させないと予想されるという事実に十中八九起因して、多くのI型阻害剤に対して無反応であることが明らかである。従って、本発明者らのアッセイはキナーゼのDFG-outコンフォメーションを誘導する全てのアロステリック結合剤を検出するだけでなく、いくつかの固く結合するATP競合阻害剤に関するKdも報告することができる。興味深い知見は、無差別なATP競合キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンが本発明者らのアッセイによって検出されないということであった。事実、p38αはスタウロスポリンが阻害しない数少ないキナーゼのうちの1つであると報告されている(Karamanら、2008)。
Figure 2011528560
本発明者らは、蛍光標識されたキナーゼが、特に、活性化ループ中にコンフォメーション変化が存在せず、阻害剤がその蛍光を直接変化させるのにフルオロフォアに十分に近くない場合に、これらの化合物をどのように感知することができるのかを理解するための構造情報を現在調べている。最も可能性のある説明は、いくつかのATP競合阻害剤が、活性化ループに影響することなく、アクリロダンの位置のわずかなシフトまたは回転を引き起こし得る結合の際に、キナーゼの別の種類のコンフォメーション変化を誘導するということである。より極性が高いか、または帯電した環境への最もわずかなシフトが、蛍光を変化させるのに十分なものであり得る。特に、本発明者らは、DFGのAspとの相互作用を形成し得るATP競合化合物またはp38αの門番残基の近辺の小さい疎水性サブポケットに接近するか、もしくは進入する化合物に特に焦点を当てて、SB203580のKdがac-p38αによりどのように正確に報告されるかを決定するために構造を試験し続けるであろう。これらの構造調査は完了に近い。
本発明者らは、いくつかのI型阻害剤の結合が、活性化ループを含む予想外のコンフォメーション変化および／またはキナーゼヒンジ領域への結合の際のC突出部と比較したN突出部の再配列を誘導し得ると決定した。後者の場合、これらの局所的なコンフォメーション変化は、活性化ループを移動させることなく、フルオロフォアの近辺の極性環境を調節し、アロステリック結合剤に関してスクリーニングする場合、偽ヒットをもたらすことができた。本発明者らは、強力な低nMのI型p38α阻害剤であり、SKF86002の近い構造類似体である1つのそのような化合物、SB203580を同定した。驚くべきことに、SB203580の結合の際にac-p38αにおいて観察された蛍光変化は強固であり、他の方法を用いて以前に公開されたもの(15±2 nM)(Reganら、2002)と同じであるKd値を与える結合曲線を作製することができた(図28B)。
特にこの化合物がそのような感度の高い応答を誘発した理由をより良く理解するために、本発明者らはそれをp38αと共結晶化させた(図28C)。その構造を、ATP結合ポケット中ではっきり見える阻害剤の正の密度差と共に2.3Åの解像度まで解像した。阻害剤の歩リジニル基は、SB203580をI型阻害剤と定性化するヒンジ領域と水素結合を形成するが、キナーゼはDFG-outコンフォメーションを採った。メチルスルフィニル-置換フェニルの平面は、DFGモチーフとP-ループの間に挟まれ、Tyr35(P-ループ)およびPhe169(DFGモチーフ)の側鎖とのπ-πスタッキング相互作用を形成する。イミダゾール部分のN3は、水分子を介して、DFGモチーフのN末端に位置するLeu167の主鎖と水素結合する。これらの相互作用の正味の結果は、SB203580のI型結合様式にも関わらず、DFG-outコンフォメーションでのp38αの安定化である。その化合物はアロステリック部位内に結合しないが、アッセイはこのユニークな結合様式に起因して該化合物を検出した。
興味深いことに、SB203580は、タンパク質X線結晶学およびNMR技術(PDBコード：2ewa; Vogtherrら、2006および1a9u、Wangら、1998)の両方により大規模に分析されている。1つの研究はDFG-inコンフォメーションへのSB203580の結合を報告したが(Wangら、1998)、他のグループはこの阻害剤が両方のDFGコンフォメーションに実際に結合することができる(約50％の阻害剤が、それぞれのコンフォメーション中に占められる)ことを報告し、さらに、2D-NMR実験を用いてこの知見を確認した。
p38αの高親和性ATP競合阻害剤、SKF86002の固有の蛍光を用いてPargellisら、2002により記載のようにその結合を測定して、本発明者らは、この阻害剤が約78 nMのKdでac-p38αに結合することを見出した。しかしながら、アクリロダンのレシオメトリック蛍光の変化をモニターしながら同じ実験を実施したところ、721 nMのKdが得られ、I型阻害剤に対するアクリロダンの上記の無反応性を強調している。本発明者らは、SKF86002が同様の様式でSB203580に結合し得るというこれらの観察に基づいて主張することができる。両化合物は構造類似性、特に、SB203580について観察されるように、門番の後ろの疎水性サブポケット中に戻って伸長するようである4-フルオロフェニル部分を有する。これらの化合物のコアのY形状構造は、DFG-outコンフォメーションを安定化するp38αのPhe169およびTyr35とのπ-πスタッキング相互作用の形成を担うSB203580の追加のフェニル部分を除いて、正確に同じである。この環はSKF86002には存在しない。結合様式が類似すると仮定すると、この構造の差異は、DFG-outコンフォメーションを安定化するSKF86002の能力を低下させ、かくして、SB203580に対するその高感度の応答とは対照的に、その結合に対するアクリロダン標識された活性化ループの観察される無反応性を説明している。多くのI型阻害剤に対するこの無反応性にも関わらず、前記アッセイはDFGモチーフ、およびかくして、活性化ループのコンフォメーションと相互作用し、これを調節するI型結合剤に対して非常に高感度であるようである。
これらの知見の結果として、数種のATP競合阻害剤が、アロステリック阻害剤についてスクリーニングしながら、偽ヒットとして登録することができるようである。従って、ATPおよびアロステリック化合物を本発明者らのアッセイを用いて互いに識別することができるかどうかを決定することが必要であった。
キュベット方法を用いて、本発明者らは、蛍光変化の動力学を調査することによりこれを迅速に達成することができた。BIRB-796などのアロステリック阻害剤の場合、本発明者らは、動力学が比較的遅く、蛍光変化は完了に達するまで数分かかることを既に示した(図7B、図3BおよびDを参照)。しかしながら、SB203580などのATP競合阻害剤の場合、誘導される蛍光変化は瞬間的である(2〜4秒)。タンパク質のコンフォメーション変化はアロステリック阻害剤の場合と同様、これらの化合物の結合を可能にするには必要ではないため、これは驚くべきことではない。さらに、ATP結合部位は、キナーゼサンプルがDFG-outコンフォメーションにある場合にのみ利用可能となるアロステリック部位と比較して比較的接近が容易である。この瞬間的応答は、Ro3201195およびSKF86002についても観察された。これらの結果の一例を図7に示す。
384穴プレート形式
ここで、アロステリック阻害剤のKdを測定するためのキュベットについて記載されたエンドポイントアッセイを、384穴および96穴プレート型について、それぞれ20μlおよび100〜200μlの総液滴量を含むこれらのプレート型における使用のためにスケールダウンした。阻害剤の溶解性を改善し、希釈およびピペッティング工程の回数を制限するために注意を払った。BIRB-796に関する結果を図8に示す。
384穴プレートについては、阻害剤保存液を20Xの最終的な所望の濃度でDMSO中で調製した。各ウェルは1μlの阻害剤溶液＋19μlの50 nM ac-p38αを含むバッファーを含んでいた(混合後に5％ v/vのDMSO)。このバッファーは、阻害剤の溶解性を改善するのに用いた標準的な洗剤である0.01％ v/v Brij-35またはTriton X-100を添加したキュベット方法において用いられるものと同じである。これらの条件下で、BIRB-796の眼に見える沈降物は観察されなかった。この時点で、阻害剤BIRB-796を用いてスクリーニングを繰り返して、シグナルノイズ比、インキュベーション時間およびインキュベーション温度を最適化した。混合後、平衡に達し、各阻害剤について最も低い測定可能なKd(BIRB-796については約70 nMのKd)および良好なシグナルノイズ比(約0.77のZ因子)を達成するには、室温で6時間または4℃で一晩のインキュベーション時間で十分であることがわかった。上記のキュベット方法を用いて、本発明者らは、p38αのBIRB-796阻害の予想された時間依存性を証明することができた(図9)。さらなる例においては、34,000個の化合物ライブラリーのHTSスクリーニングを、前記アッセイを用いて実施した。97個の384穴プレートを必要とした完全なスクリーニングにわたって、0.85±0.06の優れたZ因子が達成された。
同様のバッファーおよびインキュベーション条件を、96穴形式において用いた。しかしながら、阻害剤の200X保存液をDMSO中で調製し、200μlの総量に希釈した(混合後に0.5％v/v DMSO)。この形式では、BIRB-796のKdは約27 nMであり、384穴形式(約0.84のZ因子)よりもわずかに良好なシグナルノイズ比であることがわかった。プレートの全ての測定を、Tecan Safire2を用いて行った。いくつかのさらなるスクリーニングにより、96穴形式のより正確な評価が得られた(Z因子＝0.88±0.03)。キュベット方法を用いて得られた値と比較して、測定されたKdは、96穴形式では最も固い結合阻害剤であるBIRB-796について5倍より高く、384穴形式ではさらにより高い。従って、Kd見積もりにとって最も好適なHTS形式は96穴形式であるが、384穴プレートはアロステリック結合剤の初期HTSスクリーニングにとって最良である。
HTS形式の適用
本発明者らの初期の報告以来、384穴形式を用いて、化合物ライブラリースクリーニングにおいてエンドポイント測定を行ってきた。スクリーニングされた分子は、キナーゼのDFG-outコンフォメーションに結合するように、コンピューターシミュレーションおよびモデリングを用いて設計されたものであった。DFG-outコンフォメーションは、このアッセイにより検出されるアロステリック阻害剤結合にとって必要なコンフォメーションである。これらの化合物のコア構造およびそれらの提唱される結合様式を、図10に示す。
全ての化合物は、2位にウレアまたはアミドを有する2,5-置換されたチアゾール部分を有し、古典的なp38αピラゾロウレア化合物としてキナーゼと同様の相互作用を作る。チアゾール部分を、BIRB-796のナフタレン部分がp38α中で結合し、アミドまたはウレア部分の適切な配置をもたらし、このポケットへの強い結合のためのピラゾロウレア化合物により作られる特徴的な相互作用を作る小さい疎水性サブポケットの近くに配置されるように設計した。同様に、嵩高い疎水性部分をウレア／アミド位置の後に置いて、アロステリックポケットをより良好に占有させた。この分子の反対側の末端を、より極性の隣接するATP結合ポケット中で水素結合相互作用を形成することができる極性ヒドロキシル基、アミンおよびN原子に沿って様々なアルキル部分および／またはフェニル環で修飾した。様々なサイズの化合物を作製して、潜在的なIII型(アロステリックのみ)およびII型(アロステリックとATP部位の間で架橋)結合剤のライブラリーを作製した。
このスクリーニングのために、各ライブラリー化合物の4倍希釈液を、溶媒としてDMSOを用いて384穴プレート中で調製するピペッティングスキームを作製した。各希釈液は、スクリーニングにおいて用いられた20Xの所望の最終濃度(0.05、0.5、5、50μM)であった。このアッセイのためのピペッティングスキームは、ac-p38αの量を100 nMに増加させて、高濃度(500μM)で存在し得る化合物に由来するバックグラウンド蛍光を回避することを除いては384穴プレートについて上記されたものであった。BIRB-796を陽性アロステリック結合対照として使用し、阻害剤を含まないac-p38αをバックグラウンド／基線蛍光に用いた。混合後、プレートをRTで5〜6時間インキュベートした後、Tecan Safire2を用いて測定した。
このスクリーニングにより、全て500μMの濃度でac-p38αの蛍光比を増加させた11個の化合物が同定された。これは1.8％のヒット率に相当する。しかしながら、これらのヒットのうちの5個のみが、残りの7個の化合物よりも強く結合した。BIRB-796のものほど有意な蛍光変化を生成した化合物はなかったが、これは全てのヒットがより弱く結合する化合物であることを示唆している。興味深いことに、これらの化合物の構造は、ATP部位中で結合すると提唱された分子の領域中に類似する特徴を有し、これらの化合物の結合様式が提唱された様式から実際に180°反転することを本発明者らに提唱させた。この特定の部分は該化合物にタンパク質との好ましい相互作用を与え、DFG-outコンフォメーションおよび蛍光応答を誘導し得る。
次の工程は、スクリーニング結果を検証し、キュベット方法を用いて上記のようにこれらの化合物の結合様式(ATP競合的対アロステリック)を評価することであった。全てのヒットは放出スペクトルの正確な変化をもたらし(図2)、5個の最も強いヒットは14〜40μMの範囲のKdを有していた。大きいライブラリースクリーンに由来する残りのヒットは40〜60μMのKdを有していた。各化合物が立体中心を有し、製造業者により提供されたライブラリー中でエナンチオマー混合物として存在したという事実におそらく起因して、これらの化合物のKd値はむしろ高いことに留意することが重要である。鏡像異性的に純粋なヒットは、より低いKdを有する可能性が非常に高い。しかしながら、この効果にも関わらず、前記アッセイは依然として類似する構造的特徴を有するヒットを同定することができた。1つの化合物(85-C8)の特性評価を図11に示す。
