KR20170092634A - 파킨 리가제 활성화 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파킨 리가제 활성화를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 화합물을 투여함으로써 파킨 리가제를 활성화시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 파킨 리가제의 활성화와 관련된 질환 또는 병태를 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

Description

파킨 리가제 활성화 방법 및 조성물 {PARKIN LIGASE ACTIVATION METHODS AND COMPOSITIONS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2015년 10월 5일 출원된 미국 가출원 번호 62/237,400, 2015년 9월 22일 출원된 미국 가출원 번호 62/222,008, 및 2014년 12월 5일 출원된 미국 가출원 번호 62/087,972의 우선권의 이점을 주장하고, 상기 가출원들의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

본 발명의 분야

본 발명은 치료학적 이익을 위해 아연 핑거 도메인을 파괴시킴으로써 파킨 리가제를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.

유비퀴틴-프로테아좀 경로 시스템 (UPS)은 중요한 조절인자 단백질을 조절하고, 미스폴딩되거나 또는 비정상적인 단백질을 분해시키는 중요한 경로이다. UPS는 다중의 세포 프로세스에서 중요하고, UPS에 결함이 있거나 또는 불균형 상태일 경우, 다양한 질환의 발병을 유발한다. 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 거의 모든 생물 측면에서 단백질 안정성 및 활성을 조절하고, 다수의 기능의 기저를 이루는 기본적인 세포 기전이다. 유비퀴틴의 특이적인 단백질 기질에의 공유 부착은 E3 유비퀴틴 리가제의 작용을 통해 달성된다. 상기 리가제는 500개 초과의 상이한 단백질을 포함하고, 이는 그의 E3 기능적 활성의 구조적 요소에 의해 정의되는 다중 부류로 분류된다. 구체적으로, HECT 및 RING 리가제, 둘 모두는 활성화된 유비퀴틴을 티오에스테르로부터 기질 상의 리신 잔기의 e-아미노산 기로 전달하지만; 그러나, HECT 리가제는 유비퀴틴과 함께 중간 티오에스테르 결합을 형성하는 활성 부위 시스테인을 가지는 반면, RING 리가제는 유비퀴틴을 E2로부터 기질로 직접 전달할 수 있도록 허용하는 스캐폴드로서 작용하다. 최근 증거는 RING과 RING 사이(RING-between-RING: RBR) 패밀리인 RING 리가제의 서브패밀리는 정규 RING 도메인 이외에도 촉매성 시스테인 잔기 1,2를 함유할 수 있다는 것을 제안한다 (Riley et al. 2013. Nat Commun. 4:1982, "Riley et al.")(상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다).

탈유비퀴틴화 단백질 및 유비퀴틴-특이적인 프로테아제 (DUB 및 USP) 및 E3 리가제는 UPS에서 중요한 역할을 한다. 상기 단백질은 분화된 기능을 위해 유비퀴틴 (Ub)의 결합을 안정화시키는 가요성 아연 핑거 (ZnF) 도메인에 의해 지원을 받는다.

파킨은 유비퀴틴의 특이적인 기질에의 공유 부착에서 작용하는 RING과 RING 사이 E3 리가제이며, 파킨의 돌연변이는 파킨슨병, 암 및 미코박테리아 감염과 연관되어 있다. Zn 이온과 배위결합하는 특이적인 잔기 뿐만 아니라, 고전적 E2-결합 도메인을 정의하는 정규 RING 크로스브레이스 구조와의 그의 관계와 관련하여 파킨에 대한 개별 RING 도메인이 많은 논쟁의 대상이 되고 있다. R0은 신규 도메인 구조이지만, E3 RING 도메인보다는 Zn-핑거 도메인과 더 유사하다 (Riley et al. 2013. Nat Commun. 4:1982).

다수의 신약 개발 프로그램이 UPS에 주력하고 있지만, 효소적 단백질 활성 부위에의 직접적인 접근 및 선택성 부족으로 인해 거의 성공을 거두지 못해 왔다. 본 발명은 종양 및 신경계 장애를 비롯한, 각종 질환 및 장애에 치료학적 이점을 제공하는, Zn-핑거 도메인를 파괴시키는 신규한 접근법에 관한 것이다.

본 발명은 치료학적 이익을 위해 UPS에서 리가제의 ZnF 도메인 중의 아연 이온 및/또는 시스테인 잔기에 결합시킴으로써 UPS에서 리가제의 구조 및/또는 기능을 조절하는 것에 관한 것이다. 본 기전은 리가제의 활성 부위에 결합시키는 것과는 상이하며, 이는 Ub의 테일을 받는 것이다. 본 발명은 파킨 ZnF 도메인 중 아연 이온에 소분자를 배위결합시킴으로써, 또는 파킨 ZnF 도메인 중 시스테인 잔기와 소분자의 화학 반응에 의해 파킨 리가제를 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 소분자의 아연 이온에의 배위결합은 ZnF 도메인으로부터 아연 이온을 제거할 수 있거나, 또는 제거하지 못할 수도 있다. 시스테인 잔기와 소분자의 화학 반응은 가역적 또는 비가역적일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시양태는 파킨 리가제를 활성화시키는 방법을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 파킨 리가제는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 화합물을 투여함으로써 활성화될 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 Zn 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인과 결합 또는 반응할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 시스테인 중의 티올 기와 반응할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 활성화된 파킨 리가제는 하나 이상의 종양을 억제시킨다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 활성화된 파킨 리가제는 도파민 뉴런을 보호한다.

Zn 이온에 배위결합할 수 있는 화합물로는 1좌, 2좌 또는 3좌 리간드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 시스테인 잔기 중의 티올 기와 반응할 수 있는 화합물로는 알킬화제, 산화제, 마이클(Michael) 수용자, 또 다른 불포화된 구조, 또는 디술피드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 화합물은 손상된 미토콘드리아를 제거하고/거나, 세포적 스트레스 동안 세포 생존가능성을 증가시키고/거나, 종양 형질변환을 감소시키고/거나, 세포에서 알파-시누클레인을 이동시킨다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암 진단을 받은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 암은 교모세포종, 소세포 폐 암종, 유방암 또는 전립선암이다.

일부 실시양태에서, 환자는 신경퇴행성 질환 진단을 받은 것이다.

특정 실시양태에서, 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 헌팅톤병이다. 추가 실시양태에서, 치매는 루이소체 치매 (DLB), 다계통 위축증 (MSA) 또는 진행성 핵상 마비 (PSP)이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 화합물은 파킨 리가제 중 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 실질적으로 파괴시킨다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 아연 핑거는 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465에 의해 정의되는 도메인으로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다. 구체적인 실시양태에서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기는 인간 파킨 리가제의 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되어 있다. 추가 실시양태에서, 아연 핑거는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 아연 킬레이터일 수 있다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 인간 파킨 리가제의 C59 및 C377로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다.

한 실시양태에서, 화합물은 파킨 리가제 중 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 실질적으로 파괴시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제 중 아연 핑거는 인간 파킨 리가제의 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인 내에 위치할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 실질적으로 파괴되는 아연 핑거는 파킨 리가제의 IBR 아미노산 328-377에 위치한다.

또 다른 실시양태에서, 화합물은 파킨 리가제를 활성화시키는 데 있어서 포스포 유비퀴틴 (pUB)과 함께 시너지적으로 작용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화는 유비퀴틴화를 변경시킨다.

또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화는 알츠하이머 치매, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 프리드라이히 운동실조(Freidreich's ataxia), 척수소뇌성 실조증, 다계통 위축증, PSP, 타우병증, 미만성 루이소체병, 루이소체 치매, α-시누클레인의 비정상적인 축적을 특징으로 하는 임의의 장애, 노화 과정 장애, 뇌졸중, 박테리아성 감염, 바이러스성 감염, 미토콘드리아 관련 질환, 정신 지체, 난청, 시각상실, 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 루프스, 거짓비늘 녹내장을 비롯한 녹내장, 레버 유전성 시각 신경병증(Leber's Hereditary Optic Neuropathy), 및 류머티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 또는 질병을 치료하거나, 또는 그의 발생을 감소시킨다.

구체적인 실시양태에서, 박테리아성 감염은 미코박테리움 감염이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 바이러스성 감염은 C형 간염 감염이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 미토콘드리아 관련 질환은 알퍼스병, 바쓰 증후군/LIC (치사성 영아 심근병증), 베타-산화 결손증, 카르니틴-아실-카르니틴 결핍증, 카르니틴 결핍증, 크레아틴 결핍증 증후군, 코엔자임 Q10 결핍증, 복합체 I 결핍증, 복합체 II 결핍증, 복합체 III 결핍증, 복합체 IV 결핍증/COX 결핍증, 복합체 V 결핍증, CPEO, CPT I 결핍증, CPT II 결핍증, KSS, 젖산산증, LBSL - 백질이영양증, LCAD, LCHAD, 라이병 또는 증후군, 루프트 질환, MAD/글루타르산뇨 타입 II, MCAD, MELAS, MERRF, MIRAS, 미토콘드리아 세포병변, 미토콘드리아 DNA 고갈, 미토콘드리아 뇌병증, 미토콘드리아 근육병, MNGIE, NARP, 피어슨 증후군, 피루베이트 카르복실라제 결핍증, 피루베이트 데히드로게나제 결핍증, POLG 돌연변이, 호흡 연쇄 관련 질환, SCAD, SCHAD, 및 VLCAD로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 암을 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 방법을 포함한다. 구체적인 실시양태는 그를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키고, 파킨 리가제 활성을 유도하는 화합물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 화합물은 Zn 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인 중의 티올 기와 반응할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화는 하나 이상의 종양을 억제시킨다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 손상된 미토콘드리아를 제거하고/거나, 세포적 스트레스 동안 세포 생존가능성을 증가시키고/거나, 종양 형질변환을 감소시키고/거나, 세포에서 α-시누클레인을 이동시킨다. 또 다른 실시양태에서, 암은 교모세포종, 소세포 폐 암종, 유방암 또는 전립선암이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 파킨슨병을 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 방법을 포함한다. 파킨슨병을 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 구체적인 실시양태는 그를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키고, 파킨 리가제 활성을 유도하는 화합물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 화합물은 Zn 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인 중의 티올 기와 반응할 수 있다.

일부 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화는 유비퀴틴의 공유 부착에 의해 기질 단백질을, 파킨 그 자체인 기질 단백질을, 또 다른 단백질, 예컨대, 미토퓨전(Mitofusion) 1 또는 2, FBW7을, 또는 다른 공개적으로 보고된 파킨 리가제의 기질을 변형시킬 수 있는 파킨의 능력에 의해 정의되는 바와 같이, 유비퀴틴화를 변경시킨다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 제약 제제를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 제약 제제는 파킨 리가제를 활성화시킨다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제약 제제는 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 화합물 또는 그의 염, 및 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 여기서, 화합물 또는 그의 염은 Zn 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인 중의 티올 기와 반응할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 인간 파킨 리가제의 C59 및 C377로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제약 조성물은 고체, 분말, 액체 및 겔로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제로 존재한다.

도 1은 (AH001 또는 하기 표 2에서 화합물 76으로 식별되는) N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드인 킬레이터 화합물이 활성-기반 유비퀴틴 비닐 술폰 프로브와의 파킨 리가제 반응을 증가시킨다는 것을 나타내는 것이다.
도 2는 (AH007 또는 하기 표 2에서 화합물 77로 식별되는) 6-벤질-2,5-디메틸-3-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-티올인 친전자체 및 킬레이터 화합물이 활성-기반 유비퀴틴 비닐 술폰 프로브와의 파킨 리가제 반응을 증가시킨다는 것을 나타내는 것이다.
도 3은 화합물 N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드인 킬레이터 화합물 (AH001)이 자가-유비퀴틴화 검정법에서 파킨 활성을 증가시킨다는 것을 나타내는 것이다.
도 4a 및 4b는 N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드 (AH001)가 pUB와 함께 시너지적으로 자가-유비퀴틴화 검정법에서 파킨 활성을 증가시키고, 더 낮은 저농도의 pUB가 파킨을 활성화시킬 수 있도록 허용한다는 것을 나타내는 것이다.
도 5는 6-벤질-2,5-디메틸-3-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-티올인 친전자체 화합물 (AH007)이 자가-유비퀴틴화 검정법에서 파킨 활성을 증가시킨다는 것을 나타내는 것이다.

그 안의 임의 도면 및 별첨을 포함하는 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 마치 각 개별 공개문헌, 특허 또는 특허 출원, 도면 또는 별첨 그의 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다.

정의

제약상 허용되는 염으로는 염을 형성하기 위해 염기로서 작용하는 활성 화합물을 무기산 또는 유기산과 반응시킴으로써 수득되는 것, 예를 들어, 염산, 황산, 인산, 메탄술폰산, 캄포르술폰산, 옥살산, 말레산, 숙신산, 시트르산, 포름산, 히드로브롬산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 살리실산, 만델산, 카르본산 등의 염을 포함한다. 통상의 기술자는 다수의 공지된 방법들 중 임의의 것을 통해 화합물을 적절한 무기산 또는 유기산과 반응시킴으로써 산 부가 염을 제조할 수 있다는 것도 추가로 이해할 것이다.

"치료하는"이라는 용어는 대상체에서 병태의 적어도 하나의 증상을 완화시키거나, 경감시키거나, 지연시키거나, 감소시키거나, 역전시키거나, 개선시키거나, 또는 관리하는 것 중 하나 이상의 것을 수행하는 것을 의미한다. "치료하는"이라는 용어는 또한 병태의 발병 (즉, 병태의 임상적 소견 이전의 기간)을 정지시키거나, 지연시키거나, 또는 병태가 발생되거나, 또는 악화될 위험을 감소시키는 것 중 하나 이상의 것을 수행하는 것을 의미할 수 있다.

