CN117815363A

CN117815363A - Star-PAP在制备提高脂肪胰岛素敏感性药物中的应用

Info

Publication number: CN117815363A
Application number: CN202311592946.7A
Authority: CN
Inventors: 王计秋; 宁光; 刘瑞欣; 陈纳
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF ENDOCRINE AND METABOLIC DISEASES; Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF ENDOCRINE AND METABOLIC DISEASES; Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2023-11-27
Filing date: 2023-11-27
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本发明涉及Star‑PAP在制备提高脂肪胰岛素敏感性药物中的应用。本发明通过实验发现了PAP介导的RNA多聚腺苷酸化在脂肪代谢稳态的作用，Star‑PAP作为InsrRNA结合蛋白，其缺乏可以导致脂肪萎缩症和胰岛素抵抗，为下一步制备提高脂肪胰岛素敏感性药物奠定了基础。

Description

Star-PAP在制备提高脂肪胰岛素敏感性药物中的应用

技术领域

本发明属于代谢综合征药物领域，特别涉及Star-PAP在制备提高脂肪胰岛素敏感性药物中的应用。

背景技术

脂肪萎缩综合征是一类没有营养剥夺情况下，脂肪组织出现不同程度丢失为特征的异质性疾病。脂肪萎缩综合征根据分布及发病原因分为可分为4类：先天性全身性脂肪营养不良(Congenital systemic lipodystrophy，CGL)、家族性部分脂肪营养不良(Familialpartial lipodystrophy，FPLD)、获得性全身性脂肪营养不良(Acquired systemiclipodystrophy，AGL)和获得性部分脂肪营养不良(Acquired partial lipodystrophy，APL)。脂肪组织的缺乏导致患者瘦素分泌不足，从而出现摄食增加，而不同器官(包括肝脏和肌肉)的异位脂质储存则会引起全身胰岛素抵抗。胰岛素抵抗和脂肪萎缩综合征相关的代谢并发症是其发病率和死亡率的关键因素。脂肪萎缩症患者非常罕见，对这些患者的研究，可以对脂肪组织的生物学效应及其在代谢综合征发生过程中的病理生理学有更深的理解。

越来越多的证据提示脂肪萎缩综合征伴随的胰岛素抵抗与肥胖过程中发生的胰岛素抵抗具有相似的机制，因此治疗方法上两者有很多相似之处，比如家族性部分脂肪萎缩症的病人可以通过胃切除术来缓解代谢并发症，而这一治疗措施在肥胖治疗中也是比较常见的。由于脂肪组织减少导致病人体内瘦素水平缺乏，目前FDA批准使用瘦素类似物美曲普汀(Metreleptin)治疗脂肪萎缩症，可以缓解病人的脂肪肝、血脂和血糖等，但由于其价格昂贵，且无法从根本上增加脂肪组织含量，适用范围比较狭窄。目前对于脂肪萎缩综合征的治疗仍没有根治措施，因此，研究影响脂肪萎缩症的发病机制，寻找能够缓解脂肪萎缩症并发症的干预措施，对于延长患者寿命，提高生活质量具有十分重要的临床价值。目前临床上已发现涉及单基因脂肪萎缩综合征的基因超过20个，虽然患者的临床表现形式多样，但一个关键的病理生理特征就是脂肪组织功能障碍，致病基因的分子和细胞学改变主要涉及脂肪细胞分化、脂滴的结构与生成和甘油三酯合成与分解等过程。因此，研究脂肪组织含量的调节机制，可以为探索脂肪萎缩症的机制和干预靶点提供重要线索。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供Star-PAP在制备提高脂肪胰岛素敏感性药物中的应用，通过实验发现了PAP介导的RNA多聚腺苷酸化在脂肪代谢稳态的作用，Star-PAP作为InsrRNA结合蛋白，其缺乏可以导致脂肪萎缩症和胰岛素抵抗，为下一步制备提高脂肪胰岛素敏感性药物奠定了基础。

本发明提供了Star-PAP在制备提高脂肪胰岛素敏感性药物中的应用。

所述药物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。

所述药学上可接受的载体和/或辅料包括稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂中的至少一种。

所述药物组合物包含治疗有效量的所述的Star-PAP。

所述药物组合物的剂型包括片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂中的至少一种。

有益效果

本发明通过实验发现了PAP介导的RNA多聚腺苷酸化在脂肪代谢稳态的作用，Star-PAP作为InsrRNA结合蛋白，其缺乏可以导致脂肪萎缩症和胰岛素抵抗，为下一步制备提高脂肪胰岛素敏感性药物奠定了基础。

附图说明

图1为脂肪组织特异性Tut1敲除(ADTKO)小鼠的构建；其中，

(A)单细胞测序数据GSE10246显示Star-PAP在各组织分布情况。

(B)qPCR检测Tut1在各组织表达情况。

(C)Tut1^flox/flox小鼠模型构建策略示意图。

(D)qPCR检测雄性ADTKO小鼠和对照组iWATSVFs和成熟脂肪细胞中的Tut1水平敲低效率(每组n＝4)。

(E)qPCR检测雄性ADTKO小鼠和对照组BAT和肝脏中的Tut1水平敲低效率(每组n＝4)。图2为脂肪组织特异性敲除Star-PAP小鼠出生一周未出现体重及脂肪组织改变；其中，