ac-p38αへの各ヒットの添加(30μMの単回用量)は、SB203580およびBIRB-796により図7に認められる応答の混合物と類似する新しく、驚くべき種類の蛍光応答を生成した。化合物の添加の際に、蛍光の瞬間的低下が存在し、これはATPポケット中の結合を示唆し、次いで、一次関数を用いて適合させることができる遅い蛍光崩壊を示し、これは活性化ループの移動およびアロステリック部位への接近を示唆する。予想していなかったが、瞬間的蛍光変化の規模および遅い段階の蛍光変化の動力学は両方とも用量依存的であり、阻害剤濃度に対してプロットした場合、線状に適合させることができる。
これらの初期の蛍光の結果に基づいて、本発明者らは、これらのヒットが実際に反転した結合様式を有するか否かに関する上記の考えに戻った。最近の刊行物は、本発明者らにこの反転した結合様式が確かに可能であるという証拠を提供した(Andersenら、2008)。Auroraキナーゼにおいては、ダサチニブ(Sprycel)、Src/Ablキナーゼ阻害剤、およびINH-29の結合様式は主にATP競合的であり、キナーゼのヒンジ領域に結合する。この領域への結合はキナーゼの強力なATP競合的阻害の必須条件である。両化合物、特にINH-29は、本発明者らのライブラリーヒットと多くの構造的特徴を共有する。両方とも2,5-二置換チアゾールであり、INH-29も2位にウレア部分を有する。ダサチニブのこの結晶構造を用いて、本発明者らはライブラリーヒット中でモデリングし、それをダサチニブ上に上書きし、構造中に多くの薬理作用団N原子の大きなアラインメントを見出した。この構造により、本発明者らは本発明者らのヒットの提唱された結合様式のモデルを構築することができ、これらの化合物の保存された化学的部分は、ATP結合部位からアロステリックポケットに向かって伸長するのにちょうど十分に長い。本発明者らのヒットとダサチニブの比較を図12に示す。
かくして、本発明者らのモデルと組合わせたデータは、ヒットがダサチニブと同様の様式でキナーゼのヒンジ領域に迅速に結合することを示唆し得る。一度結合したら、ヒット化合物の保存された構造部分は、アロステリックポケットの一部において自身でゆっくり位置し、初期の迅速な応答に続く遅い蛍光変化を誘発し得る。
最も強いヒット化合物の各々のリアルタイム蛍光測定は、この考えを支持するようである(データは示さない)。ac-p38αを含むキュベットへの単一用量(30μM)の各ヒット化合物の添加は、眼に見える規模の速い蛍光変化をもたらす。しかしながら、遅い段階の蛍光変化のkobsは、全てのヒット化合物について類似する範囲にある(4.2〜8.8 x 10-4M-1s-1)。ダサチニブは、この様式で結合した場合、アロステリックポケットに到達することができる部分を欠き、本発明者らのキュベットアッセイにおいては、ダサチニブのみが、専らATP競合阻害剤に特徴的である瞬間的蛍光応答をもたらす。興味深いことに、ac-p38αを用いるダサチニブの滴定は、約389 nMのKdをもたらした。これはp38αにおける約27 nMの報告されたKd(Karamanら、2008)よりも非常に高く、再度、多くの阻害剤がATPポケットに存在し、acp38αのみが20 nM未満のKdを有するATP競合阻害剤のKdを正確に報告することができるという本発明者らの観察と一致している。
これらの化合物に関するいくつかの追跡試験を実施して、それらの結合様式をさらに特性評価し、キナーゼ活性の阻害剤としてのこれらのヒットを検証した。本発明者らはまず、市販の活性に基づくアッセイにおいて化合物を試験することにより、標識されたキナーゼ結合アッセイを用いて本発明者らのHTSスクリーンの知見を認証した。これらの化合物の親和性はかなり弱いが(中程度のμMのKd値)、それらはp38αキナーゼ活性の阻害において同じ活性を示す(中程度のμMのIC50値)。これらのデータを、図12Dに表形式で示す。
これらのチアゾール化合物の結合様式をより良好に推測するために、本発明者らは再度、アクリロダン標識されたp38αを用いて、リアルタイムで結合速度を測定した。しかしながら、本発明者らの以前の測定とは反対に、本発明者らはわずか2μMの各化合物を用いた。図11中で動力学を試験するのに用いたものよりも少ない化合物を用いることに関する論理的根拠は、多量に添加されるリガンドが、結合速度を増加させ、これは上記の初期の迅速な段階を説明することができるということである。予想通り、わずかに2μMを用いることは、遅い速度段階のみを残し、この初期の速い速度を排除した。本発明者らは、これが、本発明者らが図12で最初に提唱したダサチニブ様結合様式とは反対に、アロステリックポケット中での結合をより明確に示唆すると考えている。87H9の場合、結合速度は非常に遅かった(t1/2＝118秒)。全ての他のチアゾール-ウレアヒット化合物は同様に振舞った(データは示さない)。
結合様式に関して本発明者らの結合アッセイにより行われた予測を確認し、認証するために、本発明者らはいくつかのこれらの化合物を野生型p38αと共結晶化させただけでなく、87H9の結晶構造を取得することができた(図12E)。リガンドは実際、アロステリックポケット内に完全に位置し、DFG-outコンフォメーションに結合している。本発明者らの以前にモデリングした結合様式での上記のフェニル部分(図11を参照)は、門番残基の後ろに位置する疎水性サブポケットの内側に埋まっている。この構造的特徴は、このスクリーニング構想で同定された全てのチアゾール-ウレア化合物において保存されており、その親和性に対する重要な寄与因子である可能性が高い。さらに、ウレア部分はDFGモチーフおよびCへリックスのグルタミン酸側鎖との予想された相互作用を形成する。これらの水素結合相互作用は、アロステリックポケット中で結合するウレア部分を有するリガンドの特徴である。p38αのアロステリックポケット内に結合するリガンドとしてのこれらのチアゾール-ウレア化合物の同定は、典型的には、ATPと競合するI型阻害剤であるこのクラスの化合物の新規結合様式である。
35,000個の化合物のライブラリーのHTSスクリーニング
HTSスクリーニングの概要
本発明者らは、本出願に記載されるp38αのためのアクリロダン標識されたキナーゼ結合アッセイを用いて、約35000個の化合物からなる化合物ライブラリーの大集団をスクリーニングした(スキームについては図12Fを参照)。キナーゼを活性化ループ上で標識して、不活性DFG-outコンフォメーションに特異的に結合し、これを安定化するリガンドを同定する。DFG-out結合剤は、468 nmから514 nmへの最大放出のシフトを誘導し、二重の最大放出は平衡で作られたリガンド結合のレシオメトリック測定(エンドポイント測定)を可能にする。これらの型のレシオメトリック蛍光読み出しは、それらが小さい希釈率および滴定シリーズにおける異なるサンプル間のピペッティング誤差について補正し、少量のHTSプレート中で観察されることが多い「エッジ効果」を排除するため、有利である。
384穴HTS形式での標識されたキナーゼ結合アッセイを最初に使用して、DFG-outコンフォメーションのための可能なリガンド、またはDFG-out結合剤を最初にスクリーニングすることにより、完全なスクリーニングを実行した。これを、単一濃度の各リガンドで一次スクリーニングを最初に実施した後、それぞれの潜在的なヒットのKdを直接決定するために一定濃度範囲にわたって二次スクリーニングを実施することにより達成した。
アクリロダン標識されたp38αに関するHTSスクリーニング設定
スクリーニングの設定および実行のための方法を以下に提供する。一次スクリーニングを単一濃度(12.5μM)の各リガンドを用いて実行して、どの化合物がp38αのDFG-outコンフォメーションを誘導し、安定化するかを最初に決定した。予め保存した阻害剤のプレート(DMSO中10 mMでウェルあたり1種の化合物)を用いて、保存プレートから化合物をバッファー(50 mM Hepes pH 7.45、200 mM NaCl、0.01％Triton-X100(注記：Tritonの代わりにBrij-35を用いることもできる))中に50μMに希釈することにより、予備希釈プレートを最初に調製した。大量の同じバッファーも用いて、バックグラウンド(標識されたキナーゼを添加しない)およびスクリーニングプレート(+100 nMアクリロダン標識されたp38α)をピペッティングするための溶液を調製した。
工業用ピペッティングロボットを用いて、最初に5μlの予備希釈した化合物を2個の384穴小容量アッセイプレートのセットに分注した。続いて、15μlのバッファーをバックグラウンドプレートに添加しながら、標識されたキナーゼを含む同じ容量のバッファーをスクリーニングプレートに添加して、DFG-out結合剤を検出した。DFG-out結合剤はp38α中で周知の遅い解離速度を有するため(Pargellisら、2002)、両プレートを接着ホイルで被覆し、4℃で一晩保存した。％v/v DMSOは全てのプレートにおいて0.2％未満であった。Tecan Safire2装置を用いて、384穴プレート形式で蛍光読み出し値を測定した。全てのプレートはまた、6ウェルの陰性DMSO対照(リガンドなし)ならびに6ウェルの陽性対照(12.5μMのBIRB-796)を含んでいた。アクリロダン標識されたp38α(スクリーニングプレート)の存在下で測定されたシグナルから、514 nmおよび468 nmでの固有の化合物蛍光(バックグラウンドプレート)を差し引くことにより、データを加工した。バックグラウンドプレートは固有の化合物蛍光について補正し、ライブラリー中の多くの高度に蛍光性の化合物の大部分を排除した。多くの場合、そのような化合物のレシオメトリック蛍光値を補正したバックグラウンドは、陰性DMSO対照と同じであった(データは示さない)。次いで、以前に記載のように、結合の程度を、バックグラウンド-補正されたデータのレシオメトリック蛍光(R＝514 nm/468 nm)を取ることにより評価した。陽性対照について観察された最大応答の25％に到達した任意の化合物を、その後の試験に提出した。
二次スクリーニングを、これも一定範囲の濃度(100 nM〜50μM)の各リガンドを用いて384穴プレート中で実行して、結合曲線を作製するか、または高い程度の蛍光干渉に起因して拾われた偽ヒットを同定した。予備希釈プレートを、化合物の濃度が最終的なスクリーニングプレート中で必要とされる濃度よりも2倍高くなるようなバッファーを用いて調製した。以前のように、大量の同じバッファーを用いて、バックグラウンド(標識されたキナーゼを添加しない)およびスクリーニングプレート(+100 nMのアクリロダン標識されたp38α)をピペッティングするための溶液も調製した。ピペッティングロボットを用いて、最初に3.5μlの予備希釈された化合物を2個の384穴小容量アッセイプレートのセット中に分注した。各プレートは、それぞれ10種の濃度(100 nM〜50μM)および1つの濃度あたり4個のウェルでスクリーニングされた、一次スクリーニングで同定された7種以下の異なる化合物を含んでいた。続いて、3.5μlのバッファーをバックグラウンドプレートに添加しながら、標識されたキナーゼを含む同じ容量のバッファーをスクリーニングプレートに添加した。プレートを密閉し、インキュベートし、一次スクリーニングについて記載のように測定した。514 nmおよび468 nmでの生データならびにバックグラウンド補正されたレシオメトリックデータを用いて、偽蛍光ヒットを排除した。例示的サンプルプレートのレイアウトを以下に示す。
レシオメトリック蛍光値により、信頼できる結合曲線をプロットして、p38αに結合するリガンドのKdを直接決定することができた。また、指示される場合、結合曲線を、リガンドにより結合したp38αの割合(％)としてプロットした。結合したp38αの割合(％)を以下のように計算する：
結合した割合(％)＝((R−Runsat)/Rsat'd) x 100
(式中、Rはリガンドの所与の濃度でのレシオメトリック蛍光であり、RunsatおよびRsat'dはそれぞれ同じリガンドの飽和濃度の非存在下または存在下でp38αについて得られたレシオメトリック蛍光値である)。
Figure 2011528560
ヒットの同定および検証
一次アッセイスクリーニングの性能を、全てのプレートの陽性および陰性対照のレシオメトリック値をモニターすることにより評価し、全スクリーニングについて0.82±0.6のZ因子計算値を得た(図12G)。1周目のスクリーニングの後、90個の化合物が潜在的なヒットと同定され、これはわずかに約0.25％の「ヒット率」に相当する。二次スクリーニングにおいてS字状の結合曲線を与えた化合物を、DFG-out結合剤の可能性があるとして確認したが、任意の残りの高い蛍光の化合物は偽ヒットとして容易に同定された。レシオメトリック蛍光値の変化を用いて、結合曲線をプロットし、Kd値を直接決定した。2周目のスクリーニング後、残ったわずかに35個の化合物を、DFG-out結合剤の可能性があると確認した。
次の検証工程においては、全ての化合物保存液をLC-MSにより分析して、純度を評価し、予想される化合物質量を検証した。80％以上純粋であることがわかった唯一の化合物を、製造業者の説明書に従って、IC50決定のためのHTRFキナーゼアッセイ(CisBio社から市販されている)を用いるさらなるスクリーニングにかけた。アクリロダン標識されたp38αを用いてDFG-out結合剤であると同定された初期の35個のヒットのこれらの追跡検証試験の完了後、これらの化合物のうちの27個が、検証されたキナーゼ阻害剤としてHTRFアッセイにおいてp38αの酵素活性をも阻害した。
いくつかの化合物(HTS 1-15)ならびに決定されたKdおよびIC50値を表3に提示する。多くの場合、アクリロダン標識されたp38αを用いて決定されたKdは、活性に基づくアッセイにおいて決定されたIC50値と密接に一致し、活性に基づくアッセイにとって必要である活性リン酸化キナーゼを阻害することができるDFG-out結合剤を同定するための非リン酸化不活性p38αの使用を検証する。しかしながら、化合物HTS 3-6およびHTS 12は、活性に基づくアッセイにおいて10〜50倍活性が低い。ATP結合部位に隣接するアロステリックポケット内に部分的に結合する阻害剤に対する親和性の喪失が文書で十分に立証されている(Seeligerら、2007)。活性に基づくHTRFアッセイにとって必要であるp38αの活性化ループのリン酸化は、p38αのDFG-inコンフォメーションを安定化するようである。それらの結合様式がDFG-outコンフォメーションに依存する場合、これはそれらの有意により高いIC50値を説明する。