"유효량"이란, 상태, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 환자에게 투여될 때, 상기 처치가 이루어질 수 있도록 하는 데 충분한, 본 발명에 따른 제제의 양을 의미한다. "유효량"은 활성 성분, 치료하고자 하는 상태, 장애 또는 병태 및 그의 중증도, 치료하고자 하는 포유동물의 연령, 체중, 신체 상태 및 반응에 따라 달라질 것이다.

용량 또는 양에 적용되는 "치료학상 유효"라는 용어는 화합물 또는 제약 제제의 양이 그를 필요로 하는 환자에게 투여되었을 때, 원하는 임상적 이익을 초래하는 데 충분하다는 것을 지칭한다.

본원에서 언급되는 모든 중량 퍼센트 (즉, "중량%" 및 "wt. %" 및 w/w)는 달리 명시되지 않는 한, 제약 조성물의 총 중량에 대해 상대적인 값으로 측정된 것이다.

본원에서 사용되는 바, "실질적으로" 또는 "실질적인"이라는 것은 작용, 특징, 특성, 상태, 구조, 물품 또는 결과의 한도 또는 정도가 완전하거나, 또는 거의 완전하다는 것을 지칭한다. 예를 들어, "실질적으로" 밀봉된 객체라는 것은 객체가 완전하게 밀봉되어 있거나, 또는 거의 완전하게 밀봉되어 있다는 것을 의미할 것이다. 절대적 완전성으로부터의 정확한 허용가능한 이탈 정도는 일부 경우에서는 구체적인 맥락에 의존하여 달라질 수 있다. 그러나, 일반적으로 말하면, 마치 절대적 및 전체 완성이 달성된 것과 동일한 전반적인 결과를 가질 수 있도록 완성에 근접하여야 할 것이다. "실질적으로"라는 것의 사용은 작용, 특징, 특성, 상태, 구조, 물품 또는 결과가 완전하게 또는 거의 완전하게 없다는 것을 지칭하는 것으로서, 부정적 함축으로 사용할 때에도 동일하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 다른 활성 작용제를 "실질적으로 함유하지 않는" 조성물은 다른 활성 작용제가 완전하게 없거나, 또는 효과가 마치 다른 활성 작용제가 완전하게 없는 것과 동일한 정도로 다른 활성 작용제가 거의 완전하게 없는 것이 될 것이다. 다시 말해, 성분 또는 요소 또는 또 다른 활성제를 "실질적으로 함유하지 않는" 조성물은 상기 물품의 측정가능할 정도의 효과가 없는 한, 이 물품을 여전히 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 2개 이상의 단백질/아미노산 서열의 "정렬"은 www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/에서 이용가능한 정렬 프로그램 ClustalW2를 사용함으로써 수행할 수 있다. 하기 디폴트 파라미터가 쌍별 정렬에 사용될 수 있다: 단백질 가중치 매트릭스 = Gonnet; 갭 개방 = 10; 갭 확장 = 0.1.

본원에서 사용되는 바, " 유비퀴틴 프로테아좀 경로 시스템 (UPS)"은 효모에서부터 포유동물까지 보존되는 유비퀴틴 프로테아좀 경로에 관한 것이며, 이는 진핵 세포에서 수명이 가장 짧은 단백질 표적화된 분해를 위해 요구된다. 표적으로는 그의 적시의 파괴가 제어된 세포 분열에 중요한 것인 세포 주기 조절 단백질 뿐만 아니라, 소포체 내에서 적절하게 폴딩하지 못하는 단백질을 포함한다. 유비퀴틴 변형은 3가지 부류의 효소에 의해 수행되는 ATP-의존성 과정이다. "유비퀴틴 활성화 효소" (E1)는 고도로 보존되는 76개의 아미노산으로 이루어진 단백질인 유비퀴틴과의 티오-에스테르 결합을 형성한다. 상기 반응을 통해 유비퀴틴은 이어서 "유비퀴틴 접합화 효소" (E2)에 결합될 수 있고, 이어서, 유비퀴틴의 카르복시-말단과 기질 단백질 상의 리신 잔기 사이에 이소펩티드 결합이 형성된다. 후자의 반응을 위해서는 "유비퀴틴 리가제" (E3)가 요구된다. E3 리가제는 단일- 또는 다중-서브유니트 효소일 수 있다. 일부 경우에서, 유비퀴틴-결합 및 기질 결합 도메인은 어댑터 단백질 또는 컬링(culling)에 의해 함께 결합되는 별개의 폴리펩티드 상에 존재한다. 다수의 E3 리가제는 각각 오직 기질 단백질의 서브세트만을 변형시킬 수 있다는 점에서 특이성을 제공한다. 추가의 특이성은 인산화를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 기질 단백질의 번역 후 변형에 의해 달성된다. 단일 유비퀴틴화의 효과로는 세포내 국재화의 변화를 포함한다. 그러나, 폴리유비퀴틴 쇄를 생성하는 다중 유비퀴틴화 사이클은 분해를 위해 단백질을 프로테아좀으로 표적화하는 데 요구된다. 다중서브유니트 26S 프로테아좀은 폴리유비퀴틴화된 기질을 인식하고, 언폴딩하고, 소형 펩티드로 분해시킨다. 상기 반응은 프로테아좀 복합체의 실린더형 코어 내에서 발생하고, 펩티드 결합 가수분해는 촉매성 친핵체로서 코어 트레오닌 잔기를 이용한다. 다중유비퀴틴 쇄 수용체 형태의 복잡한 추가 층은 폴리유비퀴틴화와 분해 단계 사이에 있을 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 상기 수용체는 26S 프로테아좀에 의한 그의 인식에 도움을 줌으로써 그의 분해를 촉진시키면서, 폴리유비퀴틴화된 기질의 서브세트와 반응한다. 상기 경로는 세포 항상성 뿐만 아니라, 인간 질환에서도 중요하다. 유비퀴틴/프로테아좀-의존성 분해는 대개 세포 분열 주기 및 세포 성장을 제어하는 데 사용되기 때문에, 프로테아좀 억제제가 잠재적인 암 치료제로 개발될 일부 가능성을 가지고 있다는 것을 연구원들은 알아냈다.

유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통한 단백질 분해가 세포내 단백질의 비-리소좀 단백질분해의 중요한 경로이다. 이는 각종의 기본적인 세포 프로세스, 예컨대, 세포 주기 진행, 분열, 발생 및 분화의 조절, 아폽토시스, 세포 이동, 및 면역 및 염증성 반응 조정에서 중요한 역할을 한다. 상기 시스템에서 중요한 요소는 유비퀴틴의 표적화된 단백질에의 공유 연결이며, 이는 이어서, 아데노신 트리포스페이트-의존성, 다중-촉매성 프로테아제인 26S 프로테아좀에 의해 인식된다. 손상, 산화 또는 미스폴딩된 단백질 뿐만 아니라, 다수의 중요한 세포 기능을 제어하는 조절 단백질이 상기 분해 과정의 표적 중에 있다. 상기 시스템의 이상은 세포 항상성의 탈조절 및 다중 질환의 발생을 유도한다 (Wang et al. Cell Mol Immunol. 2006 Aug; 3(4):255-61).

본원에서 사용되는 바, " 파킨 리가제 " 또는 " 파킨 "은 인간에서 PARK2 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 관한 것이다 (Kitada T, Asakawa S, Hattori N, Matsumine H, Yamamura Y, Minoshima S, Yokochi M, Mizuno Y, Shimizu N (April 1998). "Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism". Nature 392 (6676): 605-608. doi:10.1038/33416. PMID 9560156. Matsumine H, Yamamura Y, Hattori N, Kobayashi T, Kitada T, Yoritaka A, Mizuno Y (April 1998). "A microdeletion of D6S305 in a family of autosomal recessive juvenile parkinsonism (PARK2)". Genomics 49 (1): 143-146. doi:10.1006/geno.1997.5196. PMID 9570960). 상기 단백질은 다중 단백질 E3 유비퀴틴 리가제 복합체의 성분이며, 이는 결국 분해를 위해 단백질을 표적화하는 것을 매개하는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 일부이다. PARK2 유전자의 돌연변이는 상염색체 열성 유년 발병 파킨슨병 (AR-JP)으로 공지된 가족성 형태의 파킨슨병을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본원에서 사용되는 바, "리가제"는 2개 이상의 화합물 또는 생체분자를 새 화학 결합과 함께 결합시킴으로써 그의 연결을 촉매화시킬 수 있는 효소이다. 상기 둘의 "라이게이션"은 보통 더 큰 화합물 또는 생체분자 중 하나에 의존하는 작은 화학 기의 가수분해, 또는 두 화합물을 함께 연결하는 것을 촉매화시키는 효소, 예컨대, 기 C-O, C-S, C-N 등의 연결을 촉매화시키는 효소를 동반한다. 유비퀴틴-단백질 (E3) 리가제는 유비퀴틴화를 위해 단백질을 선택하는, 큰 패밀리의 매우 다양한 효소이다.

" Ub 리가제"는 종양, 염증 & 감염 질환에 대한 질환 발병에 관여한다. 정규 RING 도메인 및 촉매성 시스테인 잔기, 둘 모두를 함유하는, E3 리가제의 RING과 RING 사이 (RBR) 패밀리에 속하는 E3 리가제는 보통, 'RING/HECT 하이브리드' 효소로 명명되는 HECT E3 리가제로 제한된다. 파킨 돌연변이는 파킨슨병, 암 및 미코박테리아 감염과 연관이 있다. 파킨은 미토콘드리아 완전성에서 중요한 역할을 하는 신경보호 단백질로 인식되고 있다. 인간 유전자 데이터는 파킨슨병 (PD) 발병에 대한 기전으로서 파킨 활성 손실이 연루되어 있음을 보여주고 있다.

본원에서 사용되는 바, "아연 핑거 ( ZnF ) 도메인"은 아연 이온을 배위결합시켜 기능적 활성을 안정화시키는 것을 특징으로 하는 단백질 구조에 관한 것이다. ZnF는 UPS에서 Ub, 탈유비퀴틴화 효소 (DUB) 및 리가제 (E3)의 결합을 안정화시킨다.

본원에서 사용되는 바, "리간드"는 리간드 중의 하나 이상의 원자를 통해 금속에 결합하고, 이는 대개 킬레이팅 리간드로서 명명된다. 두 부위를 통해 결합하는 리간드는 2좌로 분류되고, 3개 부위를 통한 것은 3좌로 분류된다. "바이트 각도"란, 2좌 킬레이트의 두 결합 사이의 각도를 지칭한다. 킬레이팅 리간드는 일반적으로 유기 링커를 통해 공여자 기를 연결시킴으로써 형성된다. 고전적 2좌 리간드는 에틸렌 (-CH2CH2-) 링커와 두 암모니아 기를 연결시킴으로써 유도되는 에틸렌디아민이다. 다좌 리간드의 고전적 예는, 일부 금속은 완전하게 둘러싸면서, 6개의 부위를 통해 결합할 수 있는, 6좌 킬레이팅제인 EDTA이다. 킬레이팅 시스템의 결합 친화도는 킬레이팅 각도 또는 바이트 각도에 의존한다. 보통 리간드는 1 초과의 원자 상에 고립 전자쌍을 가지는 바, 다수의 리간드는 다중 부위를 통해 금속 이온에 결합할 수 있다. 일부 리간드는 단, 상이한 개수의 고립 전자쌍을 가지는 원자를 통해 금속 중심에 결합할 수 있다. 금속 리간드 결합의 결합 순서는 부분적으로는 금속 리간드 결합 각도 (M-X-R)를 통해서 구별될 수 있다. 이러한 결합 각도는 선형 또는 구부러짐으로 지칭되며, 각 굽힘 정도와 관련해서는 추가로 논의된다. 예를 들어, 이온 형태의 이미도 리간드는 3개의 고립 전자쌍을 가진다. 1개의 고립 전자쌍이 시그마 X 공여자로서 사용되고, 나머지 두 고립 전자쌍는 L형 pi 공여자로서 이용가능하다. 두 고립 전자쌍 모두가 pi 결합에 사용된다면, 이때, M-N-R 기하학적 구조는 선형이다. 그러나, 상기 고립 전자쌍 중 하나 또는 그 둘 모두가 비-결합인 경우, 이때, M-N-R 결합은 구부러진 상태이고, 그 굽힘 정도는 pi 결합이 얼마나 존재할 수 있는지를 시사한다. 소수의 헤테로원자, 예컨대, 질소, 산소 및 황 원자가 아연과 상호작용하는 것으로 밝혀졌고, 아연과 이들 헤테로원자 사이의 이상적인 거리가 확인되었다. 카르복실레이트는 1좌 및 2좌 상호작용, 둘 모두 통하여 아연에 결합한 반면, 히드록사메이트는 지배적으로는 2좌 방식으로 결합하였다. 이러한 결과는 표적 단백질 중 아연과 상호작용할 수 있는 잠재능을 가진 새 억제제를 디자인하는 데 도움이 된다. 사실상 모든 분자 및 모든 이온이 금속에 대한 리간드로서의 역할을 할 수 있다 (또는 금속에 "배위결합"할 수 있다). 1좌 리간드는 실제로 모든 음이온 및 모든 단순 루이스 염기를 포함한다. 따라서, 할라이드 및 슈도할라이드가 중요한 음이온성 리간드인 반면, 암모니아, 일산화탄소 및 물은 특히 공동 전하 중성 리간드이다. 단순 유기 종 또한 매우 일반적이며, 이는 음이온성 (RO^- 및 RCO₂ ^-) 또는 중성 (R₂O, R₂S, R_{3- x}NH_x, 및 R₃P)일 수 있다. 다좌 리간드의 복합체는 킬레이트 복합체로 명명된다. 이는 1좌 리간드로부터 유도된 복합체보다 더 안정적인 경향이 있다. 킬레이트 효과인, 이러한 증진된 안전성은 일반적으로 엔트로피 효과에 기인하는 것으로, 이는 1개의 다좌 리간드로 다수의 리간드를 대체하는 데 유리하다. 킬레이팅 리간드가, 적어도 부분적으로는 중심 원자를 둘러싸고, 그에 결합하는 큰 고리를 형성할 때, 큰 고리의 중앙의 중심 원자를 그대로 방치한다. 더욱 강성일수록 및 그의 리간드의 자리수가 더 높을수록, 마크로시클릭 복합체의 불활성 정도는 증가하게 될 것이다.