(A)1周龄ADTKO小鼠和对照小鼠的体重(对照小鼠n＝7；ADTKO小鼠n＝5)。

(B)1周龄ADTKO小鼠和对照小鼠的BAT，iWAT和肝脏组织称重(左图)及组织百分比(右图)(对照小鼠n＝7；ADTKO小鼠n＝5)。

(C)1周龄ADTKO小鼠和对照小鼠的代表性大体图(背面)。

(D-E)1周龄ADTKO小鼠和对照小鼠的BAT，iWAT和肝脏组织代表性大体图(D)和代表性HE染色图(E)。

(F)1周龄ADTKO小鼠和对照小鼠的肝脏甘油三酯含量定量(对照小鼠n＝7；ADTKO小鼠n＝5)。

(G)qPCR检测1周龄ADTKO小鼠和对照小鼠iWAT的基因改变情况(对照小鼠n＝7；ADTKO小鼠n＝5)。

图3为脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂肪组织含量随年龄进行性减少；其中，

(A)：雄性ADTKO小鼠和对照小鼠正常饮食喂养下的体重曲线(对照小鼠n＝14；ADTKO小鼠n＝15)。

(B-D)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄和23周龄时的体脂含量百分比(B)，组织重量百分比(C)及iWAT和eWAT的组织代表性大体图和代表性HE染色图(D)(5周龄：对照小鼠n＝10；ADTKO小鼠n＝9；23周龄：对照小鼠n＝15；ADTKO小鼠n＝10)。

图4为脂肪组织特异性敲除Star-PAP抵抗高脂喂养和瘦素缺陷肥胖小鼠的脂肪堆积；其中，(A-D)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠高脂喂养下体重曲线(A)，体脂含量百分比(B)，组织重量百分比(C)及iWAT和eWAT的组织代表性大体图和代表性HE染色图(D)(对照小鼠n＝22；ADTKO小鼠n＝9)。

(E-H)雄性obADTKO小鼠及对照小鼠代表性全身及组织大体图(E)，体重曲线(F)，体脂含量百分比(G)及iWAT和eWAT组织重量百分比(H)(每组n＝3)。

图5为脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂肪因子分泌减少；其中，

(A-B)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄(左)、23周龄(中)和高脂喂养后血浆脂联素(A)和瘦素(B)水平(5周龄:对照小鼠n＝10；ADTKO小鼠n＝9,23周龄:每组n＝9，高脂组：每组n＝8)。

图6为雌性小鼠脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂肪组织减少；其中，

(A)雌性ADTKO小鼠和对照小鼠正常饮食喂养下的体重曲线(对照小鼠n＝20；ADTKO小鼠n＝15)。

(B-D)雌性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄和23周龄时的体脂含量百分比(B)，组织重量百分比(C)及iWAT和内脏脂肪组织(Visceral white adipose tissue，vWAT)的组织代表性大体图和代表性HE染色图(D)(5周龄：每组n＝4；23周龄：每组n＝9)。

(E-H)雌性ADTKO小鼠和对照小鼠高脂喂养下体重曲线(E)，体脂含量百分比(F)，组织重量百分比(G)及iWAT和vWAT的组织代表性大体图和代表性HE染色图(H)(每组n＝8)。

(I-L)雌性obADTKO小鼠及对照小鼠代表性全身及组织大体图(I)，体重曲线(J

)，体脂含量百分比(K)及iWAT和vWAT组织重量百分比(L)(每组n＝3)。

(M-N)：雌性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄(左)、23周龄(中)和高脂喂养后血浆脂联素(M)和瘦素(N)水平(5周龄：每组n＝4；23周龄：每组n＝8，高脂组：每组n＝8)。

图7为成年后脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂肪组织迅速减少；其中，

(A)ADTKOERT和对照组小鼠使用他莫昔芬诱导性敲除Star-pap示意图。

(B-D)ADTKOERT和对照组小鼠体脂含量百分比(B)，iWAT和eWAT的组织重量百分比(C)及组织代表性大体图和代表性HE染色图(D)(对照小鼠n＝11；ADTKOERT小鼠n＝18)。

图8为ADTKO小鼠脂肪组织减少并非由于摄食减少或能量消耗增加；其中，

(A-C)雄性23周龄ADTKO小鼠和对照小鼠的每日平均摄食量和累积进食量(A)，RER

(B)和校正瘦组织后的能量消耗(C)(每组n＝8)。

(D-F)雄性高脂喂养ADTKO小鼠和对照小鼠的每日平均摄食量和累积进食量(D)，RER(E)和校正瘦组织后的能量消耗(F)(每组n＝8)。

图9为脂肪组织特异性敲除Star-PAP出现胰岛素抵抗；其中，

(A)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄时GTT(对照小鼠n＝10；ADTKO小鼠n＝9)。

