CN103585631A - 利用microRNA海绵技术预防和治疗肿瘤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用microRNA海绵技术预防和治疗肿瘤的方法。具体地，通过调节RelA因子可以调节经典和非经典NF-κB通路的激活，从而调控肿瘤的生长。microRNA“海绵”miR-221/222是一种RelA基因的抑制剂，它可极大地降低结直肠癌细胞的增殖和体内成瘤。miR-221/222与结直肠癌细胞的增殖和体内成瘤成正相关，通过microRNA“海绵”技术抑制结直肠癌中高表达的miR-221/222，可极大地阻断经典和非经典NF-κB通路的激活；RelA因子或其编码序列可以作为抑制肿瘤中的靶点，RelA因子的抑制剂用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

Description

利用microRNA海绵技术预防和治疗肿瘤的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及利用microRNA海绵技术预防和治疗肿瘤的方法。

背景技术

结肠癌(Colorectal cancer)是胃肠道系统(Gastrointestinal system)中常见的恶性肿瘤之一。近些年来结肠癌的发病率在我国呈明显上升趋势，从上世纪70年代的万分之一上升到现在的万分之三，居恶性肿瘤发病率的第四位。

结肠癌的发生非常复杂，其发病原因至今仍不太明确。但是越来越多的证据表明，慢性炎症与肿瘤的发生存在着密切关系。慢性炎症过程中释放的炎症因子及其他的有害复合物能够造成细胞DNA的损伤，从而改变细胞的增殖和生存能力，促进肿瘤的发生。比如：慢性大肠炎(Chronic inflammatory bowel disease)能够极大增加结肠癌的发病几率；溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis)患者的肠癌发生率也高于一般人群。

NF-κB在慢性炎症和肿瘤的发生过程中起着关键的作用。NF-κB作为一种重要的转录因子，对免疫球蛋白(IgG)的kappa轻链的转录进行调控。此后发现：NF-κB在固有免疫和适应性免疫应答、炎症反应、肿瘤发生以及有机体的分化发育等过程中也起到重要作用注。NF-κB家族转录因子主要包含五个成员：p50、p52、p65、c-Rel和RelB，它们分别由NF-κB1、NF-κB2、RelA、c-Rel和RelB基因编码。

NF-κB的活化过程主要有两条通路：经典NF-κB通路(Canonical pathway)和非经典NF-κB通路(Non-canonical pathway)。经典NF-κB通路与肿瘤的关系已经有大量的报道。它涉及肿瘤发生发展的各个方面，与肿瘤细胞的增殖与凋亡、肿瘤血管形成和肿瘤的转移等都密切相关，经典NF-κB通路的作用在各种类型的肿瘤中得到体现，如淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌等中都检测到经典通路的激活。目前对于非经典NF-κB通路在肿瘤中作用的研究相对较少，但是在胰腺癌中非经典NF-κB通路的激活促进了肿瘤细胞的增殖；在前列腺癌中阻断非经典NF-κB通路能够通过降低IL8的生成而抑制肿瘤的生长。

但是目前本领域对于NF-κB与癌症尤其是结肠癌的具体联系和机制尚不明确，因此本领域迫切需要进行此发明的研究和开发。

发明内容

本发明的目的就是提供一种利用microRNA海绵技术预防和治疗肿瘤的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种RelA因子的抑制剂、或RelA基因的抑制剂的用途，它们被用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述的RelA因子选自下组：

(A)氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示的多肽；

(B)将SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的RelA因子衍生物，或其活性片段；

(C)序列与SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列相比，同源性≥90%，较佳地≥95%，更佳地≥98%，最佳地≥99%的RelA因子衍生物，或其活性片段。

在另一优选例中，所述的RelA基因编码RelA因子。

在另一优选例中，所述的RelA基因选自下组：

(A1)编码如SEQ ID NO.:2所示RelA因子的多核苷酸序列；

(B1)如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列；

(C1)将SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的多核苷酸序列；

(D1)序列与SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸序列相比，同源性≥90%，较佳地≥95%，更佳地≥98%，最佳地≥99%的多核苷酸序列；

(E1)与(A1)-(D1)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌。

在另一优选例中，所述的肿瘤为结肠癌。

在另一优选例中，所述RelA因子的抑制剂选自下组：RelA因子的抗体、RelA因子的结合蛋白。

在另一优选例中，所述RelA基因的抑制剂为：mir-221海绵、mir-222海绵、抑制RelA启动子的抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述RelA基因的抑制剂为mir-221海绵和/或mir-222海绵。