본원에서 사용되는 바, " 킬레이터 "는 킬레이트 (예를 들어, 금속 원자를 함유하는 헤테로시클릭 고리를 형성하기 위해 금속 원자 또는 이온이 리간드 상의 2개 이상의 지점에서 리간드에 결합한 것인 배위결합 화합물)를 형성함으로써 화학 활성을 억제시키는 결합제에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바, "킬레이션"은 이온 및 분자가 금속 이온에 결합하는 특정 방식에 관한 것이다. 국제 순수 응용 화학 연합(International Union of Pure and Applied Chemistry: IUPAC)에 따르면, 킬레이션은 다좌 (다중 결합된) 리간드와 단일 중심 원자 사이의 2개 이상의 별개의 배위 결합의 형성 또는 존재를 포함한다. 일반적으로, 이러한 리간드는 유기 화합물이며, 이는 킬란트, 킬레이터, 킬레이팅제, 또는 금속 이온 봉쇄제로 불린다.

본원에서 사용되는 바, " 친전자체 "는 전자가 풍부한 중심에 기여하는 종에 관한 것이다. 화학에서, 친전자체는 전자에 기여하는 시약이다. 이는 친핵체에 결합하기 위해 전자쌍을 수용함으로써 화학 반응에 참여한다. 친전자체는 전자를 수용하기 때문에, 이는 루이스 산이다. 대부분의 친전자체는 양으로 하전된 것이거나, 부분 양전하를 보유하는 원자를 가지거나, 전자의 옥텟을 가지지 않는 원자를 가진다.

하기 기술내용은 본 발명의 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에서 제공하는 정보 중 임의의 것이 선행 기술이거나, 또는 본 청구 발명에 관한 것이거나, 또는 구체적으로 또는 암시적으로 언급된 임의의 공개문헌이 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.

유비퀴틴-단백질 (E3) 리가제는 유비퀴틴화를 위해 단백질을 선택하는, 큰 패밀리의 효소이다. "Ub 리가제"로 불리는 상기 유비퀴틴 리가제는 암, 염증 및 감염 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는 각종 질환 및 병태에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

한 구체적인 Ub 리가제는 파킨 리가제이다. 파킨 리가제는 다중 단백질 "E3" 유비퀴틴 리가제 복합체의 성분이며, 이는 결국 분해를 위해 단백질을 표적화하는 것을 매개하는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 일부이다. 비록 파킨 리가제의 구체적인 기능에 대해서는 알려져 있지 않지만, 파킨 리가제 돌연변이는 각종 질환, 예컨대, 파킨슨병, 암 및 미코박테리아 감염과 연관이 있다. 따라서, 파킨 리가제는 치료학적 개입을 위한 관심 표적이 된다.

추가로, 관련 기술분야에 공지된 리가제를 조절하는 각종 방법이 알려져 있다. 다수의 리가제, 특히, 유비퀴틴-프로테아좀 경로 시스템 (UPS)에 관여하는 리가제는 상기 리가제에서 중요한 단백질 결합 영역을 안정화시키는 아연 핑거 (ZnF) 도메인을 가지는 것으로 알려져 있다.

ZnF 도메인은 아연 이온과 배위결합하고, 이러한 배위결합은 단백질의 기능적 활성을 안정화시킨다. ZnF 도메인을 가지는 단백질이 제공하는 기능적 활성으로는 예컨대, 유비퀴틴을 인식하는, 중요한 세포 신호전달 경로의 조절, DNA, 예컨대, 전사 및 수복 조절, 및 세포 산화환원 센서로서의 작용을 포함할 수 있다. 아연의 ZnF 도메인에의 결합, 또는 간단하게는 아연이 ZnF 도메인과 상호작용하는 방식을 조절하는 것이 UPS에 관여하는 리가제에 중요하다.

파킨 리가제는 하나 이상의 ZnF 도메인을 가지는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 파킨 리가제에서 ZnF 도메인을 조정하는 데 있어 2가지 다른 전략법에 초점을 맞추고 있다. 본 발명의 한 전략법은 ZnF 도메인에 결합하여 아연의 결합을 허용하지 않거나, 또는 ZnF 도메인으로부터 아연, 예컨대, Zn, 또는 Zn^{2 +}을 해리시키는 킬레이팅 화합물을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 전략법은 ZnF 도메인 중 시스테인 아미노산 잔기에 결합하거나, 또는 그와 결합하는 화합물을 사용하는 것을 포함한다. 하나 이상의 시스테인 잔기 (및 종종 히스티딘 잔기 지원하에서)는 아연 이온에 결합 및/또는 배위결합하는 데 있어 ZnF 도메인에서 중요하다. 아연 이온 (보통 Zn^{2 +})은 다중 시스테인 또는 히스티딘 잔기와 배위결합할 수 있다. 도메인 중에 시스테인 잔기가 많을수록, ZnF 도메인은 더욱 큰 가요성을 띠게 된다. 리가제, 예컨대, 파킨 리가제는 다중의 시스테인 잔기가 그의 ZnF 도메인 중의 아연과 배위결합하는 것으로 간주된다. 파킨 리가제의 ZnF 도메인에서의 이러한 가용성은 도메인이 가역성을 띠게 할 수 있는 것으로 간주되며, 따라서, 파킨 리가제를 조절할 수 있는 하나의 가능한 기전이다.

따라서, 본 발명은 파킨 리가제 중 아연 이온 및/또는 시스테인 잔기(들)와 상호작용할 수 있고, 이로써, 파킨 리가제의 활성을 조절할 수 있는 친전자성, 킬레이션 또는 친전자성 및 킬레이션 특성, 둘 모두를 가지는 하나 이상의 작용제 또는 하나 이상의 화합물의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 아연 이온이 파킨 리가제의 ZnF 도메인 중 적어도 하나에서 배위결합하지 못하도록 하는 것이 그의 활성을 유도하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명은 Zn의 킬레이션에 의해, 이어서, ZnF 도메인으로부터의 그의 제거에 의해, 또는 Zn을 고정시키는 시스테인 아미노산(들)에서의 친전자성 공격을 통하여 파킨 리가제를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 파킨 리가제를 활성화시키는 방법은 파킨 리가제 활성화를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 하나 이상의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제를 활성화시키는 방법은은 대상체에게 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 2개 이상의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 친전자체 또는 킬레이터일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 친전자체로서, 및 킬레이터로서, 둘 모두로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 작용기가 킬레이팅 특성을 가지고, 작용기가 친전자성 특성을 가지는 것인, 다중 작용기를 포함할 수 있다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 표 1 및 표 2의 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다. 비록 특정 이론으로 제한되는 것은 아니지만, 표 1 또는 표 2의 화합물 중 적어도 일부는 킬레이터, 친전자체 또는 그 둘 모두일 수 있다고 간주된다. 예를 들어, 표 2로부터의 화합물 76 및 97은 킬레이터로서 작용하지만, 표 2의 화합물 113은 티올 반응성 친전자체로서 작용하는 것으로 간주된다. 또 다른 예에서, 표 1 또는 표 2로부터의 화합물은 친전자체로서 및 친핵체로서, 둘 모두로 작용한다. 예를 들어, 표 2의 화합물 91 및 107은 둘 모두 킬레이터이지만, 가능하게는 티올 반응성 친전자체로서도 작용할 수 있는 것으로 간주된다. 따라서, 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 표 1 및 표 2의 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택되는 친전자체, 킬레이터, 또는 친전자체 및 킬레이터 둘 모두이다.

또 다른 실시양태에서, 표 1 및 표 2의 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르는 파킨 리가제에 결합하고, 활성화시킨다. 예를 들어, 화합물 N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드 (AH001)인 킬레이터 화합물 및 6-벤질-2,5-디메틸-3-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-티올 (AH007)인 친전자체 및 킬레이터 화합물, 둘 모두는 독립적으로 활성-기반 유비퀴틴 비닐 술폰 프로브와의 파킨 리가제 반응을 증가시킨다. 실시예 2-3을 참조한다. 그러므로, 킬레이터 및/또는 친전자체, 둘 모두는 파킨 리가제에 결합하고, 활성화시킬 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 화합물은 2-(4-벤질피페라진-1-일)-N-[(2-히드록시-3-프롭-2-에닐-페닐)메틸리덴아미노]아세트아미드 (이는 또한 Pac-1로도 지칭된다) 또는 그의 염 또는 에스테르일 수 있다. 비록 특정 이론으로 제한되는 것은 아니지만, 하기 표 2에서 화합물 114로서 제공되는 Pac-1의 구조는 킬레이터인 것으로 간주되고, 이는 또한 파킨 리가제 반응을 증가시킬 수 있는 능력을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Pac-1, 또는 그의 염은 친전자체일 수 있고/거나, 킬레이터 및 친전자체, 둘 모두일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 화합물은 Pac-1의 유도체 또는 유사체일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 PCT 출원 공개 번호 WO2010/091382, WO2013/131089, WO2013/124407, WO2014/022858, 미국 출원 공개 번호 US2015/0210659, US2015/0231132, US2014/0073609, US20150017264, US2015/0099759, 미국 특허 번호 8,916,705, 미국 특허 번호 9,102,661, 미국 특허 번호 8,592,584, 및 미국 특허 번호 8,778,945 (상기 특허의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같은 화합물일 수 있다.

구체적인 예에서, 활성-기반 프로브 검정법 및 질량 분광측정법 분석은 표 1 및/또는 표 2 중의 일부 후보 화합물이 인간 파킨 리가제 중의 다중 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다는 것을 시사한다. 예를 들어, 질량 분광측정법 분석은 AH007이 파킨 리가제 중 적어도 시스테인 잔기 59 (C59) 및 시스테인 잔기 377 (C377)에 결합한다는 것을 나타낸다.

따라서, 구체적인 실시양태에서, 파킨 리가제를 활성화시키는 방법은 그를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 하나 이상의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은 표 1 및/또는 표 2, 또는 그의 염 또는 에스테르로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 킬레이터, 친전자체 또는 킬레이터 및 친전자체, 둘 모두일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은 Zn 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, Zn 이온은 Zn⁺ 또는 Zn^{2 +} 이온일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Zn 이온에 배위결합할 수 있는 화합물은 1좌, 2좌, 또는 3좌 리간드이다.

또 다른 실시양태에서, 화합물은 1 초과의 시스테인 잔기 중 티올 기에 결합하고/거나, 그와 반응할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 2개의 시스테인 잔기 중 티올 기에 결합하고/거나, 그와 반응할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 3개의 시스테인 잔기 중 티올 기에 결합하고/거나, 그와 반응할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 4개의 시스테인 잔기 중 티올 기에 결합하고/거나, 그와 반응할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 인간 파킨 리가제의 아미노산 141-225, 아미노산 238-293, 아미노산 313-377, 및 아미노산 418-449로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인 중 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다. http://www.uniprot.org/uniprot/O60260을 참조한다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 인간 파킨 리가제의 C182, C258 및 C377로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 인간 파킨 리가제의 C59 및 C377로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 인간 파킨 리가제의 C377과 반응할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 AH007이다.

또 다른 실시양태에서, 화합물은 인간 파킨 리가제의 C182, C258 및/또는 C377에 상응하거나, 또는 그와 정렬되는 파킨 리가제, 파킨 리가제 유도체, 또는 파킨 리가제 동족체의 하나 이상의 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 인간 파킨 리가제의 C59 및/또는 C377에 상응하거나, 또는 그와 정렬되는 파킨 리가제, 파킨 리가제 유도체, 또는 파킨 리가제 동족체의 하나 이상의 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 AH007이다.

또한, IBR 도메인이 파킨 활성을 조절하는 데 있어 중요한 역할을 할 수 있다고 간주된다. RO 도메인은 상기 논의된 바, 파킨 리가제를 조절할 수 있는 가능한 기전에 관여할 수 있는 적어도 하나의 ZnF 도메인을 포함할 수 있다고 간주된다. 따라서, 구체적인 실시양태에서, IBR 도메인 (아미노산 328-377)에 위치하는 적어도 하나의 ZnF 도메인의 구조는 그를 필요로 하는 대상체에게로의 화합물 투여에 의해 실질적으로 파괴될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표 1 및/또는 표 2, 또는 그의 염 또는 에스테르로부터 선택되는 하나 이상의 화합물은 IBR 도메인 (아미노산 328-377)에 위치하는 적어도 하나의 ZnF 도메인의 구조를 실질적으로 파괴시킬 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 화합물은 ZnF 도메인 중에 또는 ZnF 도메인 근처에 존재하는 임의의 히스티딘 잔기(들)를 포함하는 시스테인 잔기에 결합하고/거나, 또는 그와 반응할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 화합물은 파킨 리가제 중 적어도 하나의 아연 핑거 (또는 ZnF 도메인)의 구조를 실질적으로 파괴시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 파킨 리가제 중 하나 이상의 ZnF 도메인을 파괴시킬 수 있다.