(B)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠23周龄时GTT(对照小鼠n＝15；ADTKO小鼠n＝10)。(C)ADTKOERT和对照组小鼠注射完他莫昔芬12天后随机血糖(对照小鼠n＝11；ADTKOERT小鼠n＝18)。

(D)雄性obADTKO小鼠及对照小鼠GTT(每组n＝3)。

(E)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄时ITT(对照小鼠n＝10；ADTKO小鼠n＝9)。

(F)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠23周龄时ITT(对照小鼠n＝15；ADTKO小鼠n＝10)。(G)雄性obADTKO小鼠及对照小鼠GTT(每组n＝3)。

(H)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄时未禁食情况下血浆胰岛素水平(对照小鼠n＝10；ADTKO小鼠n＝9)。

(I-J)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠23周龄饥饿-再进食实验中对应时间点的血糖(I)和血浆胰岛素水平(J)(对照小鼠n＝15；ADTKO小鼠n＝10)。

(K-L)雌性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄时GTT(K)和ITT(L)(每组n＝4)。

(M-N)雌性ADTKO小鼠和对照小鼠23周龄时GTT(M)和ITT(N)(对照小鼠n＝9；ADTKO小鼠n＝8)。

(O-P)雌性ADTKO小鼠和对照小鼠23周龄饥饿-再进食实验中对应时间点的血糖(O)和血浆胰岛素水平(P)(对照小鼠n＝9；ADTKO小鼠n＝8)。

图10为脂肪组织特异性敲除Star-PAP出现脂质异位沉积；其中，

(A-D)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄时，BAT和肝脏组织重量百分比(A)，BAT的代表性大体图和HE染色图(B)，肝脏的代表性大体图和HE染色图(C)和肝脏的甘油三酯定量(对照小鼠n＝10；ADTKO小鼠n＝9)。

(E-G)ADTKOERT和对照组小鼠BAT和肝脏组织重量百分比(E)，代表性HE染色图(F)和肝脏的甘油三酯定量(G)(对照小鼠n＝11；ADTKOERT小鼠n＝18)。

(H-K)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠23周龄时，BAT和肝脏组织重量百分比(H)，BAT的代表性大体图和HE染色图(I)，肝脏的代表性大体图、HE染色图和油红染色图(J)及肝脏的甘油三酯定量(K)(对照小鼠n＝15；ADTKO小鼠n＝10)。

图11为脂肪组织特异性敲除Star-PAP出现血脂紊乱；其中，

(A-D)雄性ADTKO小鼠和对照小鼠5周龄和23周龄时禁食6小时后的血浆总胆固醇(TC)(A)，低密度脂蛋白-c(LDL-c)(B)，甘油三酯(TG)(C)和高密度脂蛋白-c(HDL-c)(D)水平。(5周龄：对照小鼠n＝10；ADTKO小鼠n＝9；23周龄：对照小鼠n＝15；ADTKO小鼠n＝10)。

图12为Star-PAP敲除导致脂肪组织基因广泛改变；其中，

(A)ADTKOERTiWAT相较对照组小鼠改变的基因火山图(Q value<0.05，|log2 FC|<0.5)(每组n＝4)。红点表示Insr。

(B)ADTKOERTiWAT相较对照组小鼠下调基因的KEGG分析。胰岛素信号通路是下调通路之一，用粉色标注。

(C)ADTKOERTiWAT相较对照组小鼠上调基因的KEGG分析。

图13为Star-PAP敲除下调脂质合成和胰岛素信号通路；其中，

(A)ADTKOERTiWAT相较对照组小鼠胰岛素信号通路和脂肪酸代谢通路基因表达的热图(每组n＝4)。

(B)5周龄ADTKO和对照组小鼠iWAT成熟脂肪细胞Insr，脂质摄取和合成基因的表达(对照组n＝3,ADTKO组n＝5)。

(C)5周龄ADTKO和对照组小鼠iWAT在有或没有胰岛素刺激10min时的胰岛素受体信号蛋白水平(每组n＝3)。

(D)ADTKOERT和对照组小鼠iWATInsr，脂质摄取和合成基因的表达(对照组n＝11,ADTKOERT组n＝19)。

(E)ADTKOERT和对照组小鼠iWAT在有或没有胰岛素刺激10min时胰岛素受体信号蛋白水平(每组n＝3)。

(F)23周龄ADTKO和对照组小鼠iWATInsr，脂质摄取和合成基因的表达(每组n＝8)。(G)23周龄ADTKO和对照组小鼠iWAT在有或没有胰岛素刺激10min时的胰岛素受体信号蛋白水平(没有胰岛素刺激组每组n＝3，胰岛素刺激组每组n＝4)。

(H-I)ADTKO和对照组iWAT SVFs体外诱导分化第8天的脂质摄取和合成基因的表达((每组n＝4)(H)及胰岛素受体信号蛋白水平(每组n＝3)(I)。

(J-L)转染Star-PAP慢病毒和空载组的iWAT SVFs体外诱导分化第8天的油红染色(J)，脂质摄取和合成基因的表达(每组n＝4)(K)及胰岛素受体信号蛋白水平(每组n＝3)(L)。