在另一优选例中，所述的mir-221海绵的序列如SEQ ID NO.:5或SEQ IDNO.:6所示。

在另一优选例中，所述的mir-222海绵的序列如SEQ ID NO.:7或SEQ IDNO.:8所示。

在本发明的第二方面，提供了一种microRNA海绵，所述的microRNA海绵具有选自下组的结构(或序列)：

序列如SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:6所示的mir-221海绵、和/或序列如SEQID NO.:7或SEQ ID NO.:8所示的mir-222海绵。

在另一优选例中，所述的microRNA海绵可以特异性地与RelA因子的编码序列结合。

在本发明的第三方面，提供了第二方面所述海绵的用途，它被用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述的microRNA海绵用于抑制肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的抑制肿瘤细胞包括：抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡、或其组合。

在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤：在RelA因子抑制剂或RelA基因抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制抑制肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的RelA因子抑制剂抑制所述肿瘤细胞中RelA因子的活性；或RelA基因抑制剂抑制所述肿瘤细胞中RelA基因的表达。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌；较佳地为结肠癌。

在另一优选例中，所述的抑制肿瘤细胞为抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿成瘤。

在另一优选例中，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中RelA因子的活性降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有RelA因子的活性。

在另一优选例中，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中RelA基因的表达降低10%以上，较佳地降低20%以上，更佳地降低30%以上，更佳地降低40%以上，更佳地降低50%以上，更佳地降低60%以上，更佳地降低70%以上，更佳地降低80%以上，更佳地降低90%以上，最佳地完全没有RelA基因的表达。

在本发明的第五方面，提供了一种可用于治疗肿瘤或抑制肿瘤细胞的药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量活性成分：RelA因子的抑制剂或RelA基因的抑制剂。

在另一优选例中，所述的RelA因子抑制剂选自下组：RelA因子抗体、RelA因子结合蛋白。

在另一优选例中，所述的RelA基因的抑制剂为mir-2212海绵，和/或mir-222海绵。

在另一优选例中，所述的RelA基因的抑制剂包括特异性针对mir-221的海绵、特异性针对mir-222的海绵、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示非经典NF-κB通路的激活依赖于经典NF-κB通路；其中，图1A显示RelA和RelB在结直肠癌临床样本中的表达情况；图1B显示RelA和RelB的表达在结直肠癌临床样本中呈高度正相关；图1C-图1F显示RelA在蛋白和RNA水平都可影响非经典NF-κB通路相关基因的表达。

图2显示miR-221/222能够影响RelA的表达并影响经典和非经典NF-κB通路的激活；其中，图2A-图2D显示miR-221/222影响RelA的蛋白表达；图2E-图2H显示miR-221/222影响RelA的RNA水平；图2I显示miR-221/222影响RelA、RelB和p52的核内水平；图2J-图2K显示miR-221/222影响NF-κB报告基因活性；图2L显示抑制miR-221/222部分阻断TNFα刺激的经典NF-κB通路的激活；图2M-图2O显示抑制miR-221/222部分阻断CD40L刺激的非经典NF-κB通路的激活。

图3显示miR-221/222通过调控RelA的编码区影响RelA的表达；其中，图3A显示抑制miR-221/222可抑制RelA和RelA+5”UTR表达载体的蛋白表达；图3B显示抑制miR-221/222可抑制RelA和RelA+5”UTR表达载体的RNA水平；图3C-图3D显示了图3A实验中的miR-221/222的表达情况；图3E显示miR-221/222不影响RelA的5”UTR报告基因活性；图3F-图3I显示miR-221/222通过调控RelA编码区调控RelA的表达；图3J显示miR-221/222可影响RelA的mRNA稳定性；图3K-图3L显示在RKO细胞系中miR-221/222可能通过其它机制调控RelA。

图4显示miR-221/222通过调控PDLIM2影响RelA的表达；其中，图4A显示在抑制miR-221/222情况下MG132处理可恢复RelA的表达；图4B显示不同结直肠癌细胞系中miR-221/222、RelA、RelB和PDLIM2的表达情况；图4C-图4F显示HCT116、RKO和293T中miR-221/222可影响PDLIM2的表达；图4G-图4H显示miR-221/222通过结合PDLIM2的3”UTR直接调控其表达。

图5显示RelA和RelB正调控miR-221/222的表达；其中，图5A显示RelA/p50可上调miR-221/222表达；图5B显示RelB/p52可上调miR-221/222表达；图5C显示敲低RelA可下调miR-221/222表达；图5D显示敲低RelB可下调miR-221/222表达。