かくして、本発明者らのアッセイ系のために非リン酸化形態のキナーゼを利用することにより、DFG-outコンフォメーションがエネルギー的により好ましく、大きい化合物ライブラリー中でのDFG-out結合剤の検出のための感度を増強させるようである。HTS 3-6およびHTS 12に対する感度の増加は、この不活性なキナーゼコンフォメーションに結合するキナーゼ阻害剤のHTSスクリーニングのための標識されたキナーゼ結合アッセイの使用に対する重要な利点を証明している。興味深いことに、化合物HTS 1およびHTS 2は、強力なI型p38α阻害剤SB203580の誘導体である(図7)。p38α中での結合様式はよく記載されており、阻害剤がI型結合様式を保持するが、本出願の実施例6に記載のように、DFG Phe(Phe169)の側鎖と、グリシンに富むループ中に認められるTyr残基(Tyr35)の側鎖との間にスタッキングすることによりπ-π相互作用を形成することにより、p38αのDFG-outコンフォメーションに結合し、これを安定化することができる点でユニークである。従って、本発明者らの新規結合アッセイを用いるHTS 1およびHTS 2の検出は、結果の内部検証として役立つ。その高い親和性および阻害活性を考慮すれば、1および2はp38α中で同じI型結合様式を採用するようである。
選択されたヒット化合物の結合速度およびSAR
このアッセイは、SB203580などの、DFG-outコンフォメーションを安定化するI型リガンドも検出するため、本発明者らはアクリロダン標識されたp38αへのこれらの化合物の結合のリアルタイム動的測定を実施して、これらのヒットの可能な結合様式へのいくらかの洞察を得た。
HTSスクリーニングに由来する2個のヒット、HTS 14およびHTS 15は、活性に基づくアッセイにおける試験のために市販されていない。従って、いくつかの近い誘導体(HTS 14a-eおよびHTS 15 a-c)をIC50決定のため、およびSAR試験を実施するために取得した(図12H)。アクリロダン標識されたp38α結合アッセイを用いて、各化合物のKdを決定し、本発明者らはメタ置換フェニル環、より具体的には、この位置でのハロゲン置換を有する化合物に対する明らかな選択性を見出した。HTS 14b中のメタ-ブロモによるHTS 14aのメタ-塩素の置換は、Kdの100倍の低下をもたらす。さらに、HTS 14cとHTS 15aの比較は、シクロペンチル環によるシクロヘキシルの置換が、親和性をほぼ10倍低下させることを示している。いくつかの他のヒット化合物についてと同様、これらの誘導体は活性に基づくアッセイにおいては非常により弱い効果を有する。
Figure 2011528560
今までのところ、p38αとのこれらの化合物の共結晶化は成功しておらず、結合様式の詳細な理解は依然として不可能である。しかしながら、アクリロダン標識されたp38αを用いて、本発明者らはエンドポイント測定を実施して、市販の誘導体HTS 14b-dに関する結合曲線を取得することができた(図12Hの左下)。HTS 14bのリアルタイム動的測定は、468 nmでのアクリロダンの蛍光放出の急速な低下を示しており、これはキナーゼのDFG-outコンフォメーションをいくらか誘導し、安定化し得るI型リガンドの結合をもう一度示唆している。このアッセイ系を用いて、よく知られたp38α阻害剤であるSB2-3580についても同様のデータが得られた(図7および28を参照)。
リガンド結合の構造的詳細
リガンド結合の動的測定(図12Iを参照)は、HTS 12を除いてほぼ全ての化合物がI型阻害剤であるようであり、明らかに遅い結合速度(約38秒のt1/2)を与えることを示唆していた。p38αのDFG-outコンフォメーションに結合することを示唆する速く結合する化合物の例も示す。この型の遅い結合速度は、アロステリックポケット内に完全に、または部分的に結合するII/III型リガンドの特徴である。リアルタイム動的測定により推測された結合様式にも関わらず、それらが本発明者らの新規結合アッセイによって高感度に検出されたという事実は、それらが不活性DFG-outコンフォメーションをいくらか安定化し得ることを示唆している。
本発明者らは、いくつかの残りの阻害剤と野生型p38αとを共結晶化させて、結合様式に関する詳細な構造情報を取得し、アクリロダン標識されたp38αに結合するリガンドのリアルタイム測定から取得された動的情報を検証しようとした(図12J)。いくつかの化合物はタンパク質と共結晶化しなかったか、または化合物中で適切にモデリングするには阻害剤の占有率が低すぎる結晶をもたらした。これらの困難にも関わらず、本発明者らは、p38αとの複合体にあるHTS 8およびHTS 11-13のタンパク質X線結晶構造を取得することができた。HTS 12の結晶構造は、リガンドがATP結合部位に隣接するアロステリック部位内に結合し、キナーゼがDFG-outコンフォメーションにあることを示しており、これはアクリロダン標識されたp38αに関する本発明者らの動的測定において観察された結合の遅い速度と一致している(データは示さない)。しかしながら、このリガンドの電子密度は、阻害剤の全ての部分において適切にモデリングするには十分に良好なものではなかった。
得られた最良の結晶構造は、キナーゼ測定により示唆されるように、I型結合様式で結合するHTS 13に関するものであったが、p38αの活性化ループは不活性コンフォメーションで認められる。DFGのPhe側鎖はATP結合ポケット中に深く引かれ、そこで阻害剤分子の側の疎水性パッチと相互作用するようである。このパッチは、阻害剤にATP結合部位内でコイルを形成させ、DFGのPhe側鎖の方向に向いている大きい疎水性パッチを提供する内部水素結合により生成されるようである。さらに、前記阻害剤は、門番残基を超えて疎水性サブポケット中に伸長するトリクロロフェニル部分を含む。このサブポケット内に結合する部分は、p38αに対するリガンドの効力を増強することが知られており、DFG-outコンフォメーションがエネルギー的により好ましくなるようにp38αのコンフォメーション平衡をもシフトさせ得る(Reganら、2002)。
標識戦略；構造データの配列を用いる標識部位の選択
他のキナーゼにおけるこの手法の実現可能性を効率的に証明するために、本発明者らはこのアッセイ系の次の候補として、様々な種に由来する一連のセリン／トレオニンおよびチロシンキナーゼを選択した。最も重要なことに、本発明者らはDFG-inおよびDFG-outコンフォメーションスイッチにより調節されることが知られ、いくつかの構造情報が一方または両方のコンフォメーションで利用可能である一連のキナーゼを選択した。本発明者らはまた、それらがDFG-outコンフォメーションを採用することができるかどうかが依然として未知であるキナーゼを選択した。これらのキナーゼ(GSK3β(ヒト)、GSK3(菌類相同体)、cSrc、CSK、EGFR(ヒト)、Lck(ヒト)およびAurora A(ヒト))について、活性化ループの配列アラインメントを、ループの出発点および終点として、それぞれDFGモチーフおよび高度に保存されたAPEモチーフを用いて作製した。本発明者らはまた、構造情報がまだ利用可能でないキナーゼ(DDR1(ヒト)およびpfMAPK1(プラスモジウム・ファルシパルム))の配列も整列させた。これらのキナーゼのアラインメントを図13に示す。
p38αにおいては、本発明者らは、高度に保存されたアラニンまたはセリンであることが多い、DFGモチーフの後ろの2個の位置(アラニンにより占有される)をシステインに突然変異させることにより、この位置にフルオロフォアを結合させた。
それは高度に保存されたDFGモチーフ(図13の囲み1)と、いくつかの潜在的なリン酸化部位ならびに活性化ループの三次構造の組織化に関与する様々な荷電残基および／または疎水性残基を含む活性化ループの残りとの間にあるため、この部位を選択した。最も大きい蛍光変化が、フルオロフォア移動の定量的距離よりもむしろ環境(溶媒接近性)の異なる変化の結果生じるであろうことも考慮しながら、活性化ループのこれらの領域を回避するためにあらゆる試みを行った。本発明者らは、DFG-inおよびDFG-outコンフォメーションの両方においてac-p38αについて得られた構造情報を提供したフルオロフォアについてSASA(表面積溶媒接近性)計算を実施するであろう。今までは、本発明者らはDFG-outコンフォメーションにおいてのみフルオロフォアを観察してきた。
p38αのために選択した標識位置の後ろには、典型的には、多くのキナーゼにおいては、キナーゼのへリックスCとのイオン性相互作用の形成に関与するか、または活性化ループの他の領域中のリン酸化された残基と相互作用するLysまたはArg(囲み2)などの塩基性アミノ酸が来る。多くのキナーゼにおいては、この位置の後ろには、LeuもしくはIle(囲み3)などの数個の疎水性残基、次いで、活性化ループの安定化に関与する数個のより荷電した残基(囲み4)、次いで、セリン、ThrもしくはTyr残基を含む可変的リン酸化領域(囲み5)が来ることが多い。活性化ループの末端近くには、高度に保存された塩基性残基、次いで、TyrおよびTrpなどの1個または2個の嵩高い疎水性平面残基を見出すことができる(囲み6)。通常、この後ろには、ループの末端に高度に保存されたAPEモチーフ(囲み7)が来る。これらのアラインメントの分析は、p38αが多くのキナーゼと比較して特に短い(よりコンパクトな)活性化ループを有することを示している。従って、構造情報は、他のキナーゼにおける多くの類似する標識位置を同定する際により役立った。上記で整列された各キナーゼについては、利用可能な構造をp38αの活性形態(PDBコード：1wbo)および不活性形態(PDBコード：1wbs)と整列させた。全ての場合、特に長い活性化ループは、p38α中で標識された位置がより長い活性化ループを有するキナーゼにとって最良の位置ではないかもしれないことを示している。これらのキナーゼについて、p38α標識部位の前の1個の位置であるDFGモチーフの直後の位置は、構造的に最良に整列するようである。多くのキナーゼにおいては、Leuがこの位置に認められる。DDR1およびpfMAPK1と同様、構造情報が利用可能でない場合、既知の構造的キナーゼ鋳型に基づく構造モデルを、標識部位および溶媒露出したシステイン残基の同定を補助するためのオンラインツールを用いて作製した。これらのシステインのセリンへの突然変異は、非特異的蛍光標識の排除にとって重要である。この種類の情報は、配列アラインメントの調査によっては容易に取得することができない。
DFGモチーフの直後にTrp残基を有するAurora Aキナーゼなどの他の例外的事例も存在する。この場合、Trp残基はDFG-outコンフォメーションへの移行の間に位置を有意に変化させないようである。フルオロフォアのより平面的な環構造を考慮して、アミノ酸配列中の隣接する位置もまた、疎水性Trp残基との好ましいか、または好ましくない相互作用を防止するのを助けるための標識を回避した。かくして、DFGの後ろの3番目の位置をAurora Aにおいて選択した(Val)。
別の例外的事例は、代替的な不活性状態を形成し、DFGスイッチにより調節されないようであるEGFRである。不活性EGFRは活性化ループのコンフォメーション変化を受け、それをATP結合部位にさらに持って行き、そこでそれはミニα-へリックスを形成する。そのようなキナーゼにおいてアロステリック阻害剤をスクリーニングすることは不可能であるかもしれないが、本発明者らは同じ原理を用いてこのキナーゼを標識し、この不活性コンフォメーションを誘導し得る化合物をスクリーニングしようと試みている。EGFRのユニークな性質を考慮すれば、配列アラインメントのみでは最良の標識部位を決定するのに十分ではない。従って、構造情報を用いて、DFG-outコンフォメーションにあるp38αの標識部位と類似する位置に再配置するEGFRの活性化ループ上の位置を同定した。本発明者らは、これをDFGモチーフの後ろの5個の残基であるLeuであると決定した。いくつかの構造アラインメントを図14に示してこれらの位置を例示する。
2〜3の例外を除いて、DFGモチーフの後ろの最初の2個の残基が、このアッセイ手法における使用にとって大多数のキナーゼを標識するのに最適であるようである。上記に列挙したものとは異なる一連のキナーゼを用いて共通のモチーフを決定した代替的なアラインメントにおいてこれを確認した。(GSK3β(ヒト)、p38α(ヒト)、b-Raf(ヒト)、CDK2(ヒト)、cSrc(ヒト)、CSK(ヒト)、EGFR(ヒト)、Lck(ヒト)、Abl(ヒト)およびAurora A(ヒト))の得られたアラインメントを図13Bに示す。活性化ループ配列は高度に保存されたDFG(囲み1)およびAPEモチーフ(囲み6)により挟まれている。DFG+3位置は一般的には活性化ループの一次リン酸化部位と直接相互作用する塩基性アミノ酸である(Nolenら、2004)。DFG+5を介するDFG+3は、チロシンキナーゼ中のC突出部の他の構造的特徴を有する疎水性アンカーポイントとして働く(Levinsonら、2008)。この後ろには可変長断片(囲み3)とリン酸化され得る高い出現率のTyr、SerおよびThr残基を含む領域(囲み4)が続く。活性化ループのC末端(囲み5)は、キナーゼのC突出部といくつかの相互作用を形成し、基質結合において重要である。
本発明者らは、活性化ループのN末端のDFGモチーフの直後の残基(DFG+1およびDFG+2)が、コンフォメーション変化と共に有意な移動を示し、典型的には、キナーゼ活性に影響することが知られる疾患に関連する遺伝的変化と関連しないことを見出した(Torkamaniら、2008)。さらに、全てのヒトキナーゼの配列アラインメントは、少なくとも47種のキナーゼがこれらの2個の位置に天然のCysを有することを示しており、これはCysへの標識部位残基の突然変異が許容される可能性が高いことを示唆している。
上記のように、従って、その後、p38αのAla172(DFG+2位置)を、チオール反応性フルオロフォアとの特異的反応のためにCysに突然変異させた。最後に、本発明者らは、フルオロフォアと望ましくなく反応し得る溶媒露出したCysを同定するために利用可能な構造情報を使用した。本発明者らは、p38α中の4個のCysのうちの2個のみが溶媒露出している(Cys119およびCys162)ことを決定し、続いてこれらをSerに突然変異させて、キナーゼが活性化ループ上でのみ単一に標識される確率を増加させ、究極的には質量分析法によりこれを確認した(図16D〜F)。
ソラフェニブとの複合体にあるac-p38αの結晶構造
