CN109745324A - 非经典NF-kB通路的小分子抑制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非经典NF‑kB通路的小分子抑制剂及其应用。具体而言，本发明提供能抑制或阻止RelB蛋白与其靶DNA结合的试剂或能抑制RelB蛋白的转录功能的试剂在制备治疗或预防受益于RelB蛋白与其靶DNA的结合受阻而使得非经典NF‑κB通路被抑制的疾病的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及非经典NF-kB通路的小分子抑制剂及其应用。
背景技术
核因子kB(Nuclear Factor-kB，NF-kB)是转录因子家族之一，参与很多重要的生物学过程，包括免疫应答，炎症反应、肿瘤的发生、细胞的存活、增殖、发育和分化等。哺乳动物NF-kB家族主要包含：NF-kB1(p50)、NF-kB2(p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel五个家族成员。这五个蛋白都包含一个用于DNA结合和形成二聚体的区域，大约含有300个氨基酸，叫做REL同源区。在RelA、RelB以及Rel蛋白C端，都包含了一个转录活性区域。这个区域用于介导与转录因子及辅助转录因子如TATA结合蛋白(TBP)、TFIIB、E1A结合蛋白300KD(EP300)和CREB结合蛋白(CBP)的结合。RelB在N端有一个亮氨酸拉链结构(LZ)。
NF-kB通路的激活过程主要包括：经典NF-kB通路和非经典NF-kB通路。经典NF-kB通路的激活依赖于诱导IkB蛋白降解，特别是IkBa降解。如RelA和p50组成的二聚体，在未被激活的时候，NF-kB1(p105)组成性剪切为p50，并与RelA形成异源二聚体，胞浆内IkB与其结合，从而抑制其入核行使转录功能。在病原体及炎症因子(TNFa、IL-1b和TLRs)等刺激下，IkB蛋白激酶(IKK)复合体磷酸化IkB，而使其通过泛素化依赖的方式降解，从而释放出RelA/p50，进而入核行使转录因子的功能。
非经典NF-kB通路是2002年开始正式被认识。非经典NF-kB通路的激活依赖于NF-kB2p100的剪切。未被激活时，NF-kB2p100与RelB结合而驻留于胞浆内。在胞外信号因子，主要是TNF家族成员(如RANKL、LTa1b2、CD40L和BAFF等)的刺激下，NF-kB2p100被剪切成p52，去除抑制信号，从而形成p52/RelB二聚体而入核。非经典NF-kB通路的激活仅需要一些特定的受体，主要是TNF受体超家族成员，包括BAFF、CD40、LTbR、RANK、TNFR2和Fn14等。这些受体均可介导非经典NF-kB通路的某一特定的生物学功能。受体激活非经典NF-kB通路的共同特征是在受体配体结合时可以招募TRAF3-TRAF2-cIAP1/2复合体，并使其降解，从而引起NIK聚集和激活以及NF-kB2p100的剪切(图1)。
近年来的研究表明非经典NF-kB通路调控着非常重要的生物学过程，比如淋巴系统的发育、T细胞的阴性选择、B细胞存活和成熟、以及骨代谢，此通路的激活异常会引起很多免疫性疾病和骨代谢性疾病。此外，非经典NF-kB通路的异常激活与多种肿瘤的发生相关。
在癌症中，激活非经典通路的主要机制有三种：病毒致癌基因，信号通路成员的突变，信号上游的分子过表达。在卡波济氏肉瘤和原发性渗出淋巴瘤细胞中，人疱疹病毒8(HHV-8)蛋白vFLIP-K13能激活非依赖NIK的p100剪切成p52，并促进细胞的存活和增殖。非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)的潜在膜蛋白(LMP)-1也被报道能以依赖于NIK的方式促进p100的剪切。和这些结果一致的是，在EBV阳性的霍奇金氏淋巴瘤、鼻咽癌和DLBCL中，p52都是高表达的。乙型肝炎病毒HBx蛋白也能通过提高Bcl-3的表达来加强p52信号。在肝细胞癌细胞系中，Bcl-3/p52复合物能激活Cyclin D1启动子，促进细胞的增殖和转化。在许多人类血液恶性肿瘤中，p100/p52基因常常出现染色体重排和突变。如p100C端区域常常缺失，形成激活状态的p100，该蛋白入核能激活NF-kB目的基因，导致细胞的增殖和存活。这种突变在很多癌症中可见，比如多发性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤以及B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)。除了p52突变，非经典NF-kB通路上游激酶和调节因子的突变也有报道。上游的许多调节因子(TRAF2，TRAF3，cIAP1&2，CD40，BAFFR，BIRC和NIK)的突变能促进NIK的稳定从而激活非经典NF-kB通路。这种激活机制在不同的肿瘤类型中起重要的作用，包括DLBCL、脾脏缘带淋巴瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤以及肺癌。据报道，在粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤体外系统中，API2-MALT1融合癌蛋白能分离NIK，从而激活非经典NF-kB通路。另外，在人类前列腺癌肿瘤细胞中，STAT3的激活能NIK，从到诱导p100的剪切激活非经典NF-kB通路。
根据不同的癌症细胞类型，非经典NF-kB通路的转录靶标也是不同的。比如，在黑色素瘤细胞中，RelB-p52复合物能直接调控EZH2增强子的转录从而抑制衰老程序的启动。同样的，在正常的人皮肤成纤维细胞和病人来源的CLL细胞中，EZH2的表达都依赖于p52。
基因敲除的研究手段证明了非经典NF-kB通路中各个分子在B细胞存活和发育中的重要作用。例如，BAFF在B细胞的存活中扮演重要的角色。比如BAFF-NIK-p52信号通路能上调抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xL的表达，这些基因对于细胞的存活至关重要。BAFF-NIK-p52信号通路还能抑制凋亡基因的表达。在淋巴结的发育过程中，LTβ信号通过p52和p50发挥生物学功能。LTβ能激活粘附分子如细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)的表达。这两种分子对于小鼠淋巴结的形成和发育都很重要。同时，LTβ还能诱导细胞因子(CCL20和CXCL3)的表达。这些细胞因子对于淋巴结的形成和B细胞、T细胞在淋巴结中的区室化很重要。在B细胞中敲除TRAF3会导致小鼠中浆细胞的增加。
非经典NF-kB通路除了在B细胞中发挥重要的作用，在其他的一些免疫细胞中也发挥重要作用。它对于B细胞中可诱导共刺激因子(ICOS)配体的表达是必须的。ICOS对于滤泡辅助T细胞(Tfh细胞)的发育至关重要。在小鼠调节性T细胞(Treg)中特异性敲除TRAF3会促进抗原诱导的Tfh细胞激活，促进生发中心的形成以及IgG抗体的产生。TRAF3缺失的Treg细胞会呈现ICOS表达的缺失。在NIK缺失的小鼠中，皮肤上树突上皮T细胞的量会显著降低。在Th17细胞中，P52-c-Rel异源二聚体参与调控粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，IL23R和CD80的表达。Th17在小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病过程中扮演重要角色(Yuet al.,2014)。
在DC细胞中，CD40L诱导激活的非经典NF-kB通路能上调吲哚胺2,3二加氧酶(IDO)和下调促炎因子的表达，从而增加Treg的数量。另外，在DC中敲除p52会增加激活标志分子CD80和主要组织相容性复合物Ⅱ(MHCⅡ)的表达，这些提示了在小鼠中，p52的激活会负调控DC的功能。在另一个研究中，在CD11c+DC中敲除NIK不会影响正常淋巴器官的发育，但会导致抗原交叉启动缺失。在内皮细胞上特异性敲除LTβR会导致小鼠中外周淋巴结发育缺失，这证明了内皮细胞在淋巴结形成过程中的作用。
在小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)中，RelB/p52能结合到Ifnb基因的启动子上从而阻止了p65的结合，抑制了干扰素的表达，这对于抗病毒变异很重要。在骨髓细胞特异性敲除TRAF2会促进BMDMs中的促炎细胞因子的表达。TRAF3缺失的BMDMs显示会上调c-Rel和IRF5蛋白表达。在另一个独立的研究中，骨髓细胞中特异性敲除TRAF3会导致年老的(15-22个月)小鼠自发慢性炎症和肿瘤。
非经典NF-kB通路在不同的免疫疾病中也扮演着重要的角色。过度激活的非经典NF-kB通路会导致自身免疫病和其他相关的病理状态。例如，p52过表达的小鼠由于自我激活淋巴细胞的存活会发生炎症的自身免疫病，这是由于抗凋亡基因Bim1的表达被p52抑制所导致的。在另一个研究中显示，小鼠组成性激活p52会发生肺炎，伴随着肺泡损伤和纤维化。另外，当被移植到MHCⅡ错配的小鼠中，来源于NIK缺失小鼠的T细胞也不能诱导移植物抗宿主疾病。
在类风湿性关节炎病人中，NOTCH的激活会导致成骨细胞和滑膜细胞中的p52激活。事实上，p52的激活会促进促炎因子的产生并同时抑制成骨细胞的形成，这些会导致慢性炎症，骨缺失以及软骨破坏，而这些都是类风湿性关节炎的标志。总之，持续性激活非经典NF-kB通路信号往往和缺陷(自身免疫和耐受)相关联。
发明内容
本发明提供下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：
式中，
A1、A2和A3各自独立选自CR1或N；
D选自CR2、O、S或NR3；
E和F各自独立选自C(R4)2或NR5；
L为连接基团；
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基；
R1和R2各自独立选自H、C1-C6烷基、卤素、C1-C3烷硫基或OH；
R3选自H或C1-C6烷基；
R4和R5各自独立选自H、C1-C6烷基、卤素或羟基，或R4、R5与它们所连接的环原子一起形成除E和F外还任选含有1、2或3个选自O、S和N的杂原子的5～8元饱和或不饱和环。