图6显示敲低RelA可抑制肿瘤细胞系的体外增殖和体内成瘤；其中，图6A显示细胞在24、48、72、96、120小时时计数绘制细胞生长曲线，敲低RelA可降低HCT116细胞的体外生长；图6B显示WST-1法检测24、48、72、96、120小时时细胞数量与活力；图6C显示细胞周期分析，BrdU-7AAD加入诱导培养的稳转细胞系，继续培养50分钟，流式检测细胞周期，Flowjo7.6软件分析结果，敲低RelA可减少S期细胞增加G0/G1期细胞；图6D为克隆形成实验，细胞诱导培养11天，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数，进行统计分析，敲低RelA可减少克隆数；图6E为软琼脂实验，稳转细胞系以10000个细胞种植于软琼脂胶内，培养28天后，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数，敲低RelA可减少软琼脂克隆数；图6F-图6G显示RelA RNAi与对照tGFPRNAi稳转细胞系注射到裸鼠腋窝皮下成瘤；图6H显示22天取肿瘤称量重量；图6I-图6J为Real-time PCR检测肿瘤组织中相关基因的表达情况；图6K为WB检测肿瘤组织中RelA、RelB等基因表达情况。

图7显示抑制miR-221/222可降低结直肠癌细胞系的体外增殖和体内成瘤；其中，图7A为细胞在24、48、72、96、120小时时计数绘制细胞生长曲线，抑制miR-221/222可降低HCT116细胞的体外生长；图7B显示了WST-1法检测24、48、72、96、120小时时细胞数量与活力；图7C为细胞周期分析，BrdU-7AAD加入诱导培养的稳转细胞系，继续培养50分钟，流式检测细胞周期，Flowjo7.6软件分析结果，抑制miR-221/222可减少S期细胞增加G0/G1期细胞；图7D为miR-221/222 sponge构建示意图；图7E为miR-221/222 sponge稳转细胞系中miR-221和miR-222的表达情况；图7F：miR-221/222 sponge稳转细胞系中RelA和RelB的表达情况；图7G为克隆形成实验，细胞诱导培养11天，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数，进行统计分析，抑制miR-221/222可减少克隆数；图7H：软琼脂实验，稳转细胞系以10000个细胞种植于软琼脂胶内，培养28天后，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数，抑制miR-221/222可减少软琼脂克隆数；图7I-图7J：miR-221/222 sponge与对照sponge稳转细胞系注射到裸鼠腋窝皮下成瘤；图7K：22天取肿瘤称量重量。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，通过调节RelA因子可以调节经典和非经典NF-κB通路的激活，从而调控肿瘤的生长。具体地，microRNA“海绵”miR-221/222是一种RelA基因的抑制剂，它可极大地降低结直肠癌细胞的增殖和体内成瘤。通过microRNA“海绵”技术抑制结直肠癌中高表达的miR-221/222，可极大地阻断经典和非经典NF-κB通路的激活；RelA因子或其编码序列可以作为抑制肿瘤中的靶点，RelA因子的抑制剂用于制备预防或治疗肿瘤的药物。在此基础上完成了本发明。

RelA因子及其编码基因

如本文所用，术语“RelA因子”属于NF-κB家族转录因子的成员之一。RelA因子是重要的转录因子，对免疫球蛋白(IgG)的kappa轻链的转录进行调控。NF-κB在固有免疫和适应性免疫应答、炎症反应、肿瘤发生以及有机体的分化发育等过程中也起到重要作用。

如本文所用，术语“RelA基因”、“RelA编码基因”、“RelA因子的编码基因”、“RelA因子的编码序列”可以互换使用，都是指编码NF-κB家族转录基因p-65的多核苷酸序列。本领域的普通技术人员可使用常规方法获得RelA基因的序列，如从NCBI获取。

本发明的RelA因子可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。本发明的RelA因子可以是天然纯化的产物或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的RelA因子可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的RelA因子还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括具有RelA因子或RelA因子活性的RelA因子多肽片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持天然RelA因子相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明还包括与本发明的RelA因子具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。本发明包括RelA因子类似物与天然RelA因子的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