記載のアッセイ原理の原子的および分子的基礎をより良く理解するために、本発明者らはI型、II型およびIII型キナーゼ阻害剤の存在下および非存在下でアクリロダン標識されたp38αを結晶化させるために設定した。今までのところ、本発明者らはソラフェニブとの複合体にあるac-p38αの結晶構造を2.5Åの解像度まで解像した(図15)。キナーゼはDFG-outコンフォメーションを採る活性化ループを有するその不活性状態で認められる。アクリロダン標識されたC172とII型阻害剤ソラフェニブに関する正の密度差が明らかに眼に見える。フルオロフォアはF168(DFGモチーフ)とP-ループの間に挟まれた疎水性環境中に認められる。阻害剤のハロゲン化フェニル部分は、キナーゼがその不活性コンフォメーションにある場合にのみ存在するアロステリック結合ポケットを占有する。阻害剤のウレア部分とE71の側鎖(へリックスC)およびD168の主鎖NH(DFG-ループ)との水素結合相互作用が明確に示され、以前に報告されたb-Rafソラフェニブ複合体と一致する(PDBコード1uwh(Wanら、Cell 2004))。置換されたピリジンはキナーゼのヒンジ領域に結合する。興味深いことに、このピリジン環の方向は、b-Raf複合体と比較して有意に異なる。さらに、M109周辺のヒンジ領域は、少なくとも2つのコンフォメーションを示す。この時点で、本発明者らは、ソラフェニブの結合様式において観察される差異およびヒンジ領域の変化が、タンパク質のフルオロフォア標識といくらか関連することを無視することができなかった。ソラフェニブとの複合体にある未標識のp38αならびにBIRB-796については、アクリロダン標識されたp38αおよび未標識のp38αの共結晶化実験を行っている。
異なるフルオロフォアの適用
本発明者らは、3種の異なるチオール反応性フルオロフォアの選択物で標識されたp38αの初期試験を最近完了し、表4に示し、環境変化に対して感受性であると報告した。活性化ループコンフォメーションにおける変化の検出のために、本発明者らはこれらのフルオロフォアもこのアッセイ手順にとって好適であるかどうかを試験することを選択した。
フルオロフォア結合を、アクリロダンについて記載されたように実行した。次いで、初期の蛍光測定を行って、最適な励起および放出波長を決定した。次いで、リアルタイム蛍光測定を、各フルオロフォアに関する最大放出を用いて試みた。単一用量の0.1μMソラフェニブを、0.1 mMのそれぞれ新規に標識されたp38αを個々に含むキュベットに添加した。アクリロダン標識されたp38αを用いる同じ条件下で得られたものと同様の結合速度が全ての事例において得られた。新しいフルオロフォアのうち、NBD-p38α、IAEDANS-p38α、Atto680-p38αおよびフルオレセイン-p38αは、測定された波長で最も高い感度を有していたが、ピレン-p38αに関するシグナルノイズ比は弱く、この手法にとって好適ではないようである。
Figure 2011528560
さらなる実験を実施して、それぞれの蛍光標識されたp38αのΔIstdを決定した。これらのフルオロフォアは強度における変化のみを示すため、ΔRmaxの決定は不可能であろう。アクリロダンについて観察されるように、NBD、フルオレセイン、Atto680またはピレンについても最大放出のシフトが観察されなかった。最大放出はIAEDANSに関する新しい波長にシフトさせないが、このフルオロフォアはアクリロダンと構造的に関連し、同様のスペクトル挙動を示さない。本発明者らは、IAEDANS-p38αを用いてKd値を取得するための信頼できるエンドポイント測定を証明することができた。しかしながら、NBD、フルオレセイン、Atto680およびピレンは主に、アクリロダンについて観察されるか、またはIAEDANSについてはあまり観察されないが、スペクトル形状のさらなる変化なしに放出強度の一般的な増加または減少と応答する。信頼できるエンドポイントは結果としてこれらの場合においては取得するのが困難であるが、これはレシオメトリック蛍光を使用することができないことが、エンドポイント滴定においてキュベット間の希釈およびピペッティングの誤差を拡大するためである。しかしながら、全てのフルオロフォアを変化する成功率で使用して、結合および解離の速度定数を取得し、Kd計算値を決定することができる。かくして、これは、両方の蛍光パラメーター(最初の報告に記載)のための基準がアッセイの開発にとって必須ではない点を強調している。これらの基準の1つが満たされる限り、フルオロフォア-キナーゼコンジュゲートはこのアッセイにおいて合理的に高い成功機会を有する。しかしながら、アクリロダンおよびIAEDANSなどのレシオメトリック測定を許容するフルオロフォアは、高効率スクリーニングのための理想的な候補である。
次に、それぞれの標識されたキナーゼの蛍光特性を、II型阻害剤BIRB-796を用いてDFG-outコンフォメーションを誘導することにより特性評価した。平均強度と比較したp38αの飽和の際の正規化された強度変化(ΔIstd)およびp38αの未結合と飽和DFG-outコンフォメーションの間の最大標準強度変化(ΔRmax)を、各コンフォメーション状態で観察される最大放出を用いて各フルオロフォアについて算出した。
これらの基準に従って、アクリロダン標識されたp38α(ac-p38α)は、このキナーゼに関するアロステリック阻害剤結合を検出するための蛍光に基づくアッセイのための理想的なプローブであると確認する(表5のSARのためのこのプローブの使用を参照)。アロステリックリガンドが、極性の低い方からより極性の高い環境へのアクリロダンの移動を示唆する468 nmから514 nmへの最大放出のシフトを誘導するため、ac-p38αはレシオメトリック測定を可能にする(Hibbsら、2004；Richieriら、1992)。
最大放出における大きいシフトは、アクリロダンについて観察されるように、NBD、フルオレセイン、Atto680またはピレンについても観察されなかった。しかしながら、最適でないΔRmax値にも関わらず、IAEDANSはアクリロダンを構造的に密接に関連し、BIRB-796結合に対する応答において類似するスペクトル挙動を示した。IAEDANSの最大放出は新しい波長に完全にシフトしなかったが、2つの変化する最大値間のレシオメトリック測定(R＝510 nm/465 nm)が可能であった。かくして、本発明者らは、Kd値を直接決定するための結合曲線を作製するのに用いることができるIAEDANS-p38αを用いて信頼できるエンドポイント測定を取得することができた(図29)。しかしながら、BIRB-796のKdはIAEDANS-p38αを用いて測定した場合、3倍より高かったことに留意すべきである。これらの型の手法を用いて取得されたKd値は、選択される標識部位および測定を実行するために用いられる特定のフルオロフォアにいくらか依存することが多いため、これは驚くべきことでもない(de Lorimierら、2002)。
Figure 2011528560
NBD、フルオロセイン、Atto680およびピレンの場合、p38αのDFG-outコンフォメーションへのBIRB-796の結合は、スペクトル形状における任意の付随する変化なしに単一の波長で放出強度の一般的な低下を引き起こした(図30)。試験したフルオロフォアは全て、ΔIstdの基準を満足したため、それらを上手く用いて結合および解離に関する速度定数を取得することができた。最終的にはそのような動的情報を用いて、結合曲線を直接測定することなくリガンドのKdを算出することができる。かくして、活性化ループ上で標識された蛍光タグ付キナーゼは、有用な情報を提供するためにΔIstdおよびΔRmaxの両方の基準を満たす必要はない。これらの基準の1つが満たされる限り、標識されたキナーゼはアロステリック阻害剤結合および活性化ループコンフォメーションの変化を上手く検出する合理的に高い機会を有する。しかしながら、アクリロダンおよびIAEDANSなどのレシオメトリック測定を許容するフルオロフォアは、リガンドのKdを直接決定するための理想的な候補であり、より高い費用のHTSプラットフォーム中に実装した場合、成功および信頼性に関する最も高い機会を有するであろう。
生物学的方法
ニワトリcSrcの蛍光標識と新規スクリーニングアッセイの開発
DFG-inおよびDFG-outコンフォメーションでのニワトリcSrc(キナーゼドメイン)の結晶構造を密接に試験して、活性化ループコンフォメーションの変化を感知することによりアロステリック阻害剤の結合を報告するcSrcの活性化ループのN末端近くの好適なフルオロフォア結合部位を同定した。既知のリン酸化部位またはタンパク質の安定性を維持するのに重要であるようである他の部位である残基を選択しないように注意を払った。他の溶媒露出したCysをSerに保存的に突然変異することにより(C277S、C483S、C496S)、非特異的標識を最小化しながら、部位特異的突然変異誘発により選択された位置にCysを導入した(L407C)。
その比較的小さいサイズに起因して、バイオセンサーコンジュゲート(de Lorimierら、2002)、アクリロダン(チオール反応性)の形成における極性変化に対する高い感受性および文書で十分に立証された使用が、キナーゼの活性化ループの標識にとって好ましかった。標識部位Cys突然変異(L407C)およびアクリロダン(DMF中に溶解)を含む純粋なcSrcキナーゼを、1:1.5の比率のタンパク質：フルオロフォアでバッファー(pH 7.0)中で混合し、4℃で一晩暗室中で反応させた。コンジュゲーションの間に存在するDMFの量は0.1％ v/vを超えなかった。次いで、コンジュゲートされたcSrcを濃縮し、測定バッファー(50 mM Hepes、200 mM NaCl、pH 7.45)で3回洗浄して、未反応のフルオロフォアを除去した。次いで標識されたcSrcを分注し、暗室中で保持し、-20℃で凍結した。続いて、標識を、標識されたタンパク質および未標識のタンパク質のトリプシン化された断片の質量スペクトル分析により検証した(図16)。DFG-in(ダサチニブ)およびDFG-outコンフォメーションに結合する阻害剤を用いるcSrcの蛍光特性評価を図17に示す。
cSrc変異体に関するin vitroキナーゼ活性アッセイ
ビオチン化ポリGlu-Tyr基質ペプチドを、cSrcによりリン酸化した。反応が完了した後、Europium Cryptateで標識した抗ホスホチロシン抗体およびフルオロフォアXL66で標識されたストレプトアビジンを添加した。Europium CryptateとXL665の間のFRETを測定して、基質ペプチドのリン酸化を定量した。ATP濃度をその対応するKm値(野生型cSrcについては15μMおよびcSrc-T338Mについては1μM)に設定し、100 nMの基質を野生型および薬剤耐性cSrcの両方に用いた。キナーゼ、基質ペプチドおよび阻害剤を2時間予備インキュベートした後、ATPの添加により反応を開始させた。cSrcキナーゼに関するIC50の決定を、製造業者の説明書に従ってCisbio社製のHTRF(登録商標)KinEASE TM-TKアッセイ(Bangnols-sur-Ceze, France)を用いて測定した。Tecan Safire2プレートリーダーを用いて、317 nmで励起した60μs後に620 nm(Eu-標識された抗体)および665 nm(XL665標識されたストレプトアビジン)でサンプルの蛍光を測定した。8つの異なる阻害剤濃度を用いて行われた反応の両方の強度の割合をHillの4パラメーター式に適合させて、IC50値を決定した。各反応を2回実施し、各IC50の少なくとも3回の独立した決定を行った。
HPLCおよび質量分析法によるcSrc標識の分析
タンパク質を標準的な手順に従ってトリプシン処理した後、HPLCおよび質量分析を行って、所望のタンパク質断片へのフルオロフォアのコンジュゲーションを確認した。未標識および標識されたcSrc(60μg)を、10％ v/vのアセトニトリルを含む55 mM NH4CO3中、プロテオミクス等級のトリプシン(3μg)と共に別々にインキュベートした。サンプルを37℃で一晩インキュベートし、液体窒素中で凍結し、凍結乾燥した。次いで、凍結乾燥された粉末を分析のために75μlの水に再懸濁した。次いで、消化されたペプチド断片を分離し、バイナリーポンプ、サーモスタット自動サンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えたHPLC(Agilent 1100シリーズ)を用いて精製した。サンプルを、周囲温度で3μmの粒子径を有するWaters(Milford, MA, USA)Atlantis dC18カラム(2.1 mm x 150 mm)に通過させた。サンプルを、以下の勾配：100％溶媒A(水中の0.1％ギ酸)で5分間、55分かけて線状勾配で60％の溶媒B(アセトニトリル中0.1％ギ酸)まで上昇させた後、10分間で80％の溶媒Bに増加させた後、90分まで80％の溶媒Bで保持することを用いて0.2 ml/分で泳動させた。質量分析装置(Thermo LTQ)に、標準的な電子スプレーイオン源(光源電圧＝4 kV)を装備した。自動MS/MS分析を、最も強いピーク(必要とされる10,000の最少シグナル強度)について、トリプルプレー実験(通常のMS、最も強いピークのズームスキャン、次いで荷電状態が2以上であった場合のMS/MS)において実施した。35％の正規化された衝突エネルギーをMS/MS分析に用いた。
アロステリック阻害剤のスクリーニングおよびK d の決定
スクリーニング戦略を、384穴プレート中でアクリロダン標識されたcSrcについて実行した。候補化合物の保存液を、20xの最終的な所望の濃度でDMSO中で調製した。化合物を10および50μMの最終濃度で3回、標識されたcSrcと混合した。各ウェルは1μlの化合物＋100 nMのキナーゼを含む19μlの測定バッファー(+0.01％v/v Brij-35)を含んでいた(混合後に5％ v/vのDMSO)。プレートを接着性アルミホイルで覆い、RTで15〜30分間インキュベートした後、Tecan Safire2プレートリーダーを用いて445、475および505 nmの放出強度を測定した。アクリロダンを386 nmで励起した。結合をλ445/λ475の比を用いて測定したが(図18a)、阻害剤の結合様式をλ505/λ475の比により示した(図18b)。蛍光特性評価に関するさらなる詳細を、図17に提供する。潜在的なヒットを、キュベットまたは96穴プレート中でのさらなる滴定試験にかけて、Kd値を取得した。
