JP2010527614A - パーキン基質およびアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｓｅｐｔ４タンパク質のパーキン媒介性のユビキチン化を測定する、パーキン活性についてのインビトロ、エクスビボおよびインビボアッセイを提供する。該アッセイはパーキンタンパク質のリガーゼ活性を調節する剤についてスクリーニングするのに使用しうる。
【選択図】 図１

Description

［関連出願の交差引用］
本出願は、２００７年５月２１日に出願された米国仮出願第６０／９３９，３３５号明細書（その完全な内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。

パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質のドーパミンニューロンの減少を神経病理学的特徴とする神経学的障害である。このニューロン減少は、動作緩慢、強直および／若しくは振戦のような運動の変化として臨床的に現れる（非特許文献１）。ヒト遺伝子データはＰＤの発症に関連づけられる遺伝子を同定した。これらの遺伝子の１種は、若年発症患者のコホートを使用して第６染色体に位置を突き止められ、そしてパーキンタンパク質として同定された（非特許文献２）。パーキンタンパク質はユビキチン−プロテアソーム経路（ＵＰＳ）で機能するＥ３リガーゼタンパク質である（非特許文献３）。ＵＰＳは、分解のためのタンパク質の標的を定めた除去、ならびに細胞プロテアソーム（非特許文献４）若しくはリソソーム（非特許文献５）による分解のための基質を同定および標識するためのＥ３リガーゼ機能に関与する主細胞経路である。

ＰＤの別の特質は、レビー小体として知られる不溶性のタンパク質性細胞封入体の存在である。レビー小体は多くのタンパク質から構成され、最も顕著なものはα−シヌクレインタンパク質である（非特許文献６）。α−シヌクレイン遺伝子中の点突然変異若しくは遺伝子の多重化がＰＤをもたらす（非特許文献７；非特許文献８）。

パーキンソン病を処置するための新たな治療薬が緊急に必要とされる。本発明は、こうした新たな治療薬を同定かつ検証するのにおよび他の用途に有用な新たな方法および物質を提供する。

Ｇｅｌｂら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５６：３３−３９（１９９９） Ｋｉｔａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３９２：６０５−６０８（１９９８） Ｓｈｉｍｕｒａ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５：３０２−３０５（２０００） Ｈｅｒｅｓｈｋｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７：４２５−４７９（１９９８） Ｈｉｃｋｅ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９：１０７−１１２（１９９９） Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３８８：８３９−４０（１９９７） Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：２０４５−７（１９９７） Ｋｒｕｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１８：１０６−８（１９９８）

［発明の要約］
本発明は、セプチン４（Ｓｅｐｔ４）タンパク質がパーキンのリガーゼ活性によりユビキチン化され得る条件下でパーキンタンパク質およびＳｅｐｔ４タンパク質を組合せること、ならびにＳｅｐ４ｔタンパク質のユビキチン化の存在、速度若しくは程度を測定することを包含する、パーキン活性の検出方法を提供する。いくつかの態様において、パーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質はインビトロで組合せる。いくつかの態様において、パーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質は、Ｅ１、Ｅ２、Ｍｇ−ＡＴＰおよびユビキチンを含有する緩衝反応媒体中で組合せられる。該アッセイのいくつかの態様において、パーキン活性は細胞中で検出される。該アッセイのいくつかの態様において、パーキン活性はエクスビボの細胞中で検出される。該アッセイのいくつかの局面において、細胞は内因性Ｓｅｐｔ４を発現する。いくつかの局面において、細胞は初代（非形質転換）細胞である。いくつかの局面において、該アッセイで使用される細胞はＳＨＳＹ−５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ−２２６６）若しくはヒト胎児脳細胞である。

本発明はパーキン活性のモジュレーターについてのアッセイを提供する。該アッセイは、（１）セプチン−４タンパク質がユビキチン化され得る条件下でパーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質をインビトロで一緒にインキュベートすること；（２）パーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質を試験剤の存在下で（１）の条件下で一緒にインキュベートすること；（３）試験剤の存在下でのセプチン−４ユビキチン化の速度若しくは程度を試験剤の非存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度と比較すること（試験剤の存在下でのセプチン−４ユビキチン化の相対的増大は該試験剤がパーキンのユビキチン化活性を高めることを示し、また、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的減少は該試験剤がパーキンのユビキチン化活性を阻害することを示す）を包含する。該アッセイのいくつかの態様において、パーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質を、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ユビキチンおよびＡＴＰを含有する組成物中で組合せる。該アッセイのいくつかの態様において、Ｅ２タンパク質はＵｂｃＨ５、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ１３およびＵｂｃＨ１３／Ｕｅｖ１よりなる群から選択される。

本発明は、付加的に、（ａ）パーキンを発現しかつＳｅｐｔ４を発現する哺乳動物細胞を提供すること、および（ｂ）該細胞中でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を測定することを包含する、パーキン活性の細胞に基づく測定方法を提供する。該方法のいくつかの局面において、Ｓｅｐｔ４タンパク質は細胞中で内因的に発現される。該アッセイのいくつかの他の局面において、Ｓｅｐｔ４タンパク質は細胞中で組換え発現される。該方法のいくつかの局面において、パーキンタンパク質はパーキンタンパク質のバリアント若しくはフラグメントである。いくつかの局面において、パーキンタンパク質は、位置１６７のセリンの代わりにアスパラギン；位置２１２のシステインの代わりにチロシン；位置２４０のトレオニンの代わりにメチオニン；位置２７５のアルギニンの代わりにトリプトファン；位置２８９のシステインの代わりにグリシン；若しくは位置４３７のプロリンの代わりにロイシンを有するバリアントである。

いくつかの態様において、本発明はパーキン活性のモジュレーターについてのエクスビボの細胞に基づくアッセイを提供し、前記アッセイは、（ａ）パーキンを発現しかつＳｅｐｔ４を発現する哺乳動物細胞を提供すること、（ｂ）該細胞を試験剤に曝露すること、および（ｃ）試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を試験剤に曝露されない対照細胞中でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度と比較すること（試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的増大は該試験剤がパーキンのユビキチン化活性を高めることを示し、また、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的減少は該試験剤がパーキンのユビキチン化活性を阻害することを示す）を包含する。いくつかの態様において、Ｓｅｐｔ４タンパク質は細胞中で内因的に発現される。いく
つかの態様において、Ｓｅｐｔ４タンパク質は細胞中で組換え発現される。いくつかの態様において、パーキンタンパク質はバリアント若しくはフラグメントである。いくつかの態様において、パーキンタンパク質は、位置１６７のセリンの代わりにアスパラギン；位置２１２のシステインの代わりにチロシン；位置２４０のトレオニンの代わりにメチオニン；位置２７５のアルギニンの代わりにトリプトファン；位置２８９のシステインの代わりにグリシン；若しくは位置４３７のプロリンの代わりにロイシンを有するバリアントである。

本発明はパーキン活性のモジュレーターの同定方法を提供し、前記方法は、（ａ）神経細胞中でパーキンを共発現しかつＳｅｐｔ４を発現するヒト以外の動物を提供すること；（ｂ）該動物に試験剤を投与すること；（ｃ）試験剤を投与した動物の前記神経細胞中でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を、該剤を投与されていない対照動物でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度と比較すること（治療薬の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的増大は該治療薬がパーキンのユビキチン化活性を高めることを示し、また、該治療薬の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的減少は、該治療薬がパーキンのユビキチン化活性を阻害することを示す）を包含する。一態様において、動物はげっ歯類（例えばマウス）若しくはヒト以外の霊長類である。一態様において、該動物は前記細胞中で導入遺伝子（１種若しくは複数）を発現し、前記導入遺伝子（１種若しくは複数）はセプチン−４およびパーキンのいずれか若しくは双方をコードする。