在某些实施方案中，所述式I化合物具有下式II结构：
式中，
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基。
在某些实施方案中，式I化合物具有下式III所示结构：
式中，
R6选自H或C1-C6烷基；
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基。
在某些实施方案中，Ar为任选地被1、2、3或4个选自羟基、C1-C6烷基和卤素的取代基取代的C6-C14芳基。
在某些实施方案中，Ar上至少具有一个羟基取代基。优选地，该羟基取代基位于邻位。
本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物含有本文所述的式I、II或III化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供能抑制RelB蛋白与其靶DNA的结合的试剂在药物中的应用，该药物用于治疗或预防受益于RelB蛋白与其靶DNA的结合受阻而使得非经典NF-κB通路被抑制的疾病。
在某些实施方案中，所述试剂为本发明所述的式I、II和III所示的化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述试剂为核酸分子，所述核酸分子选自打靶载体、siRNA和干扰RNA的表达载体。
在某些实施方案中，所述试剂为RelB的特异性抗体。
本发明还提供一种治疗或预防受益于非经典NF-κB通路被抑制的疾病方法，所述方法包括给予需要的对象治疗有效量的能抑制RelB蛋白与其靶DNA的结合的试剂。
在某些实施方案中，所述试剂为本发明式I、II或III的化合物、其药学上可接受的盐或其药物组合物。
本发明还提供在治疗或预防方法中使用的能抑制RelB蛋白与其靶DNA的结合的试剂，包括式I、II或III化合物或其药学上可接受的盐，所述治疗或预防方法用于治疗或预防受益于RelB蛋白与其靶DNA的结合受阻而使得非经典NF-κB通路被抑制的疾病。
本发明还提供一种经基因工程处理的癌细胞，与未经相同的基因工程处理的癌细胞对照相比，所述癌细胞中RelB的表达降低或完全不表达RelB，或表达的RelB蛋白与其靶DNA无结合活性或结合活性降低。
本发明还提供一种用于药物筛选的细胞培养物，所述细胞培养物含有本文所述的癌细胞。
附图说明
图1：非经典NF-kB通路治疗靶点(Vinay Tergaonkar 2016)。
图2：靶向RelB蛋白的小分子药物筛选系统。a、Q-PCR检测HCT116细胞系中c-MycRNA的表达水平；b、Western Blot检测HCT116细胞系中c-Myc蛋白的表达水平；c、双萤光素酶报告基因检测c-Myc报告基因的活性。d、MTT实验检测HCT116细胞在不同时间点的细胞活性。
图3：RelB/p52/DNA与小分子药物结构模拟图。a、RelB蛋白三维结构图；b、RelB/p52/DNA与小分子药物结构模拟(1和2为DNA，3为小分子药物，外围为RelB/p52蛋白二聚体)。
图4：小分子药物对c-Myc的抑制作用。a、在双萤光素酶报告基因实验中，检测小分子药物对c-Myc报告基因的影响；b、在HCT116细胞系中，Western Blot检测小分子药物对c-Myc蛋白水平的影响。
图5：在HCT116细胞中,检测细胞活性。a、在HCT116细胞中，不同浓度的小分子药物检测细胞活性；b、图a的汇总图；c、细胞活性检测实验测定RS09和RS47对HCT116的IC50。
图6：小分子药物在对不同细胞系活性的影响。a、小分子药物对结肠癌细胞系细胞活性的影响；b、小分子药物对正常肠上皮细胞系细胞活性的影响；c、小分子药物对肝癌细胞系细胞活性的影响；d、小分子药物对肺癌细胞系细胞活性的影响
图7：验证小分子药物能结合RelB蛋白阻止其与靶DNA结合。a、在双萤光素酶报告基因实验中，检测小分子药物对NF-kB报告基因的影响；b、在双萤光素酶报告基因实验中，检测小分子药物对Bcl-3报告基因的影响；c、EMSA实验验证小分子药物对RelB蛋白与探针结合的影响；d、Pulldown实验验证小分子药物能否与RelB分子结合；e、Realtime PCR检测小分子药物是否影响TNF的RNA表达水平。
图8：在BAFF刺激诱导B细胞系统中，检测小分子药物对非经典NF-kB通路的抑制作用。a、Realtime PCR检测pim2基因的RNA表达水平；b、流式细胞技术检测小分子药物对人来源B淋巴瘤细胞存活的抑制作用流式细胞技术检测小分子药物对小鼠原代B细胞存活的抑制作用。
图9：免疫荧光共定位小分子药物和RelB蛋白。
图10：小分子药物抑制HCT116细胞生长。a、流式分析小分子药物对HCT116细胞周期影响；b、a结果的统计图；c、流式分析小分子药物对HCT116细胞凋亡影响；d、c结果的统计图；e、小分子药物对HCT116克隆形成的影响、
图11：小分子药物抑制SW620细胞生长。a、流式分析小分子药物对HCT116细胞周期影响；b、a结果的统计图；c、流式分析小分子药物对HCT116细胞凋亡影响；d、c结果的统计图；e、小分子药物对HCT116克隆形成的影响。
图12：小分子药物RS47促进B淋巴瘤细胞凋亡。a、小分子药物对BJAB细胞凋亡的影响；b、a结果统计图；c、小分子药物对人来源B淋巴瘤细胞凋亡的影响；d、小分子药物对BMSC细胞凋亡的影响。
图13：小分子药物抑制HCT116裸鼠皮下成瘤。a、HCT116裸鼠皮下成瘤图例；b、皮下成瘤肿瘤质量统计图；c、成瘤细胞中c-Myc RNA的表达水平；d、成瘤细胞中C-Myc蛋白的表达水平。
具体实施方式
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明发现，某些小分子能和RelB蛋白结合，嵌在其与靶DNA结合的位点，从而阻止RelB蛋白与DNA结合，抑制其转录功能，从而抑制非经典NF-κB通路，并因此可用于治疗或预防由非经典NF-κB通路介导的各种疾病，包括癌症和炎症性疾病。
本发明的小分子化合物包括下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：
式中，
A1、A2和A3各自独立选自CR1或N；
D选自CR2、O、S或NR3；
E和F各自独立选自C(R4)2或NR5；
L为连接基团；
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基；
R1和R2各自独立选自H、C1-C6烷基、卤素、C1-C3烷硫基或OH；
R3选自H或C1-C6烷基；
R4和R5各自独立选自H、C1-C6烷基、卤素或羟基，或R4、R5与它们所连接的环原子一起形成除E和F外还任选含有1、2或3个选自O、S和N的杂原子的5～8元饱和或不饱和环。
本文所用“烷基”指直链或支链C1-C6烷基，优选C1-C4烷基，更优选C1-C3烷基。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基等。
本文所用“烷硫基”指被本文所述烷基取代的硫基。
本文所用“芳基”指含有6到14个碳原子的单环、双环或三环芳族基团。优选的芳基是C6-10芳基。典型的C6-14芳基包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯基、亚联苯基和茀基。
本文所用的“碳环基”包括环烷基和部分饱和的碳环基团。有用的环烷基是C3-8环烷基。典型的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。有用的部分饱和的碳环基团具有3-8个环碳原子的环烯基，可以是环戊烯基、环庚烯基和环辛烯基。
本文所用的“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本文所用的“卤代烷基”包括被一个或多个氟、氯、溴或碘原子取代的C1-C6烷基，优选的是C1-C4烷基，例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1,1-二氟乙基、氯甲基、氯氟甲基和三氯甲基。
本文所用“杂环基”指饱和或部分饱和的3-7员单环，或7-10员双环体系，由碳原子和任选的1－4个选自O、N和S的杂原子组成。有用的饱和或部分饱和杂环基团包括四氢呋喃基、吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、咪唑烷基、咪唑啉基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、异色满基、色满基、吡唑烷基和吡唑啉基。
本文所用“杂芳基”是指含有5-14个环原子，并且有6个，10个或14个电子在环体系上共用的基团。所含环原子是碳原子和从氧、氮、硫中任选的1-3个杂原子。有用的杂芳基包括噻吩基(苯硫基)、苯并[d]异噻唑-3-基、苯并[b]噻吩基、萘并[2,3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、夹氧蒽基、噻吩恶基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、包括但不限制于2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌间二氮(杂)苯基、菲咯啉基、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基、异恶唑基、呋咱基、吩恶嗪基、1,4-二氢喹喔啉-2,3-二酮、7-氨基异香豆素、吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮、四氢化五员[c]吡唑-3-基、吡唑[1,5-a]嘧啶基、苯并异恶唑基如1,2-苯并异恶唑-3-基、苯并咪唑基、2-羟吲哚基、噻重氮基和2-氧代苯并咪唑基。