图14为脂肪组织特异性敲除Star-PAP促进脂肪细胞凋亡和炎症；其中，

(A)23周龄ADTKO和对照组小鼠iWATTUNEL免疫荧光染色代表图(每组n＝3)。

(B)5周龄ADTKO和对照组小鼠iWAT激活型caspase-3免疫组化染色(每组n＝3)。

(C)5周龄ADTKO和对照组小鼠eWAT炎症基因的表达(每组n＝4)。

图15为Insr是Star-PAP的靶基因之一；其中，

(A)已有报道的人基因突变或小鼠基因敲除等可导致脂肪萎缩的基因，与iWAT的RNA-Seq中的ADTKO-ERT较对照组下调的913个基因交集的韦恩图。

(B)HEK293细胞中直接与Star-PAP蛋白结合并在Star-PAP敲低后下调的基因，与iWAT的RNA-Seq中的ADTKO-ERT较对照组下调的913个基因交集的韦恩图。

(C)A图与B图分别交集到的基因再次交集的韦恩图。

图16为Star-PAP直接结合Insr RNA；其中，

(A)使用抗Flag抗体对外源性表达Star-PAPWT和△ZF的HEK293细胞进行INSR、HO1、GCLC、GAPDH的前体mRNARIP分析。

(B)使用抗STAR-PAP抗体对内源性表达STAR-PAP的诱导后白色脂肪细胞进行3'UTR-Insr,3'UTR-Nqo1,3'UTR-Gclc,3'UTR-Gapdh的RIP分析。((A-B)PC：阳性对照；NC：阴性对照。)

(C)使用Insr探针拉下STAR-PAP的代表性western blot。

图17为Star-PAP通过调节Insr多聚腺苷酸化来影响mRNA表达；其中，

(A)根据距离CDS的远近定义两个含量最高的poly A信号(PAS)为远端PAS(dPAS)和近端PAS(pPAS)的示意图。

(B)qPCR检测3T3/L1细胞分别转染敲低Star-pap和Insr-3’UTR的小干扰RNA后Insr表达(每组n＝4～6)。

(C-D)3'RACE检测ADTKO和对照小鼠iWAT成熟脂肪细胞及体外诱导分化后的白色脂肪细胞总RNA中InsrdPAS和pPAS的含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一、实验方法

Tut1^flox/flox小鼠模型构建：Tut1基因(NM_197993.3；Ensembl:ENSMUSG00000071645)位于小鼠第19号染色体上；已鉴定出9个外显子，其中ATG起始密码子位于1号外显子，TGA终止密码子位于9号外显子。2号外显子被选为条件敲除区域。2号外显子的缺失会导致Tut1基因功能的丧失。为了设计靶向载体，从C57BL/6J文库中选取BAC克隆RP23-118O2和RP23-31H10作为模板，用PCR法生成同源臂和CKO(Conditional knockout,条件性敲除)区；在目标载体中，Neo元件加在Frt位点两侧，CKO区域的两侧是LoxP点。Flp介导重组后获得CKO等位基因，进一步通过Cre酶介导重组后的作用获得2号外显子敲除的等位基因鼠。

繁育策略：首先将Tut1^flox/flox小鼠与Adiponectin-Cre^+/-小鼠交配，获得Tut1^flox ^/wt:Adiponectin-Cre^+/-小鼠。再将Tut1^flox/wt:Adiponectin-Cre^+/-小鼠与Tut1^flox/flox小鼠交配，获得脂肪组织特异性敲除Tut1小鼠，基因型Tut1^flox/flox:Adiponectin-Cre^+/-(ADTKO)。Tut1^flox/flox:Adiponectin-CreERT2^+/-(ADTKO^ERT)小鼠获得方式同ADTKO。将ADTKO小鼠与ob/wt小鼠交配，获得小鼠ob/wt：Tut1^flox/wt：Adiponectin-Cre^+/-，再进行自交，即可获得瘦素缺陷且脂肪组织特异性敲除Tut1的小鼠(基因型：ob/ob：Tut1^flox/flox：Adiponectin-Cre^+/-)。

2.实验结果

(1)脂肪组织特异性Tut1敲除(ADTKO)小鼠的构建

为了研究Star-PAP在脂肪组织中的表达水平，首先对公共单细胞测序数据进行分析，结果显示，Star-PAP广泛表达于全身各组织(图1A)，进一步qPCR结果显示，Tut1在脑和肝脏组织中表达相对较高，脂肪组织中表达中等(图1B)。为了进一步评估Star-PAP在脂肪组织中的作用，用Talen基因编辑技术构建了Tut1^flox/flox小鼠(图1C)，可在Cre重组酶作用下，切掉2号外显子，导致Star-PAP蛋白无法表达。Adiponectin-cre在脂肪组织表达高度特异，且可实现有效重组敲除，将Tut1^flox/flox小鼠与Adiponectin-cre小鼠进行交配，得到脂肪组织特异性敲除Tut1小鼠，简称为ADTKO小鼠。qPCR检测Star-PAP在ADTKO小鼠WAT的成熟脂肪细胞较对照组敲低约75％，在SVFs中没有改变(图1D)。同时在BAT显著敲低，在肝脏组织没有改变(图1E)，验证了小鼠模型敲除的特异性。