パーキンおよびＳｅｐｔ４タンパク質ドメインを示す。パーキンは、完全長タンパク質として、若しくはパーキンのアミノ酸１−２３７を使用してのいずれかで酵母２ハイブリッドスクリーニングでバイトとして使用した。最も頻繁なヒットＳｅｐｔ４が双方のスクリーニングから合計８２回同定され、最初の１１７アミノ酸を除きＳｅｐｔ４の配列全体にわたった。破線はパーキンおよびＳｅｐｔ４の相互作用ドメインを示す。 ＨＥＫ２９３細胞中のパーキンおよびＳｅｐｔ４の相互作用を具体的に説明するウエスタンブロットである。パーキンを過剰発現する安定なＨＥＫ２９３細胞株をｐｃＤＮＡ（Ｃ）若しくはＳｅｐｔ４ ｃＤＮＡ（Ｓ４）いずれかでトランスフェクトした。パーキンを細胞ライセートから免疫沈降し、そして、結合された物質をＳｅｐｔ４に対する抗体を用いるイムノブロッティングにより分析した。細胞抽出液（ＣＥ）を参照のため示す。 ヒト皮質細胞中でパーキンおよびＳｅｐｔ４が相互作用することを示すウエスタンブロットである。空のレンチウイルスでトランスフェクトしたヒト皮質ニューロン（ＨＣＣ）若しくはパーキンレンチウイルスでトランスフェクトしたＨＣＣいずれかから調製したライセートを、パーキンに対する抗体およびプロテインＧビーズと３時間インキュベートした。ビーズを洗浄し（Ｗ）、そして未結合（ＦＴ）および結合タンパク質（Ｅ）をイムノブロッティングにより分析した。 ２６Ｓプロテアソームを阻害した細胞中でＳｅｐｔ４がユビキチン化される（より高分子量バンドにより明示されるとおり）ことを示すウエスタンブロットである。ＨＥＫ２９３細胞およびパーキンを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞をｐｃＤＮＡ若しくはｐＳｅｐｔ４いずれかでトランスフェクトし、ＤＭＳＯ若しくはエポキソミシンで処理し、そして細胞ライセートをＳｅｐｔ４に対する抗体でイムノブロットした。 パーキンがインビトロでのＳｅｐｔ４のユビキチン化を媒介することを示すウエスタンブロットである。精製したＳｅｐｔ４をＧＳＴ−Ｅ１、ＵｂｃＨ８、Ｕｂ、ＡＴＰおよびＧＳＴ−パーキンと３７℃で示された時間インキュベートした。サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動しかつウエスタンブロットした。図２Ａは抗Ｓｅｐｔ４抗体での染色を示し、および図２Ｂは抗パーキンでの染色を示す。 Ｓｅｐｔ４ユビキチン化が特定のパーキン−Ｅ２の組合せに特異的でないことを示すウエスタンブロットである。多様なＥ２酵素を使用するインビトロユビキチン化アッセイを利用してユビキチン化Ｓｅｐｔ４を評価した。サンプルを３７℃で０、３０若しくは６０分間インキュベートし、そしてＳｅｐｔ４に対する抗体を使用してイムノブロットした。^＊は交差反応するバンドを示す。 Ｓｅｐｔ４ユビキチン化がＥ３リガーゼ、パーキンに特異的であることを示すウエスタンブロットである。Ｓｅｐｔ４のユビキチン化を評価するための多様なＥ３ユビキチンリガーゼを使用するインビトロユビキチン化アッセイ。サンプルを３７℃で０若しくは３０分間インキュベートし、そしてＳｅｐｔ４に対する抗体を使用してイムノブロットした。

［発明の詳細な記述］
Ｉ．緒言
遺伝子データは、ヒトにおけるパーキンタンパク質活性の低下が黒質のドーパミン作動性ニューロンの進行性の減少および最終的にパーキンソン病（ＰＤ）をもたらすことを確立した。パーキンタンパク質は、Ｅ１ユビキチン活性化酵素およびＥ２ユビキチン結合酵素とともに作動するＥ３（ユビキチン）リガーゼタンパク質である。Ｅ１酵素はユビキチンを結合のため活性化しかつそれをＥ２酵素に転移するのにＡＴＰを使用する。パーキンはＥ２と相互作用し、そしてユビキチンをタンパク質基質上のリシンのε−アミノ基に転移する。ユビキチン部分の基質への連続的付加はポリユビキチン鎖を生成する。パーキン活性は、基質若しくは「標的タンパク質」へのユビキチンの転移の速度若しくは程度を測定することによりアッセイし得る。

既知のパーキン基質はα−シヌクレインおよびパーキンタンパク質それ自体（自己ユビキチン化）を包含する。セプチン ４（Ｓｅｐｔ４）もまたパーキンリガーゼの基質であることが今や発見された。Ｓｅｐｔ４タンパク質は雑多なユビキチン化基質ではなくしかしパーキンにより特異的にユビキチン化されることを発明者が示していたため、この発見は特別の重要性を有する。従ってＳｅｐｔ４のユビキチン化はパーキンのリガーゼ活性の直接の尺度として使用し得る。例えば、パーキンの活性は、インビトロ、エクスビボ若しくはインビボでのＳｅｐｔ４のユビキチン化の速度若しくは程度を測定することによりアッセイし得る。

パーキンのリガーゼ活性のアッセイは多様な応用で有用であり、そしてＰＤおよび他の神経学的疾患の処置における使用のための薬物候補をスクリーニングおよび評価するためにとりわけ貴重である。アッセイは、生物学的サンプル中のパーキンの存在若しくは活性を検出する、組換え若しくは精製されたパーキンタンパク質の完全性を評価する、改変若しくはバリアントパーキンタンパク質のリガーゼ活性を評価する、および本開示を鑑みて明らかであろう他の用途のためにもまた有用である。

ＩＩ．パーキンのリガーゼ活性のインビトロアッセイ
一局面において、本発明は、（１）Ｓｅｐｔ４タンパク質がユビキチン化され得る条件下でパーキンタンパク質およびＳｅｐｔ４タンパク質を一緒にインキュベートすること、ならびに（２）Ｓｅｐｔ４タンパク質のユビキチン化の速度若しくは程度を測定することによるパーキン活性のインビトロ測定方法を提供する。

パーキンおよび他のＥ３リガーゼによるユビキチン化を検出するための多数のアッセイ
が当該技術分野で公知であり、そして本発明で使用し得る。パーキンのリガーゼ活性が保持される緩衝液、試薬およびアッセイ条件を、基質としてＳｅｐｔ４タンパク質を使用する本発明のパーキン活性アッセイで使用しうる。従って、本開示（パーキンの基質としてのＳｅｐｔ４タンパク質の同定を包含する）により導かれる当業者は、パーキンによるＳｅｐｔ４ユビキチン化を測定するためにこうしたアッセイを適応することが可能であろう。例えば、パーキンおよびＳｅｐｔ４をＥ１（例えばＵＢＡ１ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５５３８６）、Ｅ２（例えばＵｂｃＨ７）、Ｍｇ−ＡＴＰ、ユビキチンおよび水性緩衝液（例えば５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．８）の存在下で組合せかつインキュベートすることができ、そしてＳｅｐｔ４タンパク質へのユビキチンの結合の速度若しくは程度を測定し得る。本明細書で使用されるところの「インキュベートする」は、成分を組み合わせることおよび通常は室温若しくは生理学的温度で酵素反応（１種若しくは複数）を進行させることというその通常の意味を有する。例示的アッセイ条件を具体的説明のためかつ制限のためでなく本明細書に記述する。

Ｓｅｐｔ４タンパク質のユビキチン化の速度若しくは程度は多様な方法で測定し得、そして本発明は特定の一方法に制限されない。Ｓｅｐｔ４ユビキチン化の一測定方法は、ユビキチン化反応を実施すること、反応混合物中のタンパク質を電気泳動により分離すること、分離されたタンパク質を支持体に転写すること（ウエスタンブロッティング）、ウエスタンブロットを抗Ｓｅｐｔ４抗体でプロービングすること、およびＳｅｐｔ４基質へのユビキチンの結合を反映するＳｅｐｔ４の移動度の変化を検出することを伴う（実施例を参照されたい）。免疫学的に基づくアッセイ（ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ニューヨーク、１９８８（本明細書に引用することにより組み込まれる）を参照されたい）、質量分析法、電磁スペクトル分光法、クロマトグラフィー法、検出可能に標識したユビキチンを使用するユビキチン化、および当業者に明らかであろう他のアプローチを制限なしに包含するユビキチン化の他の測定方法を使用し得る。例えば、プレートアッセイにおいて、蛍光標識ユビキチンを蛍光プレートリーダーを使用して直接検出し得、ビオチン標識ユビキチンは標識ストレプトアビジン（例えばストレプトアビジン−ＨＲＰ若しくは５０００倍Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ［Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ．イリノイ州ロックフォード］）を使用して検出し得、そしてエピトープ標識ユビキチンは抗標識抗体を使用するイムノアッセイで検出し得る。ユビキチン化されたＳｅｐｔ４の検出方法は使用される標識（ｌａｂｅｌ）若しくは標識（ｔａｇ）に依存することができる。

多数のインビトロアッセイ形式を本発明の実務で使用し得る。例えば、アッセイ成分は溶液中にあり得るか、または１種若しくはそれ以上を固定しうる。ユビキチン化アッセイは、例えば、パーキンおよび他の試薬を包含するユビキチン化反応混合物をウェル、チューブ若しくはチャンバーに添加することにより実施することができ、そしてユビキチン化反応が起こる。生じるユビキチン化されたＳｅｐｔ４タンパク質（「ｕＳｅｐｔ４」）のレベルは、免疫学的方法（例えば検出可能に標識した抗ユビキチン若しくは抗Ｓｅｐｔ４抗体を複合体に結合すること）、他の結合方法（例えば反応中でビオチニル化ユビキチンを使用すること、およびアビジンに結合したプローブを使用してｕＳｅｐｔ４を検出すること）を使用して、または検出可能に標識したユビキチンをアッセイで使用することにより測定する。