本文中，对于所提及可被取代的基团，当被取代时，其取代基的数量可以是1、2、3或4个，取代基可选自：卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、C1-6酰氨基、C1-6酰氧基、C1-6烷氧基、芳氧基、烷硫基、C6-C10芳基、C3-C8环烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、饱和和不饱和的杂环基或杂芳基。
本发明式I中，优选地，A1、A2和A3中至少一个为N，优选其中至少两个为N。在某些实施方案中，A1、A2和A3中，A1和A3为N，A2为CR1。
在优选的实施方案中，R1为H。在某些实施方案中，R1可以是C1-C6烷基或C1-3烷硫基。
在优选的实施方案中，D为O或S。
在优选的实施方案中，E和F分别为C(R4)2，且E和F中，各自的一个R4为H，另两个R4与所连接的C一起形成除E和F的碳外还任选含有1、2或3个选自O、S和N的杂原子的5～8元饱和或不饱和环，优选是5～8元饱和碳环，更优选是环己烷。
因此，在某些实施方案中，式I化合物中，含A1-A3以及D-F的环为4b,5,6,7,8,8a-六氢苯并[4,5]-噻吩并[2,3-d]嘧啶环。
在式I的优选实施方案中，L为含N和C的连接基团。在某些实施方案中，L为-NH-N＝C(R7)-或-NH-NH-C(R8)-NH-C(R8)-，其中，R7为H或C1-C3烷基；各R8独立为S和O。
在式I的优选实施方案中，Ar优选为任选被1、2、3或4个选自羟基、卤素和C1-C3烷基的取代基取代的C6-C14芳基，更优选为被1、2、3或4个选自羟基、卤素和C1-C3烷基的取代基取代的苯基。
因此，在某些实施方案中，式I化合物具有下式II结构：
式中，
L是连接基团；
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基。
在式II优选的实施方案中，L优选为含N和C的连接基团。在某些实施方案中，L为-NH-N＝C(R7)-或-NH-NH-C(R8)-NH-C(R8)-，其中，R7为H或C1-C3烷基；各R7独立为S和O。
在式II的优选实施方案中，Ar优选为任选被1、2、3或4个选自羟基、卤素和C1-C3烷基的取代基取代的C6-C14芳基，更优选为被1、2、3或4个选自羟基、卤素和C1-C3烷基的取代基取代的苯基。
因此，在某些实施方案中，式I化合物具有下式III所示结构：
式中，
R6选自H或C1-C6烷基；
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基。
在式III的优选实施方案中，Ar优选为任选被1、2、3或4个选自羟基、卤素和C1-C3烷基的取代基取代的C6-C14芳基，更优选为被1、2、3或4个选自羟基、卤素和C1-C3烷基的取代基取代的苯基。
在某些实施方案中，式I、II或III的化合物包括本文所述的化合物RS07、RS09、RS10、RS47和RS51。在其它实施方案中，式I、II和III的化合物不包括本文所述的化合物RS07、RS09、RS10、RS47和RS51。
可采用本领域周知的方法制备本发明的化合物。尤其是，可参照化合物RS07、RS09、RS10、RS47和RS51的制备方法使用合适的原料和试剂制备落入本文通式I内的其它化合物。
一些本发明化合物可能作为立体异构体，包括旋光异构体存在。本发明包括所有立体异构体和这样的立体异构体的外消旋混合物，以及可以根据本领域技术人员众所周知的方法分离出来的单独的对映体。
本文中，药学上可接受的盐的例子包括无机和有机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱例如钠羟基、三(羟基甲基)胺基甲烷(TRIS，胺丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐。
本文还提供一种药物组合物，该药物组合物含有本文所述的式I、II或III化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。本文中，“药学上可接受的载体”指无活性成分，如固体，半固体，或液体填充剂，稀释剂，包衣材料，制剂佐料，赋形剂或载体，与治疗剂合用，一起构成用于给予对象的“药物组合物”。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度对于对象而言是无毒的，且与制剂中的其他成分相容。药学上可接受的载体对于所采用的制剂而言是适当的。例如，如果治疗剂将口服给药，则载体可以是凝胶胶囊。如果治疗剂将皮下给药，则理想的是，载体对皮肤无刺激，且不引起注射位点反应。
可将具有所需纯度的本文所述化合物与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合而制备所述药物组合物。药学上可接受的载体可包括如缓冲剂(如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸)；抗氧化剂(如抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和m-甲酚)；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸)；单糖；二糖；和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
示例性的药物载体还可包括粘合剂，如预糊化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等；填充剂，如乳糖或其它糖类，微晶纤维素，果胶，明胶，硫酸钙，乙基纤维素，聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等；润滑剂，如硬脂酸镁，滑石粉，二氧化硅，胶态二氧化硅，硬脂酸，金属硬脂酸盐，氢化植物油，玉米淀粉，聚乙二醇，苯甲酸钠，乙酸钠等；崩解剂，如淀粉，羟基乙酸淀粉钠等；和润湿剂，如十二烷基硫酸钠等。
药物组合物可以是任何合适的剂型，包括但不限于适合于各种给药方式的剂型，例如适合于口服、静脉注射、局部或外用给药的剂型。药物组合物中可含有合适量的本发明化合物，这可由制造商根据实际情况加以确定。
本发明通过抑制RelB蛋白与其靶DNA结合，抑制其转录功能，从而抑制非经典NF-κB通路。基于此，可使用能抑制或阻止RelB蛋白与其靶DNA结合的试剂，或能抑制RelB蛋白的转录功能的试剂来实施本发明。这类试剂可以是本领域已知的RelB蛋白表达或活性的抑制剂，包括能从基因水平减少RelB蛋白表达的抑制剂以及能从蛋白水平抑制RelB蛋白与其靶DNA结合活性的抑制剂。可通过给予合适的核酸分子，用以减少RelB蛋白的表达。例如，合适的核酸分子可以是合适的打靶载体，用以从基因组中敲除RelB的基因序列，从而使得感兴趣的细胞不表达RelB蛋白；或在RelB基因序列中引入突变，从而使得感兴趣的细胞表达无活性或弱活性的RelB蛋白。尤其感兴趣的是能在已知的RelB蛋白与其靶DNA的结合位置上引入突变，以使RelB蛋白与其靶DNA的结合变弱或无结合活性的核酸分子。合适的核酸分子还可以是能抑制RelB表达的siRNA以及RelB基因的RNA干扰载体。可采用本领域常规的方法构建合适的打靶载体、siRNA以及RNA干扰载体。在某些实施方案中，RelB的抑制剂是蛋白类抑制剂，如RelB的特异性抗体；或者是小分子化合物，如本发明式I、II或III所示的化合物或其药学上可接受的盐，尤其包括化合物RS51、RS07、RS09、RS10和RS47。
应理解的是，本文所述的非经典NF-κB通路、RelB蛋白及其靶DNA等均为本领域所周知的非经典NF-κB通路、RelB蛋白和靶DNA。因此，本文可治疗或预防非经典NF-κB通路介导的疾病，尤其是受益于非经典NF-κB通路被抑制的疾病，更优选是受益于RelB蛋白与其靶DNA的结合受阻而使得非经典NF-κB通路被抑制的疾病。
本文所述的疾病包括任何因非经典NF-kB通路被过度激活而导致的疾病，包括但不限于各种癌症、自身免疫疾病、炎症性疾病和骨相关疾病。尤其是，由于本文的试剂(尤其是式I、II或III化合物)能阻断非经典NF-κB信号，因此它们能通过抑制趋化因子的产生，阻止炎症细胞和肿瘤基质细胞在肿瘤微环境中聚集，从而抑制肿瘤血管发育和形成，抑制肿瘤的生长。因此，适用于本文所述化合物治疗或预防的癌症可以是实体瘤和血液肿瘤，包括但不限于肝癌、黑素瘤、霍奇金病、淋巴瘤、急性淋巴白血病、慢性淋巴白血病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸癌、软组织肉瘤、原发性巨球蛋白血症、膀胱癌、慢性粒细胞白血病、原发性脑癌、恶性黑素瘤、小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌性癌症、绒毛膜癌、蕈樣肉芽腫、头颈癌、骨原性肉瘤、胰腺癌、急性粒细胞白血病、毛细胞白血病、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、泌尿生殖系统肿瘤病、甲状腺癌、食管癌、恶性高钙血症、子宫颈增生症、肾细胞癌、子宫内膜癌、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、肾上腺皮质癌、皮肤癌和前列腺癌。自身免疫性疾病可以是系统性红斑狼疮、多发性硬化和自身免疫性肝炎。炎症性疾病可以是肠炎或类风湿性关节炎。骨相关疾病可以是骨质疏松等。
本发明还提供一种治疗或预防受益于非经典NF-κB通路被抑制的疾病方法，所述方法包括给予需要的对象治疗有效量的能抑制或阻止RelB蛋白与其靶DNA结合的试剂，或能抑制RelB蛋白的转录功能的试剂，尤其是本发明式I、II或III的化合物、其药学上可接受的盐或其药物组合物。在实施本文所述的治疗或预防方法时，给有需要的对象施用治疗或预防有效量的本文所述的化合物或其药物组合物。对象可以是哺乳动物，尤其是人。给药量是有效地改善或消除一个或多个病症的药量。对于特定疾病的治疗，有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案给药。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。