(2)脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂肪组织减少

为了研究脂肪组织敲低Star-PAP后对小鼠代谢表型和脂肪组织的影响，对不同周龄ADTKO小鼠和对照小鼠进行体重、体脂和脂肪组织重量检测，以及形态学检测小鼠脂肪组织的脂滴形成情况，同时检测脂肪组织分化、脂肪酸合成相关基因表达水平的改变情况。

①脂肪组织特异性敲除Star-PAP小鼠出生一周未出现体重及脂肪组织改变

首先对1周龄ADTKO小鼠和对照小鼠进行评估。ADTKO小鼠无论是体重、脂肪组织称重、脂肪组织大体表型和HE染色均较对照组无显著改变，肝脏形态学也没有明显改变(图2A-F)。基因表达结果显示ADTKO组Star-pap在此时已经明显敲低，但是脂肪细胞分化的关键基因过氧化物酶增殖子激活受体γ2(Peroxisomerpoliferator-activated receptorγ2，Pparγ2)，脂联素(Adiponectin)以及脂肪酸合成的关键基因Acaca、Fasn均没有显著改变(图2G)，提示脂肪组织特异性敲除Star-PAP对出生一周内小鼠脂肪组织无明显影响。

②脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂肪组织含量随年龄进行性减少

进一步对小鼠从断奶后进行每周体重记录，并在5周龄和23周龄时取材。尽管正常饮食喂养情况下ADTKO小鼠和对照小鼠没有体重差异(图3A)，体脂检测结果已经显示5周龄时ADTKO小鼠脂肪含量较对照组下降29.8％，23周龄时更为显著，较对照组下降多达41.6％(图3B)。脂肪组织称重结果显示，ADTKO小鼠的皮下脂肪组织(iWAT)和附睾旁脂肪组织(Epididymal white adipose tissue，eWAT)在5周龄时较对照组显著减少，23周龄时减少程度进一步增加(图3C)。白色脂肪组织HE染色结果显示，5周龄ADTKO小鼠脂肪细胞大小显著减小；23周龄时脂肪细胞数目出现了明显减少，并出现大量纤维化样改变，残余脂肪细胞代偿性体积增大(图3D)。以上结果说明脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致白色脂肪组织含量随年龄进行性减少。

③脂肪组织特异性敲除Star-PAP抵抗高脂喂养和瘦素缺陷肥胖小鼠的脂肪堆积

为了探究脂肪组织特异性敲除Star-PAP是否有抵抗肥胖的作用，进一步对ADTKO小鼠进行了高脂喂养以及与ob/ob小鼠交配两种诱导肥胖表型的处理。HFD喂养情况下体重曲线结果显示，ADTKO小鼠可显著抵抗高脂诱导的体重增加(图4A)，体脂检测和组织称重结果也显示脂肪组织显著减少(图4B-C)，同时HE染色也表现出明显脂肪细胞数目减少及纤维化(图4C)。ob/ob小鼠是瘦素缺陷导致的肥胖小鼠模型，将ADTKO小鼠与ob/ob小鼠进行杂交后得到的纯合小鼠称为obADTKO，结果同样显示，Star-PAP敲除亦可完全抵抗瘦素基因缺陷带来的脂肪组织增加(图4E-H)。这些结果表明脂肪组织特异性敲除Star-PAP可以抵抗高脂喂养和瘦素缺陷导致的脂肪堆积。

④脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂肪因子分泌减少

脂肪组织可分泌脂肪因子如脂联素(Adiponectin)和瘦素(Leptin)，在调节机体胰岛素敏感性方面具有重要作用，脂肪因子水平与脂肪组织含量密切相关。进一步检测了血浆中脂肪因子的分泌情况，发现Adiponectin和Leptin分泌水平在ADTKO组出现显著减少(图5A-B)，与年龄进行性和高脂饮食下脂肪组织减少程度相一致。说明脂肪组织特异性敲除Star-PAP影响脂肪组织功能，导致脂肪因子分泌减少。

⑤雌性小鼠脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂肪组织减少

上述研究均是在雄性小鼠上进行，为了观察Star-pap调节脂肪含量作用是否存在性别差异，接下来在雌性小鼠上也检测了上述表型，与雄性小鼠一致，雌性ADTKO小鼠与对照小鼠相比，也出现脂肪组织随着年龄进行性减少(图6A-D)，抵抗高脂喂养和瘦素缺失下的脂肪堆积(图6E-L)，以及脂肪因子分泌显著减少(图6M-N)。这些结果说明脂肪组织特异性敲除Star-PAP在雌雄小鼠表现一致，均可显著减少脂肪组织。