１アプローチにおいて、Ｓｅｐｔ４を固定する。具体的説明のため、１アッセイにおいて、Ｓｅｐｔ４タンパク質を表面（マイクロウェルプレート、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、磁性ビーズなどのような）に固定し、そしてパーキン、Ｅ１、Ｅ２、ユビキチンおよびＡＴＰを包含するリガーゼ反応混合物とインキュベートする。一態様において、Ｓｅｐｔ４タンパク質は、９６ウェル若しくは３８６プレート（例えばＩｍｍｕｌｏｎ［マサチュ
ーセッツ州ウォルサム］；Ｍａｘｉｓｏｒｂ［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、独国カールスルーエ］などから入手可能）のウェルに固定する。ユビキチン化を妨害しないＳｅｐｔ４タンパク質のいかなる固定方法も使用し得る。例えば、１アプローチにおいて、エピトープ標識Ｓｅｐｔ４タンパク質を標識を介して支持体に固定する。別のアプローチにおいて、Ｓｅｐｔ４エピトープを認識する抗体を使用する抗体結合系を使用してＳｅｐｔ４を固定しうる。あるいは、抗体はＳｅｐｔ４タンパク質に融合したエピトープ標識を認識し得る。いくつかのアプローチにおいて、固定は抗体媒介性相互作用以外の相互作用を必要とする。例えば、１アプローチにおいて、Ｎ末端の６Ｈｉｓ標識をもつＳｅｐｔ４タンパク質をニッケル被覆アッセイプレートを使用して固定する。１アプローチにおいて、ビオチニル化成分をアビジンとの相互作用を介して固定する。

ブロッキング段階後に、Ｅ１（ユビキチン活性化酵素）、Ｅ２（ユビキチン結合酵素）、ＡＴＰ−Ｍｇ、ユビキチン（通常は標識ユビキチン）およびパーキン（パーキンＥ３リガーゼ）を包含するリガーゼ反応混合物を、固定したＳｅｐｔ４タンパク質と組合せる。場合によってはＥ１をエピトープ標識する（例えばＧＳＴ若しくはＨｉｓ_６で）。反応成分はいかなる所望の順序でも添加し得る。ＡＴＰは所望の場合は反応を開始するために最後に添加し得る。当業者は、該アッセイの機能的効果に影響を及ぼすことなく反応混合物に対する変更を行い得ることを認識するであろう。例えば、トリス、Ｂｉｃｉｎｅおよび他の緩衝液をＨＥＰＥＳの代わりに使用し得る。

例示的一反応混合物は
・パーキンタンパク質（例えば２〜１０μｇ）
・５００ｎＭ １：１ ビオチン：ユビキチン（ビオチニル化ユビキチン）
・２〜６ｎＭ ＧＳＴ−Ｅ１
・３００ｎＭ Ｅ２（ＵｂｃＨ７）
・１０ｍＭ ＭｇＡＴＰ
・５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．８
である。

１反応成分、典型的にはＡＴＰを陰性対照としてのある種のサンプルから省略し得る。一態様において、該アッセイは９６若しくは３８４ウェルプレート形式で実施する。プレートをある期間インキュベートする（例えば室温で６０分若しくは３７℃で１０〜９０分のような）。プレートを洗浄して可溶性試薬を除去し、そしてユビキチンの存在若しくは量（すなわちユビキチン化されたＳｅｐｔ４のユビキチン成分）を測定する。洗浄溶液は例えば５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ ＮａＣｌでありうる。

反応成分の添加前に、表面をブロッキング溶液で処理してタンパク質とりわけＥ１のプレートへの非特異的結合を低下させうる。ブロッキング剤は、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）；ＳｙｎＢｌｏｃｋ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ノースカロライナ州ローリー）；ＳｅａＢｌｏｃｋ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、独国ダルムシュタット）；金属キレートブロック（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）；１％カゼイン；グルタチオン；およびこれらの多様な組合せを包含する。ブロッキング段階後にウェルをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ洗浄液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）若しくはリガーゼ緩衝液洗浄液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し得る。一態様において、Ｉｍｍｕｌｏｎ ９６若しくは３８４ウェルプレートを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ ＮａＣｌ中１％カゼインでブロッキングし、そして５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／５０ｍＭ ＮａＣｌ／４ｍＭ ＤＴＴを使用して洗浄する。

別のアプローチにおいて、ユビキチン化アッセイを溶液中で（すなわちＳｅｐｔ４タンパク質若しくは他の成分を固定することなく）実施し得、そして反応溶液（若しくはそのアリコート）をその後捕捉プレートに移す。例示的一反応において、反応成分を５０マイクロリットル容量に集成し、そしてアッセイを３７℃で１０〜９０分（例えば６０分）間実施する。アッセイの終了時かつ／若しくはアッセイの多様な時点で、反応混合物若しくはそのアリコートを、Ｓｅｐｔ４を結合する（例えば抗Ｓｅｐｔ４抗体若しくはＨｉｓ標識Ｓｅｐｔ４についてニッケル）またはユビキチンを結合する（例えば抗ユビキチン抗体、Ｈｉｓ標識ユビキチンについてニッケル）あるいはエピトープ標識ユビキチンについて抗エピトープ標識抗体（抗ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ_６、Ｍｙｃ、ＭＢＰのような）を含有する固定された部分を含有する捕捉プレート（例えば９６若しくは３８４ウェルプレート）に移す。

アッセイは、特定の終点でのＳｅｐｔ４の単位量あたりの総ユビキチン化（ユビキチン化の「程度」）を測定するようにかつ／若しくはＳｅｐｔ４分子のポリユビキチン化の程度（すなわちユビキチン鎖の長さ）を測定するように設計し得る。アッセイは、複数の時点でユビキチン化を測定して（実施例２を参照されたい）単位時間あたり若しくは変動する条件下のユビキチン化のレベル（ユビキチン化の「速度」）を決定するように設計し得る。

上に示されるとおり、一般に、本発明のインビトロアッセイは、Ｓｅｐｔ４（例えばＳｅｐｔ４ｖａｒ３）のパーキンに基づくユビキチン化が起こる条件下で実施する。例えば、該反応は一般にパーキンタンパク質、Ｓｅｐｔ４タンパク質、Ｅ１（例えばＵＢＡ１、ＵＢＡ２）、Ｅ２（例えばＵｂｃＨ２、ＵｂｃＨ５、ＵｂｃＨ６、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ８、ＵｂｃＨ１３）、Ｍｇ−ＡＴＰおよびユビキチンを緩衝溶液（例えば生理学的ｐＨおよびモル浸透圧濃度のＨＥＰＥＳ、トリス若しくはＢＩＣＩＮＥ緩衝液）中に包含する。アッセイ成分は当該技術分野で既知の方法を使用して、若しくは下述されるとおり作成しうるか、または購入しうる。例えば、精製ユビキチン経路酵素はＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．（８４０ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｄｒｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ
０２１３９）から得ることができる。Ｗｅｅら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９：４８９−９８（２０００）もまた参照されたい。パーキン、Ｓｅｐｔ４、Ｅ１、Ｅ２およびユビキチンは精製されかつ／若しくは組換えであることができ、そして哺乳動物（例えばヒト、ウサギ若しくはマウス）または他の真核生物からでありうる。本明細書で論考されるところの多様なパーキンバリアントを使用しうる。該アッセイのいくつかのバージョンにおいて、反応成分は同一種由来である（例えばヒトのパーキン、Ｓｅｐｔ４、Ｅ１、Ｅ２およびユビキチン、若しくはマウスのパーキン、Ｓｅｐｔ４、Ｅ１、Ｅ２およびユビキチン）。具体的説明のためかつ制限のためでなく、特定のアッセイ成分を下でさらに論考する。

アッセイのアプローチの一選択を上述したとは言え、ユビキチン化されたＳｅｐｔ４（ｕＳｅｐｔ４）を作成および検出することに対する多数の可能なアプローチが存在することが認識されることができ、そして上述されたアッセイの多くの変形を同定することは当業者の能力内に十分にあることができる。