在本发明的一个优选例中，编码RelA因子的氨基酸序列（NP_068810.3）为；

MDELFPLIFP AEPAQASGPY VEIIEQPKQR GMRFRYKCEG RSAGSIPGER STDTTKTHPT     60

IKINGYTGPG TVRISLVTKD PPHRPHPHEL VGKDCRDGFY EAELCPDRCI HSFQNLGIQC    120

VKKRDLEQAI SQRIQTNNNP FQVPIEEQRG DYDLNAVRLC FQVTVRDPSG RPLRLPPVLS    180

HPIFDNRAPN TAELKICRVN RNSGSCLGGD EIFLLCDKVQ KEDIEVYFTG PGWEARGSFS    240

QADVHRQVAI VFRTPPYADP SLQAPVRVSM QLRRPSDREL SEPMEFQYLP DTDDRHRIEE    300

KRKRTYETFK SIMKKSPFSG PTDPRPPPRR IAVPSRSSAS VPKPAPQPYP FTSSLSTINY    360

DEFPTMVFPS GQISQASALA PAPPQVLPQA PAPAPAPAMV SALAQAPAPV PVLAPGPPQA    420

VAPPAPKPTQ AGEGTLSEAL LQLQFDDEDL GALLGNSTDP AVFTDLASVD NSEFQQLLNQ    480

GIPVAPHTTE PMLMEYPEAI TRLVTGAQRP PDPAPAPLGA PGLPNGLLSG DEDFSSIADM    540

DFSALLSQIS S                                                         551

SEQ ID NO.:2

本发明还提供了编码RelA因子的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

在本发明的一个优选例中，编码RelA因子的DNA序列（NM_021975.3）为；

agcgcgcagg cgcggccgga ttccgggcag tgacgcgacg gcgggccgcg cggcgcattt     60

ccgcctctgg cgaatggctc gtctgtagtg cacgccgcgg gcccagctgc gaccccggcc    120

ccgcccccgg gaccccggcc atggacgaac tgttccccct catcttcccg gcagagccag    180

cccaggcctc tggcccctat gtggagatca ttgagcagcc caagcagcgg ggcatgcgct    240

tccgctacaa gtgcgagggg cgctccgcgg gcagcatccc aggcgagagg agcacagata    300

ccaccaagac ccaccccacc atcaagatca atggctacac aggaccagg gacagtgcgca    360

tctccctggt caccaaggac cctcctcacc ggcctcaccc ccacgagctt gtaggaaagg     420

actgccggga tggcttctat gaggctgagc tctgcccgga ccgctgcatc cacagtttcc     480

agaacctggg aatccagtgt gtgaagaagc gggacctgga gcaggctatc agtcagcgca     540

tccagaccaa caacaacccc ttccaagttc ctatagaaga gcagcgtggg gactacgacc     600

tgaatgctgt gcggctctgc ttccaggtga cagtgcggga cccatcaggc aggcccctcc     660

gcctgccgcc tgtcctttct catcccatct ttgacaatcg tgcccccaac actgccgagc     720

tcaagatctg ccgagtgaac cgaaactctg gcagctgcct cggtggggat gagatcttcc     780

tactgtgtga caaggtgcag aaagaggaca ttgaggtgta tttcacggga ccaggctggg     840

aggcccgagg ctccttttcg caagctgatg tgcaccgaca agtggccatt gtgttccgga     900

cccctcccta cgcagacccc agcctgcagg ctcctgtgcg tgtctccatg cagctgcggc     960

ggccttccga ccgggagctc agtgagccca tggaattcca gtacctgcca gatacagacg    1020

atcgtcaccg gattgaggag aaacgtaaaa ggacatatga gaccttcaag agcatcatga    1080

agaagagtcc tttcagcgga cccaccgacc cccggcctcc acctcgacgc attgctgtgc    1140

cttcccgcag ctcagcttct gtccccaagc cagcacccca gccctatccc tttacgtcat    1200

ccctgagcac catcaactat gatgagtttc ccaccatggt gtttccttct gggcagatca    1260

gccaggcctc ggccttggcc ccggcccctc cccaagtcct gccccaggct ccagcccctg    1320

cccctgctcc agccatggta tcagctctgg cccaggcccc agcccctgtc ccagtcctag    1380

ccccaggccc tcctcaggct gtggccccac ctgcccccaa gcccacccag gctggggaag    1440

gaacgctgtc agaggccctg ctgcagctgc agtttgatga tgaagacctg ggggccttgc    1500

ttggcaacag cacagaccca gctgtgttca cagacctggc atccgtcgac aactccgagt    1560

ttcagcagct gctgaaccag ggcatacctg tggcccccca cacaactgag cccatgctga    1620

tggagtaccc tgaggctata actcgcctag tgacaggggc ccagaggccc cccgacccag    1680

ctcctgctcc actgggggcc ccggggctcc ccaatggcct cctttcagga gatgaagact    1740

tctcctccat tgcggacatg gacttctcag ccctgctgag tcagatcagc tcctaagggg    1800

gtgacgcctg ccctccccag agcactgggt tgcaggggat tgaagccctc caaaagcact    1860

tacggattct ggtggggtgt gttccaactg cccccaactt tgtggatgtc ttccttggag    1920