⑥成年后脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂肪组织迅速减少

虽然Adiponectin较为特异表达于成熟脂肪细胞，但是不能排除长期敲除Star-PAP的成熟脂肪细胞对前体脂肪及发育的影响，因此，将Tut1^flox/flox小鼠与Adiponectin-cre^ERT小鼠进行交配，简称为ADTKO^ERT小鼠，以实现在特定时间对成年小鼠成熟脂肪细胞进行Star-PAP敲除，观察短期Star-PAP敲除的快速效应。选取成年小鼠，连续5天给予他莫昔芬腹腔注射，继续观察12天，对小鼠进行体脂检测和取材(图7A)。有意思的是，短期敲除仍可使ADTKO^ERT小鼠表现出体脂含量显著下降，白色脂肪组织重量减少，以及白色脂肪细胞大小减少的表型(图7B-C)，类似于5周龄ADTKO小鼠改变，这些结果说明成年后脂肪细胞特异性敲除Star-PAP亦可导致脂肪组织迅速减少。

(3)ADTKO小鼠脂肪组织减少并非由于摄食减少或能量消耗增加

为了进一步探究ADTKO脂肪组织的减少是否由摄食量减少或者消耗增加导致，对小鼠进行摄食量监测，结果显示，ADTKO小鼠较对照小鼠在正常饮食情况下出现轻微的累计摄食量增加(图8A)，高脂饮食情况下累计摄食量显著增加(图8D)。代谢笼结果显示ADTKO小鼠的呼吸商比对照组小鼠稍高(图8B和E)，说明ADTKO小鼠以糖供能增加，同时小鼠的能量消耗在矫正瘦组织后没有差异(图8C和F)。上述结果说明小鼠的脂肪组织减少并不是由于摄食量减少或能量消耗减少所致。

(4)脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致胰岛素抵抗、肝脏脂质沉积等代谢紊乱表型

①脂肪组织特异性敲除Star-PAP促发胰岛素抵抗

接下来检测了小鼠的糖代谢情况，腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)显示5周龄ADTKO小鼠即出现糖耐量受损(图9A)，而23周龄时葡萄糖耐量改善(图9B)，脂肪组织诱导性敲除Star-PAP可出现随机血糖显著升高(图9C)，同时obADTKO小鼠糖耐量受损(图9D)。上述结果提示脂肪组织特异性敲除Star-PAP短期内导致葡萄糖耐量下降。进一步检测小鼠的胰岛素敏感性，胰岛素耐量实验(ITT)显示，不同周龄ADTKO小鼠及obADTKO小鼠均存在明显的胰岛素抵抗(图9E-G)，摄食情况下的血胰岛素水平显著升高(图9H)。对23周龄小鼠进行了禁食-再进食实验，结果ADTKO小鼠在正常摄食情况下血糖较对照组增高近1倍，但撤去食物后，出现明显血糖下降，与对照组血糖相似，禁食后24小时再给予食物，两组小鼠血糖迅速升高，但ADTKO组小鼠血糖更高(图9I)。也采集了这个过程中不同时间点的小鼠血浆检测胰岛素分泌水平，ADTKO小鼠的胰岛素水平在进食情况下显著高于对照小鼠，但在禁食24小时后恢复至于对照小鼠相似水平(图9J)，说明ADTKO小鼠存在胰岛素抵抗，而胰岛功能可能尚处在代偿期，可随血糖波动而改变胰岛素分泌量。

与雄性小鼠表现一致，雌性ADTKO小鼠与对照小鼠相比，也在早期即出现糖耐量受损，胰岛素抵抗，高胰岛素血症(图9K-P)。以上结果说明脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致明显的胰岛素抵抗。

②脂肪组织特异性敲除Star-PAP导致脂质代谢紊乱

脂肪萎缩是一类以脂肪组织减少，脂质异位沉积到肝脏、肌肉等器官，同时伴有胰岛素抵抗、高胰岛素血症、脂质紊乱为特点的罕见疾病。在上述结果中已经发现小鼠脂肪组织减少并有显著的胰岛素抵抗，那么脂肪组织特异性敲除Star-PAP是否导致了脂肪萎缩症的发生？进而检测了小鼠的异位脂质沉积和血脂代谢情况。

A.脂肪组织特异性敲除Star-PAP出现脂质异位沉积

组织称重和HE染色结果显示，5周龄ADTKO小鼠和短期快速Star-PAP敲除情况下，肝脏重量显著增加，但肝脏脂质沉积未见明显增加(图10A-G)。而23周龄ADTKO小鼠则表现出BAT重量减轻，但BAT脂滴明显增大，提示存在棕色脂肪白色化，同时肝脏形态学染色结果呈现出更多脂质沉积(图10H-J)，肝脏甘油三酯定量结果进一步验证了这一结论(图10K)。以上结果说明脂肪组织特异性敲除Star-PAP后，由于白色脂肪不能储存脂质，后期可出现脂质异位沉积到BAT和肝脏组织。