ａ）パーキン
哺乳動物パーキンタンパク質を本アッセイで使用する。該アッセイで使用するパーキンタンパク質は精製された若しくは組換えのタンパク質調製物であり得る。あるいは、パーキンを含有すると考えられる患者サンプル（例えば生検）若しくは他の起源中のパーキンのリガーゼ活性を測定し得る。好ましい一態様において、パーキンはマウス若しくはヒトである。パーキン（例えばヒトおよびマウスパーキン）のアミノ酸配列は既知である。ヒトパーキンタンパク質の例示的一配列は例えばＮＣＢＩ受託番号ＢＡＡ２５７５１で見出
される。マウスパーキンタンパク質の例示的一配列は例えばＮＣＢＩ受託番号ＡＡＩ１３２０５で見出される。本発明のアッセイで使用するパーキンは野生型配列を有し得る。あるいは、パーキンは対立遺伝子バリアント、別の天然に存在するバリアント、若しくは組換え製造バリアントでありうる。該アッセイで使用するパーキンは、バリアントが少なくとも若干のリガーゼ活性を保持する限りは１個若しくはそれ以上の残基の置換、挿入若しくは欠失により野生型配列から逸脱するバリアントであり得る。いくつかのバージョンにおいて、野生型と異なる活性レベルを有するパーキンバリアントを使用する（例えば、位置１６７のセリンの代わりにアスパラギン；位置２１２のシステインの代わりにチロシン；位置２４０のトレオニンの代わりにメチオニン；位置２７５のアルギニンの代わりにトリプトファン；位置２８９のシステインの代わりにグリシン；若しくは位置４３７のプロリンの代わりにロイシンを有するバリアント）。場合によっては、細胞若しくは生物体中で発現される場合に野生型パーキンと異なる表現型を与えるバリアントを使用する。本アッセイで適するパーキンの一形態は、一般に、同一のモル量の野生型ヒトパーキンのリガーゼ活性の最低５０％、好ましくは最低７５％、しばしば最低８０％、および最も非常に最低９０％を保持することができる。加えて、パーキンフラグメントを使用し得るが、但しそれらは最も少なく若干のリガーゼ活性を保持する。しばしば、こうしたフラグメントは長さが最低１００、最低２００、最低３００若しくは最低４００アミノ酸であり、そして天然に存在するパーキンタンパク質の最低２００、最低３００若しくは最低４００残基を含みうる。いくつかの態様において、本発明で使用するパーキンのバリアントは、天然に存在する形態のパーキンと最低８０％の配列同一性、最低９０％の配列同一性、およびときに最低９５％の配列同一性を共有する。２種のタンパク質間の配列同一性は該２タンパク質配列を最適に整列することにより決定しうる。タンパク質は、人的に、若しくは、デフォルトのパラメータを使用してＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）アライメントプログラムのようなコンピュータに実装されるアルゴリズムを使用して整列し得る。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記述されるＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。該アルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワード（ｗｏｒｄ）と整列される場合に何らかの正の値の閾値スコアＴに一致するか若しくはそれを満足するかのいずれかである、問い合わせ配列中の短いワード長（ｓｈｏｒｔ ｗｏｒｄｓ ｏｆ ｌｅｎｇｔｈ）Ｗを同定することにより高スコアリング配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）を同定することを必要とする。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸはアライメントの感度および速度を決定する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）（Ｗ）、１０の期待（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。

パーキンの組換え発現方法は当該技術分野で公知である。具体的説明のためかつ制限のためでなく、Ｍａｒｒら、２００３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２３：１９９２−６を参照されたい。パーキンは融合タンパク質として発現させることができ、そして、例えば精製および／若しくはマイクロタイターウェルのような支持体への結合を容易にするためのエピトープ標識を包含しうる。パーキンは、「パーキンソン病治療薬および酵素的に活性のパーキン製剤についてのアッセイ（Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐａｒｋｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）」（引用することにより本明細書に組み込まれる）についての同時係属出願第１１／６３８，２４２号明細書に記述される
とおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくは他の細菌中で組換え発現しかつ精製しうる。この精製法は、タンパク質がアルギニン含有溶液中で再フォールディングされる透析段階を包含する。細胞からのパーキンタンパク質の精製方法もまた既知である。

ｂ）セプチン４
セプチン４の３種のスプライスバリアント、すなわちＳｅｐｔ４ｖａｒ１（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００４５６５）、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２（「ＡＲＴＳ」としてもまた知られる）（ＮＰ＿５３６３４０）およびＳｅｐｔ４ｖａｒ３（ＮＰ＿５３６３４１）が今日まで同定されている。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ１およびＳｅｐｔ４ｖａｒ３は、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ１がＮ末端に付加的な２１アミノ酸を含有することを除き同一配列を有する。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２（ＡＲＴＳ）は残基１−２４７についてバリアント１および３と配列同一性を共用し、そしてその後アミノ酸２４７−２７４の配列が異なる（Ｌａｒｉｓｃｈら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：９１５−２０（本明細書に引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。また、Ｃｈａｎｃｅら、２００６、”Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｆｏｃａｌ，ｅｐｉｓｏｄｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ：ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｗｉｔｈ ｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｒｅｓｓｕｒｅ
ｐａｌｓｉｅｓ ａｎｄ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｅｕｒａｌｇｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ”Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ．８（１−２）：１５９−７４；Ｓｐｉｌｉｏｔｉｓら、２００６”Ｈｅｒｅ ｃｏｍｅ ｔｈｅ ｓｅｐｔｉｎｓ：ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｃｏｏｄｉｎａｔｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ”Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１９（Ｐｔ １）：４−１０；Ｈａｌｌら、２００４、”Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｐｔｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ”Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０４（４）：４８９−５０５（それぞれ本明細書に引用することにより組み込まれる）もまた参照されたい。

下の実施例に示されるとおり、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ３はパーキンの基質である。本発明のアッセイにおいて、Ｓｅｐｔ４タンパク質はＳｅｐｔ４ｖａｒ３でありうる。あるいはＳｅｐｔ４タンパク質はＳｅｐｔ４ｖａｒ１でありうる。あるいはＳｅｐｔ４タンパク質はＳｅｐｔ４ｖａｒ２でありうる。アイソフォームのバリアント、フラグメントおよび混合物もまた使用しうる。Ｓｅｐｔ４のアイソフォーム１およびアイソフォーム３はアミノ末端の２１アミノ酸残基のみ異なり、そしてパーキンと同等の相互作用を有すると考えられる。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２（ＡＲＴＳ）はアミノ末端１−２４７残基で相同性を有する。神経細胞からの共免疫沈降実験は、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２およびパーキンが相互と相互作用することを示した。Ｓｅｐｔ４ｖａｒ３に対する類似性により、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２はパーキンによりユビキチン化されると考えられる。パーキンによるＳｅｐｔ４ｖａｒ２のユビキチン化は、本明細書に記述されるインビトロアッセイを使用して、またはＳｅｐｔ４ｖａｒ２ユビキチン化をインビボ若しくはエクスビボで測定することにより、容易に検出し得る。

天然に存在するアイソフォームの配列から逸脱するＳｅｐｔ４バリアントを、あるいは、パーキンのユビキチン化基質としてはたらくそれらの能力をそれらが保持する限りは、使用し得る。特定の一Ｓｅｐｔ４バリアントがパーキンのユビキチン化の基質として作用し得るかどうかは、本発明に記述される方法を使用して試験し得、例えば、パーキンによるＳｅｐｔ４バリアントのユビキチン化を実施例５に記述されるとおり評価し得る。

いくつかの態様において、切断型のＳｅｐｔ４を本発明の方法とともに使用し得る。例えば、下の実験実施例に示されるとおり、Ｎ末端から１１７アミノ酸を欠くＳｅｐｔ４バリアントはパーキンによりユビキチン化されるそれらの能力を保持し、そして従って本発明のアッセイで使用し得る。切断型バリアントは、いくつかの態様において、長さが最低
１００、最低１５０、最低１５７若しくは最低２００アミノ酸でありうる。いくつかの態様において、Ｓｅｐｔ４の他のバリアントを使用して本発明の方法を実施し得る（例えば挿入、欠失若しくは置換によりＳｅｐｔ４ｖａｒ１、Ｓｅｐｔ４ｖａｒ２若しくはＳｅｐｔ４ｖａｒ３と異なるＳｅｐｔ４バリアント）。有用なバリアントはパーキンのユビキチン化の基質であるという特性を保持し、それは本明細書に記述される形式のような慣例のアッセイを使用して試験し得る。本発明で使用し得るＳｅｐｔ４の他のバリアントは、Ｓｅｐｔ４タンパク質と最低８０％の配列同一性、最低９０％の配列同一性若しくは最低９５％の配列同一性を共有するバリアントを包含する。当業者は、２タンパク質配列を最適に整列することにより、バリアントと親タンパク質の間で共有される配列同一性を容易に決定し得る。上述されたＣｌｕｓｔａｌＷおよびＮＣＢＩアライメントプログラムのようなアライメントプログラムは、２タンパク質を最適に整列するのに使用し得る例示的プログラムである。

Ｓｅｐｔ４タンパク質は融合タンパク質として発現させることができ、そして例えば精製および／若しくはマイクロタイターウェルのような支持体への結合を容易にするためのエピトープ標識を包含しうる。細菌、昆虫および哺乳動物系での他のタンパク質発現方法は当業者に既知であり、そしてＳｅｐｔ４を発現かつ精製するのに応用し得る。例えば、Ｉｈａｒａらは、バキュロウイルス系を使用して、ヒトおよびマウスからクローン化したヒスチジン標識Ｓｅｐｔ４タンパク質を発現している（Ｉｈａｒａら、２００７、Ｎａｕｒｏｎ、５３：５１９−３３）。