虽然每个人的需求各不相同，本领域技术人员可确定药品制剂中每个部分的最佳剂量。一般情况下，本文所述的化合物或其药学上可接受的盐对哺乳动物每天口服的给药量按照约0.0025到50毫克/公斤体重计。最好是每公斤口服给药约0.01到10毫克/公斤。单位口服剂量可以包括约0.01到50毫克，最好是约0.1到10毫克的本发明化合物。单位剂量可给予一次或多次，每天为一片或多片，每片含有约0.1到50毫克，合宜地约0.25到10毫克的本发明化合物或其溶剂化物。
本发明还提供在治疗或预防方法中使用的能抑制或阻止RelB蛋白与其靶DNA结合的试剂，或能抑制RelB蛋白的转录功能的试剂，尤其是本文式I、II或III化合物或其药学上可接受的盐，所述治疗或预防方法用于治疗或预防本文所述的受益于RelB蛋白与其靶DNA的结合受阻而使得非经典NF-κB通路被抑制的疾病。
本发明还发现，在结肠癌细胞系中敲低RelB的表达能显著抑制促癌基因c-Myc的表达，可以此为基础建立小分子药物的筛选系统。因此，本发明还提供一种经基因工程处理的癌细胞，与未经相同的基因工程处理的癌细胞对照相比，所述癌细胞中RelB的表达降低或完全不表达RelB，或表达的RelB蛋白与其靶DNA无结合活性或结合活性降低。优选地，所述经基因工程处理的癌细胞是结肠癌细胞。
本发明因此还提供一种细胞培养物，其含有所述经基因工程处理的癌细胞。
下列实施例是举例说明，而不是限制本发明的方法和制剂。其他对于本领域技术人员来说是显而易见的，和在临床治疗中通常会遇到的对各种条件和参数的适当修改和改进，都在本发明的精神和范围内。
一、实验材料
1、实验仪器
实验仪器包括离心机、PCR仪、分光光度计、电泳仪等，均来自市售产品，如来自Beckman Coulter、Eppendorf、东胜创新、Thermo等。
2、实验试剂
3、实验动物
裸鼠：购于上海斯莱克实验动物有限公司，该小鼠为Babl/c背景，T细胞免疫缺陷小鼠，SPF级。
实验小鼠由中科院上海生命科学研究院健康科学研究所SPF级动物房饲养。
4、实验方法
4.1、过表达质粒构建
a、在NCBI上查找相关基因的DNA序列，找到CDS区，并用软件Primer Premier5设计扩增引物，用于克隆相应的基因序列。上游引物和下游引物5’端分别带有酶切位点和保护碱基，酶切位点由表达载体上的酶切位点决定。序列由博尚公司合成。
引物序列：
hRelB F：CGgcgatagcATGCTTCGGTCTGGGCCAGCCTC(SEQ ID NO:1)
hRelB R：CGacgcgtCTACGTGGCTTCAGGCCCCGGGG(SEQ ID NO:2)
b、合成的引物配成10μM的标准引物浓度。以人的cDNA文库为模板进行序列扩增反应。该实验使用TOYOBO公司的KOD-Plus高保真PCR酶来保证实验的成功率。
反应条件：
| 试剂 | 用量(μl) |
| 引物F | 1.5 |
| 引物R | 1.5 |
| 10X缓冲液 | 5 |
| 2mMdNTPs | 5 |
| 25mM MgSO<sub>4</sub> | 3 |
| 模板 | 1 |
| KOD酶 | 1 |
| 双蒸水 | 定容至50 |
反应程序：
c、1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR是否有目的条带出现，如阳性则进行下列实验。
d、PCR产物回收(Transgene)
a)取50μl PCR产物，加五倍体积的溶液BB，混合后加入到吸附柱中，静置1min可以提高回收效率。1000g，1min离心，除去滤出液。
b)然后加入650μl WB，1000g，1min离心，除去滤出液。
c)再次离心1000g，1min，去除吸附柱中残留的WB。
d)吸附柱置于干净的离心管中，在吸附柱中央加入20μl ddH2O(提前预热到65℃可以提高回收产率)。静置1min。
e)1000g，1min离心，洗脱DNA用于下步实验或于-20摄氏度保存。
e、双酶切体系酶切载体和PCR产物
| 试剂 | 用量 |
| 载体或PCR产物 | 2μg或40μl |
| 内切酶1 | 1μl |
| 内切酶2 | 1μl |
| 10X缓冲液 | 2μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 定容至50μl |
4℃酶切过夜或(37℃酶切1h)。
f、琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块。
g、凝胶回收(Axygen)
a)计算凝胶的体积，100mg＝100μl；
b)加入3倍体积的缓冲液DEA，75℃溶解凝胶(红色)；
c)加入0.5倍DEA体积的DEB，上下颠倒混匀(黄色)；
d)12000g 1min离心，除去滤出液；
e)加入500μl缓冲液W1，12000g 1min离心，除去滤出液；
f)加入700μl缓冲液W2，12000g 30s离心，除去滤出液；
g)加入700μl缓冲液W2，12000g 1min离心，除去滤出液；
h)12000g，1min再次离心去除残留的滤液；
i)换新离心管，加入25μl ddH2O，静置1min；
j)12000g，1min离心，收集上清液，并测定浓度。
h、使用T4连接酶将目的片段和酶切好的载体连接成重组质粒。
连接体系：
| 试剂 | 用量 |
| 目的片段 | 6μl |
| 载体 | 1μl |
| T4缓冲液 | 2μl |
| T4连接酶 | 1μl |
在室温下连接1h。
i、转化
a)取连接产物加入到感受态细胞中，冰上孵育30min；
b)42℃热激90s；
c)冰上放置2-3min，加入无抗性的LB 800l，37℃培养50min；
d)将菌液取出5000rpm离心3min，去上清至200 l，重悬菌液；
e)在超净台内，涂有抗性的LB板；
f)倒置，37℃培养过夜。
j、挑选单克隆到4-5ml含有抗性的LB培养基中，37℃，250rpm摇菌过夜。
k、吸取少量的过夜培养的菌液保存于40％甘油溶液中(1:1)，并于-80℃储存菌液。
l、小抽(Axygen)
a)过夜培养的菌液12000rpm，1min离心，去上清；
b)加入250μl缓冲液S1重悬菌体沉淀。不能留有菌块；
c)加入250μl缓冲液S2，温和并充分的上下颠倒4-6次，混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min；
d)加入350μl缓冲液S3，温和的上下颠倒6-8次，12000g，10min离心；
e)吸取d)步骤中的上清并转移到制备管中(事先置于2ml离心管内)，12000g，1min离心，弃滤液；
f)将制备管放回离心管内，加入500μl缓冲液W1，12000g，1min离心，弃滤液；
g)将制备管放回离心管内，加入700μl缓冲液W2，12000g，1min离心，弃滤液；
h)将制备管放回离心管内，加入700μl缓冲液W2，12000g，1min离心，弃滤液；
i)将制备管重新放回2ml离心管内，再次离心12000g，1min；
j)将制备管移入新的1.5ml离心管内，在制备管中央滴入50μl ddH2O，室温静置1min，12000g，离心1min；
k)测定质粒浓度，双酶切鉴定是否有阳性的目的条带；
l)将条带阳性的质粒送测序，获得目的质粒。
4.2、敲除质粒构建
a、本实验使用Clontech的RNAi Designer工具设计shRNA。首先，用RNAi TargetSequence Selector选择需要敲除的目标序列。然后再使用shRNA sequence Designer根据选定的目标序列设计相应的shRNA序列。在设计序列的时候，应该在shRNA序列的两端加上限制性内切酶酶切位点。将设计好的序列送至博尚公司合成。
b、shRNA退火
合成的shRNA为两条互补的单链，需要经过退火形成为一条两端带有粘性末端的双链DNA。
退火反应体系(碧云天)
| 试剂 | 用量 |
| Top strand | 10μl |
| Bottom strand | 10μl |
| 5X退火缓冲液 | 10μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 定容至50μl |
退火的反应程序：
95℃
-0.1℃/8s；700个循环
4℃保存
c、接下来的酶切，连接，转化，挑克隆，鉴定，摇菌，小抽实验同上。
4.3、脂质体转染
a、提前铺板的细胞长到70％左右，可以进行细胞转染。
b、按照转染的铺板规格选取不同量的转染试剂Lipo 2000。一般按1μg DNA：2.5μlLipo 2000进行转染。转染前，先将Lipo 2000用不含血清的培养基稀释，同体积稀释DNA，静置5min后混匀。
c、将上述混合液静置20min。
d、将混合液沿着培养板壁加入到需要转染的细胞中，轻轻混匀培养基。
e、放入培养箱培养4-6h后，将培养液换成新鲜的培养基继续培养。
f、收样进行实验。
4.4、RNA的抽提
a、去除培养板中的培养基，并用预冷的1X PBS洗一遍细胞，以除去残留的培养基，去上清。
b、每个样品中加入1ml TRIzol试剂，并充分吹打细胞，直至细胞完全裂解。此时，样品可以置于-80摄氏度保存。
c、每个样品中加入0.2ml氯仿，剧烈votex 30s，室温孵育3min。
d、4℃离心，12000rpm，15min。
e、吸取上层的无色水相溶液，体积约为50％的TRIzol，尽量少吸取些，以免吸取到杂质，影响抽提的质量。
f、在吸取的上层无色液体中加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温孵育10min。
g、4℃离心，12000rpm，10min，并去除上清。
i、加入75％乙醇(DEPC水配置)，剧烈votex。
j、4℃离心，7500g，5min，去上清。
k、室温晾干管中残留的乙醇，并溶于一定体积的DEPC水中。
l、测定RNA的浓度。
4.5、RNA反转录
a、测定RNA的浓度，计算出相应的体积。
b、反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 5X Master mix | 10μl |
| 总RNA | 1μg对应体积 |
| DEPC H<sub>2</sub>O | 定容至20μl |
反应条件：
37℃ 15min
85℃ 5s