B.脂肪组织特异性敲除Star-PAP出现血脂紊乱

进一步检测了血浆脂类水平，结果显示，ADTKO组小鼠较对照组总胆固醇(Totalcholesterol，TC)和低密度脂蛋白-c(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c)水平明显升高(图11A-B)，甘油三酯(Triglyceride，TG)含量早期没有差异，23周龄时出现下降(图11C)，高密度脂蛋白-c(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-c)水平早期没有差异，23周龄时出现升高(图11D)。以上结果说明ADTKO小鼠出现血脂代谢紊乱。

综上，脂肪组织敲除Star-PAP导致小鼠出现胰岛素抵抗，血脂代谢紊乱，脂质异位沉积及脂肪组织炎症加重，类似临床的脂肪萎缩症表型。

(5)Star-PAP调控脂肪细胞的脂质合成和胰岛素信号通路

上述系列结果证明脂肪组织敲低Star-PAP能够减少脂肪组织，并促进脂肪萎缩症的发生发展。脂肪组织减少可能由于脂肪细胞生成减少、脂质合成减少或脂肪酸氧化分解增加。那么Star-PAP敲除具体影响了哪些过程和通路呢？由于ADTKO小鼠出现进行性脂肪萎缩，为了避免全身其他器官改变对脂肪组织的影响，首先选择成年诱导型Star-pap敲低的小鼠模型ADTKOERT的iWAT进行RNA测序分析，进而在ADTKO小鼠成熟脂肪细胞及iWAT、体外诱导分化脂肪细胞模型进行验证。

①Star-PAP敲除导致脂肪组织基因表达广泛改变

ADTKO^ERT和对照组小鼠的iWATs RNA测序结果火山图显示，ADTKO^ERT组较对照组共有1379个基因表达下调，1311基因表达上调(Q value<0.05，|log2 FC|<0.5)(图12A)。接下来对上调和下调基因进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)基因集富集分析，结果显示，下调基因涉及的代谢通路主要包括碳代谢途径、丙酮酸代谢、脂肪酸代谢和胰岛素信号传导途径等(图12B)，上调基因涉及途径包括趋化因子信号通路、溶酶体、凋亡和P53信号通路等(图12C)，提示Star-PAP敲除对脂肪组织基因表达影响广泛。

②Star-PAP敲除下调脂质合成和胰岛素信号通路

KEGG分析结果提示Star-PAP敲除所致的脂肪代谢紊乱可能存在碳代谢原料缺失导致脂质合成障碍，并涉及胰岛素信号通路。接下来分析了胰岛素信号通路和脂肪酸代谢信号通路的差异基因表达，发现这两个通路基因表达在Star-PAP敲除组出现明显下降(图13A)。分离5周龄ADTKO小鼠iWAT中的成熟脂肪细胞，发现胰岛素受体编码基因Insr、脂质合成相关基因如Fasn，Acaca均出现明显下降(图13B)，脂肪组织磷酸化AKT(P-AKT)和总IRβ(T-IRβ)蛋白水平明显降低，说明脂肪组织胰岛素信号通路受损(图13C)。ADTKO^ERT小鼠和23周龄ADTKO小鼠iWAT进一步验证了这一结果(图13D-G)。体外实验分离ADTKO小鼠脂肪原代细胞进行诱导分化，或者分离野生型小鼠的原代细胞敲低Star-PAP后进行诱导分化，qPCR结果和蛋白表达结果均证实敲除/敲低Star-PAP下调脂质摄取和合成相关基因表达，降低胰岛素信号通路活性(图13H-I；图13K-L)。油红染色结果也表明敲低Star-PAP抑制脂肪细胞生成(图13J)。

③脂肪组织特异性敲除Star-PAP促进脂肪细胞凋亡和炎症

在前述RNA-Seq结果中，同时也检测到Star-PAP敲除可以上调包括趋化因子信号通路、溶酶体以及凋亡等信号通路，而脂肪组织炎症和脂肪细胞凋亡坏死往往与胰岛素敏感性相关。为了评估脂肪组织炎症及脂肪细胞凋亡情况，首先对白色脂肪组织进行了TUNEL免疫荧光染色及激活型Caspase3免疫组化染色。结果显示，ADTKO组较对照组出现明显增加的TUNEL荧光信号(图14A)，激活型Caspase3阳性细胞更多(图14B)，说明Star-PAP敲除显著增加脂肪细胞凋亡。qPCR结果表明，巨噬细胞标志基因肿瘤坏死因子α(Tumor necrosisfactor，Tnfα)、单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein，Mcp1)、小鼠含生长因子样模体粘液样激素样受体(Mouse EGF-like module-containing mucin-likehormone receptor-like 1，EMR1，又称F4/80)和整合素αX(Integrin alpha X，Cd11c)在ADTKO小鼠脂肪组织的mRNA表达水平显著升高(图14C)，这说明脂肪组织巨噬细胞浸润增加，炎症反应增加。