라일리(Riley) 등은 Zn 배위결합 잔기를 포함하는 다중 기능성 영역을 포함하는 465개의 아미노산으로 이루어진 인간 파킨 리가제 (표 3에 제공되고, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004562.2에서 확인되는 아미노산 서열 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1))를 기술하였다. 라일리 등은 R0, R1, IBR 및 R2로서 지정된 4개의 도메인에 대해 논의하였다. R0, R1 및 R2는 앞서 RING 도메인으로서 지정되었던 것이다. 그러나, 라일리 등은 R0, IBR 및 R2 도메인이 실제, 또는 전통의 RING 도메인인지 여부에 대하여 의문을 품게 되었다: "R0은 신규 도메인 구조이지만, E3 RING 도메인보다는 Zn-핑거 도메인과 더 유사하다." 라일리 등은 또한 IBR도 R2 도메인도, 이들은 보통 RING 도메인과 연관된 바와 같은 크로스브레이스 구조를 가지는 것이 아니기 때문에, 정규 RING 도메인 모티프와 유사하지 않다고 진술하였다. 추가로, R0, IBR 및 R2 도메인 분석 결과 그의 아연 중심에 취약 가능성이 있는 것으로 나타났다. 따라서, R0, IBR 및 R2 도메인이 파킨 리가제의 활성을 조절하는 데 있어 이상적인 도메인 후보인 것으로 보인다. R0, IBR 및 R2 도메인은 각각 인간 파킨 리가제의 아미노산 141-216, 아미노산 328-377, 및 아미노산 415-465를 지칭한다.

따라서, 구체적인 실시양태에서, 실질적으로 파괴될 수 있는 적어도 하나의 아연 핑거는 인간 파킨 리가제의 아미노산 141-216, 아미노산 328-377, 및 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되어 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 적어도 하나의 아연 핑거로부터의 아미노산은 정렬시 인간 파킨 리가제로부터의 R0, IBR 및 R2 도메인 중 하나 이상의 것과 중복될 수 있다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 실질적으로 파괴될 수 있는 적어도 하나의 아연 핑거는 인간 파킨 리가제의 아미노산 141-225, 아미노산 238-293, 아미노산 313-377, 및 아미노산 418-449로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되어 있다. http://www.uniprot.org/uniprot/O60260을 참조한다.

구체적인 실시양태에서, 파킨 리가제 중 아연 핑거 중 적어도 하나는 1, 2, 3, 또는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 아연 핑거 파괴는 파킨 리가제의 활성을 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제 중 아연 핑거 중 적어도 하나는 인간 파킨 리가제의 아미노산 141-225, 아미노산 238-293, 아미노산 313-377, 및 아미노산 418-449로부터 1, 2, 3, 또는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들어, 구체적인 실시양태에서, 화합물은 인간 파킨 리가제의 C182, C258 및 C377로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합하거나, 또는 그와 반응함으로써 하나 이상의 아연 핑거와 반응하고, 이로써, 그를 파괴시킬 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 파킨 리가제의 자가-유비퀴틴화 활성화를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의 하나 이상의 화합물을 투여함으로써 파킨 리가제의 자가-유비퀴틴화를 활성화시키는 것을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시킨다. 또 다른 예에서, 표 1 및/또는 표 2의 화합물은 파킨 리가제의 자가-유비퀴틴화를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표 1 및/또는 표 2의 화합물은 다른 화합물의 첨가시 파킨 리가제의 자가-유비퀴틴화를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 파킨의 내인성 세포 조절인자인 포스포 유비퀴틴 (pUB)은 파킨 리가제에 첨가되어 파킨 리가제 및 그의 자가-유비퀴틴화를 활성화시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화에서 포스포 유비퀴틴 (pUB)과 함께 시너지적으로 작용하는 표 1 및/또는 표 2의 하나 이상의 화합물, 또는 그의 염 및 에스테르가 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 예컨대, 실시예 5를 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은 파킨 리가제 및/또는 그의 자가-유비퀴틴화의 활성화를 시너지적으로 증가시키기 위해 pUB와 함께 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 킬레이터 및/또는 친전자체일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은 표 1 및/또는 표 2, 또는 그의 염 또는 에스테르로부터 선택된다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 파킨 리가제의 활성화는 알츠하이머 치매, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 프리드라이히 운동실조, 척수소뇌성 실조증, 다계통 위축증, PSP, 타우병증, 미만성 루이소체병, 루이소체 치매, α-시누클레인의 비정상적인 축적을 특징으로 하는 임의의 장애, 노화 과정 장애, 뇌졸중, 박테리아성 감염, 바이러스성 감염, 미토콘드리아 관련 질환, 정신 지체, 난청, 시각상실, 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 루프스, 거짓비늘 녹내장을 비롯한 녹내장, 레버 유전성 시각 신경병증, 및 류머티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 또는 질병을 치료하거나, 또는 그의 발생을 감소시킨다.

구체적인 실시양태에서, 박테리아성 감염은 미코박테리움 감염이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 바이러스성 감염은 HIV, B형 간염 감염 또는 C형 간염 감염이다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 구체적으로 암 치료 및/또는 그의 발생 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키고, 파킨 리가제 활성을 유도하는 하나 이상의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하거나, 또는 그의 발생을 감소시키는 방법을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 활성화된 파킨 리가제는 하나 이상의 종양 성장을 억제시키고/거나, 하나 이상의 종양의 전이를 예방한다.

또 다른 실시양태에서, 암은 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 카포시 육종, 림프종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 소아 비정형 유기형/간상 종양, 기저 세포 암종, 피부암 (비흑색종), 소아 담도암, 간외 방광암, 골암, 종야의 유잉 육종 패밀리, 골육종 및 악성 섬유성 조직구증, 뇌간 신경교종, 뇌종양, 배아 종양, 생식 세포 종양, 두개인두종, 뇌실막종, 기관지 종양, 버킷 림프종 (비호지킨 림프종), 카르시노이드 종양, 미지의 원발성 위장 암종, 심장(Cardiac) (심장(Heart)) 종양, 림프종, 원발성 자궁경부암, 소아 암, 척삭종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병, 만성 골수증식성 신생물, 결장암, 결장직장암, 피부 T-세포 림프종, 유관 상피내암종, 자궁내막암, 뇌실막종, 식도암, 감각신경모세포종, 유잉 육종, 두개외 생식 세포 종양, 고환외 생식 세포 종양, 간외 담도암, 안암, 안구내 흑색종, 망막모세포종, 골의 섬유성 조직구증, 악성 골육종, 담낭암, 위암(Gastric cancer) (위암(Stomach cancer)), 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양, 고환외 암, 난소암, 고환암, 임신성 융모성 질환, 신경교종, 뇌간암, 모발상 세포 백혈병, 두부경부암, 심장암, 간세포암 (간암), 조직구증, 랑게르한스 세포암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 섬세포 종양, 췌장 신경내분비 종양, 카포시 육종, 신장암, 신장 세포 암, 윌름즈 종양 및 다른 소아 신장 종양, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 만성 림프구성 암, 만성 골수 암, 모발상 세포 암, 구순암 및 구강암, 간암 (원발성), 소엽 상피내암 (LCIS), 폐암, 비-소세포 암, 소세포 암, 림프종, 피부 T-세포 (균상 식육종 및 세자리 증후군), 호지킨 암, 비호지킨 암, 마크로글로불린혈증, 발덴스트롬, 남성 유방암, 골의 악성 섬유성 조직구증 및 골육종, 흑색종, 안구내 암 (안암), 메르켈 세포 암종, 중피종, NUT 유전자를 포함하는 잠재 원발성, 중심선 관 암종을 동반한 경부의 악성, 전이성 편평세포 암, 입암, 다발성 내분비샘 종양 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상 식육종, 골수형성이상 증후군, 골수형성이상/골수증식성 신생물, 골수 백혈병, 만성, 골수성 백혈병, 급성, 다발성 골수종, 만성 골수증식성 신생물, 비강암 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 경구암, 구강암, 구순암 및 입인두암, 골육종 및 골의 악성 섬유성 조직구증, 상피암, 저 악성 잠재적 종양, 췌장 암, 췌장 신경내분비 종양 (섬세포 종양), 유두종, 부신경절종, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 가슴막폐 모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 직장암, 신장 세포암 (신장암), 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 유잉 암, 카포시 암, 골육종 (골암), 연조직 암, 자궁암, 세자리 증후군, 피부암, 소아 흑색종, 메르켈 세포 암종, 비흑색종, 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평세포 암종, 피부암 (비흑색종), 잠재 원발성, 전이성 암을 동반한 경부의 소아 편평세포 암, 위암 (위암), T-세포 림프종, 피부암, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포 암, 미지의 원발성, 소아 암종, 희귀성 소아 암, 요도암, 자궁암, 자궁내막암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 빌름스 종양, 및 여성 암으로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택될 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 암은 교모세포종, 소세포 폐 암종, 유방암 및/또는전립선암이다. 또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제가 대상체에서 하나 이상의 종양을 억제시킨다.

또 다른 구체적인 실시양태에서, 화합물은 손상된 미토콘드리아를 제거하고/거나, 세포적 스트레스 동안 세포 생존가능성을 증가시키고/거나, 종양 형질변환을 감소시키고/거나, 세포에서 알파-시누클레인을 이동시킨다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 구체적으로 파킨슨병 치료 및/또는 그의 발생 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키고, 파킨 리가제 활성을 유도하는 하나 이상의 화합물을 투여함으로써 파킨슨병을 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 것으로서, 여기서, 화합물은 Zn 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인(들) 중의 티올 기와 반응할 수 있는 것인 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 화합물은 손상된 미토콘드리아를 제거하고/거나, 세포적 스트레스 동안 세포 생존가능성을 증가시키고/거나, 세포에서 알파-시누클레인을 이동시킨다 (문헌 ["Somatic Mutations of the Parkinson's disease-associated gene PARK2 in glioblastoma and other human malignancies" (Nature Genetics Jan 2010 42(1)77-82)]).

또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화는 유비퀴틴화를 변경시킨다. 구체적으로, 유비퀴틴화 변경은 유비퀴틴의 공유 부착에 의해 기질 단백질을, 파킨 그 자체인 기질 단백질을, 또 다른 단백질, 예컨대, 미토퓨전 1 또는 2, FBW7을, 또는 다른 공개적으로 보고된 파킨 리가제의 기질을 변형시킬 수 있는 파킨의 능력에 의해 유발된다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 암 치료 및/또는 그의 발생 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키고, 파킨 리가제 활성을 유도하는 화합물을 투여함으로써 암을 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 것으로서, 여기서, 화합물은 아연 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있는 것인 것을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 표 1 또는 표 2 또는 그의 염 또는 에스테르로부터의 것이다. 구체적인 실시양태에서, 파킨 리가제는 하나 이상의 종양의 성장을 억제시키고/거나, 하나 이상의 종양의 전이를 예방한다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 손상된 미토콘드리아를 제거하고/거나, 세포적 스트레스 동안 세포 생존가능성을 증가시키고/거나, 종양 형질변환을 감소시키고/거나, 세포에서 알파-시누클레인을 이동시킨다. 또 다른 실시양태에서, 암은 교모세포종, 소세포 폐 암종, 유방암 또는 전립선암이다.

또 다른 실시양태에서, 암을 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 화합물은 1좌, 2좌 또는 3좌 리간드로서 Zn 이온에 배위결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 암을 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 화합물은 Zn 이온에 배위결합하여 파킨 리가제 중 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 파괴시킨다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기는 인간 파킨 리가제의 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 실질적으로 IBR 도메인 (아미노산 328-377)에 위치하는 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 파괴시킨다. 또 다른 실시양태에서, 아연 핑거는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화는 유비퀴틴화를 변경시킨다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 시스테인 중의 티올 기에 결합하거나, 또는 그와 반응한다. 또 다른 실시양태에서, 시스테인은 인간 파킨 리가제의 C59 및 C377로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 시스테인은 인간 파킨 리가제의 C377이다. 또 다른 실시양태에서, 화합물 화합물은 AH001 및/또는 AH007이다.

또 다른 실시양태에서, 암을 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 화합물은 알킬화제, 산화제, 마이클 수용자, 또 다른 불포화된 구조이고/거나, 디술피드를 가진다. 구체적인 실시양태에서, 상기 화합물은 실질적으로 파킨 리가제 중 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 파괴시킨다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기는 인간 파킨 리가제의 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 아연 핑거는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 방법은 파킨슨병 치료 및/또는 그의 발생 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키고, 파킨 리가제 활성을 유도하는 화합물을 투여함으로써 파킨슨병을 치료하고/거나, 그의 발생을 감소시키는 것으로서, 여기서, 화합물은 아연 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인에 결합하거나, 또는 그와 반응할 수 있는 것인 것을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 표 1 또는 표 2 또는 그의 염 또는 에스테르로부터의 것이다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 손상된 미토콘드리아를 제거하고/거나, 세포적 스트레스 동안 세포 생존가능성을 증가시키고/거나, 세포에서 알파-시누클레인을 이동시킨다. 또 다른 실시양태에서, 아연 이온에 배위결합할 수 있는 화합물은 1좌, 2좌 또는 3좌 리간드이다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기는 인간 파킨 리가제의 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 실질적으로 IBR 도메인 (아미노산 328-377)에 위치하는 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 파괴시킨다. 또 다른 실시양태에서, 아연 핑거는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화는 유비퀴틴화를 변경시킨다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 시스테인 중의 티올 기에 결합하거나, 또는 그와 반응한다. 또 다른 실시양태에서, 시스테인은 인간 파킨 리가제의 C59 및 C377로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 시스테인은 인간 파킨 리가제의 C377이다. 또 다른 실시양태에서, 화합물 화합물은 AH001 및/또는 AH007이다.