gggggagcca tattttattc ttttattgtc agtatctgta tctctctctc tttttggagg    1980

tgcttaagca gaagcattaa cttctctgga aaggggggag ctggggaaac tcaaactttt    2040

cccctgtcct gatggtcagc tcccttctct gtagggaact ctggggtccc ccatccccat    2100

cctccagctt ctggtactct cctagagaca gaagcaggct ggaggtaagg cctttgagcc    2160

cacaaagcct tatcaagtgt cttccatcat ggattcatta cagcttaatc aaaataacgc    2220

cccagatacc agcccctgta tggcactggc attgtccctg tgcctaacac cagcgtttga    2280

ggggctggcc ttcctgccct acagaggtct ctgccggctc tttccttgct caaccatggc    2340

tgaaggaaac cagtgcaaca gcactggctc tctccaggat ccagaagggg tttggtctgg    2400

gacttccttg ctctccctct tctcaagtgc cttaatagta gggtaagttg ttaagagtgg    2460

gggagagcag gctggcagct ctccagtcag gaggcatagt ttttactgaa caatcaaagc    2520

acttggactc ttgctctttc tactctgaac taataaatct gttgccaagc tggctagaaa    2580

aaaaaaaaaa aaaaa                                                     2595

SEQ ID NO.:1

根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。

RelA因子的抑制剂

如本文所用，术语“RelA因子的抑制剂”是指抑制RelA因子活性的物质。RelA因子的抑制剂选自下组：RelA因子的抗体、RelA因子的结合蛋白等。

RelA基因的抑制剂

如本文所用，术语“RelA基因的抑制剂”是指抑制RelA基因复制或转录的物质，或减少RelA基因表达（表达产物如mRNA等）的物质，RelA基因的抑制剂包括（但不限于）：mir-221海绵、mir-222海绵、抑制RelA启动子的抑制剂、或其组合。RelA基因的抑制剂优选mir-221海绵和/或mir-222海绵。

miRNA

本发明提供了一类与肿瘤(尤其是结肠癌)密切相关的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA (Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA是指：miRNA-221，miRNA-222、或经修饰的且与miRNA-221或miRNA-222功能相同或基本相同的衍生物。

在本发明的一个优选例中，miRNA-221的核苷酸序列：如SEQ ID NO.：3所示；miRNA-222的核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示。

在另一优选例中，所述的miRNA来源于人或非人哺乳动物。

所述的“功能与miRNA-221或miRNA-222相同或基本相同”是指保留了miRNA-221或miRNA-222的≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%的功能。

本发明还包括miRNA变体和衍生物，本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA-221或miRNA-222进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。

miRNA海绵

如本文所用，术语“miRNA海绵”或“miRNA sponge”可以互换使用，都是指一种吸收目标miRNA的DNA序列，使得目标miRNA无法与天然靶点结合，起到调节天然靶点的目的。

在本发明的一个优选例中，提供了一种miRNA海绵，所述的microRNA海绵具有选自下组的结构(或序列)，所述的microRNA海绵可以特异性地与RelA因子的编码序列结合：

mir-221海绵:

F:

5’-gatccGAAACCCAGCATGTATGTAGCTCTTCGAAACCCAGCATGTATGTAGCTCTTCGAAACCCAGCATGTATGTAGCTCTTCGAAACCCAGCATGTATGTAGCTttttttg-3’（SEQ ID NO.:5）

R:

5’-aattcaaaaaaAGCTACATACATGCTGGGTTTCGAAGAGCTACATACATGCTGGGTTTCGAAGAGCTACATACATGCTGGGTTTCGAAGAGCTACATACATGCTGGGTTTCg-3’（SEQ ID NO.:6）

mir-222海绵：

F:

5’-gatccACCCAGTAGGTCATGTAGCTCTTCACCCAGTAGGTCATGTAGCTCTTCACCCAGTAGGTCATGTAGCTCTTCACCCAGTAGGTCATGTAGCTttttttg-3’（SEQ ID NO.:7）

R:

5’-aattcaaaaaaAGCTACATGACCTACTGGGTGAAGAGCTACATGACCTACTGGGTGAAGAGCTACATGACCTACTGGGTGAAGAGCTACATGACCTACTGGGTg-3’（SEQ ID NO.:8）

本发明提供的所述海绵被用于制备预防或治疗肿瘤的药物，或用于抑制肿瘤细胞。所述的抑制肿瘤细胞包括：抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡、或其组合。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量活性成分：RelA因子的抑制剂或RelA基因的抑制剂。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备抑制自身免疫反应的抑制剂、制备预防或治疗自身免疫反应疾病的药物。所述的自身免疫反应疾病选自下组：类风湿性关节炎、多发性脑脊髓硬化症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、牛皮癣、硬皮病、慢性溃疡性肠炎、慢性萎缩性胃炎、慢性淋巴性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病、干燥综合征。

本发明的主要优点在于：

(1)通过microRNA“海绵(sponge)”技术抑制结直肠癌中高表达的miR-221/222可极大地阻断经典和非经典NF-κB通路的激活；

(2)抑制miR-221/222可极大地降低结直肠癌细胞的增殖和体内成瘤；

(3)miR-221/222“海绵”具备潜在的治疗结直肠癌的应用价值，为结肠癌的早期诊断和治疗提供新的思路和分子靶标。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