細胞培養物
PC3およびDU145は、寛大にもRoman Thomas博士(Max Planck Institute for Neurological Research, Cologne)によって提供されたものである。この細胞を、10％熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)および100ユニット/mLペニシリン／ストレプトマイシンを補給したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。細胞を、5％CO2を含む加湿した空気中、37℃で培養した。阻害剤処理後(5時間)、細胞を冷却したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で2回洗浄した後、溶解バッファー(20 mM Tris-HCl pH7.5、150 mM NaCl、1％Triton、1 mM Na2EDTA、1 mM EGTA、2.5 mMピロリン酸ナトリウム、1 mMβ-グリセロリン酸、1 mM Na3VO4、1μg/mLロイペプチン、1 mM PMSFおよび一般的なプロテアーゼ阻害剤)中、氷上で10分間溶解した。続いて、細胞を20000 x gおよび4℃で20分間遠心分離した。上清を免疫ブロット分析にかけた。
SrcおよびFAKの免疫ブロット分析
分光光度計(ND-1000、peQLab)を用いてタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に移した。ブロットを、5％無脂肪乳を補給したTween-20を含むTris緩衝生理食塩水(TBST)中で1時間ブロックした後、抗ホスホ-FAK、抗ホスホ-Src、抗FAK、および抗Srcと命名された一次抗体中、4℃で一晩インキュベートした。全ての抗体はCell Signaling Technology社から取得したものである。洗浄後、ブロットを二次抗体と共にインキュベートした後、増幅化学発光(ECL)検出系を用いてフィルム上で検出した。
化学合成
キナゾリンの合成プロトコルは当業界でよく知られている。ピラゾロウレアの合成のためのプロトコルは、例えば、Reganら(2003)および本出願内で言及される他の刊行物に記載されている。
結晶化および構造決定
cSrc-RL37、cSrc-RL38、cSrc-RL45およびcSrc-T338M-RL45の結晶化およびデータ収集
cSrc-RL37およびRL38複合体構造について、本発明者らは、キナーゼ(20 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM DTT中で保存)と共に阻害剤(DMSO中で調製)を予備インキュベートして、結晶化の前に酵素-阻害剤複合体を形成させることによる懸滴蒸気拡散法により結晶を取得した。RL37およびRL38の場合、500μMの阻害剤を330μMの野生型ニワトリcSrcと共に2時間予備インキュベートした。結晶を、1μLのタンパク質-阻害剤溶液と、1μLのリザーバー溶液(0.1 mM MES(pH 6.9)、4％グリセロール、10％PEG4000および50 mM酢酸ナトリウム) (Seeligerら、2007)とを混合した後、20℃で成長させた。トリクリニック(tri-clinic)空間基P1の平面状の結晶が1日以内で成長した。RL45の場合、同じ濃度の阻害剤を、180μMの野生型cSrcまたはcSrc-T338Mと共に4時間予備インキュベートした。0.2μLのタンパク質-阻害剤複合体と、0.2μLのリザーバー溶液(85 mM MES(pH6.5)、10.2％のPEG 20000、15％(v/v)のグリセロール)とを混合した後、20℃でシッティングドロップ法を用いて結晶を成長させた。Mosquito Nanodrop結晶化ロボット(TTP LabTech Ltd., Melbourn, UK)を用いて液滴をピペッティングした。阻害剤RL37およびRL38とのcSrcの結晶のために、20％のグリセロールを凍結防止剤として用いた後、それらを液体窒素中で瞬間凍結した。cSrcとRL45との結晶を、グリセロールを添加せずに直接凍結させた。全てのcSrc-阻害剤複合体結晶の回折データを、1Åに近い波長を用いて、cSrc-RL37およびcSrc-RL38については2.5ÅならびにcSrc-RL45については2.6Åの解像度でSwiss Light Source (PSI, Villingen, Switzerland)のPX10SAビーム線で収集した。データセットをXDS(Kabsch, 1993)で加工し、XSCALE(Kabsch, 1993)を用いてスケール化した。
cSrc-RL37、cSrc-RL38、cSrc-RL45およびcSrc-T338M-RL45の構造決定および精製
全部で4種のcSrc-阻害剤複合体構造を、鋳型として公開されたcSrc構造2OIQ(Seeligerら、2007)を用いて、PHASER(Read, 2001)との分子置換により解像した。非対称ユニット中の2個のcSrc分子を、COOTプログラム(EmsleyおよびCowtan、2004)を用いて手動で改変した。このモデルを、シミュレートされたアニーリングを用いるCNS(Brungerら、1998)を用いて最初に精製して、モデルの偏りを除去した。最後の精製を、REFMAC5(Murshudovら、1997)を用いて実施した。Dundee PRODRG2サーバー(Schuttelkopfら、2004)を用いて作製した場合、阻害剤のトポロジーをファイルした。精製された構造を、PROCHECKを用いて検証した(Laskowskiら、1993)。
アクセッション番号
座標および構造因子を、Protein Data Bankに以下のアクセッション番号の下で寄託した：RL37に結合したcSrc、3F3U；RL38に結合したcSrc、3F3T；RL45に結合したcSrc、3F3VおよびRL45に結合したcSrc-T338M、3F3W。
cSrcキナーゼのIII型阻害剤の同定
いくつかの腫瘍型、特に、胃腸癌および前立腺癌(Yeatman, 2004)において過剰発現されるか、または上方調節されると提唱されているため、およびIII型阻害剤はまだ報告されていないため、本発明者らはチロシンキナーゼcSrcを選択した。さらに、cSrc中の門番は、EGFRの最初の臨床出現が報告される前(Blenckeら、2003)でも、ATP競合阻害剤に対する薬剤耐性突然変異のホットスポットであると推測された。DFG-in(Breitenlechnerら、2005)およびDFG-out(Darら、2008、Seeligerら、2007)コンフォメーションにあるcSrcのいくつかの結晶構造がProtein Data Bankで利用可能であり、これは本発明者らのアッセイがこのキナーゼを用いて成功することを示唆している。スクリーニング戦略において、本発明者らは、本発明者らの新しく開発された蛍光タグ付cSrcアッセイを用いて、μM範囲のKd値を有するcSrcへのIII型アロステリック結合剤として、4種のピラゾロウレア化合物(3-6)(関連する図面では1a-1dとも呼ばれる)を同定した(図19)。III型阻害剤の結合はcSrcキナーゼについてはまだ報告されていないが、いくつかのピラゾロウレアは低いnM範囲の親和性を有するp38αキナーゼの強力なIII型結合剤であることが知られ(Pargellisら、2002；Dumasら、2000)、記載のII型p38α阻害剤BIRB-796が開発されたコア足場を形成する。(3-6)の結合を蛍光cSrcを用いて検出したが、Kdの正確な決定は、50μMを超える制限された化合物の溶解性に起因して不可能であった。続いて、酵素活性アッセイを用いて、これらのスクリーニングヒットが実際にcSrcキナーゼ活性を阻害することを確認し、再度制限された溶解性に起因して、本発明者らは中程度のμM範囲でもIC50値を有するようである(3,RL57)および(5,RL38)によるcSrcの阻害を観察することしかできなかった(図19b)。(3-5)中の共有されたR2アニリン部分を考慮すると、両アッセイ形式における(3、RL57)に対する選択性は、R1アリール置換基の大きさおよび疎水性の程度が、不活性cSrcへのエネルギー的により好ましい結合の重要な決定因子であることを示唆している。次いで、同じ活性アッセイを、薬剤耐性cSrc変異体(T338M)(Blenckeら、2003；Michalczykら、2008)を用いて実行し、より嵩高い門番残基の存在は野生型cSrcと比較した場合、(3,RL57)活性に対する効果を有さないが、(5,RL38)は最早活性ではないようであることを示し、cSrcに対するその親和性への寄与における(3,RL57)のR1部分の重要性をさらに強調している。キナゾリン(9,RL56)、(10,RL6)(関連する図面ではそれぞれ2bおよび2cとも呼ばれる)およびcSrc-T338Mにおける効力の劇的な喪失を示すアミノチアゾールダサチニブなどのI型阻害剤と違って(図2b)、この残基は門番位置の後ろで、かつアロステリックポケットの内側にのみ結合する最適なサイズおよび疎水性の程度を有する化合物と干渉しないと予想される。
cSrc中のIII型阻害剤の複合体構造
これらの化合物の親和性および選択性プロフィールをより良く理解し、不活性キナーゼ(DFG-outコンフォメーション)のアロステリック部位への結合を確認するために、本発明者らはcSrcとの複合体にあるいくつかのピラゾロウレアを結晶化し、(4,RL37)(図20)および(5,RL38)cSrc複合体の高品質回折結晶を取得した。この構造を、非対称ユニット中の2個の分子との分子置換により空間基P1中で解像し、両構造の配位を2.5Åに精製した。キナーゼの活性化ループおよび隣接するへリックスCはDFG-outコンフォメーションで認められ、阻害剤はその電子密度により明確に定義され、キナーゼドメインの予想されるアロステリック部位に存在する(図20a)。本発明者らの知識では、これはIII型阻害剤との複合体にある非受容体チロシンキナーゼの初めて報告された結晶構造である。2個のタンパク質分子の各々は不活性cSrc-イマチニブ構造と良く重ね合わさる(Seeligerら、2007)。この公開された構造と同様、DFGモチーフのF405を阻害剤により置換し、ATP結合部位中で反転させて、DFG-out、または不活性コンフォメーションを採らせ、ATPの結合に接近できないようにした。さらに、キナーゼドメインのDFG-ループおよびへリックスCと、阻害剤のウレア部分との間の重要な水素結合相互作用は保存されており、cSrc(Darら、2008)、B-Raf(Wanら、2004)およびp38α(Pargellisら、2002)との複合体にある他のウレア誘導体について報告されたものと等構造(isostructural)である。
cSrcキナーゼのための強力なII型ハイブリッド阻害剤の設計
cSrc中のこれらのIII型ピラゾロウレアの中程度のIC50値(μM)を考慮して、本発明者らは、本明細書で得られたX線結晶構造と、以前に公開されたcSrcとの複合体にあるキナゾリンのX線結晶構造(Michalczykら、2008)を用いて、cSrcに対する高い親和性を有するより大きな阻害剤分子を設計した。本発明者らは、cSrc-RL37複合体と、4-アミノ-キナゾリンとの複合体にある本発明者らの最近解像されたcSrc構造の1つ(Michalczykら、2008)とを重ね合わせ、両阻害剤足場のフェニル置換基(キナゾリンの4-アミノフェニルおよびピラゾロウレアのR1)がThr338門番側鎖の近くに良好に整列する(図20b)ことを見出したが、これは、1,4-パラまたは1,3-メタ置換されたリンカー部分を介して両足場を融合することにより、より強力な阻害剤を作製することができることを示唆している(図20c)。本発明者らは、NMR(Shukerら、1996)もしくはタンパク質X線結晶解析(Gillら、2005；Nienaberら、2000)により同定された分子断片を効率的に連結もしくは増殖させて高い親和性を有する分子を作製することができる断片に基づく設計手法、ならびにDFG-out結合剤の合理的設計の新しい概念(LiuおよびGray、2006；Jacobsら、2008)の両方により刺激された。両方法は、キナーゼリード探索計画において強力であることがわかっている(Okramら、2006；Warnerら、2006)。
ピラゾロウレアはp38αの阻害のための特権的モチーフであることがわかっており、門番残基の後ろの、キナーゼにおける薬剤耐性と関連することが多い位置に結合するため、本発明者らはまた、より大きい門番側鎖を考慮するさらなる構造に基づく設計プロセスのためのキナーゼ阻害剤選択性の決定因子を研究するための出発点としてこれらのアロステリック足場を使用したかった。本発明者らは、提唱される1,4-パラおよび1,3-メタハイブリッド化合物を、p38αのDFG-outコンフォメーションに結合したBIRB-796の公開された構造(Pargellisら、2002)中にドッキングさせ、不活性cSrcと比較した場合、門番残基とDFGモチーフの近辺の異なる結合部位形状を観察した。これらの観察を考慮して、本発明者らは、cSrcが1,4-パラ結合を介して融合されたハイブリッド化合物をより良好に提供するが、1,3-メタ結合はp38αへの結合を好むべきであると推測した。より重要なことに、本発明者らは、これらの化合物における1,4-置換パターンが、薬剤耐性キナーゼに認められるような門番位置のより大きいアミノ酸側鎖との立体衝突を回避するための最適な形状を提供すると推測した。4-アミノキナゾリン(9,10)および同定されたピラゾロウレア(3および5)は単独で野生型cSrcにおいてはμM範囲のIC50を有する弱い阻害剤断片であるが、本発明者らは、得られる1,4-置換ハイブリッド化合物が野生型の阻害において有意に増加した効力を示すだけでなく、薬剤耐性cSrc-T338M突然変異体においてもそうであると予想した。
新規II型阻害剤としての4-アミノ-ピラゾロウレア-キナゾリンのフォーカスライブラリーの合成
本発明者らは、cSrcの新規阻害剤として融合キナゾリンピラゾロウレアの小さいフォーカスライブラリーを合成した(図21および図22)。パネルは、薬剤耐性cSrc-T338Mの立体門番残基の周囲に向かい、これらの型のピラゾロウレア足場を含む化合物により強力に阻害されることが知られるキナーゼであるp38αに選択的に結合するように設計された変化する阻害剤形状を有する類似体を含んでいた。