또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화는 유비퀴틴화를 변경시키고, 여기서, 유비퀴틴화 변경은 유비퀴틴의 공유 부착에 의해 기질 단백질을, 파킨 그 자체인 기질 단백질을, 또 다른 단백질, 예컨대, 미토퓨전 1 또는 2, FBW7을, 또는 다른 공개적으로 보고된 파킨 리가제의 기질을 변형시킬 수 있는 파킨의 능력에 의해 유발된다. 구체적인 실시양태에서, 화합물은 파킨 리가제 활성화를 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 표 1 또는 표 2 또는 그의 염 또는 에스테르로부터의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 알킬화제, 산화제, 마이클 수용자, 또 다른 불포화된 구조이거나, 또는 디술피드를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 실질적으로 파킨 리가제 중 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 파괴시킨다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기는 인간 파킨 리가제의 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 실질적으로 IBR 도메인 (아미노산 328-377)에 위치하는 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 파괴시킨다. 또 다른 실시양태에서, 아연 핑거는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 파킨 리가제 활성화는 유비퀴틴화를 변경시킨다. 또 다른 실시양태에서, 화합물은 시스테인 중의 티올 기에 결합하거나, 또는 그와 반응한다. 또 다른 실시양태에서, 시스테인은 인간 파킨 리가제의 C59 및 C377로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 시스테인은 인간 파킨 리가제의 C377이다. 또 다른 실시양태에서, 화합물 화합물은 AH001 및/또는 AH007이다.

단백질은 세포의 구조적 및 생화학적 요건을 제공하기 위해 구축되지만, 이는 또한 고도로 조절되는 과정에서 파괴됨으로써 단순한 파괴 및 공간 관리보다 더 많은 목적에 도움을 준다. 단백질은 그의 N-말단에 존재하는 아미노산의 성질에 의해 측정되는 바, 상이한 반감기를 가진다. 일부는 수명이 긴 반면, 나머지는 신속하게 분해될 것이다. 단백질 분해는 세포가 미스폴딩된 또는 손상된 단백질을 처리할 수 있도록 할 뿐만 아니라, 세포내 필수 단백질, 예컨대, 세포 주기에 관여하는 단백질의 농도를 미세 조정한다. 이러한 신속하고, 고도로 특이적인 분해는 1개 내지 수개의 유비퀴틴 분자의 표적 단백질에의 첨가를 통해 달성될 수 있다. 본 과정이 유비퀴틴화로 불리는 것이다.

유비퀴틴화는 세포 생존 및 분화 및 선천 및 적응 면역을 비롯한, 다수의 생리학적 과정에 중요하다. 최근, 신호전달 경로에서의 유비퀴틴의 분자 작용, 및 유비퀴틴 시스템에서 어떠한 변경이 상이한 인간 질환 발생을 유도하는지에 관한 이해가 상당한 진보를 이루었다. 유비퀴틴화가 암, 대사 증후군, 신경퇴행성 질환, 자가면역, 염증성 장애, 감염 및 근육 위축증의 발병 및 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Popovic et al. Nature Medicine 20, 1242-1253 (2014)).

본 발명의 일부 실시양태는 제한하는 것은 아니지만, 고형 종양, 예컨대, 신경교종 (희소돌기신경교종, 혼합형 신경교종 및 교모세포종), 폐암, 유방암, 전립선암, 난소암, 및 종양에서 바르부르크 효과 (Warburg effect) (바르부르크 효과를 막는 파킨 활성의 복원)와 연관된 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 호전시키는 방법에 관한 것이다. 인간 유전적 및 병리 데이터가 파킨 단백질이 가치가 높은 표적이라는 것을 뒷받침한다. 파킨이 충분히 활성화되지 않으면, 세포 사멸 및 도파민 뉴런 손실이 발생한다 ("Familial Parkinson Disease Gene Product, Parkin, Is a Ubiquitin-Protein Ligase" Nature Genetics 25, 302-305, 1 July 2000).

본 발명의 추가 실시양태는 알츠하이머 치매, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 프리드라이히 운동실조, 척수소뇌성 실조증, 다계통 위축증, PSP, 타우병증, 미만성 루이소체병, 루이소체 치매, α-시누클레인의 비정상적인 축적을 특징으로 하는 임의의 장애, 노화 과정 장애, 및 뇌졸중을 포함하나, 이에 제한되지 않는 신경계 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 호전시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시양태는 제한하는 것은 아니지만, 정신 지체, 난청, 시각상실, 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 및 자가면역 질환, 예컨대, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 루프스, 거짓비늘 녹내장을 비롯한, 녹내장, 레버 유전성 시각 신경병증, 및 류머티스성 관절염과 연관된 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 호전시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 본 발명의 추가 실시양태는 제한하는 것은 아니지만, 하기와 같은 미토콘드리아 관련 질환 또는 캡슐과 연관된 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 호전시키는 방법에 관한 것이다:

· 알퍼스병

· 바쓰 증후군/LIC (치사성 영아 심근병증)

· 베타-산화 결손증

· 카르니틴-아실-카르니틴 결핍증

· 카르니틴 결핍증

· 크레아틴 결핍증 증후군

· 코엔자임 Q10 결핍증

· 복합체 I 결핍증

· 복합체 II 결핍증

· 복합체 III 결핍증

· 복합체 IV 결핍증/COX 결핍증

· 복합체 V 결핍증

· CPEO

· CPT I 결핍증

· CPT II 결핍증

· KSS

· 젖산산증

· LBSL - 백질이영양증

· LCAD

· LCHAD

· 라이병 또는 증후군

· 루프트 질환

· MAD/글루타르산뇨 타입 II

· MCAD

· MELAS

· MERRF

· MIRAS

· 미토콘드리아 세포병변

· 미토콘드리아 DNA 고갈

· 미토콘드리아 뇌병증

· 미토콘드리아 근육병

· MNGIE

· NARP

· 피어슨 증후군

· 피루베이트 카르복실라제 결핍증

· 피루베이트 데히드로게나제 결핍증

· POLG 돌연변이

· 호흡 연쇄

· SCAD

· SCHAD

· VLCAD.

파킨 활성 증가는 손상된 미토콘드리아 (적색)를 제거하고, 세포적 스트레스 동안 세포 생존가능성을 증가시키고, 종양 형질변환을 감소시키고, 세포에서 α-시누클레인을 이동시킨다. 파킨으로부터 아연을 제거하는 다중의 다양한 파킨 활성화 화합물이 확인되었다. ZnF 미스폴딩 후 활성화는 다른 공지된 ZnF 단백질과 유사하다.

본 발명은 또한 대상체에서 파킨 리가제를 활성화시키기 위한 제약 조성물을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 하나 이상의 화합물 또는 그의 염을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 하나 이상의 화합물 또는 그의 염은 Zn 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인 중 적어도 하나의 티올 기와 반응할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제약 조성물은 표 1 및 표 2의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에서 화합물, 방법 및 제약 조성물은 하기 약물 부류 중 하나 이상의 것으로부터의 것일 수 있다: 8-히드록시퀴놀린; 알파-히드록시케톤; 아미노메틸 벤즈이미다졸; 아미노메틸 인돌; 바르비투레이트; 벤즈이소티아졸론, 카르복실레이트, 디티오비스벤즈아미드, 디티오카르바메이트, 포름아미드, 히드라지드, 히드록사메이트, 히드록시피리디논/히드록시피라논, 히드록시술폰아미드, 이미다졸, 케톤 수화물, N-아실 오르토-페닐렌디아민, N-히드록시우레아, O-치환된 포스파메이트, 포스파메이트, 포스폰, 술파메이트, 술파미드, 술포디이민, 술폰아미드, 티아디아진, 티아디아졸로티온, 및 티올. 예를 들어, 표 1의 하기 목록은 대표적인 것이지만, 본 발명에서 사용될 수 있는 잠재적인 화합물에 대한 완전한 목록은 아니다.

<표 1>

잠재적인 화합물의 예

<표 2>

잠재적인 화합물의 예

<표 3>

인간 파킨 리가제의 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)

본 발명은 또한 유효 용량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 작용제를 포함하는 것으로서, 여기서, 작용제 또는 화합물은 아연 이온에 배위결합할 수 있거나, 또는 작용제 또는 화합물은 시스테인 중 티올 기와 반응할 수 있는 것인, 대상체에서 파킨 리가제를 활성화시키기 위한 제약 제제에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 실시양태는 제약상 허용되는 부형제 또는 애주번트를 추가로 포함하는 제약 제제에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 대상체에게 조성물을 임상적으로 허용되는 임의의 경로로 투여하는 것을 포함한다. 다양한 측면에서, 투여 경로는 전신, 예컨대, 경구 또는 주사에 의한 투여이다. 작용제 또는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 유도체는 경구적으로, 비내로, 경피적으로, 폐로, 흡입에 의해, 협측으로, 설하로, 복강내로, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 직장으로, 흉강내로, 경막내로, 내문으로, 및 비경구적으로 투여된다. 대안적으로 또는 추가로, 투여 경로는 국부, 예컨대, 국소, 종양내 및 종양 주변 투여이다.

일부 실시양태에서, 화합물은 경구적으로 투여된다.

다른 실시양태에서, 본원에 개시된 작용제는 정맥내 경로에 의해 투여된다. 추가 실시양태에서, 비경구적 투여는 볼루스로 또는 주입에 의해 제공될 수 있다.

조성물이 투여되는 방식은 부분적으로는 원인 및/또는 위치에 의존한다. 통상의 기술자는 특정 투여 경로의 이점에 대해 인지할 것이다.

본 방법은 원하는 생물학적 반응을 달성하기 위한 유효량, 예컨대, 치료하고자 하는 병태, 예컨대, 종양 및 신경계 장애의 증상을 완전히 또는 부분적으로 경감, 호전 또는 예방하는 데 효과적인 양으로 작용제 또는 화합물 (또는 작용제 또는 화합물을 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함한다.

다양한 측면에서, 표 1 및/또는 표 2에 제시된 구조 화학식 중 어느 하나의 화합물, 또는 그의 염 또는 에스테르의 투여량은 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 약 100 mg/kg (체중) (예컨대, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg)이다.

제약상 허용되는 혼합물 중 개시된 화합물의 농도는 투여하고자 하는 화합물의 투여량, 사용되는 화합물(들)의 약동학적 특징, 및 투여 경로를 비롯한, 여러 인자에 의존하여 달라질 것이다. 작용제는 단일 용량으로 또는 반복 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물을 사용하는 투여 요법은 환자 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료하고자 하는 병태의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용되는 특정 화합물 또는 그의 염을 비롯한, 다양한 인자에 따라 선택된다. 치료는 환자의 전반적인 건강 상태, 및 제제 및 선택된 화합물(들)의 투여 경로를 비롯한, 다수의 인자에 의존하여 매일 또는 더 빈번하게 실행될 수 있다. 통상의 의사 또는 수의사는 병태의 진행을 예방하거나, 역행시키거나, 또는 정지시키는 데 필요한 약물의 유효량을 쉽게 결정하고, 처방할 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 조성물은 단일 또는 다중 단위 투여 형태로 제조 및/또는 투여될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태는 표 1 및/또는 표 2에 제시된 구조 화학식 중 어느 하나의 화합물 제약상 허용되는 담체, 예컨대, 제약상 허용되는 부형제, 담체, 결합제, 및/또는 희석제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 개시된 화합물의 제제화 및 투여 기술은 문헌 [Remington : the Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)]에서 살펴볼 수 있다.

다른 실시양태에서, 본원에 기술된 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 및 프로드럭은 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 조합된 제약 제제에서 사용된다. 적합한 제약상 허용되는 담체는 불활성 고체 충전제 또는 희석제 및 멸균 수성 또는 유기 용액을 포함한다. 임의적으로, 조성물은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다. 화합물은 원하는 투여량을 본원에 기술된 범위로 제공하는 데 충분한 양으로 상기 제약 조성물 중에 존재할 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 제약 조성물 중에서 통상 발견되는 다른 부가 성분을 관련 기술분야에 확립된 그의 투여량 수준으로 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 추가의 화합성인 제약상 활성인 물질, 예컨대, 예를 들어, 항소양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 항염증제를 함유할 수 있거나, 또는 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제제화하는 데 유용한 추가의 물질, 예컨대, 염료, 향미제, 보존제, 항산화제, 유백제, 증점제 및 안정제를 함유할 수 있다. 그러나, 상기 물질 첨가시, 이는 본 발명의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해하지 않아야 한다. 제제는 멸균 처리될 수 있고, 원하는 경우, 제제의 올리고뉴클레오티드(들)와 유해하게 상호작용하지 않는, 보조제, 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 완충제, 착색제, 향미제 및/또는 방향 물질 등과 혼합될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함한다. 특정의 상기 실시양태에서, 부형제는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀라제, 스테아르산 마그네슘, 활석, 살리실산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 레비게이션, 유화, 캡슐화, 포획 또는 정제화 공정을 포함하나, 이에 제한되지 않는 공지된 기술을 사용하여 제조된다.