结直肠癌中经典和非经典NF-κB通路呈组成性激活状态

试验材料：临床组织标本从复旦大学附属中山医院获得，shRelA载体用pLVX-shRNA1构建。

试验方法：使用Clontech的RNAi Designer工具设计目的shRNA。先使用RNAiTarget Sequence Selector选择shRNA的目标序列，再使用shRNA Sequence Designer根据目标序列设计相应的shRNA序列。为了便于将shRNA连接到载体上，在设计序列时在shRNA序列两端加入了限制性酶切位点。使用市售质粒载体pLVX-shRNA1，其上含有BamH1和EcoR1酶切位点，在设计的shRNA序列两端分别加入了这两种酶的酶切位点。

靶向序列：

5'-GGTGCAGAAAGAGGACATT-3'（SEQ ID NO.:9）；

上链引物：

5'-gatccGGTGCAGAAAGAGGACATTTTCAAGAGAAATGTCCTCTTTCTGCACCTTTTTTg-3'（SEQ ID NO.:10）；

下链引物：

5'-aattcAAAAAAGGTGCAGAAAGAGGACATTTCTCTTGAAAATGTCCTCTTTCTGCACCg-3'（SEQ ID NO.:11）。

构建好的shRelA载体被转染入HC T116或Lovo细胞系中，转染3天后，western blotting和real-time PCR检测相关基因的表达。

结果表明，发明人在40例结直肠癌临床样本中，发现RelA和RelB在肿瘤组织中的表达都比癌旁正常组织高(图1A)，并且RelA和RelB的表达呈高度的正相关(图1B)。由于经典NF-κB通路激活早，而非经典NF-κB通路激活稍晚，所以发明人推测经典NF-κB通路可能调控非经典NF-κB通路。为此，发明人在结直肠癌细胞系HC T116和Lovo中敲低或过表达RelA，发现RelA无论是从蛋白水平还是RNA水平都可影响非经典NF-κB通路相关基因的表达(图1C-1F)。

实施例2

miR-221/222影响RelA的表达并影响经典和非经典NF-κB通路的激活

试验材料：miR-221/222的mimics和antisense购自吉玛公司。Real-time PCR试剂盒购自Takara公司。RNA反转试剂盒购自Transgene公司。双荧光报告基因检测试剂盒购自Promega公司。

试验方法：100nM miR-221/222的mimics或antisense被转染到HCT116和RKO细胞中，转染3天后，western blotting和real-time PCR检测相关基因的表达。100nM miR-221/222的mimics或antisense、200ng NF-κB报告基因载体和50ngpRL-TK载体被共转染至HCT116细胞系中，转染2天后，检测NF-κB报告基因的活性。1ng/ml的CD40L刺激HCT116细胞，12h小时收集样品，检测miR-221/222的表达。100nM的miR-221/222被转染至HCT116，转染1天后，CD40L刺激，在不同时间点收集样品检测p52的剪切情况。

结果表明，发明人在结直肠癌细胞系HCT116(图2A、图2B、图2E、图2F)和RKO(图2C、图2D、图2G、图2H)中抑制或过表达miR-221/222，发现miR-221/222可正向调控RelA的表达，并正向调控非经典NF-κB通路相关基因的表达。抑制miR-221/222后，RelA、RelB和p52在细胞核内的量都有所减少(图2I)，并且过表达或抑制miR-221/222可升高或降低NF-κB报告基因的活性(图2J和图2K)。此外，抑制miR-221/222可部分阻断TNFα(图2L)和CD40L(图2M-O)刺激引起的经典和非经典NF-κB通路的激活。

上述结果表明，miR-221/222可调控NF-κB通路。

实施例3

miR-221/222通过调控RelA的编码区影响RelA的表达

试验材料：RelA表达载体用市售的pcDNA3.1(+)构建。突变试剂盒购自Takara公司。Actinomycin D购自上海前尘生物公司。

上链引物：5’-ATAAAGCTTATGGACGAACTGTTCCCCCTC-3’（SEQ IDNO.:12），下链引物：5’-ATAGGATCCTTAGGAGCTGATCTGACTCAG-3’（SEQID NO.:13），酶切位点：HindIII和BamHI。

由于miR-221/222正向调控RelA的表达，发明人试图验证其是否通过结合RelA的5’UTR从而促进其表达。试验方法：100nM miR-221/222 antisense和2μg的RelA表达载体被共转染至HCT116或293T细胞，转染3天后，western印迹和real-time PCR检测相关基因的表达。100nM miR-221/222的mimics或antisense、200ng psiCHECK2-RelA-5’UTR报告基因载体被共转染至HCT116细胞系中，转染2天后，检测psiCHECK2-RelA-5’UTR报告基因的活性。RelA编码区突变方法按照说明书提供的步骤进行。10ng/ml Actinomycin D被用来检测RelA的mRNA稳定性，在转染miR-221/222 mimics或antisense 3天的HCT116细胞中，加入10ng/ml的Actinomycin D，在不同时间点收RNA样品检测RelA的表达。