新規II型ハイブリッドcSrc阻害剤のin vitroでの特性評価
本発明者らの共結晶化実験により確認されたアロステリック部位が実際に溶液中で薬剤たり得るのかどうかを試験するため、ならびにp38αおよび薬剤耐性cSrc-T338Mに対する阻害剤の選択性に関する上記の仮説を試験するために、本発明者らはまず、上記の蛍光標識されたキナーゼアッセイ系を用いて各化合物のKDを測定した。各蛍光キナーゼから得られた結合データは、それぞれ、cSrcおよびp38αに対する1,4-および1,3-置換されたハイブリッド化合物の予想された結合選択性を確認した。さらに、本発明者らはいくつかのII型ハイブリッド化合物を用いるcSrc(野生型および薬剤耐性)に関する酵素活性アッセイ(図21)を実施して、リン酸転移の阻害を確認した。本発明者らは、各II型ハイブリッドを構築するのに用いたピラゾロウレア(3,5)またはキナゾリン(9,10)部分と比較した場合、これらの化合物の測定されたIC50値における効力の有意な(最大で4桁)増加を観察した。測定されたKD値は、IC50値と比較してわずかにより高いが、1,4-および1,3-置換されたハイブリッド化合物について同じ傾向に従う。最後に、および最も重要なことに、動力学は、1,4-置換されたハイブリッド化合物(11a-c)(関連する図面では3a-3cとも呼ばれる)がin vitroでcSrc-T338M突然変異体の効力の喪失を示さないことを明確に示している。
阻害剤とのp38の結晶化
様々な阻害剤を、未改変のp38αについて以前に報告された条件(Bukhtiyarovaら、2004)と同様の条件を用いて野生型p38αと共結晶化した。簡単に述べると、タンパク質-阻害剤複合体を、30μLのp38α(10 mg/mL)と0.3μLの阻害剤(DMSO中の100 mM)とを混合し、混合物を氷上で1〜2時間インキュベートすることにより調製した。サンプルを13,000 rpmで5分間遠心分離して、過剰の阻害剤を除去した。懸滴蒸気拡散法を用いて、および1.5μLのタンパク質-阻害剤溶液と0.5μLのリザーバー(100 mM MES pH 5.6-6.2、20-30％PEG4000および50 mM n-オクチル-β-D-グルコピラノシド)とを混合することにより、24穴結晶化プレート中で結晶を成長させた。
p38αと阻害剤との結晶のために、20％グリセロールを凍結防止剤として使用した後、それらを液体窒素中で瞬間凍結した。p38α-SB203580およびp38α-RL45複合体結晶の回折データを、1Åに近い波長を用いてSwiss Light Source (PSI, Villingen, Switzerland)のPX10SAビーム線で収集した。p38α-RL48、p38α-RL62およびp38α-ソラフェニブ複合体の回折データを社内で収集した。全てのデータセットをXDS(Kabsch, 1993)を用いて処理し、XSCALE(Kabsch, 1993)を用いてスケール化した。全てのp38α-阻害剤複合体構造を、鋳型として公開されたp38α構造(PDBコード：1ZYJ)(Michelottiら、2005)または(PDBコード：2EWA)(Vogtherrら、2006)を用いるPHASER(Read, 2001)による分子置換により解像した。非対称ユニット中の分子を、COOTプログラム(EmslexおよびCowtan、2004)を用いて手動で改変した。このモデルはモデルの偏りを減少させるためにシミュレートされたアニーリングを用いてCNSと共に初めて精製されたものである(Brungerら、1998)。この最後の精製を、REFMAC5(Murchudowら、1997)を用いて実施した。Dundee PRODRG2サーバー(Schuttelkopfおよびvan Aalten、2004)を用いて作製された場合、阻害剤のトポロジーをファイルする。精製された構造を、PROCHECK(Laskowskiら、1993)を用いて検証した。PyMOL(de Lano, 2002; http:///www.pymol.org)を用いて図面を作成した。
cSrcおよび薬剤耐性cSrc-T338M突然変異体中での新規II型阻害剤の複合体結晶構造
このクラスのII型阻害剤の結合様式のより深い洞察を得るため、およびこれらの1,4-置換された阻害剤がどのように嵩高いMet門番残基をバイパスすることができるのかを理解するために、本発明者らは、cSrc(野生型および薬剤耐性)とRL45(11b)とを共結晶化させ、この化合物がDFG-outコンフォメーションに結合し、アロステリック部位から遠いATP結合ポケットに広がる提唱されたII型阻害剤結合様式を採用することを見出した(図23)。
簡単に述べると、キナゾリン部分のN1は、cSrc(Michalczykら、2008)、CDK2(Shewchukら、2000)、p38α(Shewchukら、2000)、Aurora(Heronら、2006)よびEGFR(Blairら、2007；Stamosら、2002)に結合するキナゾリンについて典型的に観察される、キナーゼのヒンジ領域(M341)との直接的水素結合相互作用を作る。ピラゾロウレア部分はへリックスCにより形成されるアロステリック部位および活性化ループのN末端領域に存在し、cSrc-RL37およびcSrc-RL38複合体について見られるようにタンパク質との同一の水素結合相互作用を形成する。キナゾリンとピラゾロウレア足場を架橋する阻害剤の中心フェニル環は、門番残基とDFGモチーフのF405との間に挟まれている。興味深いことに、cSrc-T338M-RL45複合体においては、立体的に要求するMet門番の存在が、阻害剤の中心フェニル部分を90°反転させて、阻害剤のフェニル環の平面がM338のCεに面するようにアミノ酸側鎖との立体衝突を回避させる。さらに、F405の側鎖は90°回転して、両π電子系(阻害剤のフェニルとF405のフェニル側鎖)の静電的に好ましいedge-to-face方向(Hunterら、1991)を保存する(図23cおよび23d)。1,3-置換されたハイブリッド化合物(11dおよび11e)(関連する図面中では3dおよび3eとも呼ばれる)中の中心フェニルエレメントの回転は、キナゾリンまたはピラゾロウレア部分とタンパク質との結合を破壊せずには不可能であり、(11d)および(11e)などの1,3-二置換されたハイブリッドが薬剤耐性cSrc-T338Mに結合しない理由の説明を提供する(図24)。
II型cSrc阻害剤はcSrc依存的癌細胞系における細胞間接触を破壊する
細胞系におけるRL46(11c)によるcSrc阻害を評価するために、本発明者らは、様々な濃度のRL46(11c)、100 nMダサチニブ(陽性Src阻害対照)、またはビヒクル(DMSO)でPC3およびDU145前立腺癌細胞系を処理した。本発明者らは、Y416(cSrcの活性化ループ中の自己リン酸化部位)およびY576/Y577(焦点接着キナーゼ(FAK)の活性化ループ中の2個の残基)のリン酸化状態をモニターした。FAKは細胞間で形成する焦点接着に局在化し、細胞周期進行、細胞生存および細胞移動の重要な調節因子であるcSrcの非受容体チロシンキナーゼ基質である(Schaller, 2001)。cSrcキナーゼによるY576およびY577上でのFAKのリン酸化および活性化はFAKの完全な酵素活性にとって必要であり、焦点接着の破壊を引き起こし、細胞間接触および細胞-マトリックス接触の喪失ならびにアポトーシスをもたらす(Yeatman, 2004; Clalbら、1995)。FAKおよびcSrcの過剰発現は、乳癌および結腸癌の両方において細胞侵襲および転移の増加をもたらすことが示されている(Novakowskiら、2002)。ダサチニブまたはRL46(11c)による集密なPC3およびDU145細胞の5時間の処理後、pSrcおよびpFAKレベルは顕著に低下した(図25a)。これは、細胞接着の喪失および細胞数の有意な減少により示される、細胞表現型における異なる変化と相関していた(図25b)。本発明者らの結果は、観察された表現型の変化がこれらの2つの癌細胞系における本発明者らのハイブリッド化合物によるcSrcキナーゼの直接的阻害に起因することを明確に示している。
直接的阻害剤結合のキナーゼ選択性プロフィール
本発明者らの新しく開発されたII型ハイブリッド化合物に対するキナーゼの選択性を決定するために、キナーゼのプロファイリングを、5μMの濃度の64種の異なるキナーゼ(Ambit Biosciences)の選択されたサブパネルに対するRL45(11b)について実施した(図26)。阻害剤のプロファイルは、2つの主要なキナーゼ群：(i)TK(チロシンキナーゼファミリー)および(ii)CMGC(CDK、MAPK、GSK3およびCLKファミリー中のセリン-トレオニンキナーゼ)に対する異なる選択性でDFG-outコンフォメーションを採用することができる系統発生的に異なるキナーゼに結合するRL45(11b)の傾向を示す。RL45(11b)のプロファイリングが多くの(全てではないが)TKに固く結合する強い選択性を示したことに留意すべきなのは興味深い。多くのセリン／トレオニンキナーゼファミリー(すなわち、CAMKおよびAGCファミリー)に対するRL45(11b)の結合は多くの場合非常に弱いとスコア化されたが、RL45(11b)はセリン-トレオニンキナーゼのCMGCファミリーに対する異なる選択性を示した。これらのキナーゼの配列アラインメントの分析は、これらのCMGCキナーゼの多くが、PheまたはThr門番を含むことを示している。本発明者らは、RL45(11b)が突然変異cSrcなどのTK中のこれらの大きい門番をどのように克服することができるかの構造的詳細および阻害剤の中心フェニルとDFGモチーフのPheとの間の好ましいedge-to-faceのπ-π相互作用の形成を明確に示した。本発明者らは、セリン-トレオニンキナーゼの試験したCMGCファミリーのいくつかにおいて観察されたPhe門番も同様の機構により阻害剤を安定化し、RL45(11b)によるこれらのキナーゼの強力な阻害をもたらすと推測する。TKはまた、RL45(11b)に対して感受性であり、本発明者らはこれを、多くのTKに認められるより小さい門番(ThrまたはVal)に帰している。in vitro結合アッセイと活性アッセイの組合せは、本明細書で提供されるキナゾリンピラゾロウレアハイブリッドが、阻害剤選択性を指令するさらなる医療化学戦略のための有望なキナーゼ阻害剤足場であることを示している。門番は多くのチロシンキナーゼ中ではThrであり、
I型阻害剤の選択性および親和性の重要な決定因子としても働く。従って、阻害剤と薬剤耐性疎水性門番の側鎖およびDFGフェニルアラニン残基との潜在的なクロストークの観察と組合わせたこれらのII型ハイブリッド阻害剤の開発は、一般的な門番突然変異に関連する薬剤耐性の増加を克服するための魅力的な生化学的戦略を提供する。
p38に関するII型およびIII型阻害剤のSAR
本発明者らは、薬理活性団および結合様式がp38αにおいて公知である化合物のクラスであるピラゾロウレアのフォーカスライブラリーを設計および作製し、この足場の新規誘導体を使用して、構造活性相関(SAR)を試験し、ac-p38αの蛍光応答を特性評価した。ピラゾロウレアは、III型およびII型キナーゼ阻害剤の原型の1つである。III型ピラゾロウレアは以前の臨床候補BIRB-796の開発を刺激しただけでなく(Reganら、2002)、豊富な構造および速度データを提供し、ac-p38αを用いて本明細書で決定されたKd値(図31)と、他の手法(Pargellisら、2002；Reganら、2003；Kroeら、2003)との比較を可能にした。また、これらの公知の化合物のいくつかを合成して、本発明者らの蛍光タグ付キナーゼ結合アッセイのための物差しとして役立てた。
予想通り、BIRB-796のKdは、他の場所で報告されたように(Pargellisら、2002)、時間依存的であった(図9)。全てのIII型阻害剤はまた、この時間依存性を示したが、p38αについては平衡に達するにはあまり時間を必要としなかった(2〜4時間)。かくして、エンドポイント測定を行う前にII型およびIII型リガンドの完全な結合を確保するためには、長い予備インキュベーション時間が必要である。一般的には、本発明者らは、本発明者らのKd値と、他の手法を用いて既知の化合物について他の場所で報告されたものとの優れた一致を見出したが、最も大きい差異は10 nM未満の公開されたKdを有する化合物について生じた。BIRB-796について上記で考察されたように、p38αに対するDFG-out結合剤の親和性は、主にkoffによって決定付けられる。従って、本発明者らは、最も強い結合剤に関する文献で報告されたKd計算値は、koffが測定され、用いた方法(Kroeら、2003)に応じて有意に変化することが示された実験条件により影響を受けると考えている。しかしながら、SARにおける特定の傾向は、測定を行うのに用いられるアッセイ系に関わらず、アリール部分I(ウレアに結合した置換フェニル)およびアリール部分II(ピラゾールに結合した置換フェニル)に関して常に維持される。
アリール部分Iの場合、本発明者らは、13(RL33)(フェニル)<<12e(RL34)(4-クロロフェニル)<6(RL35)(ナフチル)のような顕著な親和性ランキングを観察したが、これは文書で十分に立証されたSAR傾向である(Pargellisら、2002；Reganら、2002；Reganら、2003；Kroeら、2003；Reganら、2003)。部分Iはp38αの門番残基の後ろの小さい疎水性サブポケット中に固定し、より嵩高いナフチル部分はこのサブポケットにより深く貫通するその能力の結果として、より良好な親油性相互作用を形成する。このサブポケット中へのより嵩高いナフチルの埋込みの際により高い溶媒和エントロピーが得られる(より多くの水分子の放出)ことを議論することもできる(Lafontら、2007)。かくして、この位置のフェニル部分のみが化合物の親和性に有意に寄与するわけではなく、12e(RL34)および6(RL35)と比較して13(RL33)の非常により高いKdを説明している。50倍より高いKdをもたらす、BIRB-796のより嵩高いナフチルの代わりに中心フェニルを有する、15,RL39によりこれをさらに確認する。これらの化合物に関する同様の知見も、他の手法を用いて他の場所で観察された(Reganら、2002)。このサブポケットの疎水性特性を考慮すれば、より極性の高い4-アミノフェニル16a,b(RL43,RL42)または3-アミノフェニル17a,b(RL41,RL79)III型誘導体に対する親和性の有意な喪失が見られることは驚くべきことでもない。