추가의 실시양태는, 제제가 고체, 분말, 액체 및 겔로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제약 제제에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 액체이다 (예컨대, 현탁제, 엘릭시르 및/또는 액제). 특정의 상기 실시양태에서, 액체 제약 조성물은 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 및 착색제을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 공지된 성분을 사용하여 제조된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 고체이다 (예컨대, 분제, 정제 및/또는 캡슐제). 특정의 상기 실시양태에서, 고체 제약 조성물은 전분, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 및 붕해제를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 관련 기술분야에 공지된 하나 이상의 성분을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 데포 제제로서 제제화된다. 특정의 상기 데포 제제는 전형적으로 비-데포 제제보다 작용 기간이 더 길다. 특정 실시양태에서, 상기 제제는 이식에 의해 (예를 들어, 피하로 또는 근육내로), 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 특정 실시양태에서, 데포 제제는 적합한 중합체 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 중 에멀젼) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제조된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 전달 시스템을 포함한다. 전달 시스템의 예로는 리포솜 및 에멀젼을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 전달 시스템은 소수성 화합물을 포함하는 것을 비롯한, 특정 제약 조성물을 제조하는 데 유용하다. 특정 실시양태에서, 특정 유기 용매, 예컨대, 디메틸술폭시드가 사용된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 공용매 시스템을 포함한다. 특정의 상기 공용매 시스템은 예를 들어, 벤질 알콜, 비극성 계면활성제, 수-혼화성 유기 중합체, 및 수성상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 소수성 화합물에 대하여 상기 공용매 시스템이 사용된다. 상기 공용매 시스템의 비-제한적인 예로는 3% w/v 벤질 알콜, 8% w/v의 비극성 계면활성제 폴리소르베이트 80 및 65% w/v 폴리에틸렌 글리콜 300을 포함하는 무수 에탄올 용액인, VPD 공용매 시스템이 있다. 상기 공용매 시스템의 비율은 그의 용해도 및 독성 특징을 유의적으로 변경시키지 않으면서, 상당 수준으로 달라질 수 있다. 추가로, 공용매 성분의 아이덴티티가 달라질 수 있고: 예를 들어, 폴리소르베이트 80 대신 다른 계면활성제가 사용될 수 있고; 폴리에틸렌 글리콜의 분율 크기가 달라질 수 있고; 예컨대, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 다른 생체화합성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜을 대체할 수 있고; 다른 당 또는 다당류가 덱스트로스 대신으로 치환될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 서방성 시스템을 포함한다. 상기 서방성 시스템의 비제한적인 예로는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 있다. 특정 실시양태에서, 서방성 시스템은 그의 화학적 성질에 따라 수시간, 수일, 수주 또는 수개월이라는 기간에 걸쳐 제약 제제를 방출할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 경구 투여용으로 제조된다. 특정의 상기 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 조합함으로써 제제화된다. 특정의 상기 담체는 제약 조성물을 대상체에 의한 경구 섭취용으로서의 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러지, 현탁제 등으로서 제제화되도록 할 수 있다. 적합한 부형제로는 충전제, 예컨대, 당 (락토스, 수크로스, 만닛톨, 또는 소르비톨 포함); 셀룰로스 시료, 예컨대, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 혼합물은 임의적으로 분쇄되고, 보조제가 임의적으로 첨가된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물을 형성하고 정제 또는 당의정 코어를 수득한다. 특정 실시양태에서, 붕해제 (예컨대, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대, 알긴산 나트륨)이 첨가된다.

특정 실시양태에서, 당의정 코어는 코팅제와 함께 제공된다. 특정의 상기 실시양태에서, 임의적으로 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 진한 당 용액이 사용될 수 있다. 염료 또는 색소가 정제 또는 당의정 코어에 첨가될 수 있다.

특정 실시양태에서, 경구 투여용 제약 조성물은 젤라틴으로 제조된 푸시-핏(push-fit) 캡슐제이다. 특정의 상기 푸시-핏 캡슐제는 하나 이상의 충전제, 예컨대, 락토스, 결합제, 예컨대, 전분, 및/또는 윤활제, 예컨대, 활석 또는 스테아르산 마그네슘, 및 임의적으로, 안정제와 혼합된 본 발명의 하나 이상의 제약 제제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 경구 투여용 제약 조성물은 젤라틴 및 가소화제, 예컨대, 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질의 밀봉 캡슐제이다. 특정의 연질 캡슐제에서, 본 발명의 하나 이상의 제약 제제는 적합한 액체, 예컨대, 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해 또는 현탁될 수 있다. 추가로, 안정제가 첨가될 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 협측 투여용으로 제조된다. 특정의 상기 제약 조성물은 종래 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지이다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 주사 (예컨대, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 투여용으로 제조된다. 특정의 상기 실시양태에서, 제약 조성물은 담체를 포함하고, 수용액, 예컨대, 물, 또는 생리학상 화합성인 완충제, 예컨대, 행크스액, 링거액 또는 생리학적 식염수 중에서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 다른 성분 (예컨대, 가용성에 도움을 주거나, 보존제로서의 역할을 하는 성분)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 주사 가능한 현탁액은 적절한 액체 담체, 현탁화제 등을 사용하여 제조된다. 특정의 주사용 제약 조성물은 예컨대, 앰플 중에 또는 다회 투약용 용기 중에 단위 투여 형태로 제공된다. 특정의 주사용 제약 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 액제 또는 에멀젼이고, 제제화제, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 사용 제약 조성물에서 사용하는 데 적합한 특정 용매로는 친유성 용매 및 지방 오일, 예컨대, 참기름, 합성 지방산 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드, 및 리포솜을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수성 주사용 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁제는 또한 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하도록 제약 제제의 용해도를 증가시키는 작용제 또는 적합한 안정제를 함유할 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 경점막 투여용으로 제조된다. 특정의 상기 실시양태에서, 장벽이 투과되기에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 상기 침투제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 흡입에 의한 투여용으로 제조된다. 특정의 상기 흡입용 제약 조성물은 가압 팩 또는 네불라이저 중의 에어로졸 스프레이 형태로 제조된다. 특정의 상기 제약 조성물은 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 가압 에어로졸을 사용하여, 투여 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브로 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐제 및 카트리지가 제제화될 수 있다. 특정의 상기 제제는 본 발명의 제약 제제 및 적합한 분말 베이스, 예컨대, 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 포함한다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 예컨대, 좌제 또는 정체 관장제와 같은 직장 투여용으로 제조된다. 특정의 상기 제약 조성물은 예컨대, 코코아 버터 및/또는 다른 글리세리드와 같은 공지된 성분을 포함한다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 국소 투여용으로 제조된다. 특정의 상기 제약 조성물은 블랜드 보습 베이스, 예컨대, 연고 또는 크림을 포함한다. 예시적인 적합한 연고 베이스로는 페트롤라툼, 페트롤라툼 플러스 휘발성 실리콘, 및 오일 에멀젼 중 라놀린 및 물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 적합한 크림 베이스로는 콜드 크림 및 친수성 연고를 포함하나, 이에 제한되지 않는다,

특정 실시양태에서, 치료학상 유효량은 치료받는 대상체의 질환의 증상을 예방, 경감 또는 호전시키거나, 그의 생존을 연장시키는 데 충분하다. 치료학상 유효량을 결정하는 것은 통상의 기술자의 능력 범위 내에 잘 포함되어 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 화합물은 프로드럭으로서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 생체내 투여시, 프로드럭은 생물학상, 제약상 또는 치료학상 더욱 활성인 형태로 화학적으로 전환된다. 특정 실시양태에서, 프로드럭은 상응하는 활성 형태보다 투여가 더 용이하기 때문에 유용하다. 예를 들어, 특정 경우에, 프로드럭은 상응하는 활성 형태보다 (예컨대, 경구 투여를 통해) 더욱 큰 생체이용성을 가질 수 있다. 특정 경우에, 프로드럭은 상응하는 활성 형태와 비교하였을 때, 개선된 가용성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로드럭은 상응하는 활성 형태보다 수용성이 더 작다. 특정 경우에, 상기 프로드럭은 세포막을 통과하는 우수한 투과성을 가지며, 여기서, 수 가용성은 이동성에 유해하다. 특정 실시양태에서, 프로드럭은 에스테르이다. 특정의 상기 실시양태에서, 에스테르는 투여시 카르복실산으로 대사적으로 가수분해된다. 특정 경우에, 화합물을 함유하는 카르복실산은 상응하는 활성 형태이다. 특정 실시양태에서, 프로드럭은 산성 기에 결합된 짧은 펩티드 (폴리아미노산)을 포함한다. 특정의 상기 실시양태에서, 펩티드는 투여시 절단되어 응하는 활성 형태를 형성하게 된다.

특정 실시양태에서, 프로드럭은 활성 화합물이 생체내 투여시 재생되도록 제약상 활성인 화합물을 변형시킴으로써 제조된다. 프로드럭은 약물의 대사 안정성 또는 수송 특징을 변경시키도록, 부작용 또는 독성을 차폐시키도록, 약물의 향미를 개선시키도록, 또는 약물의 다른 특징 또는 특성을 변경시키도록 디자인될 수 있다. 생체내 약물 대사 및 약력학적 프로세스에 관한 지식에 의해, 통상의 기술자는 일단 제약상 활성인 화합물이 공지되고 나면, 화합물의 프로드럭을 디자인할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392] 참조).

이제, 본 발명은 일반적으로 기술되었지만, 상기의 내용은, 예로서 제공되며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조함으로써 더욱 쉽게 이해될 것이다.

실시예

실시예 1: 파킨 활성제 확인

검정 원리:

활성-기반 프로브 (ABP)와 효소 중 활성 부위 시스테인과의 비가역적 반응에 기초한 검정. ABP는 N-말단에 에피토프 태그 (예컨대, HA 태그) 및 C-말단에 반응성 기를 포함하는 유비퀴틴 모이어티로 이루어진다. (R0 억제성 도메인이 없는) 파킨-RBR의 활성은 파킨-R0RBR의 활성 또는 전장의 파킨의 활성보다 유의적으로 더 높다. ABP의 파킨에의 공유 부착은 시분해 형광 공명 에너지 전이 (TR-FRET)

- 파킨-R0RBR, 전장의 파킨 → 저 TR-FRET 신호 (음성 대조군)

- 파킨 RBR → 고 TR-FRET 신호 (양성 대조군)에 의해 모니터링될 수 있다.

파킨-R0RBR의 활성 또는 전장의 파킨의 활성을 증가시키는 화합물은 TR-FRET 신호 증가에 의해 확인할 수 있다.

전략법: (에보테크 슬라이드즈(Evotec Slides)로부터 입수; 문헌 [Riley et al. 2013. Nat Commun. 4:1982] & E3x 바이오(E3x Bio)에 의해 제공된 정보에 기초; 등록 출원) 파킨-R0RBR, 전장의 파킨 및 파킨-RBR의 N-말단 His-SUMO 태그부착된 구축물의 사용.

구축물:

- 라일리 등에 의해 기술된 바와 같이, E. 콜라이(E. coli)에서 N-말단 His₆-SUMO-태그 (이는 잠재적으로는 정제 동안 SENP1 프로테아제를 사용하여 제거될 수 있다)를 포함하는 전장의 파킨 (1-465), R0RBR (141-465) 및 RBR (238-465) 발현.

- TR-FRET-검정법을 가능하게 하는 N-말단 His₆-태그 → 여전히 N-말단 His₆-SUMO-태그가 부착되어 있는 정제된 단백질의 사용.

- 어떤 구축물, 전장의 파킨 또는 R0RBR이 HTS-검정법을 촉진시키는 데 우수한 수율을 제공하는지 평가하기 위하여 모든 구축물에 대하여 소규모 시험을 수행한다.

단계 1: 단백질 제조

- E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, N-말단 His₆-SUMO, His₆-SUMO-R0RBR 및 His₆-SUMO-RBR을 포함하는 전장의 파킨에 대한 유전자 합성을 제3자를 통하여 개시하고, 적합한 발현 벡터에서 서브클로닝한다.

- 가용성 단백질의 수율을 추정하기 위해 웨스턴 블롯팅에 의해 소규모 시험 발현을 평가한다.

- RBR 구축물 뿐만 아니라, 전장의 파킨 구축물 또는 R0RBR 구축물을 BL21(DE3)로 형질전환시키고, [Riley et al.]에 개략적으로 설명된 바와 같이, (소규모 시험 발현 결과에 따라) 6-24 L 규모로 발현시킨다.

- [Riley et al.]에 기술된 바와 같이, *즉, IMAC, MonoQ 및 크기 배제로 ~10 mg의 RBR 구축물 뿐만 아니라, 전장의 파킨 구축물 또는 R0RBR 구축물을 정제한다.

단계 2: 검정법 개발

- 목적: 1,536-웰 검정용 플레이트 포맷으로 견고한 1차 스크리닝 검정법 셋업.

- (예컨대, 파킨 +/- R0 억제성 도메인을 사용하여) 적합한 역학적 범위로 384-웰 포맷으로 검정법을 확립한다.

- (예컨대, 검정 성분의 농도, 완충제, 첨가제, 시약 첨가 순서 및 인큐베이션 온도에 의해) 검정법을 최적화시킨다.

- 최적의 인큐베이션 시간을 정의하기 위한 시간 경과에 따른 실험을 실행한다.

- 검정법의 견고성 (목표: Z'>0.5)을 입증한다.

- 판독치의 안정성을 입증한다.

- DMSO 내성을 시험한다.

- (ABP와 경쟁하는) Ub의 적정에 의해 (R0 억제성 도메인이 없는) 파킨 RBR 도메인을 사용하여 수득된 검정 신호의 특이성을 입증한다.

- 검정법을 384-웰에서 최종 1,536-웰 스크리닝 플레이트 포맷으로 옮기고; 검정법을 EVO스크린™ 마크 III HTS 플랫폼에 맞게 개조한다.

- 필요할 경우, 상기 고밀도 플레이트 포맷에서 검정법의 견고성 (목표: Z'>0.5)을 최적화하기 위해 및 고처리량 스크리닝 (HTS)에 대한 검정 적합성을 입증하기 위해 검정 조건을 미세조정한다.

- 스크리닝 조건하에서 시간 경과에 따른 검정용 시약의 안정성을 확증한다.

- 플레이트-대-플레이트 및 나날의 검정법의 견고성을 입증한다.

- 스크리닝 및 히트 프로파일링을 위해 요구되는 모든 검정용 시약의 필요량을 추정하고, 입수한다.

단계 3: 스크리닝

마커 라이브러리 스크린 (MLS):

- 두 농도로 삼중으로 대략 2.5 k개의 대표적인 리드-유사 화합물의 다양한 마커 라이브러리를 1차 스크리닝 검정에 대하여 미리 스크리닝한다.