ｃ）ユビキチン、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）およびユビキチン担体タンパク質（Ｅ２）
ユビキチン、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）およびユビキチン担体タンパク質（Ｅ２）は、慣例の組換え法を使用して製造しうるか、若しくはＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）のような商業的供給元から購入しうる。本発明のユビキチン化反応で使用し得るＥ２の例は、限定されるものでないがＵｂｃＨ２、ＵｂｃＨ５、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ８、ＵｂｃＨ１０およびＵｂｃＨ１３を挙げることができる。ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）およびユビキチン担体タンパク質（Ｅ２）は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物から、若しくは異なる真核生物（例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））からでありうる。

ユビキチンは例えばＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．（８４０ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｄｒｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１３９）から商業的に入手可能である。ビオチニル化ユビキチンは購入し得るか、若しくは技術既知の手段を使用して製造し得る。１種のビオチニル化ユビキチン調製物は、５０μｇのビオチン−ユビキチン（ＵＢ−５６０、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を２９．２μｌの１ｍＭメチル化ユビキチン（Ｕ−５０２、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）溶液に再懸濁しておよそ１７％ビオチニル化された約１．１７ｍＭユビキチン３０μｌを生じることにより調製する。ユビキチンを標識（例えばエピトープ標識で）する場合、標識は通常ユビキチンのＮ末端に融合するか、若しくはそうでなければユビキチン化を妨害しない方法で結合する。

ｄ）抗体
抗体を本発明のアッセイで検出、固定および他の目的上使用しうる。パーキン、Ｓｅｐｔ４およびユビキチンに対する抗体は商業的に入手可能である（例えば１Ａ１抗パーキン抗体はＩＢＬ、ミネソタ州ミネアポリスから入手可能であり；抗Ｓｅｐｔ４ ＳＣ−２０１７９抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルズから入手可能である）か、若しくは慣例の方法を使用して作成し得る。該アッセイのいくつかのバージョンにおいて、エピトープ標識タンパク質は該標識を認識する抗体を使用して認識する。

ＩＩＩ．パーキンのリガーゼ活性のモジュレーターについてのインビトロスクリーニング
上で示されたとおり、本発明のアッセイはパーキンタンパク質活性のモジュレーターのスクリーニングに応用を見出す。例えば、パーキンを安定化する化学的シャペロンのような剤（例えばパーキンバリアント）はパーキンソン病の処置のための潜在的な剤である。一態様において、インビトロアッセイを使用して、候補剤がパーキンソン病を処置するのに有用であるかどうかを決定する。該アッセイは、精製された（若しくは部分的に精製された）パーキンタンパク質のＳｅｐｔ４ユビキチン化活性を該化合物の存在下で測定すること、および該化合物の存在下でのパーキンタンパク質のユビキチン化活性を該化合物の非存在下での精製されたパーキンタンパク質のユビキチン化活性と比較することを必要とし得る。Ｓｅｐｔ４タンパク質のユビキチン化を増大させる剤の能力は、パーキンソン病を処置するのに有用な剤およびさらなる試験のための候補を示す。

従って、一局面において、本発明はパーキン活性のモジュレーターについてのアッセイを提供する。該アッセイは、（１）Ｓｅｐｔ４タンパク質がユビキチン化され得る条件下でパーキンタンパク質およびＳｅｐｔ４タンパク質を一緒にインキュベートすること；（２）（１）の条件下でパーキンタンパク質、Ｓｅｐｔ４タンパク質および試験剤を一緒にインキュベートすること；ならびに（３）試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を試験剤の非存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度と比較することを必要とすることができ、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的増大は該試験剤がパーキン活性を高めることを示し、また、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的減少は該試験剤がパーキン活性を阻害することを示す。通常、試験剤を伴うおよび伴わない反応を同時に実施する。しかしながら対照反応を異なる時点で実施することもまた可能である。例えば、１バージョンにおいて、該アッセイは、（１）パーキンタンパク質がＳｅｐｔ４をユビキチン化し得る条件下でパーキンタンパク質、Ｓｅｐｔ４タンパク質および試験剤を一緒にインキュベートすること、ならびに（２）試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を試験剤の非存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度（例えば予め測定された値）と比較することを必要とし、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的増大は該試験剤がパーキン活性を高めることを示し、また、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的減少は該試験剤がパーキン活性を阻害することを示す。同一反応、バッチ若しくは組合せで複数の剤をアッセイすることもまた可能である。反応成分はいずれの順序でも組合せうる。例えば、試験剤は、ライゲーション反応の開始（例えばＡＴＰの添加）前に添加しうるか、若しくはライゲーション反応が開始した後に添加しうる。

パーキン活性を調節（阻害若しくは増大）する能力をスクリーニングし得る剤の型に関する特定の制限は存在しない。多様な分類の試験剤を使用し得る。例えば、化合物の多数の天然および合成ライブラリーを使用し得る（ＮＣＩ公開合成化合物集合体（ＮＣＩ Ｏｐｅｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）ライブラリー、メリーランド州ベセスダ；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７３（１９９１）；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：７０９−７１０（１９９４）；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）；Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１１４２２−１１４２６（１９９４）；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：１６１４−１６１８（１９９４）；およびＳａｌｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１１７０８−１１７１２（１９９３）に記述される化学合成ライブラリーを参照されたい）。一態様において、該剤は１０００未満およびしばしば５００未満の分子量をもつ分子のような小分子である。好ましくは該剤は血液脳関門を横断し得る。一態様において、該剤は、パーキンを安定化する（すなわち過剰発現される場合であってもパーキンを活性
のコンホメーションに維持する）若しくはミスフォールドしたパーキンバリアントの適正なフォールディングを誘発することが可能な「化学的シャペロン」である。

本明細書で使用されるところの「パーキンソン病を処置するのに有用な剤」若しくは「パーキンソン病の処置のための候補化合物」への言及は、パーキンソン病を伴う患者について治療的若しくは予防的利益を表すことが他の化合物よりありそうであると同定される化合物、すなわち薬物候補を指すことが理解されるであろう。薬物候補は患者に投与される前にさらなる試験（例えば動物でのインビボ試験）を受けうることが、創薬の過程になじみのある当業者により理解されるであろう。ヒトへの投与について承認された剤は該薬物候補の誘導体若しくはその化学修飾された形態でありうることもまた理解されるであろう。

ＩＶ．パーキンのリガーゼ活性の細胞に基づく（「エクスビボ」）アッセイ
一局面において、本発明は、（ａ）パーキンを発現しかつＳｅｐｔ４タンパク質を発現する哺乳動物細胞を提供すること；および（ｂ）Ｓｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を測定することによるパーキン活性の細胞に基づく測定方法を提供する。該アッセイを使用して、パーキンバリアントの活性を比較するため、薬物スクリーニングアッセイにおいて、およびその他の用途のため、細胞環境（例えば共発現されたタンパク質）のパーキン活性に対する影響を比較し得る。

パーキンおよびＳｅｐｔ４を発現する細胞は該タンパク質の一方若しくは双方を天然に発現する細胞であり得る。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ−２２６６）、ＣＯＳ細胞（ＣＲＬ−１６５１）；ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−６１）若しくは他の哺乳動物細胞株を包含する多様な細胞のいずれも使用し得る。一態様において、細胞は内因性Ｓｅｐｔ４および内因性パーキンを発現する。内因性Ｓｅｐｔ４を発現する細胞は細胞株（例えばＳＨＳＹ−５Ｙのような神経細胞株）および初代培養物（例えばヒト胎児脳細胞）を包含する。初代培養物は、Ｉｈａｒａら、２００７、Ｎｅｕｒｏｎ、５３：５１９−３３に記述されるとおり製造しうる。あるいは、該タンパク質のいずれか若しくは双方が細胞に対し外因性であり得かつ組換え発現し得る。細胞は安定に若しくは一過性にトランスフェクトし得る。好ましくは、細胞は複数のアッセイにわたる一貫性のため安定なトランスフェクタントである。一態様において、細胞は内因性Ｓｅｐｔ４および外因性パーキンを発現する。一態様において、細胞は内因性パーキンおよび外因性Ｓｅｐｔ４を発現する。一態様において、細胞は内因性Ｓｅｐｔ４および内因性パーキンを発現する。一態様において、細胞は外因性パーキンおよび外因性Ｓｅｐｔ４を発現する。ある好ましい態様において、細胞は内因性パーキンおよび／若しくはＳｅｐｔ４タンパク質を発現し、そして加えて該細胞は外因性の（組換え）形態のパーキンおよび／若しくはＳｅｐｔ４タンパク質を発現する。