1,RL8のピラゾールのN1へのモノ置換アリール部分IIの付加は、リガンドをアロステリックポケット中に伸長させ、親和性の有意な増加をもたらす。このフェニル環は、本発明者らのアッセイにおいてパラおよびメタ位置にある置換基に対する異なる選択性を示し、そのSAR傾向も文書で十分に立証されている(Reganら、2002)。部分IIの置換パターンの重要性をさらに調査するために、本発明者らは、より嵩高い阻害剤7(RL19)を設計、合成するためのin silicoモデリングと共に、BIRB-796(PDB-コード：1kv2)との複合体にあるp38αの結晶構造を用いた。本発明者らは、フェニル環上での4-トリフルオロメチルおよび2,6-ジクロロ置換パターンの組合せが、化合物がアロステリックポケット中に固定されるのを防止すると仮定し、これをac-p38αからの蛍光応答の完全な欠如により確認した。
上記の実施例20に記載のように、本発明者らは、cSrcキナーゼのいくつかのII型キナゾリン-ピラゾロウレアハイブリッド阻害剤の開発を報告した。cSrcの場合、より小さいIII型ピラゾロウレアは、中程度のμMのIC50値でcSrcを阻害することがわかった。1,RL8からのBIRB-796の開発(Regan、2002)と同様の様式で、cSrcのμM阻害剤でもある(Michalczykら、2008)、これらの化合物とキナゾリン足場との融合物は、ATP結合部位中に伸長して、ヒンジ領域と相互作用する強力な低nMのII型阻害剤をもたらした。さらに、本発明者らは、p38αが類似する1,3-メタ融合阻害剤11d(RL61)および11e(RL62)をより良好に提供すると推測するための分子モデリングを用いながら、1,4-パラ融合ハイブリッド11a(RL44)、11b(RL45)および11c(RL46)がcSrcに対するより良好な結合剤であることを示した。ac-p38αを用いて、本発明者らは、この仮説を確認することができ、11d(RL61)および11e(RL62)が11a(RL44)および11b(RL45)よりも6倍より高い親和性を有することを見出した。本発明者らは、それぞれp38αとの複合体にある11e(RL62)および11b(RL45)の結晶構造を分解し、1,3-メタハイブリッドがp38αに対するより高い親和性を有する理由を説明するさらなる安定化相互作用を観察した(図32)。本発明者らはまた、ac-p38αを用いるこれらの化合物の動的速度定数の広範囲の分析を実施し(表6)、11e(RL62)の解離速度が11b(RL62)のものよりも遅いが、両化合物は結合に関して類似するkobsを示し(それぞれ、11e(RL62)については1.40±0.25 x 10-3s-1(n=3)および11b(RL45)については1.36±0.13 x 10-3s-1(n=3))、これは11e(RL62)のより高い親和性に部分的に依るかもしれない。最後に、1,3-および1,4-融合ハイブリッド化合物のこれらの詳細な動力学および構造特性評価により、本発明者らはp38αの強力なII型阻害剤である新規化合物としていくつかのピラゾロウレア-キノリン類似体を設計、合成した。
Figure 2011528560
さらなるII型ハイブリッド阻害剤のSAR
1,3-メタハイブリッドに対するp38αの選択性をより良く理解するために、本発明者らは、野生型キナーゼと複合体にある11e(RL62)および11b(RL45)の両方の結晶構造を解像した(図32)。両化合物は、活性化ループがDFG-outコンフォメーションを採用する原因となり、各阻害剤はII型結合様式で結合する。しかしながら、p38αにおける1,3-メタハイブリッド11e(RL62)に対する選択性を説明するDFGモチーフの構造再配置における異なる差異が観察された。より具体的には、DFGモチーフのPhe169はキナゾリンコアの平面の隣の位置に約4Å移動し、両π電子系の好ましいedge-to-face方向の形成をもたらす。さらに、RL45-p38α複合体中では観察されない、阻害剤とDFGモチーフとの間で形成される複雑な水を介する水素結合ネットワークが存在する。DFG-outコンフォメーションに対するこれらのさらなる安定化効果は、p38αに対する1,3-メタハイブリッドのより高い親和性を説明することができる。
興味深いことに、キナゾリンのN3は、p38αとの両複合体にあるThr106門番の側鎖に対して水素結合距離の範囲内にあるようである。この相互作用の役割をさらに調査するために、本発明者らは、1,4-パラキノリンハイブリッド11c(Rl46)の効力を調査したが、そのキナゾリンハイブリッド対応物11b(RL45)と比較して親和性の有意な喪失を見出さなかったが、この相互作用はこの一連の化合物の結合にとって必須ではないことを示唆している。
本発明者らは、ピラゾールのN1から伸長するフェニル上のメチル置換基(部分II)が、メタ(3-メチルフェニル)からパラ(4-メチルフェニル)位置に移動する類似体化合物11i-pを作製することによりハイブリッド11a-hのSARを進めた。本発明者らは、この小さい変化が、そのKd値がp38αにおいて最早有意に異ならないように、それぞれ1,4-パラハイブリッドおよび1,3-メタハイブリッドの親和性のわずかな増加および低下をもたらすことを見出した。本発明者らは、そのキナゾリン類似体11I(RL48)と比較して、1,3-メタキノリンハイブリッド11n(RL51)に対する親和性の2倍の喪失を観察した。チロシンキナーゼcSrc中と違って、これらの1,4-パラII型ハイブリッド化合物が、そのより小さいIII型ピラゾロウレア対応物と比較した場合、p38αにおいてより悪い阻害剤であり、それらをp38αのあまり最適でない阻害剤にすることに留意することが重要である。
本発明者らは、cSrcなどのチロシンキナーゼにおけるCへリックスの移動の増加(Levonsonら、2006)が、これらのより大きいハイブリッド分子に結合部位をサンプリングするためのさらなる余地を提供し、より良好に適合することがわかることを前提とする。アロステリックポケットの「屋根」の有意な部分を形成するCへリックスの移動はまた、p38αと比較してcSrc中のIII型足場の有意に低下した親和性を説明することもできる。p38αのCへリックスは複数のコンフォメーションをサンプリングせず、かくして、III型ピラゾロウレア化合物のより堅いポケットおよびより熱力学的に好ましい結合をもたらす。この理論は、ac-p38αを用いてII型阻害剤11b(RL45)および11e(RL62)ならびに近いIII型類似体12a(RL29)について決定されたkoff値により支持される(表6)。直接Kd測定は、これらの化合物の親和性が以下のようにランク付けられ(12a>11e>11b)、これが測定された解離速度、または各化合物に関する滞留時間と主に相関することを示した。DFGモチーフのPhe169と、11eのキナゾリンとのπ-π相互作用と共に、前記の水を介する水素結合ネットワークは、そのII型結合様式を良好に安定化するのに役立ち、かくして、11bと比較したそのより遅い解離速度およびより低いKdを説明している(Kd＝koff/kon)。化合物5はまた、1,4-パラ置換パターンを有する中心フェニル部分を共有し、同様の速度でp38αから解離する。cSrcとは対照的に、DFG-out結合剤がより速く解離する場合、12aなどのIII型リガンドはp38α中でより長い滞留時間を有し、それによって11b、11eおよび15と比較したそのより高い親和性を説明している。11bおよび11eと類似する中心フェニル部分も有するソラフェニブのより速い解離は、十中八九、それがこれらの化合物ほど多くのアロステリックポケットを占有しないという事実に起因する。ソラフェニブのこれらのより高い解離速度は、同様により速い結合速度と良好に平衡化しており(データは示さない)、それによってp38αに対するソラフェニブの高い親和性を維持している。
また、12aがp38αの門番残基の後ろの疎水性サブポケットをより良好に占有するp-クロロフェニル部分を有し、リガンドの解離を遅延させ得ることにも留意すべきである。同様に、II型阻害剤BIRB-796は、この位置にナフチル部分を含み、そのフェニル類似体5よりも遅い解離速度およびp38αに結合する最も高い親和性をもたらす。
[実施例２７]
p38およびcSrcに関して得られた結果の比較と見解
阻害剤の選択性および薬剤耐性の出現は、長期間の治療において有効であるキナーゼ阻害剤の開発における基本的な課題のままである。ここで、本発明者らは、異なる型のキナーゼ阻害剤の結合を検出および定量するための強固で新しい方法を提供する。本発明者らは、蛍光標識されたキナーゼを作製して、活性化ループ中のコンフォメーション変化をモニターし、チロシンキナーゼcSrcの不活性DFG-outコンフォメーションを安定化させるアロステリック結合剤の識別を可能にした。本発明者らは、スクリーニング戦略においてこのアッセイを使用し、弱いcSrc結合剤としてピラゾロウレアを同定した。これらのIII型阻害剤の結合様式はcSrcおよびp38αにおいては等構造であるが(Pargellisら、2002)、cSrcに対するこれらの化合物の親和性がp38αに対する親和性よりも3桁低い理由は不明である。蛍光-cSrcに対するII型阻害剤(11a)の結合のリアルタイム動的測定は、その理由がコンフォメーション動力学にあり得ることを示唆している。cSrcと(11a)との結合は30秒以内に平衡に到達するが、同じ化合物がp38αとの結合平衡を達成するには最大で300秒必要である(図27)。II型およびIII型化合物のより遅い結合速度は、典型的にはp38αに関するものであり、文書で十分に立証されている(Pargellisら、2002)。本発明者らの動的測定に関しては、cSrcはリン酸化された活性状態にあったが、p38αは細菌から発現、精製された場合、リン酸化されていない。さらに、この研究において用いたcSrcキナーゼドメインはSHドメインを含まず、へリックスCはその活性および不活性コンフォメーションをより容易にサンプリングさせたが(Levinsonら、2006)、p38α中のへリックスCは不活性cSrcのものと類似するコンフォメーションに留まる。従って、cSrcはそのコンフォメーション空間をより迅速にサンプリングするようであるが、不活性コンフォメーションにおいてp38αよりも少ない合計時間を費やす。これは、ピラゾロウレアに結合することができるコンフォメーションがcSrc中で迅速に作られるが(より速い結合特性の観察をもたらす)、p38αにおけるよりも高いエントロピー消費に達する(cSrcに対するより低い親和性をもたらす)ことを意味する。さらに、cSrc中でへリックスCにより受けたコンフォメーション交換は、ピラゾロウレアのウレア部分との重要な水素結合相互作用を作る残基であるE310(図20および23)を、p38αにおけるその対応物(E71)よりもあまり入手できないようにし、さらにcSrcに対するピラゾロウレアの弱い親和性に寄与している。
p38αと比較してcSrcに対する結合が弱いにも関わらず、初期のピラゾロウレアヒットは、より強力なcSrc阻害剤の開発のための優れた出発点であることがわかった。cSrc中のこれらのIII型足場の構造の分析およびキナゾリンに基づくI型阻害剤との複合体にあるcSrcの構造に基づいて、本発明者らは優れたcSrc阻害剤であることがわかったキナゾリン-ピラゾロウレアハイブリッド化合物を設計した。いくつかの誘導体を合成して、これらの化合物の形状が、cSrcもしくはp38αへのその選択的結合を支配し、特定の癌細胞型における薬剤耐性を一般的に引き起こすことが知られるより大きい門番残基を回避するという本発明者らの推測に基づいてSARを調査した。本発明者らは、直接的Kd決定(蛍光cSrcおよびp38α)、キナーゼ活性アッセイおよびX線結晶分析を用いて、これらの仮説を確認することができた。これらの化合物の増加した親和性は、キナーゼのヒンジ領域と接触する付加された4-アミノキナゾリン部分に起因するだけでなく、門番残基の近くに位置する中心フェニル部分の置換パターンにも起因していた。パラおよびメタ置換化合物は両方とも低い〜中程度のnM範囲でcSrcを阻害するが、1,4-置換ハイブリッドの中心フェニル部分は薬剤分子の残りの配置を妨げることなく、より嵩高い門番側鎖との衝突を回避するのに必要な回転自由を有するため、これのみが薬剤耐性突然変異を克服した。cSrcに関連する前立腺癌細胞系におけるこれらの化合物の活性は、これらのより選択性が高く、より強力なハイブリッド化合物の設計において用いた構造に基づく論拠を支持する。どのキナーゼが標的化された治療の計画の下で点突然変異に関連する薬剤耐性を生じるかは明らかではないが、より多くのキナーゼ阻害剤を用いてより大きい患者集団を治療する際、これが将来主要な問題になる可能性があることは明らかである。細菌およびウイルスによる抗微生物剤または抗ウイルス剤に対する耐性の出現から収集されたように、必須タンパク質の化学的不活化は、突然変異の発生率を増加させ、耐性を伝達する選択的圧力を作る。これらの突然変異を担持する細胞は、迅速に分裂する細胞集団においてより顕著になる。この課題を説明し、次世代のキナーゼ阻害剤の設計を刺激するために、過度の調査が行われており、将来の臨床的に関連する突然変異体キナーゼ対立遺伝子を発見し、それらを予測マーカーとして用いるためのモデル生物においてキナーゼ阻害剤による薬剤耐性形成を誘発している。そのような知識は、同定された腫瘍細胞型に最適化された化合物を用いることにより個人的な癌治療の概念を進化させるであろう(Bradeenら、2006；von Bubnoffら、2005；Zunderら、2008)。代替的な手法においては、どの位置がキナーゼにおける薬剤耐性関連突然変異を生じる可能性があるかに関する知識は、それらを克服することができる次世代の薬剤の設計にとって重要であろう。キナーゼは依然として研究された最も大きいクラスの酵素の1つであるが、薬剤耐性を克服するための戦略は骨の折れる作業であり、解決策は不十分であった。Crespoら(2008)は、イマチニブを再設計して、DFGループ中の障害を促進することにより薬剤耐性D816V Abl突然変異体への結合のエントロピー消費を最小化することができることを示した。本発明者らの結果は、キナーゼを不活性コンフォメーションに固定しながら、これらの突然変異により誘導される結合部位の歪みに適合する固有の能力を有するII型阻害剤を作製することにより、薬剤耐性を克服するための強力な代替的論拠を例示している。本発明者らはまた、本明細書で提供されたアッセイが、目的の他のキナーゼにも適合し、その効力が耐性突然変異により影響されないより強力かつ特異的な阻害剤を設計するのに必要とされる足場の探索をもたらすことができる強力な道具であると確信している。