- MLS를 통계학적으로 분석하고, (화합물 무함유 DMSO 웰의 산포도에 기초한 플레이트 기반의) 3-시그마-방법을 이용하여 히트를 정의한다.

- 1차 스크리닝을 위해 최적의 화합물 농도를 선별한다.

1차 스크린 (PS):

- 하나의 균일한 화합물 농도로 대략 75,000개의 리드-유사 화합물을 1차 스크리닝 검정에 대하여 스크리닝하고 (n=1); 합의된 재스크린 기준 (예컨대, Z'>0.5)을 충족시키지 않는 화합물 플레이트를 재스크리닝한다.

- (화합물 무함유 DMSO 웰의 산포도에 기초한 플레이트 기반의) 3-시그마-방법을 이용하여 1차 스크린에 대해 히트를 정의한다.

- 1차 스크린을 통계학적으로 분석한다 → 1차 히트 화합물 (파킨 활성제).

히트 확증 (HC):

- 히트 확증을 위해 최대 대략 750개의 1차 히트로 이루어진 세트를 선별한다.

- 선별된 화합물에 대해 체리 피킹(Cherry picking)을 수행하고, 시험을 위해 재포맷한다.

- 화합물 스크리닝 농도로 선별된 cpd를 1차 스크리닝 검정에 대하여 재시험한다 (n=3)

- 히트 확증 캠페인을 통계학적으로 분석한다 → 확증된 소분자 파킨 활성제를 확인한다.

단계 4: 히트프로파일링 (HP):

- 히트 프로파일링을 위해 최대 대략 250개의 확증된 화합물로 이루어진 세트를 선별한다.

- 선별된 화합물에 대해 체리 피킹을 수행하고, 농도-반응 시험을 위해 재포맷한다.

- 1차 스크리닝 검정에 대하여 11점 화합물 희석액 시리즈로서 농도-반응 시험을 수행한다 (n=2)

- 농도 반응 곡선을 자동으로 데이터 피팅하고, 생성된 IC50 값을 계산한다.

- 히트 화합물을 LC/MS로 검사하여 화합물의 아이덴티티 및 순도를 확증한다.

- 활성을 띠는 히트 화합물에 대한 구조-활성 관계 분석 (SAR)을 수행한다.

- 소분자 파킨 활성제를 확증하고 프로파일링한다.

실시예 2: 유비퀴틴 비닐 술폰 프로브를 이용한 활성-기반 프로브 검정법

파킨 리가제의 활성 부위 시스테인에 비가역적으로 결합하는 유비퀴틴 비닐 술폰 프로브를 이용할 수 있다. 프로브의 파킨에의 공유 부착을 TR-FRET에 의해 모니터링할 수 있다. 후보 활성제 화합물은 파킨 리가제의 활성을 증가시킴으로써 TR-FRET 신호에 기인하여 확인할 수 있다. 하기와 같이 스크리닝을 통해 활성화 화합물이 대조군으로부터 구별될 수 있다:

100% 활성화 신호 = 열 활성화된 파킨 + DMSO 중 100 nM 대조군 활성제. 0% 활성화 신호 = 열 활성화된 파킨 + 오직 DMSO만. 파킨 활성제를 0% 활성화 신호 TR-FRET 신호의 증가에 의해 확인할 수 있다.

검정 조건:

물질:

검정용 플레이트: 백색 384 웰 플레이트 (코닝(Corning) 3572)

효소: 파킨-His 태그부착된 203 μM (10.5 mg/ml)

프로브: 유비퀴틴 비닐-술폰 (HA-Ub-VS 보스톤 바이오켐(Boston Biochem) U-212)

DMSO: DMSO (시그마(Sigma) 카탈로그 번호 D4540-100 ML)

반응 완충제: 50 mM HEPES (pH 8.5), 150 mM NaCl, 0.01% 트윈 20, 0.1% BSA

검출 완충제: 50 mM HEPES (pH 8.5), 150 mM NaCl, 0.01% 트윈 20, 0.1% BSA, 800 mM KF

검출 시약 A: 검출 완충제 중 2.6 nM 항-6HIS-Eu 트립테이트 및 40 nM 항-HA-XL665

Eu 트립테이트: 항-6HIS-Eu 트립테이트 (시스바이오(CisBio) 61HISKLA)

XL665: 항-HA-XL665 (시스바이오 610HAXLA)

효소 반응물 (파킨을 오직 활성제와 단독으로 함께 15 min 동안 미리 인큐베이션시킨다)

파킨: 40 nM

HA-Ub-VS 프로브: 70 nM

활성제/DMSO: 2X 활성제 후보/2% DMSO

반응 시간: 60분

온도: 22℃

총 부피: 10 ㎕ 반응물.

검출 반응물

상기 10 ㎕의 효소 반응물을 취하고, 하기 조건하에서 10 ㎕의 검출 시약 A를 첨가한다:

반응 시간: 60분

온도: 22℃

총 부피: 20 ㎕.

검정 방법:

1) 효소 반응 완충제 중에서 파킨을 열 활성화시킨다 (500 ㎕/1.5 ml 튜브: 에펜도르프 써모믹서(Eppendorf Thermomixer) 5분, 400 rpm, 58℃에서, 및 필요할 때까지 얼음 상에 놓아 둔다).

2) 브라보(Bravo)를 사용하여 반응 완충제 중 4.8 ㎕ 84.5 nM 파킨을 검정용 프레이트 웰에 로딩한다.

3) HP D-300 화합물 디스펜서를 이용하여 DMSO 중 0.2 ㎕ 200X 활성제 후보를 전달한다. 최고 200X 농도 = 20 μM, 이어서, 2배 희석액.

4) 실온에서 2분 동안 1,000 rpm으로 회전시킨다.

5) 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨다.

6) 브라보를 사용하여 반응 완충제 중 5 ㎕ 140 nM HA-Ub-VS 프로브를 첨가한다.

7) 실온에서 2분 동안 1,000 rpm으로 회전시킨다.

8) 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션시킨다.

9) 검출 완충제 중 10 ㎕ 2.6nM 항-6HIS-Eu 트립테이트 및 40 nM 항-HA-XL665를 첨가한다.

10) 실온에서 2분 동안 1,000 rpm으로 회전시킨다.

11) 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션시킨다.

12) 플레이트를 퍼킨 엘머 인비전(Perkin Elmer Envision) 장치 상에서 판독한다.

데이터 분석: 데이터는 CSV 파일로 판독될 수 있다. 상기 CSV 파일에는 2개의 목록이 있는데, 이는 각각 655 nm (채널 1) 및 615 nm (채널 2) 파장의 값이다. 데이터를 HTRF 비 = (채널 1/채널 2) * 10,000으로 변환시킨다.

0 uM 대조군 (오직 DMSO만)의 평균 = BKGD (배경 - 0% 활성화). 각 HTRF 비 값으로부터 BKGD를 감산한다 = HTRF-BKGD. DMSO 대조군 중 100 uM 100 nM 대조군 활성제 모두의 평균 = 최대 (100% 활성화). 이어서, 하기 식을 사용하여 하기와 같이 각 웰/후보에 대한 활성화(%)를 계산한다: 활성화(%) = (HTRF-BKGD/최대)*100.

이어서, 화합물의 활성화(%) 적정을 사용하여 활성화 EC50 또는 최고 활성화(%) (후보 화합물에 대하여 75% 미만의 활성화가 관찰되는 경우)를 찾을 수 있다.

실시예 3: 후보 친전자체 및 킬레이터 화합물을 이용한 활성-기반 프로브 검정법

표 1 및/또는 표 2의 다양한 화합물을 이용하여 상기 실시예 2에서와 같이 활성-기반 프로브 검정법을 수행하였다. 활성-기반 프로브 유비퀴틴-비닐 술폰을 이용하였을 때, 적어도 2개의 화합물이 파킨 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 도 1에서 입증되는 바와 같이, 화합물 N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드인 킬레이터 화합물 (AH001)이 활성-기반 유비퀴틴 비닐 술폰 프로브와의 파킨 리가제 반응을 증가시킨다.

유사하게, 도 2에 제시되어 있는 바와 같이, 6-벤질-2,5-디메틸-3-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-티올인 친전자체 및 킬레이터 화합물 (AH007)이 활성-기반 유비퀴틴 비닐 술폰 프로브와의 파킨 리가제 반응을 증가시킨다. 본 실시예는 킬레이터 및 친전자체, 둘 모두가 파킨 리가제 활성을 조절하고/거나, 파킨 리가제 활성을 증가시키는 것, 이 둘 모두를 할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 4: 파킨 pUB 자가- 유비퀴틴화 검정법

파킨 pUB 자가-유비퀴틴화 검정법을 사용하여 파킨 그 자신 스스로를 자가-유비퀴틴화할 수 있는 능력을 활성화시키는 후보 화합물의 효능에 대해 평가한다.

본 검정법의 원리는 E3 리가제 파킨은 유비퀴틴의 표적 단백질로의 전달을 촉매화할 뿐만 아니라, 그 자신 스스로를 자가-유비퀴틴화할 수 있는 능력을 가진다는 점이다. 본 검정법에 첨가된 포스포-유비퀴틴 (pUb)은 파킨을, 소분자 활성제가 파킨이 E1 - E2 캐스캐이드 반응을 거쳐 자가-유비퀴틴화할 수 있게 하는 상태로 변경시킨다. Eu 트립테이트 유비퀴틴, 및 His 태그부착된 파킨에 결합한 항 6His-d2를 사용함에 따라, Eu 트립테이트 유비퀴틴이 파킨 상에서 자가-유비퀴틴화되었을 때, 신호가 생성될 것이며, 이는 TR-FRET에 모니터링될 수 있다.

실시예 2 및 3의 활성-기반 프로브 검정법과 유사하게, 하기와 같이 스크리닝을 통해 활성화 화합물이 대조군으로부터 구별될 수 있다:

100% 활성화 신호 = pUb 활성화된 파킨 + DMSO 중 40 nM 대조군 활성제.

0% 활성화 신호 = pUb 활성화된 파킨 + 오직 DMSO만.

파킨 활성제를 0% 활성화 신호 TR-FRET 신호의 증가에 의해 확인할 수 있다.

물질:

검정용 플레이트: 백색 384 웰 플레이트 (코닝 3572)

효소 1: 5 μM E1 (유비퀴틴-활성화 효소/UBE1 보스톤 바이오켐 E-305)

효소 2: 25 μM E2 (UBcH7/Ube2L3 보스톤 바이오켐 E2-640)

효소 3: 파킨-His 태그부착된 203 μM (10.5 mg/ml) (An2H 공급)

pUb: 230 μM (2 mg/ml) 포스포-유비퀴틴 (S65) (보스톤 바이오켐 U-102) (An2H 공급)

Eu 트립테이트 시약: 1.77 μM 유비퀴틴 Eu (시스바이오 61UBIKLA) 250 ㎕ 증류수로 재구성.

DMSO: DMSO (시그마 카탈로그 번호 D4540-100 ML)

PF-127: 플루로닉(Pluronic) F-127 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) 50-310-494)

반응 완충제: 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1mM MgCl2, 0.005% 트윈20, 0.1% PF-127, pH 8.5

검출 완충제: 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 800 mM KF, 5mM EDTA, 0.005% 트윈 20, 0.1% PF-127, pH 8.5

검출 시약 Z: 검출 완충제 중 13.4 nM 항-6His-d2

d2 시약: 2.67 μM 항-6His-d2 (시스바이오 61HISDLA) 250 ㎕ 증류수로 재구성.

검정 조건:

10㎕ 효소 반응물 (파킨, pUb 및 활성제만 15 min 동안 미리 인큐베이션시킨다)

파킨: 196 nM

pUb: 392 nM

활성제/DMSO: 1X 활성제/1% DMSO

E1: 5 nM

E2: 50 nM

유비퀴틴 Eu: 8.8 nM

반응 시간: 120분

온도: 22℃

총 부피: 10 ㎕ 반응

검출 반응물

상기 10 ㎕의 효소 반응물을 취하고, 하기 조건하에서 10 ㎕의 검출 시약 Z를 첨가한다:

반응 시간: 60분

온도: 22℃

총 부피: 20 ㎕

검정 방법:

1) 브라보를 사용하여 반응 완충제 중 4.9 ㎕ 400.0 nM 파킨, 800 nM pUb를 검정용 프레이트 웰에 로딩한다.

2) HP D-300 화합물 디스펜서를 이용하여 DMSO 중 0.1 ㎕ 100X 활성제 후보를 전달한다. 최고 100X 농도 = 100 μM, 이어서, 2배 희석액. 이중으로 웰에 각 화합물 및 대조군을 첨가한다.

3) 실온에서 2분 동안 1,000 rpm으로 회전시킨다.

4) 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨다.

5) 브라보를 사용하여 반응 완충제 중 5 ㎕ 10 nM E1, 100 nM E2, 17.6 nM 유비퀴틴 Eu 및 2 mM ATP를 첨가한다.

6) 실온에서 2분 동안 1,000 rpm으로 회전시킨다.

7) 플레이트를 실온에서 120분 동안 인큐베이션시킨다.

8) 브라보를 사용하여 검출 완충제 중 10 ㎕ 13.4 nM 항 his d2를 첨가한다.

9) 실온에서 2분 동안 1,000 rpm으로 회전시킨다.

10) 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션시킨다.

11) 플레이트를 퍼킨 엘머 인비전 장치 상에서 판독한다.

데이터 분석: 데이터는 CSV 파일로 판독될 수 있다. 상기 CSV 파일에는 2개의 목록이 있는데, 이는 각각 655 nm (채널 1) 및 615 nm (채널 2) 파장의 값이다. 데이터를 HTRF 비 = (채널 1/채널 2) * 10,000으로 변환시킨다.