结果表明，无论有没有5’UTR，anti-miR-221/222均可降低RelA的表达(图3A-图3D)，并且miR-221/222对RelA的5’UTR报告基因活性没有任何影响(图3E)，表明miR-221/222可能是通过调控RelA的编码区来调控其表达。

发明人通过RNA22网站预测到一个miR-221/222与RelA编码区结合的位点(图3F)，抑制miR-221/222后，结合位点突变的RelA表达载体的蛋白和RNA水平都没有受到影响(图3G-图3I)，表明miR-221/222有可能是通过调控该位点来调控RelA的表达。

进一步的实验证明，miR-221/222可影响RelA的RNA稳定性(图3J)。然而，在RKO细胞系里，突变和野生型的RelA表达载体的蛋白水平都受到了miR-221/222的影响(图3K-图3L)，表明在RKO细胞系中，miR-221/222还有另外一种作用机制调控RelA的表达。

实施例4

miR-221/222通过调控PDLIM2(降解RelA的E3ligase)调控RelA的表达

试验材料：PDLIM2的3’UTR报告基因载体用psiCHECK2构建，上链引物：5’-ATACTCGAGTGGGATTACAAGCGTGAG-3’（SEQ ID NO:14）；下链引物：5’-ATAGCGGCCGCAGTCCGGGAACATAGACG-3’（SEQ ID NO.:15）。酶切位点：XhoI和NotI。

试验方法：100nM miR-221/222 mimics或antisense被转染至HCT116、RKO或293T细胞中，3天后检测PDLIM2的表达。100nM miR-221/222的mimics或antisense、200ng psiCHECK2-PDLIM2-3’UTR报告基因载体被共转染至HCT116细胞系中，转染2天后，检测psiCHECK2-PDLIM2-3’UTR报告基因的活性。

在RKO细胞系中，无论是野生型的RelA还是编码区结合位点突变的RelA表达载体，anti-miR-221/222均可降低其蛋白表达，而突变的RelA表达载体的RNA水平并不受影响，表明miR-221/222除了调控RelA编码区影响其RNA水平外，还存在其它调控机制影响RelA蛋白水平。

用MG132处理细胞后，发现在抑制miR-221/222的情况下，RelA蛋白水平恢复到对照水平，表明miR-221/222可能通过调控RelA的蛋白降解系统影响RelA的表达(图4A)。通过预测网站，预测到PDLIM2(RelA的E3 ligase)是miR-221/222的靶基因。在结直肠癌不同细胞系中，PDLIM2的表达水平都低于对照细胞系，而miR-221/222、RelA和RelB的表达水平都比对照细胞系高，PDLIM2与miR-221/222的表达呈负相关(图4B)。在HCT116、RKO和293T中，过表达或抑制miR-221/222可降低或升高PDLIM2的表达(图4C-图4F)。通过双荧光报告基因实验，发现miR-221/222可直接通过结合到PDLIM2的3’UTR区调控PDLIM2的表达(图4G-图4H)。

实施例5

RelA和RelB可调控miR-221/222的表达

试验材料：pcDNA3.1(+)-RelA和shRelA载体如前所述。pmt2t-RelB、p50、p52和shRelB载体构建同前。

试验方法：转染RelA/p50、RelB/p52表达载体和shRelA、shRelB进入HCT116，转染3天后，real-time PCR检测miR-221/222的表达。

结果(图5)表明，过表达RelA/p50和RelB/p52可上调miR-221/222的表达，而抑制RelA和RelB均可降低miR-221/222的表达，由此RelA、RelB和miR-221/222之间形成正反馈环，从而促进经典和非经典NF-κB通路的组成性激活。

实施例6

敲低RelA可抑制结肠癌细胞系的体外增殖和体内成瘤

试验材料：shRelA载体同前；WST-1购自碧云天生物公司；4-5周龄的雄性裸鼠购自斯莱克公司，用于皮下成瘤试验。

试验方法：（1）生长曲线方法：1×10⁴细胞种于12孔板，分别于1、2、3、4、5天细胞计数；（2）MTT：1000个细胞种于96孔板，分别于1、2、3、4、5天每孔加10μl WST-1，OD=450nm读数。（3）细胞周期：收细胞前1个小时，加入10μM Brdu，tripsin消化细胞并用1×PBS洗涤，逐滴加入75%酒精固定，300g离心3分钟，1×PBS洗涤后300g离心，去上清，用1ml denaturing solution重悬细胞，室温放置20分钟。加1ml 1×PBS离心，去上清，加0.5ml硼酸钠室温放置2分钟，加1ml wash buffer洗涤后离心，去上清，加一抗，室温避光放置1小时。加1ml wash buffer洗涤后离心，去上清，每孔加100μl 7AAD，4℃避光存放，至上机前加200μl 1×PBS。（4）皮下成瘤实验：2×10⁶个HCT116细胞种植于4-5周龄的雄性裸鼠皮下，一周后每隔4天测量肿瘤大小，22天后，取肿瘤称重量。