4℃ 备用
反转录的cDNA稀释四倍(加入三倍体积的水)可以用于Realtime PCR或冻存于-20℃。
4.6、实时定量PCR(Realtime PCR)
Realtime PCR采用ABI 7500 fast进行，为96孔板PCR仪
| 试剂 | 用量 |
| SYBR mix | 10μl |
| 正向引物(F) | 0.4μl |
| 反向引物(R) | 0.4μl |
| Dye Ⅱ | 0.4μl |
| 模板(cDNA) | 4μl |
| ddH2O | 4.8μl |
| 总体积 | 20μl |
反应程序(两步法)：
RT PCR引物：
| 名称 | 序列 |
| hsa-actin F | CTGGAACGGTGAAGGTGACA(SEQ ID NO:3) |
| hsa-actin R | AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA(SEQ ID NO:4) |
| Has-relb F | TTGGTGAGGATCTGCTTCCAG(SEQ ID NO:5) |
| Has-relb R | TCGGCAAATCCGCAGCTCTGAT(SEQ ID NO:6) |
| Has-c-myc F | CACACATCAGCACAACTACGCA(SEQ ID NO:7) |
| Has-c-myc R | TTGACCCTCTTGGCAGCAG(SEQ ID NO:8) |
| hsa-tnfa F | CCCAGGGACCTCTCTCTAATCA(SEQ ID NO:9) |
4.7、抽提蛋白
loading法抽提蛋白：
a、待收样细胞用预冷PBS洗两次，洗净上清；
b、事先将5X上样缓冲液稀释成1X；
c、每个样品中加入适量的上样裂解液；
d、用枪头刮取培养板中的细胞，同一方向画圈，保证所有的细胞被刮下；
e、吸取胶状的蛋白至1.5ml离心管内，100℃煮10min；
RIPA法抽提蛋白：
a、待收样细胞用预冷PBS洗两次，吸净上清；
b、在RIPA裂解液中事前加入蛋白酶抑制剂，每个样品中加入适量的RIPA裂解液，放于冰上30min，每隔10min混匀裂解液；
c、吸取裂解液至离心管内，13000rpm，4℃离心15min；
d、吸取上清即为蛋白裂解液，该裂解液可以用BCA法测定蛋白浓度。
4.8、BCA法测定蛋白浓度
a、标准样品的制备，按下表将BSA(2000μg/ml)储存液稀释
| 标准品 | 稀释液体积(PBS) | 原液体积 | 终浓度(μg/ml) |
| A | 0 | 300μl储存液 | 2000 |
| B | 125μl | 375μl储存液 | 1500 |
| C | 325μl | 325μl储存液 | 1000 |
| D | 175μl | 175μl标准液B | 750 |
| E | 325μl | 325μl标准液C | 500 |
| F | 325μl | 325μl标准液E | 250 |
| G | 325μl | 325μl标准液F | 125 |
| H | 400μl | 100μl标准液G | 25 |
| I | 400μl | 0 | 0 |
b、配制工作试剂：BCA试剂A：BCA试剂B＝50:1；
c、每个样品10μl加入200μl工作试剂，混合液加入到可拆卸96孔板中；
d、37摄氏度孵育30min；
e、取出，在酶标仪上测定吸光度，562nm；
f、利用吸光值和标准浓度得到标准曲线，根据标准曲线计算每个样品蛋白的浓度；
g、WB时，加入相同浓度的蛋白样品(样品用5X上样缓冲液稀释)。
4.9、免疫印迹实验(Western Blot)
a、上样：在预先配置好的10％SDS-PAGE胶中，每个孔加入20-30μg的蛋白样品；
b、电泳：先浓缩胶恒压80V跑40min，在用120V恒压跑60min；
c、转膜：PVDF膜需要先用甲醇激活2min，然后放入转膜液中，采用夹心法湿转，按照一定顺序摆好膜和胶的位置，放入转膜槽内，连接正确的电极，在冰浴条件下转膜，100V，50min；
d、封闭：转膜结束后，取出PVDF膜浸没在封闭液中，摇床上封闭1h；
e、剪膜，根据所杂蛋白条带的大小将PVDF膜剪成合适的大小；
f、孵育一抗：按照合适的比例稀释抗体，加入到对应的PVDF膜容器内，垂直摇床上4摄氏度过夜；
g、孵育二抗：一抗回收以后，膜在PBST溶液中洗三次，每次5min，置于水平摇床；
h、然后加入HRP标记的合适的二抗，室温孵育1h，垂直摇床上；
i、移除二抗，在PBST溶液中再次洗三次，每次5min，水平摇床上；
j、显影：利用压片或是生物发光成像仪上扫膜成像，得到结果。
4.10、双萤光素酶报告基因实验
a、按照转染的方法，细胞预先转染报告基因质粒和内参质粒以及相应的其他质粒；
b、收样细胞用PBS洗两次，加入预先稀释的1X细胞裂解液(试剂盒中包含有)，室温剧烈震荡20min；
c、吸取细胞裂解液，离心12000rpm，5min；
d、吸取上清液50μl于黑色的96孔酶标板；
e、在裂解细胞的过程中，取出预先配置好的萤光素酶试剂常温避光融解，STOP溶液需要将50X的STOP底物加入到STOP缓冲液中配制而成；
f、使用多功能酶标仪，选择自发光，在酶标板的样品中迅速加入LARII 30μl，450nm读数，报告基因的活性值；
g、读数结束后，迅速加入STOP溶液30μl，再次读数，内参值；
h、报告基因的相对数值为两者的比值。
4.11、细胞活力检测实验
a、96孔培养板中铺上适量的细胞1000-5000，加入各种处理，培养基为200μl；
b、在实验的时间点上分别在每个孔中加入WST-1(碧云天)10μl，轻轻摇晃混匀，继续在培养箱中培养1-4h，观察培养基颜色的变化；
c、在适当的时间点在多功能读板机上测定培养基的吸光值OD450nm；
d、根据不同的数值比较细胞的活力，活力越好，吸光值越大。
4.12、提取核蛋白
配制核蛋白提取液
在使用缓冲液前需加入
Na3VO4 至终浓度1mM
β-甘油磷酸盐 至终浓度10mM
DTT 至终浓度1mM
蛋白酶抑制剂
细胞核质分离：
a、将细胞消化成单细胞，收集在1.5ml离心管内；
b、预冷的PBS洗细胞两次；
c、去除PBS后，再用500μl缓冲液A重悬细胞；
d、冰上放置15min；
e、加入50μl 10％Triton(终浓度为1％)，剧烈涡流振荡10s；
f、4℃，3000rpm，离心3min；
g、上清即为胞质蛋白；
h、沉淀中再次加入适量的缓冲液A，重悬离心一次，洗净胞质蛋白，弃上清；
i、在沉淀中加入50μl的缓冲液C，用移液枪吹散细胞，冰上放置15min；
j、在最大转速下4℃离心3min；
k、上清即为核质蛋白。
4.13、EMSA(凝胶迁移实验)
a、配制4％聚丙烯酰胺凝胶
| TBE缓冲液(10X) | 1ml |
| 重蒸水 | 16.2ml |
| 39:1丙烯酰胺/双丙烯酰胺(40％,w/v) | 2ml |
| 80％甘油 | 625μl |
| 10％过硫酸铵 | 150μl |
| TEMED | 10μl |
b、混匀后倒入制胶模具中(可用常规蛋白胶制备模具)
c、EMSA结合反应
a)样品反应体系
| 无核酸酶的水 | 5μl |
| EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) | 2μl |
| 细胞核蛋白或纯化的转录因子 | 2μl |
| 标记好的探针 | 1μl |
| 总体积 | 10μl |
b)按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
c)加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可。
d、电泳：
a)用0.5X TBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
b)把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10μl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
c)按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
e、转膜：
a)取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5X TBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
b)取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5X TBE浸湿。
c)把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
d)非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。
e)再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。
f)采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10X8X0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。
g)转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。
f、交联：
a)用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索
b)交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连无探针的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。
g、化学发光法检测生物素标记的探针：
a)37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。
b)取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