0 uM 대조군 (오직 DMSO만)의 평균 = BKGD (배경 - 0% 활성화). 각 HTRF 비 값으로부터 BKGD를 감산한다 = HTRF-BKGD. DMSO 대조군 중 100 uM 대조군 활성제 모두의 평균 = 최대 (100% 활성화). 이어서, 하기 식을 사용하여 하기와 같이 각 웰/후보에 대한 활성화(%)를 계산한다: 활성화(%) = (HTRF-BKGD/최대)*100.

이어서, 화합물의 활성화(%) 적정을 사용하여 활성화 EC50 또는 최고 활성화(%) (후보 화합물에 대하여 75% 미만의 활성화가 관찰되는 경우)를 찾을 수 있다.

실시예 5: 후보 친전자체 및 킬레이터 화합물을 이용한 파킨 pUB 자가- 유비퀴틴화 검정법

표 1 및/또는 표 2의 다양한 화합물을 이용하여 상기 실시예 4에서와 같이 파킨 pUB 자가-유비퀴틴화 검정법을 수행하였다. 활성-기반 프로브 유비퀴틴-비닐 술폰을 이용하였을 때, 적어도 2개의 화합물이 파킨 활성을 증가시키는 것으로 나타났다. 도 3에서 입증되는 바와 같이, 화합물 N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드인 킬레이터 화합물 (AH001)이 자가-유비퀴틴화 검정법에서 파킨 활성을 증가시킨다. 추가로, 도 4a에 제시되어 있는 바와 같이, 자가-유비퀴틴화 검정법에서 N,N'-(1-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3,5-디일)디벤즈아미드 (AH001)는 pUB와 함께 파킨 활성화을 시너지적으로 증가시킨다.

유사하게, 도 5에 제시되어 있는 바와 같이, 6-벤질-2,5-디메틸-3-페닐피라졸로[1,5-a]피리미딘-7-티올인 친전자체 화합물 (AH007)은 검정법에서 파킨 활성을 증가시킨다. 본 실시예는 킬레이터 및 친전자체, 둘 모두 자가-유비퀴틴화 검정법에서 파킨 리가제 활성을 조절하고/거나, 파킨 리가제 활성을 증가시키는 것, 이 둘 모두를 할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 6: 잔기 C59 및 C377은 파킨에 결합하는 조절인자에 중요하다.

파킨 리가제를 AH007 화합물과 함께 인큐베이션시킨 후, 이어서, 혼합물을 단백질 분해에 의해 분해하여 파킨 리가제의 단편을 생성한 후, 텐덤 질량 분광측정법을 수행하여 분석하였다. 본 목적은 화합물 결합 AH007를 함유하는 파킨의 특이적인 단편을 확인함으로써 화합물에 대한 파킨의 특이적인 결합 잔기를 밝혀내고자 하는 것이었다. 화합물 An2H07 또한 질량 분광측정법에 의해 분석할 때, 단편화시킨다. 그러므로, 파킨의 특이적인 잔기에 부착되는 화합물 AH007의 특징적인 조각 또한 확인할 수 있다.

상기 단편을 AH007의 예측 분자량의 결합된 소분자를 나타내는 단편 크기 변경에 대하여 특징 규명하였다. 질량 분광측정법 데이터를 통해 파킨 리가제의 2개의 특이적인 잔기에서 AH007의 3개의 특이적인 단편이 확인되었다. 파킨 리가제의 시스테인 잔기 377 (C377)에 부착된 AH007 화합물의 253.08-256.09 단편 및 C377에 부착된 AH007 화합물의 343.14-346.14의 단편이 데이터를 통해 확인되었다. 파킨 리가제의 시스테인 잔기 59 (C59)에 부착된 AH007 화합물의 253.08-256.09의 단편 또한 데이터를 통해 확인되었다. 따라서, AH007 화합물과 함께 인큐베이션된 파킨 리가제에 관한 질량 분광측정법 데이터는 화합물이 파킨 리가제 중의 두 특이적인 부위: C59 및 C377에 결합 및/또는 부착한다는 것을 나타낸다. 잔기 C59 및 C377은 심지어 파킨 리가제를 포함하는 혼합물 중에서 AH007 화합물의 농도가 현저히 증가된 경우에도 오직 유일하게 관찰되는 2개의 일관된 부위였고, 이는 다수의 다른 잠재적인 부착 부위에 비해 상기 부위에 대하여 특이성이 존재한다는 것을 제안한다. 적어도 C377은 인간 파킨 리가제의 ZnF 도메인 중에 포함되어 있는 것으로 간주되며, 따라서, 가요성 파킨 리가제 ZnF 도메인 중의 시스테인 잔기는 소분자 후보에 의한 부착 및/또는 방해에 취약하다는 이론과 일치한다. C59 및/또는 C377을 포함하는 파킨의 펩티드 단편은 추가의 결합 검정법을 디자인하는 데 및 추가의 조절제 선별에 유용할 것이다.

본원에서 논의된 공개문헌은 단지 본 출원의 출원일 이전의 개시 내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 공개문헌을 앞서는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

본 발명이 그의 제안된 구체적인 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 이는 추가로 변형될 수 있고, 본 출원은 본 발명이 속하는 관련 기술분야 내의 공지 실행 또는 관행 범위 내에 있고, 본원 상기에 기술되고, 하기의 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 있는 필수 특징에 적용될 수 있는 바와 같이, 일반적으로는 본 발명의 원리를 따르고, 본 개시내용으로부터의 상기와 같은 벗어남을 포함하는, 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 개조를 포괄하는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> An2H Discovery Limited Johnston, Jennifer <120> PARKIN LIGASE ACTIVATION METHODS AND COMPOSITIONS <130> ANDI-001/03US 323223-2006 <150> US 62/237,400 <151> 2015-10-05 <150> US 62/222,008 <151> 2015-09-22 <150> US 62/087,972 <151> 2014-12-05 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Val Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu 1 5 10 15 Val Asp Ser Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys 20 25 30 Arg Gln Gly Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Glu Leu Arg Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln 50 55 60 Ser Ile Val His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met 65 70 75 80 Asn Ala Thr Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu 85 90 95 Arg Glu Pro Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu 100 105 110 Pro Gly Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg 115 120 125 Lys Asp Ser Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn 130 135 140 Ser Phe Tyr Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly 145 150 155 160 Lys Leu Arg Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu 165 170 175 Thr Gln Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met 180 185 190 Ser Gly Glu Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe 195 200 205 Phe Phe Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val 210 215 220 Ala Leu His Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr 225 230 235 240 Cys Thr Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg 245 250 255 His Val Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu 260 265 270 Asn Asp Arg Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro 275 280 285 Cys Val Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe 290 295 300 Arg Ile Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Glu Glu Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly 325 330 335 Cys Gly Ala Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys 340 345 350 Glu Gly Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys 355 360 365 Lys Glu Ala Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser 370 375 380 Gly Thr Thr Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln 385 390 395 400 Ala Arg Trp Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys 405 410 415 Pro Cys Pro Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met 420 425 430 His Met Lys Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn 435 440 445 Cys Gly Cys Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp 450 455 460 Val 465

Claims (37)

1. 파킨 리가제 활성화를 필요로 하는 대상체에게 치료학상 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 화합물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 화합물은 아연 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인과 결합 또는 반응할 수 있는 것인, 파킨 리가제를 활성화시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 활성화된 파킨 리가제가 하나 이상의 종양의 성장을 억제시키고/거나, 하나 이상의 종양의 전이를 예방하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 활성화된 파킨 리가제가 도파민 뉴런을 보호하는 것인 방법.
4. 제2항에 있어서, 화합물이 손상된 미토콘드리아를 제거하는 기능, 세포적 스트레스 동안 세포 생존가능성을 증가시키는 기능, 종양 형질변환을 감소시키는 기능 및 세포에서 알파-시누클레인을 이동시키는 기능으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 가지는 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 대상체가 암 진단을 받은 대상체인 방법.
6. 제5항에 있어서, 암이 교모세포종, 소세포 폐 암종, 유방암 또는 전립선암인 방법.
7. 제3항에 있어서, 대상체가 신경퇴행성 질환 진단을 받은 대상체인 방법.
8. 제7항에 있어서, 신경퇴행성 질환이 파킨슨병, 치매, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 헌팅톤병인 방법.
9. 제8항에 있어서, 치매가 루이소체 치매 (DLB), 다계통 위축증 (MSA) 또는 진행성 핵상 마비 (PSP)인 방법.
10. 제1항에 있어서, 아연 이온에 배위결합할 수 있는 화합물이 1좌, 2좌, 또는 3좌 리간드인 방법.
11. 제10항에 있어서, 아연 이온에 배위결합할 수 있는 화합물이 파킨 리가제 중 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 실질적으로 파괴시키는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기가 인간 파킨 리가제의 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 적어도 하나의 아연 핑거가 4개의 시스테인 잔기를 포함하는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 파킨 리가제 활성화가 유비퀴틴화를 변경시키는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 화합물이 알킬화제, 산화제, 마이클 수용자, 또 다른 불포화된 구조이고/거나, 디술피드를 가지는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 화합물이 파킨 리가제 중 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 실질적으로 파괴시키는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기가 인간 파킨 리가제의 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, 아연 핑거가 4개의 시스테인 잔기를 포함하는 것인 방법.
19. 제1항에 있어서, 파킨 리가제 활성화가 알츠하이머 치매, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 프리드라이히 운동실조, 척수소뇌성 실조증, 다계통 위축증, PSP, 타우병증, 미만성 루이소체병, 루이소체 치매, α-시누클레인의 비정상적인 축적을 특징으로 하는 임의의 장애, 노화 과정 장애, 뇌졸중, 박테리아성 감염, 바이러스성 감염, 미토콘드리아 관련 질환, 정신 지체, 난청, 시각상실, 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 루프스, 거짓비늘 녹내장을 비롯한 녹내장, 레버 유전성 시각 신경병증, 및 류머티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 또는 질병을 치료하거나, 또는 그의 발생을 감소시키는 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, 박테리아성 감염이 미코박테리움 감염인 방법.
21. 제19항에 있어서, 바이러스성 감염이 C형 간염 감염인 방법.
22. 제19항에 있어서, 미토콘드리아 관련 질환이 알퍼스병, 바쓰 증후군/LIC (치사성 영아 심근병증), 베타-산화 결손증, 카르니틴-아실-카르니틴 결핍증, 카르니틴 결핍증, 크레아틴 결핍증 증후군, 코엔자임 Q10 결핍증, 복합체 I 결핍증, 복합체 II 결핍증, 복합체 III 결핍증, 복합체 IV 결핍증/COX 결핍증, 복합체 V 결핍증, CPEO, CPT I 결핍증, CPT II 결핍증, KSS, 젖산산증, LBSL - 백질이영양증, LCAD, LCHAD, 라이병 또는 증후군, 루프트 질환, MAD/글루타르산뇨 타입 II, MCAD, MELAS, MERRF, MIRAS, 미토콘드리아 세포병변, 미토콘드리아 DNA 고갈, 미토콘드리아 뇌병증, 미토콘드리아 근육병, MNGIE, NARP, 피어슨 증후군, 피루베이트 카르복실라제 결핍증, 피루베이트 데히드로게나제 결핍증, POLG 돌연변이, 호흡 연쇄 관련 질환, SCAD, SCHAD, 및 VLCAD로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택되는 것인 방법.
23. 유효량의, 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키는 화합물 또는 그의 염, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하며,
    여기서, 화합물 또는 그의 염은 아연 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인과 결합 또는 반응할 수 있는 것인, 대상체에서 파킨 리가제를 활성화시키기 위한 제약 조성물.
24. 제23항에 있어서, 고체, 분말, 액체 및 겔로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제로 존재하는 제약 조성물.
25. 제23항에 있어서, 화합물이 표 1, 표 2, AH001 및/또는 AH007의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
26. 제1항에 있어서, 화합물이 시스테인 중의 티올 기와 결합 또는 반응하는 것인 방법.
27. 제1항에 있어서, 시스테인이 인간 파킨 리가제의 C59 및 C377로 이루어진 군 중 하나 이상의 것으로부터 선택되는 것인 방법.
28. 제1항에 있어서, 시스테인이 인간 파킨 리가제의 C377인 방법.
29. 제1항에 있어서, 화합물이
    

    

    ,

    

    , 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
30. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기가 인간 파킨 리가제의 C59 및 C377로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되는 것인 방법.
31. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기가 인간 파킨 리가제의 C377에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되는 것인 방법.
32. 제17항에 있어서, 화합물이 IBR 도메인 (아미노산 328-377)에 위치하는 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 실질적으로 파괴시키는 것인 방법.
33. 파킨 리가제 활성화를 필요로 하는 대상체에게, 파킨 리가제 활성화에서 포스포 유비퀴틴 (pUB)과 함께 시너지적으로 작용하는 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 파킨 리가제를 활성화시키는 방법.
34. 제33항에 있어서, 치료학상 유효량의 화합물이 적어도 하나의 파킨 리가제 아연 핑거를 파괴시키고, 여기서, 화합물은 아연 이온과 배위결합할 수 있고/거나, 시스테인과 결합 또는 반응할 수 있는 것인 방법.
35. 제33항에 있어서, 화합물이 파킨 리가제 중 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 실질적으로 파괴시키는 것인 방법.
36. 제35항에 있어서, 적어도 하나의 아연 핑거의 아미노산 잔기가 인간 파킨 리가제의 R0 아미노산 141-216, IBR 아미노산 328-377, 및 R2 아미노산 415-465로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인에 상응하거나, 또는 그 안에 정렬되는 것인 방법.
37. 제36항에 있어서, 화합물이 IBR 도메인 (아미노산 328-377)에 위치하는 적어도 하나의 아연 핑거의 구조를 실질적으로 파괴시키는 것인 방법.

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