结果（图6）表明，稳定抑制HCT116结肠癌细胞系的RelA，通过生长曲线和MTT，显示shRelA可抑制HCT116的体外增殖（图6A、图6B），并可将细胞阻滞在G0/G1期（图6C）。克隆形成结果显示shRelA可减少HCT116细胞的克隆数目（图6D），soft-agar结果显示shRelA可降低HCT116细胞的克隆形成能力（图6E），体内成瘤实验发现shRelA可显著降低结肠癌细胞的体内成瘤（图6F-图6H），并且发现肿瘤组织中，shRelA可降低miR-221/222、RelB、p100的表达（图6I-图6K）。

实施例7

抑制miR-221/222可降低结直肠癌细胞系的体外增殖和体内成瘤

试验材料：miR-221/222“海绵”用pLVX-shRNA1载体构建，其它的材料同实施例6。试验方法：miR-221/222“海绵”构建与构建shRelA载体相同，

mir-221海绵序列：

F：

5’-gatccGAAACCCAGCATGTATGTAGCTCTTCGAAACCCAGCATGTATGTAGCTCTTCGAAACCCAGCATGTATGTAGCTCTTCGAAACCCAGCATGTATGTAGCTttttttg-3’（SEQ ID NO.:5），

R:

5’-aattcaaaaaaAGCTACATACATGCTGGGTTTCGAAGAGCTACATACATGCTGGGTTTCGAAGAGCTACATACATGCTGGGTTTCGAAGAGCTACATACATGCTGGGTTTCg-3’（SEQ ID NO.:6）。

mir-222海绵结构或序列：

F：

5’-gatccACCCAGTAGGTCATGTAGCTCTTCACCCAGTAGGTCATGTAGCTCTTCACCCAGTAGGTCATGTAGCTCTTCACCCAGTAGGTCATGTAGCTttttttg-3’（SEQ ID NO.:7），

R：

5’-aattcaaaaaaAGCTACATGACCTACTGGGTGAAGAGCTACATGACCTACTGGGTGAAGAGCTACATGACCTACTGGGTGAAGAGCTACATGACCTACTGGGTg-3’（SEQ ID NO.:8）；

体内体外试验同实施例6。

结果（图7）表明，通过生长曲线和MTT，显示抑制HCT116结肠癌细胞系中的miR-221/222可抑制HCT116的体外增殖（图7A、图7B），并可将细胞阻滞在G0/G1期（图7C）。由于皮下成瘤试验和soft-agar试验需要长期抑制miR-221/222的表达，所以我们构建了miR-221/222“海绵”载体（图7D），通过抗性筛选得到稳转细胞系，结果显示miR-221/222海绵可降低miR-221/222的表达（图7E），并可降低RelA和RelB的表达（图7F）。Soft-agar结果显示抑制miR-221/222可降低HCT116细胞的克隆形成能力（图7G），克隆形成结果显示抑制miR-221/222可减少HCT116细胞的克隆数目（图7H），体内成瘤实验发现抑制miR-221/222可显著降低结肠癌细胞的体内成瘤（图7I-图7K）。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种RelA因子的抑制剂、或RelA基因的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组：结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述RelA因子的抑制剂选自下组：RelA因子的抗体、RelA因子的结合蛋白。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述RelA基因的抑制剂为：mir-221海绵、mir-222海绵、抑制RelA启动子的抑制剂、或其组合。

5.一种microRNA海绵，其特征在于，所述的microRNA海绵具有选自下组的结构(或序列)：序列如SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:6所示的mir-221海绵、和/或序列如SEQ ID NO.:7或SEQ ID NO.:8所示的mir-222海绵。

6.权利要求5所述海绵的用途，其特征在于，它被用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

7.一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括步骤：在RelA因子抑制剂或RelA基因抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制抑制肿瘤细胞。

8.一种可用于治疗肿瘤或抑制肿瘤细胞的药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体和有效量活性成分：RelA因子的抑制剂或RelA基因的抑制剂。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的RelA因子抑制剂选自下组：RelA因子抗体、RelA因子结合蛋白。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的RelA基因的抑制剂包括特异性针对mir-221的海绵、特异性针对mir-222的海绵、或其组合。

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