c)取7.5μl链霉亲和素-HRP偶联物加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。
d)去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有链霉亲和素-HRP偶联物的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
e)取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。
f)将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
g)去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
h)重复步骤G三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。
i)将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
j)取5ml BeyoECL Star A液和5ml BeyoECL Star B液混匀，配制成BeyoECL Star工作液。注意：BeyoECL Star工作液必须现配现用。
k)取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
l)在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Star工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。
m)取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。
n)用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
4.14、Pulldown实验
a、10cm培养皿的HCT116细胞中分别加入生物素和RS47-生物素1μM处理24h；
b、消化细胞，收集细胞悬液，并用预冷PBS洗两遍；
c、加入1mlRIPA(预先加入蛋白酶抑制剂PMSF和PI)裂解细胞，冰上放置10min；
d、细胞裂解液12000g，4℃离心10min，留上清；
e、加入生物素和RS47-生物素室温孵育2h；
f、加入40μl链霉亲和素琼脂糖珠，轻轻混匀，室温孵育1.5h，期间不时轻轻混匀；
g、500g，1min离心，弃上清；
h、用RIPA裂解液洗4遍；
i、加入20μl的loading裂解蛋白，100摄氏度煮10min；
j、离心，上面的液体就可以进行WB实验。
4.15、流式分析细胞凋亡
a、细胞样品用PBS洗两遍；
b、用预冷的1X结合缓冲液重悬细胞，每个样品80μl；
c、每个样品中加入5μl Annexin V抗体，4℃避光孵育30min；
d、PBS洗一遍细胞；
e、上流式细胞仪前加入预先配置好的7AAD染液(每个样5μl 7AAD，80μl结合缓冲液)，避光处理10min；
f、PBS洗一遍，每个空中加入300μl结合缓冲液，流式检测。
4.16、流式检测细胞周期
a、收集细胞前在细胞培养液中加入BrdU 50min，终浓度为3.3nM；
b、将培养基和消化的细胞一同收集到15ml离心管内，300g，3min；
c、用含有2％FBS的PBS洗一遍；
d、用1ml PBS重悬细胞；
e、边涡流振荡边缓慢逐滴滴入3ml预冷的乙醇。室温孵育20min；
f、离心，并用PBS洗一遍，弹散细胞沉淀；
g、用1ml变性溶液(2M HCl，现配现用)重悬细胞，混匀，室温孵育20min；
h、离心，PBS洗一遍；
i、用1ml 0.1M Na2B4O7，pH 8.5重悬细胞，用以中和残余的H+，室温2min；
j、离心，并用PBS洗一遍(此时可以转入1.5ml离心管内)；
k、加入100 l PBS+20 l BrdU抗体，室温避光孵育20min；
l、加入1ml PBS洗一遍；
m、弃上清，加入20 l 7AAD原液染10min；
n、加1ml PBS洗一遍；
o、每个样品加入500 l PBS上流式仪测流式。
4.17、免疫荧光染色
a、预先将玻片置于75％乙醇中浸泡半小时以上，再用无菌PBS清洗玻片，然后将玻片放置在12孔培养板中；
b、在培养板中铺上适当数量的细胞，培养一段时间，待细胞数长到50％左右取出玻片；
c、用PBS洗两遍玻片；
d、用4％甲醛溶液固定细胞，室温固定10min；
e、PBS洗3次，每次10min；
f、将玻片放在陶瓷或玻璃容器内，不可为塑料。在通风厨中，加入-20℃预冷的丙酮进行脱水固定5min；
g、取出玻片，PBS洗3次，每次10min；
h、将玻片细胞的一面向上放在载玻片上，并放在有适当水的湿盒内；
i、将配置好的抗体或细胞核燃料滴在玻片上，完全覆盖需要染色的实验区域。常温避光孵育30min；
j、用PBS洗3次，每次10min；
k、吸净玻片上的液体，滴加封片剂封片在载玻片上；
l、荧光显微镜下观察拍片。
4.18、克隆形成实验
a、指数生长期细胞铺1000-3000个于六孔板中；
b、细胞正常培养1周以上，直到可以看到明显的细胞克隆出现；
c、在培养皿中，预冷PBS洗一遍；
d、4％PFA室温固定20min；
e、吸取固定液，PBS洗一遍；
f、加入结晶紫染色液，室温20min；
g、吸取结晶紫染液，并用PBS洗，直到背景无明显颜色；
h、待自然风干后，与扫描仪下扫描图片，统计克隆形成数。
4.19、肿瘤细胞皮下成瘤实验
a、提前一周购买适当数量的4周龄的雄性裸鼠到动物房；
b、待肿瘤细胞系长到指数生长期，细胞状态良好，消化成单细胞悬液；
c、细胞计数，预冷PBS重悬细胞到1×107/ml的细胞浓度；
d、细胞放在冰上到动物房，每只裸鼠背部皮下注射200l的细胞悬液，即细胞总数为2×106；
e、在肿瘤生长期间，定时定量腹腔注射小分子药物
h、3周左右，处死小鼠，测量肿瘤的体积质量
i、并且选取肿瘤的非坏死部位，一部分用福尔马林固定，一部分OCT包埋放于-80℃，一部分用于收集蛋白，一部分用于收集RNA。
4.20、统计分析
数据取重复三次以上的平均值表示，两组间的实验差异采用双尾student’T检验。统计结果认为p<0.05为显著差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
二、实验结果
1、建立靶向RelB蛋白的小分子药物筛选系统
非经典NF-κB通路的异常激活会导致很多疾病，如癌症，骨相关疾病以及自身免疫病。
但在肿瘤细胞系中，还没有发现一个特异性的受非经典NF-κB通路调控的靶基因。本发明人发现，在结肠癌细胞系HCT116中，利用shRNA技术敲低HCT116细胞中的RelB的表达，在RNA水平和蛋白水平上发现c-Myc的表达量都显著的降低了(图2，a、b)。说明在HCT116细胞系中，RelB可以调控c-Myc的表达，至少敲低RelB可以下调c-Myc的表达。在双萤光素酶报告基因检测实验中，敲低RelB会显著降低c-Myc报告基因的活性(图2，c)。说明RelB不仅能调控c-Myc的表达水平，还能在一定程度上影响c-Myc的功能。上述实验在不同层面证明了在结肠癌细胞系中，当敲低RelB，会显著下调c-Myc的表达。而c-Myc作为一个重要的致癌基因，在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，因此，可以将c-Myc作为一个筛选小分子药物的靶基因。另外，在MTT检测细胞活性的实验中，我们发现在结肠癌细胞系HCT116中敲低RelB，细胞的活性在48h，相对于对照组出现明显的降低。在72h和96h，实验组的细胞活性相对于对照组差距更加明显(图2，d)。该实验说明非经典通路NF-κB通路能影响结肠癌细胞系HCT116的体外活性。
在结肠癌细胞系HCT116中，敲低RelB，会在RNA水平和蛋白水平下调c-Myc的表达，并降低c-Myc报告基因的活性。另外，在HCT116细胞中敲低RelB会显著降低细胞的活性。因此，可以将c-Myc作为一个非经典NF-κB通路下游的一个靶基因来初步筛选靶向RelB蛋白小分子药物。
2、设计和筛选靶向RelB蛋白的小分子药物
根据RelB/p52蛋白与靶DNA结合的结构模拟图(图3)，在计算机上从小分子库中初步筛选出86个小分子药物，而后又根据初步反馈的结果，根据筛选出的小分子药物的结构又进一步在小分子库中利用计算机筛选出65个小分子药物。
这些小分子在计算机的模拟图中，显示具有某些结构能和RelB蛋白结合，嵌在其与靶DNA结合的位点，从而阻止RelB蛋白与DNA结合，抑制其转录功能，从而抑制非经典NF-κB通路。尤其是，某些类别的化合物能与RelB的氨基酸残基(包括Arg119和Arg125，或Arg117、Ile205和Ala127)形成氢键，从而能阻止RelB蛋白与其靶DNA的结合。
双萤光素酶报告基因实验显示在10μM浓度下，不同的小分子药物对c-Myc报告基因的抑制作用不尽相同RS09(图4，a)。为了进一步验证这些小分子是否能抑制c-Myc的表达，在HCT116细胞系中加入10μM不同的小分子药物48h，检测细胞中c-Myc蛋白的表达量(图4，b)。结果显示，小分子药物RY06，RS07，RS09，RS47，RS51相对于对照组能明显的抑制c-Myc蛋白的表达；而RS10，RS40，RS44在蛋白水平上对c-Myc基本没有影响。部分化合物的结构如下所示：
为了进一步验证这些小分子药物能否抑制肿瘤细胞(结肠癌细胞系等)的生长，进行了测定细胞活性的实验(图5，a)。结肠癌细胞系HCT116培养基中加入不同浓度的小分子药物处理48h，检测细胞活性发现：在10μM浓度下，RS51、RS07、RS09、RS10和RS47能明显抑制HCT116细胞的活性。在2μM浓度下，RS09和RS47对HCT116的活性有明显的抑制作用。在1μM浓度下，RS09和RS47依然对细胞活性有着明显的影响；甚至在400nM的情况下，依然对细胞的活性有一定的影响。从图5(b)可以看到，在低浓度(小于1μM)下，RS09和RS47处理的实验组中HCT116细胞的活性有一个明显的下降过程。