組換えパーキンを発現する細胞を使用する場合、パーキンは発現ベクターを使用して発現させうる。一態様において、発現ベクターは野生型パーキンをコードする。例えば、ヒトパーキンのｃＤＮＡ（ＮＭ００４５６２）を、このアッセイでの使用のためにベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位に挿入し得る。別の態様において、パーキン変異体をコードする発現ベクターを使用する。同時係属出願第１１／６３８，２４２号明細書に記述されるとおり、ある種のパーキン変異体の発現はプロテアソーム機能の阻害をもたらす。例示的パーキン変異体は、Ｓ１６７Ｎ、Ｃ２１２Ｙ、Ｔ２４０Ｍ、Ｒ２７５Ｗ、Ｃ２８９Ｇ、Ｐ４３７Ｌを包含する。いくつかの態様においてＲ２７５Ｗ、Ｃ２１２Ｙ若しくはＣ２８９Ｇを使用する。パーキン変異体を使用するアッセイを、野生型パーキンを使用するアッセイに対する代替として、若しくはそれと組合せで使用し得る。いくつかの態様において、パーキンおよび／若しくはＳｅｐｔ４タンパク質はバリアントおよび／若しくは融合タンパク
質である。（インビトロアッセイに適するとして）上述されたバリアントの例および特性はまた細胞中で組換え発現させ得かつＳｅｐｔ４のユビキチン化を測定し得る。

組換えＳｅｐｔ４を発現する細胞を使用する場合、Ｓｅｐｔ４は野生型の形態（例えばＢＡＡ２５７５１）若しくはバリアントでありうる。（上述された）インビトロアッセイに適するバリアントの例および特性は細胞をまた組換え発現され得、そしてパーキンによるユビキチン化を測定し得る。バリアントタンパク質は、典型的には発現ベクターを使用して細胞に導入する。例えば、Ｓｅｐｔ４バリアントをコードする発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ３．１を使用し得る。あるいは、Ｓｅｐｔ４バリアントはレンチウイルス発現ベクターから発現させ得る。

組換え発現方法は既知である。本発明の実務に適する発現ベクター、一過性トランスフェクション法および細胞培養方法は当該技術分野で公知であり、そしてここで簡潔にのみ記述する。公知であるとおり、発現ベクターは、（例えばパーキンの）コーディング配列に作動可能に連結された真核生物発現調節領域を典型的に包含する組換えポリヌクレオチド構築物である。発現調節領域は、プロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列を包含し得る。発現ベクターは、典型的に、エピソーム、若しくは宿主染色体ＤＮＡの一体の（ｉｎｔｅｇｒａｌ）一部のいずれかとして宿主生物体中で複製可能である。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐｃＤＮＡ ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）；ｐＥＡＫ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）；および他者を包含する（２００５年まで補遺を付けられたところのＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨークを参照されたい）。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするための選択マーカー、例えばアンピシリン耐性若しくはハイグロマイシン耐性を含有する。細胞のトランスフェクションおよび培養方法もまた公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら １９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ；およびＡｕｓｕｂｅｌ、１９８９、上記中を参照されたい。

Ｖ．パーキンのリガーゼ活性のモジュレーターの細胞に基づくスクリーニング
本発明の細胞に基づくアッセイは、パーキンソン病の処置のための候補化合物を同定するためのパーキンタンパク質活性のモジュレーターについてのスクリーニングで有用である。一局面において、パーキン活性に対するある剤の効果は、（ａ）パーキンを発現しかつＳｅｐｔ４を発現する哺乳動物細胞を提供すること；（ｂ）該細胞を試験剤に曝露すること；（ｃ）試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を試験剤に曝露されない対照細胞中のＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度と比較すること（試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的増大は該試験剤がパーキン活性を高めることを示し、また、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的減少は該試験剤がパーキン活性を阻害することを示す）を伴う、細胞に基づくアッセイで評価し得る。

細胞は試験剤を細胞培地に添加することにより該剤に曝露しうる。１アプローチにおいて、Ｓｅｐｔ４タンパク質を発現する細胞をパーキンをコードする発現構築物でトランスフェクトする。該細胞を１〜１０日、好ましくは２ないし５日（例えば３日）間培養することができ、そしてその後試験剤に曝露しうる。曝露の期間は変動し得るが、しかし通常は１から２４時間まで、好ましくは４から１６時間までであることができる。同様に、多様な濃度の剤を試験し得る。濃度は剤の性質に依存して変動することができるが、しかし典型的には１ｎＭないし５μＭの範囲にあることが認識されるであろう。典型的には、数
種の異なる濃度の試験剤（例えば１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭおよび１００μＭ）をゼロ濃度の対照と一緒にアッセイする。試験剤（例えばポリペプチド、阻害性核酸など）はまた細胞中での組換え発現によっても導入し得る。あるいは、試験剤は細胞抽出液若しくはホモジェネートに添加する。

本発明の一態様において、ＨＣＣ細胞は６ウェル細胞培養プレートの培養ウェル中７５％密度まで増殖させる（例えば各ウェル直径約３０ｍｍ）。細胞を、上述されたパーキン発現ベクターでウェルあたりおよそ２．５μｇのプラスミドを使用してトランスフェクトし、そして試験剤を用いる分析前に該細胞を約３日（例えば２ないし５日）間培養する。

ＶＩ．パーキンのリガーゼ活性の動物に基づく（「インビボ」）アッセイ
アッセイはまた動物を使用しても実施し得る。いくつかの局面において、本発明はパーキンリガーゼタンパク質およびＳｅｐｔ４タンパク質を天然に発現する動物でパーキンのリガーゼ活性を評価するためのインビボモデルを提供する。インビボサンプルからのタンパク質活性を評価するためのアッセイは当業者に既知である。該アッセイは例えばパーキンおよびＳｅｐｔ４を発現する組織の抽出液を作成することにより実施し得る。抽出液は、典型的には該抽出液中でタンパク質の天然のユビキチン化状態を維持するため生理学的条件を使用して作成する。抽出液中のＳｅｐｔ４タンパク質のユビキチン化のレベル若しくは存在をその後検出する。Ｓｅｐｔ４タンパク質を例えば抗Ｓｅｐｔ４抗体を使用して天然の組織サンプルから単離および検出し得る。ユビキチン化されたタンパク質の検出方法は当業者に公知である。例えば、Ｓｅｐｔ４タンパク質を抗Ｓｅｐｔ４抗体を使用することにより抽出液から単離し得、そして純粋な若しくは半純粋なＳｅｐｔ４タンパク質をその後典型的にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、次いで抗ユビキチン抗体を用いてウエスタンブロッティングして、Ｓｅｐｔ４タンパク質のユビキチン化の存在およびレベルを検出する。

いくつかの局面において、ヒトＰａｒｋおよび／若しくはヒトＳｅｐｔ４タンパク質を発現するマウスのようなトランスジェニック動物を包含することを該アッセイで使用する。一態様において、パーキン活性は、Ｓｅｐｔ４タンパク質およびパーキンタンパク質を発現若しくは過剰発現するよう工作された動物で評価する。トランスジェニック動物の製造方法は当業者に公知である。例えば、テトラサイクリンで誘導可能な発現マウストランスジェニック系がＳｕｎら ２００７、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）、３９（４）：２３５−４６により総説されている。

いくつかの他の局面において、Ｓｅｐｔ４を発現するがしかしパーキンを発現しない動物；例えばパーキン遺伝子ノックアウト動物のようなパーキンを発現しないよう工作された動物を使用して、パーキンリガーゼの存在および非存在下での組換え的に若しくは内因的に発現されたＳｅｐｔ４タンパク質のユビキチン化のレベルを比較し；かようにパーキンのリガーゼ活性の比較評価を提供する。いくつかの態様において、ＲＮＡサイレンシング技術をＳｅｐｔ４若しくはパーキンの発現の下方制御若しくは発現の阻害に使用し得る。神経変性障害におけるＲＮＡｉ技術の使用がＦａｒａｈら、２００７、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、４：１６１−７（２００６）に記述されている。Ｓｅｐｔ４−／−ノックアウトマウスは例えばＩｈａｒａら、２００５、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ８：３４３−３５２に記述されている。

いくつかの局面において、そのＳｅｐｔ４タンパク質基質のユビキチン化またはレベル若しくはユビキチン化に基づいてパーキン活性を測定するためのインビボ動物系を、パーキン活性に対する処置剤若しくは潜在的薬物の活性の評価において使用し得る。本発明のこうした一局面において、上述された動物系を使用して、薬物若しくは他の処置剤の存在および非存在下でＳｅｐｔ４のユビキチン化若しくはユビキチン化のレベルを検出し得る
。試験剤は動物に該剤を給餌すること、または注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）若しくは他の既知の薬物投与方法により試験動物に投与し得る。