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参考文献
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Claims (18)

  1. キナーゼの活性化ループ中に天然に存在するか、もしくはそこに導入された、遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸部位で、
    (a)その環境中の極性変化に対して感受性のチオールもしくはアミノ反応性フルオロフォア；または
    (b)チオール反応性スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化されたチオールもしくはアミノ反応性標識、
    で標識されたキナーゼであって、
    前記フルオロフォア、スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化された標識が、前記キナーゼの触媒活性を阻害せず、その安定性に干渉しない、前記キナーゼ。
  2. セリン／トレオニンまたはチロシンキナーゼである、請求項１に記載のキナーゼ。
  3. p38α、MEKキナーゼ、CSK、Auroraキナーゼ、GSK-3β、cSrc、EGFR、Abl、DDR1、AKT、LCKまたは別のMAPKである、請求項１または２に記載のキナーゼ。
  4. 遊離チオールまたはアミノ基を有する、標識しようとするアミノ酸が、システイン、リジン、アルギニンまたはヒスチジンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキナーゼ。
  5. 活性化ループの外側に存在する1個以上の溶媒露出したシステインが欠失または置換された、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキナーゼ。
  6. p38αであり、システインを配列番号1の位置172に導入し、好ましくは、配列番号1の位置119および162のシステインを別のアミノ酸と置換する、請求項３〜５のいずれか１項に記載のキナーゼ。
  7. cSrcであり、システインを配列番号2の位置157に導入し、好ましくは、配列番号2の位置27、233および246のシステインを別のアミノ酸と置換する、請求項３〜５のいずれか１項に記載のキナーゼ。
  8. チオールもしくはアミノ反応性フルオロフォアが、二置換ナフタレン化合物、クマリンに基づく化合物、ベンゾキサジアゾールに基づく化合物、ダポキシルに基づく化合物、ビオシチンに基づく化合物、フルオレセイン、スルホン化ローダミンに基づく化合物、AttoフルオロフォアもしくはLucifer Yellowまたは環境変化に対する感受性を示すその誘導体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキナーゼ。
  9. チオール反応性スピン標識が窒素酸化物ラジカルである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキナーゼ。
  10. キナーゼ阻害剤をスクリーニングする方法であって、
    (a)請求項１〜９のいずれか１項に記載の遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸部位で標識されたキナーゼを提供すること、
    (b)前記蛍光もしくはスピン標識された、またはアイソトープ標識されたキナーゼと、候補阻害剤とを接触させること、
    (c)励起の際に、工程(a)および工程(b)の前記蛍光標識されたキナーゼの1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルを記録すること；または
    (c)'工程(a)および工程(b)の前記スピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼの電子常磁性共鳴(EPR)もしくは核磁気共鳴(NMR)スペクトルを記録すること；ならびに
    (d)工程(c)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルまたは工程(c)'で記録されたEPRもしくはNMRスペクトルを比較すること；
    を含み、工程(c)で得られた前記蛍光標識されたキナーゼの少なくとも1個の波長、好ましくは最大放出での蛍光強度の差異、および／またはスペクトルにおける蛍光放出波長のシフト、または工程(c)'で得られた前記スピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼのEPRもしくはNMRスペクトルの変化が、候補阻害剤がキナーゼ阻害剤であることを示す、前記方法。
  11. キナーゼ阻害剤のリガンド結合の速度および／または結合もしくは解離の速度を決定する方法であって、
    (a)請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光標識されたキナーゼと、様々な濃度の阻害剤とを接触させること；または
    (a)'阻害剤に結合した請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光標識されたキナーゼと、様々な濃度の未標識キナーゼとを接触させること；
    (b)励起の際に、各濃度の前記蛍光標識されたキナーゼの1個以上の波長での蛍光放出シグナルまたはスペクトルを記録すること；
    (c)工程(b)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルまたはスペクトルから、各濃度の速度定数を決定すること；または
    (c1)工程(b)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルから、各濃度の阻害剤に関するKdを決定すること；または
    (c2)工程(b)で記録された1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルから、各濃度の未標識キナーゼに関するKaを決定すること；
    (d)工程(b)で得られた異なる濃度の阻害剤に関するシグナルもしくはスペクトルから工程(c)で決定された速度定数からkonを直接決定すること、および／またはkoffを外挿すること；または
    (d)'工程(b)で得られた異なる濃度の未標識キナーゼに関するシグナルもしくはスペクトルから工程(c)で決定された速度定数からkoffを直接決定すること、および／またはkonを外挿すること；ならびに
    (e)必要に応じて、工程(d)もしくは(d)'で得られたkonおよびkoffから、Kdおよび／またはKaを算出すること、
    を含む、前記方法。
  12. キナーゼ阻害剤の解離または結合を決定する方法であって、
    (a)請求項１〜９のいずれか１項に記載のスピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼと、異なる濃度の阻害剤とを接触させること；または
    (a)'阻害剤に結合した請求項１〜９のいずれか１項に記載のスピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼと、異なる濃度の未標識キナーゼとを接触させること；
    (b)各濃度の阻害剤および／もしくは未標識キナーゼについて、前記スピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼのEPRもしくはNMRスペクトルを記録すること；ならびに
    (c)異なる濃度の阻害剤について、工程(b)で記録されたEPRもしくはNMRスペクトルからKdを決定すること；または
    (c)'異なる濃度の未標識キナーゼについて、工程(b)で記録されたEPRもしくはNMRスペクトルからKaを決定すること、
    を含む、前記方法。
  13. キナーゼ阻害剤のスクリーニングにとって好適な突然変異キナーゼを作製する方法であって、
    (a)存在する場合、活性化ループの外側の目的のキナーゼ中に存在する遊離チオールもしくはアミノ基を有する溶媒露出したアミノ酸または活性化ループ内の好適でない位置に遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸を、遊離チオールもしくはアミノ基を有さないアミノ酸と置換すること；
    (b)遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸が活性化ループ中に存在しない場合、目的の前記キナーゼの活性化ループ中のアミノ酸を、遊離チオールもしくはアミノ基を有するアミノ酸に突然変異させること；
    (c)目的のキナーゼを、その環境における極性変化に対して感受性のチオールもしくはアミノ反応性フルオロフォア、チオール反応性スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化されたチオールもしくはアミノ反応性標識を用いて標識すること、ここで該フルオロフォア、スピン標識、アイソトープもしくはアイソトープ富化された標識がキナーゼの触媒活性を阻害せず、および／もしくはキナーゼの安定性に干渉しないようにする；
    (d)工程(c)で得られたキナーゼと、該キナーゼの公知の阻害剤とを接触させること；ならびに
    (e)励起の際に、工程(c)および(d)の前記蛍光標識されたキナーゼの1個以上の波長での蛍光放出シグナルもしくはスペクトルを記録すること、または
    (e)'工程(c)および(d)の前記スピン標識されたキナーゼのEPRもしくはNMRスペクトルを記録すること；
    (f)工程(e)で記録された蛍光放出スペクトルまたは工程(e)'で記録されたEPRもしくはNMRスペクトルを比較すること；
    を含み、工程(e)で得られた前記蛍光標識されたキナーゼの少なくとも1個の波長、好ましくは、最大放出での蛍光強度の差異、および／またはスペクトル中の蛍光放出波長のシフト、または工程(e)'で得られた前記スピン標識もしくはアイソトープ標識されたキナーゼのEPRもしくはNMRスペクトルの変化が、該キナーゼがキナーゼ阻害剤のスクリーニングにとって好適であることを示す、前記方法。
  14. キナーゼ阻害剤が、キナーゼのATP結合部位に隣接するアロステリック部位に部分的または完全に結合する、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. キナーゼのATP結合部位に隣接するアロステリック部位に部分的または完全に結合するキナーゼ阻害剤を同定する方法であって、
    (a)請求項１０に記載の方法に従って阻害剤をスクリーニングすること、および
    (b)工程(a)で同定された阻害剤の速度定数を決定すること、
    を含み、工程(b)で決定された0.140 s-1未満の速度定数が、同定されたキナーゼ阻害剤がキナーゼのATP結合部位に隣接するアロステリック部位に部分的または完全に結合することを示す、前記方法。
  16. キナーゼを、活性化ループ中に天然に存在するかまたは活性化ループ中に導入したシステインで標識する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキナーゼまたは請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記キナーゼの阻害剤として同定された化合物の薬理学的特性を最適化することをさらに含む、請求項１０または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記最適化が、前記キナーゼの阻害剤として同定された阻害剤を改変して、
    a)活性スペクトル、器官特異性の改変、および／または
    b)効力の改善、および／または
    c)毒性の低下(治療指数の改善)、および／または
    d)副作用の低下、および／または
    e)治療作用の開始、作用期間の改変、および／または
    f)薬物動態パラメーター(吸収、分布、代謝および排出)の改変、および／または
    g)物理化学パラメーター(溶解性、吸湿性、色、味、臭い、安定性、状態)の改変、および／または
    h)一般的特異性、器官／組織特異性の改善、および／または
    i)適用形態および経路の最適化、
    を、
    a. カルボキシル基のエステル化、または
    b. カルボン酸によるヒドロキシル基のエステル化、または
    c. ヒドロキシル基の、例えば、リン酸、ピロリン酸もしくは硫酸もしくはヘミコハク酸へのエステル化、または
    d. 製薬上許容し得る塩の形成、または
    e. 製薬上許容し得る複合体の形成、または
    f. 薬理学的に活性なポリマーの合成、または
    g. 親水性部分の導入、または
    h. 芳香酸もしくは側鎖上での置換基の導入／交換、置換基パターンの変化、または
    i. イソスターもしくはバイオイソスター部分の導入による改変、または
    j. 相同化合物の合成、または
    k. 分枝側鎖の導入、または
    l. アルキル置換基の環式類似体への変換、または
    m. ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、または
    n. アミド、フェニルカルバメートへのN-アセチル化、または
    o. Mannich塩基、イミンの合成、または
    p. ケトンもしくはアルデヒドのSchiff塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジンへの形質転換、
    またはその組合せにより達成することを含む、請求項１７に記載の方法。
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