为了更清楚的了解RS09和RS47对结肠癌细胞系HCT116细胞活性的抑制作用的有效浓度，采用细胞活性测定实验来测定它们的IC50。从实验结果(图5，c)中可以看到，处理HCT116细胞48h，RS09的IC50为0.58μM，而RS47的IC50为1.28μM。基于以上实验，我们将目光锁定在RS09和RS47这两个小分子药物上。
本发明人在其他的结肠癌细胞系RKO和231中进行相同的实验，结果发现，RS09和RS47对这两种细胞系也有明显的抑制效果(图6，a)。而对于正常的结肠上皮细胞CRL-1459效果就远没有结肠癌细胞系那么明显(图6，b)。可能的原因是正常上皮细胞系中，非经典NF-κB通路未被异常激活，而结肠癌细胞戏中，非经典NF-κB通路被异常激活，因此对于RS09和RS47更加敏感。
本发明人还分别选取了肝癌细胞系SK-Hcp-1、7721和肺癌细胞系A549、NIH460来进行实验。结果显示在对HCT116有明显抑制效果的浓度1μM作用下，不管是肝癌细胞系还是肺癌细胞系对这两个小分子药物都不敏感(图6，c、d)。说明小分子药物对于不同的肿瘤的抑制作用存在选择性，这可能和肿瘤细胞系中非经典NF-κB通路的激活情况相关，也可能存在一些其他未知的信号通路影响细胞的活性，不受小分子药物的抑制。
3、RS09和RS47靶向RelB蛋白来阻止RelB和靶DNA结合
通过一系列实验可证明RS09和RS47通过与RelB结合来阻止RelB/p52二聚体和靶DNA结合，从而抑制细胞活性。
首先，在双萤光素酶报告基因实验中发现，过表达RelB能显著的提高NF-κB报告基因的的活性，而加入RS09或RS47的实验组相对于对照组，NF-κB报告基因的活性被明显抑制(图7，a)。这说明RS09和RS47确实能抑制由RelB激活的NF-κB通路的活性。
在Bcl-3萤光素酶报告基因实验中发现，过表达RelB能显著上调该报告基因的活性，而在RS09或RS47存在的情况下，其活性明显被抑制，随着小分子药物浓度的增加，抑制作用更加明显(图7，b)。这个实验在一定程度上证明了小分子药物是通过靶向RelB分子而不是RelA分子来发挥抑制作用的。
在凝胶迁移实验(EMSA)中，我们发现NF-κB探针(DNA)能和某些蛋白(包括RelB蛋白)结合出现迁移条带，在加入RelB抗体的实验组中，由于抗体和RelB蛋白的结合会出现一个超迁移条带，说明RelB蛋白可以和NF-κB探针(DNA)结合。在有RelB抗体存在的实验组中加入小分子药物，我们可以看到超迁移条带相对于对照组明显的减弱(图7，c)。这个实验说明RS09和RS47确实能抑制RelB蛋白与其靶DNA的结合。
在pulldown实验中，我们将连接有生物素的RS09或RS47和蛋白共同孵育，然后用珠拉下蛋白，检测有哪些蛋白能和小分子药物结合。实验结果显示，在有RS09或RS47的实验组中，能看到一条明显的条带，说明RS09和RS47确实可以和RelB蛋白结合(图7，d)。
不管是萤光素酶报告基因实验，还是EMSA和Pulldown实验都从正面证明了RS09和RS47能和RelB蛋白结合，阻止其与靶DNA结合来行使抑制功能。。进一步地，我们用G28-5(CD40激动剂)处理淋巴瘤细胞系BJAB 0.5h，此时能激活经典NF-κB通路，而不会激活非经典NF-κB通路。因为相对于经典通路能快速激活，非经典通路激活需要的反应时间更长。我们通过检测TNFα(经典NF-κB通路下游靶基因)RNA来表征经典通路是否被激活。从实验结果可以看到，G28-5能显著的激活非经典通路，TNFα的表达水平显著提高，而加入NF-κB经典通路抑制剂BAY，可以看到TNFα的表达量显著降低，然而RS09和RS47却对TNFα的表达完全没有影响(图7，e)。该实验证明小分子药物对经典通路不起作用，并证明RS09和RS47是通过RelB而不是RelA来发挥作用。
在B细胞中，BAFF能激活非经典NF-κB通路，而几乎对NF-κB经典通路几乎没有影响。因此，这可以作为一个很好的实验系统来验证RS09和RS47对非经典通路的抑制作用。在小鼠原代B细胞中，pim2作为非经典NF-κB通路下游的一个靶基因，在BAFF刺激24h后，RNA表达量会显著增加，而加入RS09或RS47后，可以明显的抑制pim2基因的RNA表达水平(图8，a)。人来源的B淋巴瘤细胞(PDX)，用BAFF的刺激48h，同时加入RS09或RS47处理相同的时间。利用流式细胞技术检测B淋巴瘤细胞的存活。我们发现，加入BAFF刺激其存活会显著提高，而RS09或RS47能显著的抑制其存活(图8，b)。人来源的B淋巴瘤细胞相对于永生化的B淋巴瘤细胞系能更好的反应人体内淋巴瘤细胞的状态，是更优化的实验系统。在小鼠原代B细胞中，我们也可以观察到，当加入BAFF刺激，B细胞的存活率显著升高，而加入RS09或RS47能明显的抑制B细胞的存活(图8，c)。
最后，在免疫荧光共定位实验中，我们可以看到在HCT116细胞系中，RS47和RelB蛋白在细胞水平上存在共定位的状况。在静息状态的HCT116细胞中，它们主要存在于细胞质中。这也从侧面证明了，小分子药物能和RelB蛋白结合(图9)。
4、RS47抑制结肠癌细胞系HCT116增殖并促进其凋亡
在BrdU细胞掺入实验中，我们在细胞培养基中加入RS47，最后通过流式细胞技术测定细胞周期。实验结果显示(图10，a、b)，相对于对照组，1μM RS47实验组的细胞S期的比例显著降低，从13.83％降到5.18％。相应的G0/G1期和G2/M期的细胞相对增加。说明RS47在1μM的浓度下会明显的抑制细胞的细胞周期，阻止细胞进入S期。而对于2μM的实验组，我们可以看到，在流式图的左下角明显出现了一群细胞，这群细胞为死细胞。
在细胞凋亡实验中，我们发现低浓度(0.5μM和1μM)情况下，基本不会诱导细胞凋亡。而当RS47的浓度增加到2μM时，培养72h会出现明显的细胞凋亡(图10，c)。从统计图中也可以看出，2μM浓度下的活细胞比例出现显著的降低，而不管是早期凋亡还是晚期凋亡的细胞比例都出现显著的上升(图10，d)。细胞周期实验和细胞凋亡实验说明，小分子药物在不同浓度下行使不同的生物学功能。在相对低浓度下，它主要通过影响细胞周期来调控HCT116，而在相对高浓度下，它主要听过诱导细胞凋亡来行使功能。
在克隆形成实验中，即使在0.5μM浓度下，HCT116的克隆形成出现显著的降低，不管是克隆形成的数量和克隆的大小(图10，e)。而在1μM浓度下，几乎没有克隆形成出现。说明在长时程(7d)作用下，RS47即使以相对低的浓度(0.5μM)也能发挥很好的抑制作用。说明小分子药物抑制肿瘤细胞生长是一个浓度依赖和时间依赖的过程。
5、RS47抑制结肠癌细胞系SW620增殖并促进其凋亡
在另一个结肠癌细胞系SW620上来验证RS47的抑制作用。和HCT116细胞类似，在SW620细胞系中，我们也发现，RS47能抑制细胞进入S期，并有一个浓度依赖的关系，随着浓度的增加，进入S期的细胞比例越低(图11，a、b)。在高浓度(2μM)条件下，RS47也能诱导细胞大量凋亡(图11，c、d)。在克隆形成实验中，小分子药物同样能抑制SW620细胞的克隆形成(图11，e)。
以上实验说明小分子药物对多种结肠癌细胞系有抑制作用。
6、RS47促进B淋巴瘤细胞凋亡
在B淋巴瘤细胞细胞系BJAB中，我们发现RS47对该细胞具有显著的诱导凋亡作用，随着浓度的增加，早期凋亡和晚期凋亡的细胞数都出现明显的增加(图12，a、b)。为了更好的模拟B淋巴瘤患者体内淋巴瘤细胞的状态，我们选取了一个更加优化的模型(人来源的淋巴瘤细胞)。在人来源骨髓瘤细胞和骨髓源基质细胞(BMSC)共同培养体系中，加入RS47，观察RS47是否对人来源骨髓瘤细胞有作用。BMSC细胞和人来源骨髓瘤细胞共培养，可以促进人来源骨髓瘤细胞的存活。我们发现，对于单独培养的人来源淋巴瘤细胞，RS47能促进该细胞的凋亡。在共培养的体系中，骨髓瘤细胞的存活明显增加。而加入RS47以后，相对于对照组，实验组的骨髓瘤细胞存活比例明显下降。并且随着RS47浓度的增加，骨髓瘤细胞的存活比例下降的更加明显(图12，c)。令人欣喜的是，我们发现RS47几乎对BMSC细胞的存活没有影响(图12，d)。也即是在该系统中，RS47对于淋巴瘤细胞有明显的促凋亡作用，而对于基质细胞几乎没有影响。说明RS47对于细胞的凋亡作用有一个选择性。
7、RS09抑制HCT116细胞体内成瘤
我们用HCT116细胞系进行裸鼠皮下成瘤实验，从实验结果可以看出，实验组的小鼠肿瘤大小和质量，明显小于对照组小鼠(图13，a、b)。
我们选取了肿瘤样本，提取RNA和蛋白，检测了c-Myc的表达。实验结果显示，不管是RNA水平还是蛋白水平，RS09都能抑制c-Myc的表达(图13，c、d)。也即证明了在小鼠体内成瘤过程中，RS09也能通过抑制NF-κB非经典通路来抑制肿瘤细胞的生长。
三、讨论
近年来研究表明非经典NF-κB通路也调控着非常重要的生物学过程，比如淋巴系统的发育、T细胞的阴性选择、B细胞存活和成熟、以及骨代谢。非经典NF-κB通路的激活异常会引起很多免疫性疾病和骨代谢性疾病。此外，越来越多的研究显示非经典NF-κB通路在越来越多的肿瘤发生发展中扮演着重要的角色。一些肿瘤细胞系中非经典NF-κB信号会持续性激活，一方面由于肿瘤细胞通过自分泌方式产生激活非经典NF-κB信号的细胞因子，如淋巴毒素(LT)；另一方面，肿瘤细胞中存在一些未知机制(如重要调控基因突变等)维持非经典NF-κB信号的组成性激活。阻断非经典NF-κB信号能有效的抑制肿瘤细胞生长，更能通过抑制趋化因子的产生，阻止炎症细胞和肿瘤基质细胞在肿瘤微环境中聚集，从而抑制肿瘤血管发育和形成，抑制肿瘤的生长。
本发明人找到了能与RelB蛋白结合的小分子化合物，阻止其与靶DNA结合，从而抑制其转录功能。本发明的研究显示，本发明的小分子药物不能抑制经典通路，但能抑制非经典通路的激活。在体外实验系统中，本发明的小分子药物在低浓度下能抑制结肠癌细胞系HCT116和SW620的细胞周期，在高浓度下会诱导细胞的大量凋亡，说明本发明的小分子药物能调控细胞的增殖和凋亡。另外小分子药物还能诱导B淋巴瘤细胞的凋亡，而对于共培养的基质细胞却几乎没有影响。在裸鼠皮下成瘤实验中，本发明发现，本发明的小分子药物也能抑制结肠癌细胞系HCT116的成瘤。