ＶＩＩ．実施例

方法および材料
プラスミドおよび細胞株ならびに抗体：ＨＥＫ２９３細胞はＡＴＣＣから得、そしてＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ中で増殖させた。ＨＣＣは記述された（Ｍａｌｉｎｉｎら、２００５、ＰＮＡＳ １０２（８）：３０５８−６３）とおり調製した。パーキンｃＤＮＡ（ＮＭ＿００４５６２）を細菌発現のためｐＧＥＸ６Ｐ−１ベクターに、哺乳動物細胞中での発現およびレンチウイルス発現のためｐＣＮＤＡ３．１ベクターに、記述された（Ｍａｒｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３（６）：１９９２−６（２００３））ところの方法およびベクターを使用してクローン化した。Ｓｅｐｔ４Ｖａｒ３ ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０８０４１６．１）はＯｒｉｇｅｎｅ，Ｉｎｃ（メリーランド州ロックビル）から得、そしてオープンリーディングフレームを細菌発現のためｐＧＥＸ６Ｐ−１および哺乳動物発現のためｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。パーキン抗体１Ａ１の商業的供給源（ＩＢＬ、ミネソタ州ミネアポリス）およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カリフォルニア州サンタクルズ）からのＳｅｐｔ４に対するＳＣ−２０１７９。

タンパク質産生および精製：ＧＳＴ−パーキンは記述された（Ｆａｌｌｏｎら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８（８）８３４−８４２（２００６））とおり製造した。Ｓｅｐｔ４タンパク質はＧＳＴ融合タンパク質として製造し、そして記述された（Ｉｈａｒａら、Ｎｅｕｒｏｎ ５３：５１９−５３３（２００７））とおり切断した、Ｅ１、ＵｂｃＨ７（Ｅ２）およびユビキチンはＢｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。

細胞トランスフェクション、エポキシミシン（ｅｐｏｘｉｍｉｃｉｎ）処理：Ｆｕｇｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ、カリフォルニア州）を使用して、合計１μｇのｃＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に導入した。２４時間後、細胞をＤＭＳＯ中１００ｎＭのエポキソミシン（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）若しくはＤＭＳＯ単独で処理した。エポキソミシンの１６時間後に、細胞を記述された（Ｊｏｈｎｓｏｎら、ＪＣＢ １４３：１８８３−１８９８（１９９８））とおりＩＰＢ緩衝液に溶解し、そして等タンパク質量の可溶性ライセートを１０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷しかつイムノブロットした。

共免疫沈降実験：細胞をＰＢＳで２回洗浄し、収集しかつ−２０℃で一夜保存した。融解したＨＥＫ２９３細胞を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５で溶解し、ＨＣＣをＩＰＢ緩衝液で溶解し、タンパク質含量を測定し（ブラッドフォードアッセイ、ＢｉｏＲａｄ）、そして１μｇの１Ａ１パーキン抗体を、予め浄化した（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｅｄ）ライセートに３〜１６時間添加した。予め浄化したプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を回転を伴い追加の１時間添加し、ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、そして、タンパク質をイムノブロッティング分析のためＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を使用してビーズから溶離した。

インビトロユビキチニル化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）アッセイ：５０μｌの反応を、以下の条件、すなわち５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．８、５μＭ Ｅ２、４００ｎＭ Ｅ１、２００μＭユビキチン、１μＭ Ｓｅｐｔ４および３．７５μｇ ＧＳＴ−パーキン、Ｓｉａｈ １、Ｎｅｄｄ、ＭＵＲＦ１のＥ６−ＡＰで集成した。アッセイは氷上で集成し、そして１５μｌのアリコートを３７℃で０、３０および６０分のインキュベーション後にＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に取り出した
。サンプルを１０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングを介して分析した。

パーキンおよびＳｅｐｔ４は２ハイブリッドスクリーニングで相互作用する
酵母２ハイブリッドスクリーニングを使用して、ヒトパーキンと相互作用するヒトタンパク質を同定した。パーキンタンパク質の最初の２３７アミノ酸（１−２３７）および完全長パーキンタンパク質（ＦＬ）を使用するスクリーニングからの結果の比較は、Ｓｅｐｔ４タンパク質（Ｓｅｐｔ４、ＮＭ＿０８０４１６．１）を圧倒的に表す１つの結果を示した。多様な独立した単離物はアミノ酸１１７からＣ末端までＳｅｐｔ４の領域全体にわたった。われわれはＳｅｐｔ４クローンを１−２３７のスクリーニングから同定したため、Ｓｅｐｔ４に対するパーキンの相互作用ドメインはパーキンのアミノ末端にある（図１）。われわれはＳｅｐｔ４の最初の１１７アミノ酸を包括するいかなるクローンも見出さなかった。

パーキンおよびＳｅｐｔ４は共免疫沈降実験で相互作用する
Ｓｅｐｔ４がパーキンと相互作用することを確立するために共免疫沈降（ＣＯ−ＩＰ）実験を実施した。図１ｂに示されるとおり、パーキン抗体は、パーキンを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−Ｐａｒｋｉｎ）にＳｅｐｔ４ ｃＤＮＡをトランスフェクトする場合に、パーキンおよびＳｅｐｔ４を特異的にＣＯ−ＩＰすることが可能である。ｐｃＤＮＡベクター対照でトランスフェクトしたＨＥＫ−Ｐａｒｋｉｎ細胞からのＣＯ−ＩＰはＳｅｐｔ４免疫反応性物質を沈降しなかった。さらに、パーキンをコードするレンチウイルスで形質導入したヒト皮質ニューロン（ＨＣＣ）を使用して、パーキン抗体はパーキンおよび内因性Ｓｅｐｔ４を特異的にＣＯ−ＩＰすることが可能である（図２ｂ、ＨＣＣ＋Ｐａｒｋｉｎ）。ＬＶベクター単独で形質導入した対照細胞からのＳｅｐｔ４の免疫単離は存在しなかった（図２ｂ、ＨＣＣ対照）。

インビボでのＳｅｐｔ４のユビキチン化
Ｓｅｐｔ４が細胞中でユビキチニル化され得るかどうかを決定するため、２９３ ＨＥＫ細胞をＳｅｐｔ４およびｐｃＤＮＡ若しくはＳｅｐｔ４およびパーキンでトランスフェクトし、次いでプロテアソーム阻害剤を添加した。Ｓｅｐ４抗体を使用する細胞ライセートのイムノブロットは、プロテアソーム阻害剤の添加がライセート中のＳｅｐｔ４の総量を増大させ、かつ、より高分子量種のＳｅｐｔ４の蓄積もまたもたらしたことを示す（図１ｄ）。さらに、パーキンの存在下で、パーキンがユビキチン化および２６ＳプロテアソームによるＳｅｐｔ４のターンオーバーにおいてある役割を演じうることを示唆する、より高分子量種のＳｅｐｔ４の顕著な増大されたレベルが存在する。

Ｓｅｐｔ４のユビキチン化はインビトロでパーキンにより媒介される
Ｓｅｐｔ４およびパーキンの関係を直接示すため、Ｓｅｐｔ４およびパーキンタンパク質を精製した。酵素的に活性のパーキンの存在下でのＳｅｐｔ４のユビキチニル化を評価するためインビトロアッセイを実施した。図２に示されるとおり、精製したＳｅｐｔ４はパーキンによりユビキチニル化される。パーキン活性を図２ｂに示し、ここで図２ａと同一の反応からのアリコートをパーキンに対する抗体でイムノブロットし、確実な自己ユビキチニル化を示す。これらの反応は、Ｓｅｐｔ５タンパク質に対するパーキン活性に必要とされることが報告されたＥ２酵素、ＵｂｃＨ８を使用し、そしてそれはＳｅｐｔ４タンパク質に対し明瞭に活性である。しかしながら、パーキン−Ｓｅｐｔ４活性に対する多様なＥ２酵素の調査において、われわれは、ＵｂｃＨ５、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ１３、Ｕｂ
ｃＨ１３／Ｕｅｖ１もまたＳｅｐｔ４をユビキチニル化し得、そして実際にＵｂｃＨ８より大きい程度までそうすることを見出した（図２ｃ）。これらの結果の意味は、パーキンが多様なＥ２酵素とともに多くの多様な細胞調節性の役割で機能し得るリガーゼでありうることである。多様な他のリガーゼはＳｅｐｔ４をユビキチニル化することが可能でなかったため、Ｓｅｐｔ４ユビキチニル化はパーキンに比較的特異的である（図２ｄ）。パーキンによるＳｅｐｔ４のモノユビキチン化の例は観察されなかった（反応で利用されるＥ２に関係なく、図２ｃ）ため、および、細胞へのプロテアソーム阻害剤の添加はＳｅｐｔ４レベルの増大を引き起こす（図１ｄ）ため、パーキンが２６Ｓプロテアソームによる分解の標的をＳｅｐｔ４タンパク質に定めていることがありそうである。

セプチン４を基質として使用する熱変性スクリーニングアッセイ
本発明の一局面において、２００８年１月３１日に出願されかつ引用することにより本明細書に組み込まれる米国仮出願第６１／０２５２３１号明細書に記述されるところの熱変性アッセイでセプチン４をパーキン基質として使用しうる。簡潔には、熱変性アッセイは予防および処置パーキンソン病のための候補化合物を同定するためのインビトロスクリーニングアッセイである。パーキンタンパク質（「パーキン」）をパーキンのリガーゼ活性の喪失を引き起こす条件（「熱不安定化条件」）に曝露する。熱不安定化条件への曝露は試験剤の存在若しくは非存在下で実施する。パーキンのリガーゼ活性を保存する剤がパーキンソン病の処置のための候補化合物である。

１バージョンにおいて、該スクリーニングアッセイは、ａ）複数の試験サンプルを熱不安定化条件に曝露すること（各試験サンプルはｉ）パーキンタンパク質およびｉｉ）複数の試験剤の１種を含有し）；ｂ）試験剤の非存在下で熱不安定化条件に曝露されたパーキンタンパク質を含んでなる対照サンプルに関して前記試験サンプル中のパーキンのリガーゼ活性を測定すること（パーキンのリガーゼ活性が対照サンプル中のリガーゼ活性を超える試験サンプルに含有される試験剤はパーキンソン病の処置のための候補化合物と同定される）を伴う。一態様において、試験剤の非存在下で熱不安定化条件に曝露されるパーキンはその元のＥ３リガーゼ活性の４０〜７０％を保持する。熱不安定化条件の例は４５℃から６０℃までの温度で３０分ないし１８０分間のインキュベーションを包含する。具体的説明のため、インキュベーションは約５７℃で約９０分間若しくは約６０℃で約１５０分間であり得る。

該アッセイの１バージョンにおいて、パーキンのリガーゼ活性は、パーキンタンパク質、Ｅ１ユビキチン活性化酵素、Ｅ２ユビキチン結合酵素、ＡＴＰ、ユビキチンおよびセプチン ４を適切な緩衝液中で組合せること、該組合せを２０〜３７℃でインキュベートすること、ならびにパーキン基質のユビキチン化の速度若しくは程度を測定することにより測定し得る。

該アッセイにおいて、パーキンのリガーゼ活性は、ドナー発色団がユビキチンと会合されかつアクセプター発色団がパーキン基質と会合されるか、若しくはドナー発色団がパーキン基質と会合されかつアクセプター発色団がユビキチンと会合される蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイを使用して測定し得る。一態様において、ドナー発色団はユーロピウムクリプレート（ｅｕｒｏｐｉｕｍ ｃｒｙｐｌａｔｅ）でありかつアクセプター発色団はアロフィコシアニンである。

パーキン安定剤であるパーキン活性の正のモジュレーターは、前記化合物の存在および非存在下で減弱されない（ｕｎａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）パーキンタンパク質をインキュベートすることにより、パーキンアゴニストである候補化合物と識別することができ、ここで、パーキンのリガーゼ活性を増大させる化合物はパーキンアゴニストと同定され、また
、パーキンのリガーゼ活性を増大しない化合物はパーキン安定剤と同定される。

本明細書で引用される全部の刊行物および特許文書（特許、公開特許出願および未公開特許出願）は、それぞれのこうした刊行物若しくは文書が引用することにより本明細書に組み込まれることを特別にかつ個別に示すかのように、引用することにより本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、いかなるこうした文書も関連する従来技術であるという了解として意図しておらず、また、それはそれの内容若しくは日付に関していかなる了解も構成しない。本発明は今や書かれた記述および実施例によって記述され、当業者は、本発明を多様な態様で実施し得ること、ならびに前述の記述および実施例は具体的説明の目的上でありかつ以下の請求の範囲の制限でないことを認識するであろう。

Claims (24)

1. Ｓｅｐｔ４タンパク質がパーキンタンパク質のリガーゼ活性によりユビキチン化される条件下でパーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質を組み合わせること、ならびにＳｅｐｔ４タンパク質のユビキチン化の存在、速度若しくは程度を測定することを含んでなる、パーキン活性の検出方法。
2. パーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質がインビトロで組合せられる、請求項１に記載の方法。
3. パーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質が、７と９の間のｐＨでＥ１、Ｅ２、Ｍｇ−ＡＴＰおよびユビキチンを含んでなる緩衝反応媒体中で組合せられる、請求項２に記載の方法。
4. パーキン活性がエクスビボの細胞中で検出される、請求項１に記載の方法。
5. 細胞が内因性セプチン−４タンパク質を発現する、請求項４に記載の方法。
6. 細胞が初代（非形質転換）細胞である、請求項５に記載の方法。
7. パーキン活性がＳＨＳＹ−５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ−２２６６）若しくはヒト胎児脳細胞中で検出される、請求項５に記載の方法。
8. （１）セプチン−４タンパク質がユビキチン化され得る条件下でパーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質をインビトロで一緒にインキュベートすること；
   （２）パーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質を試験剤の存在下で（１）の条件下で一緒にインキュベートすること；
   （３）試験剤の存在下でのセプチン−４ユビキチン化の速度若しくは程度を該試験剤の非存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度と比較することを含んでなり、
   ここで、試験剤の存在下でのセプチン−４ユビキチン化の相対的増大は該試験剤がパーキンのユビキチン化活性を高めることを示し、また、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的減少は該試験剤がパーキンのユビキチン化活性を阻害することを示す、パーキン活性のモジュレーターのアッセイ。
9. パーキンタンパク質およびセプチン−４タンパク質がＥ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ユビキチンおよびＡＴＰを含んでなる組成物中で組合せられる、請求項８に記載のアッセイ。
10. Ｅ２タンパク質が、ＵｂｃＨ５、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ１３、ＵｂｃＨ１３／Ｕｅｖ１よりなる群から選択される、請求項９に記載のアッセイ。
11. （ａ）パーキンを発現しかつＳｅｐｔ４を発現する哺乳動物細胞を提供すること；
    （ｂ）該細胞中のＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を測定すること
    を含んでなる、パーキン活性の細胞に基づく測定方法。
12. Ｓｅｐｔ４タンパク質が細胞中で内因的に発現される、請求項１１に記載の方法。
13. Ｓｅｐｔ４タンパク質が細胞中で組換え発現される、請求項１１に記載の方法。
14. パーキンタンパク質が野生型ヒトパーキンのバリアント若しくはフラグメントである、
    請求項１１−１３のいずれかに記載の方法。
15. パーキンタンパク質が、位置１６７のセリンの代わりにアスパラギン；位置２１２のシステインの代わりにチロシン；位置２４０のトレオニンの代わりにメチオニン；位置２７５のアルギニンの代わりにトリプトファン；位置２８９のシステインの代わりにグリシン；若しくは位置４３７のプロリンの代わりにロイシンを有するバリアントである、請求項１４に記載の方法。
16. （ａ）パーキンを発現しかつＳｅｐｔ４を発現する哺乳動物細胞を提供すること；
    （ｂ）該細胞を試験剤に曝露すること；
    （ｃ）試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を該試験剤に曝露されない対照細胞中のＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度と比較することを含んでなり、
    ここで、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的増大は該試験剤がパーキンのユビキチン化活性を高めることを示し、また、試験剤の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的減少は該試験剤がパーキンのユビキチン化活性を阻害することを示す、
    パーキン活性のモジュレーターのエクスビボの細胞に基づくアッセイ。
17. Ｓｅｐｔ４タンパク質が細胞中で内因的に発現される、請求項１６に記載の方法。
18. 細胞がＳｅｐｔ４タンパク質が細胞中で組換え発現される、請求項１６に記載の方法。
19. パーキンタンパク質が野生型ヒトパーキンのバリアント若しくはフラグメントである、請求項１６−１８のいずれかに記載の方法。
20. パーキンタンパク質が、位置１６７のセリンの代わりにアスパラギン；位置２１２のシステインの代わりにチロシン；位置２４０のトレオニンの代わりにメチオニン；位置２７５のアルギニンの代わりにトリプトファン；位置２８９のシステインの代わりにグリシン；若しくは位置４３７のプロリンの代わりにロイシンを有するバリアントである、請求項１９に記載の方法。
21. （ａ）神経細胞中でパーキンおよびＳｅｐｔ４を共発現するヒト以外の動物を提供すること；
    （ｂ）試験剤を該動物に投与すること；
    （ｃ）該試験剤を投与した動物の前記神経細胞中のＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度を該剤を投与されない対照動物でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の速度若しくは程度と比較することを含んでなり、
    ここで、治療薬の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的増大は該治療薬がパーキンのユビキチン化活性を高めることを示し、また、該治療薬の存在下でのＳｅｐｔ４ユビキチン化の相対的減少は該治療薬がパーキンのユビキチン化活性を阻害することを示す、パーキン活性のモジュレーターの同定方法。
22. 動物がげっ歯類若しくはヒト以外の霊長類である、請求項２１に記載の方法。
23. 動物がマウスである、請求項２２に記載の方法。
24. 動物が前記細胞中で１種若しくは複数の導入遺伝子を発現し、前記１種若しくは複数の導入遺伝子はセプチン−４およびパーキンのいずれか若しくは双方をコードする、請求項２１に記載の方法。

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