在用不同细胞系测定小分子药物对细胞活性影响的实验中，本发明的小分子药物对结肠癌细胞系HCT116、RKO和231的抑制效果比较明显，而对于正常的肠上皮细胞CRL1459的抑制效果不明显。
此外，本发明人首先发现在结肠癌细胞系敲低RelB的表达能显著的抑制促癌基因c-Myc的表达。可以此为基础建立小分子药物的筛选系统。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
中国科学院上海药物研究所
<120> 非经典NF-kB通路的小分子抑制剂及其应用
<130> 178300
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggcgatagc atgcttcggt ctgggccagc ctc 33
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacgcgtct acgtggcttc aggccccggg g 31
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggaacggt gaaggtgaca 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagggacttc ctgtaacaat gca 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttggtgagga tctgcttcca g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcggcaaatc cgcagctctg at 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacacatcag cacaactacg ca 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgaccctct tggcagcag 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccagggacc tctctctaat ca 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agctgcccct cagcttgag 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
attgccttca cccaccttc 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
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gccatcaaag taatctcccg 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atctacgagg gctatgctct cc 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctttgatgtc acgcacgatt tcc 23
Claims (10)
1.能抑制或阻止RelB蛋白与其靶DNA结合的试剂或能抑制RelB蛋白的转录功能的试剂在制备治疗或预防受益于RelB蛋白与其靶DNA的结合受阻而使得非经典NF-κB通路被抑制的疾病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为核酸分子或蛋白质；
优选地，所述核酸分子为用以从基因组中敲除RelB的基因序列、从而使得感兴趣的细胞不表达RelB蛋白，或在RelB基因序列中引入突变、从而使得所表达的RelB蛋白与其靶DNA无结合活性或结合活性减弱的打靶载体；能抑制RelB表达的siRNA；或RelB基因的RNA干扰载体；
所述蛋白质为RelB的特异性抗体。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物：
式中，
A1、A2和A3各自独立选自CR1或N；
D选自CR2、O、S或NR3；
E和F各自独立选自C(R4)2或NR5；
L为连接基团；
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基；
R1和R2各自独立选自H、C1-C6烷基、卤素、C1-C3烷硫基或OH；
R3选自H或C1-C6烷基；
R4和R5各自独立选自H、C1-C6烷基、卤素或羟基，或R4、R5与它们所连接的环原子一起形成除E和F外还任选含有1、2或3个选自O、S和N的杂原子的5～8元饱和或不饱和环。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式I化合物具有下式II结构：
式中，
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基；
L为-NH-N＝C(R7)-或-NH-NH-C(R8)-NH-C(R8)-，其中，R7为H或C1-C3烷基；各R8独立为S和O；
优选地，所述式I化合物具有下式III所示结构：
式中，
R6选自H或C1-C6烷基；
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，Ar为任选地被1、2、3或4个选自羟基、C1-C6烷基和卤素的取代基取代的C6-C14芳基；
优选地，Ar上至少具有一个羟基取代基；更优选地，该羟基取代基位于邻位；
优选地，所述化合物为：
6.如权利要求1－5所述的应用，其特征在于，所述疾病为因非经典NF-kB通路被过度激活而导致的疾病，选自癌症、自身免疫疾病、炎症性疾病和骨相关疾病；
优选地，所述癌症为实体瘤和血液肿瘤，选自：肝癌、黑素瘤、霍奇金病、淋巴瘤、急性淋巴白血病、慢性淋巴白血病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸癌、软组织肉瘤、原发性巨球蛋白血症、膀胱癌、慢性粒细胞白血病、原发性脑癌、恶性黑素瘤、小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌性癌症、绒毛膜癌、蕈樣肉芽腫、头颈癌、骨原性肉瘤、胰腺癌、急性粒细胞白血病、毛细胞白血病、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、泌尿生殖系统肿瘤病、甲状腺癌、食管癌、恶性高钙血症、子宫颈增生症、肾细胞癌、子宫内膜癌、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、肾上腺皮质癌、皮肤癌和前列腺癌；
所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、多发性硬化和自身免疫性肝炎；
所述炎症性疾病选自肠炎和类风湿性关节炎；
所述骨相关疾病为骨质疏松。
7.式I所示的化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物：
式中，
A1、A2和A3各自独立选自CR1或N；
D选自CR2、O、S或NR3；
E和F各自独立选自C(R4)2或NR5；
L为连接基团；
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基；
R1和R2各自独立选自H、C1-C6烷基、卤素、C1-C3烷硫基或OH；
R3选自H或C1-C6烷基；
R4和R5各自独立选自H、C1-C6烷基、卤素或羟基，或R4、R5与它们所连接的环原子一起形成除E和F外还任选含有1、2或3个选自O、S和N的杂原子的5～8元饱和或不饱和环。
8.如权利要求7所述的化合物、或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，其特征在于，所述式I化合物具有下式II结构：
式中，
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基；
L为-NH-N＝C(R7)-或-NH-NH-C(R8)-NH-C(R8)-，其中，R7为H或C1-C3烷基；各R8独立为S和O；
优选地，所述式I化合物具有下式III所示结构：
式中，
R6选自H或C1-C6烷基；
Ar选自任选取代的C6-14芳基、任选取代的C3-C8碳环基、任选取代的C3-C10杂环基或任选取代的C5-C10杂芳基。
9.如权利要求7或8所述的化合物、或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，其特征在于，Ar为任选地被1、2、3或4个选自羟基、C1-C6烷基和卤素的取代基取代的C6-C14芳基；
优选地，Ar上至少具有一个羟基取代基；更优选地，该羟基取代基位于邻位。
10.一种经基因工程处理的癌细胞或其细胞培养物，其特征在于，与未经相同的基因工程处理的癌细胞对照相比，所述癌细胞中RelB的表达降低或完全不表达RelB，或表达的RelB蛋白与其靶DNA无结合活性或结合活性降低。
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| CN201711079133.2A CN109745324A (zh) | 2017-11-06 | 2017-11-06 | 非经典NF-kB通路的小分子抑制剂及其应用 |
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| CN113736783A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-12-03 | 西北大学 | 一种抑制Notch和NF-κB信号激活的嵌合诱骗寡核苷酸及其应用 |
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- 2017-11-06 CN CN201711079133.2A patent/CN109745324A/zh active Pending
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