综上结果说明脂肪组织敲除Star-PAP下调脂质合成和胰岛素信号通路，同时促进脂肪细胞凋亡和炎症。

(6)Star-PAP直接结合并调节Insr多聚腺苷酸化

①Insr是Star-PAP的靶基因之一

检索了目前已报道的45个可导致脂肪萎缩的基因，包括脂肪萎缩症患者检测到的致病基因和小鼠基因敲除模型。将45个脂肪萎缩基因与ADTKO^ERT小鼠iWAT下调的913个基因(RNA-Seq，Q value<0.05，|log2 FC|<0.5)进行交集，韦恩图结果显示，Insr、Akt2、溶血磷脂酸酰基转移酶β抗体(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 2，Agpat2)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白C(Cell death inducing DFFA like effector c，Cidec)等6个基因在两组共有(图15A)，提示这6个交集基因可能共同贡献了脂肪组织敲除Star-PAP后脂肪萎缩的表型，但尚不知道它们是否受Star-PAP直接结合调节。2021年Laishram实验室在HEK293细胞上敲低Star-PAP后使用微阵列芯片(Microarray)检测下调的基因，同时也在HEK293上进行了紫外交联免疫沉淀结合高通量测序(Crosslinking-immunoprecipitationand high-throughput sequencing，CLIP-Seq，又称HIT-CLIP)，检测直接与Star-PAP蛋白结合的RNA，发现共有1351个基因的表达下调为Star-PAP直接结合调控所致。为了进一步筛选脂肪组织中受Star-PAP直接调节的基因，我们将ADTKO^ERT较对照组下调的913个基因与含1351个Star-PAP结合基因进行交集，结果显示有77个基因为两组共有(图15B)。进而将77个潜在靶基因与第一个交集结果6个可能贡献脂肪萎缩表型的基因再一次进行了交集，有意思的是，只有Insr在2组共有(图15C)，这提示Insr可能是受Star-PAP直接结合调节并导致小鼠脂肪萎缩的潜在靶基因。既往研究提示，Star-PAP可以在特定信号刺激下调控一类mRNA的合成，如氧化应激基因、凋亡基因，上述结果说明Star-PAP在脂肪组织也调控一系列靶基因，其中包括胰岛素信号通路重要节点Insr。

②Star-PAP直接结合Insr RNA

Star-PAP具有腺苷酰转移酶的功能，可以直接结合到前体mRNA的3’UTR上进行多聚腺苷酸化。为了探究Star-PAP对Insr的调控是否是通过直接结合导致，先在293细胞上进行初步检测。已有文献报道，Star-PAP可以直接结合到血红素氧合酶-1(Heme oxygenase1，HO1)，BCL2相互作用杀手(BCL2 interacting killer，BIK)，NAD(P)H醌脱氢酶(NAD(P)Hquinone dehydrogenase 1，NQO1)等基因的前体mRNA，而谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为阴性对照，不与Star-PAP结合^[41,42]。在293T细胞上进行RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验，结果显示外源性的Star-PAP可直接结合到INSR和HOMX1的前体mRNA上，同时不与GCLC和GAPDH结合(图16A)。Star-PAP蛋白的N端1-50个氨基酸(△ZF)是重要的RNA结合区域，非常重要的是，过表达缺失△ZF的Star-PAP可以降低其与INSR、HOMX1前体mRNA结合(图16A)。进一步通过在分化后的脂肪细胞上进行RIP实验，也检测到内源性Star-PAP和Insr 3’UTR的直接结合(图16B)。在3T3-L1脂肪细胞RNApull down实验中，使用Insr探针检测到了其与Star-PAP蛋白直接结合(图16C)。上述结果说明Star-PAP可以通过直接结合到Insr的3’UTR发挥对Insr的调节作用。

③Star-PAP通过调节Insr多聚腺苷酸化来影响mRNA表达

绝大多数基因都有多个多聚腺苷酸化位点进行可变剪切和多聚腺苷酸化，从而产生多个具有不同长度3‘UTR的转录本形式。3’READS数据显示，Insr的3’UTR上有多个多聚腺苷酸位点(Poly(A)signals，PASs)，探究丰度最高的2个转录本形式，将靠近CDS编码区的称为pPAS,远离CDS的为dPAS(图17A)。首先在CDS至pPAS之间的序列设计了siRNA，可以同时敲低pPAS和dPAS，结果显示，敲低Insr的3’UTR后，显著降低了InsrmRNA的表达，与敲低star-pap相似，证明了Insr的3’UTR对InsrmRNA表达是至关重要的(图17B)。接着分离ADTKO小鼠及对照组iWAT成熟脂肪细胞进行3’快速末端扩增法(3’RACE)扩增，结果显示，敲除Star-PAP后，Insr的pPAS和dPAS表达都明显下降(图17C)，该结果也进一步在慢病毒敲低Star-PAP诱导分化的脂肪细胞上得到验证(图17D)。

综上结果说明，Star-PAP直接结合Insr的3’UTR调节Insr多聚腺苷酸化，稳定其mRNA表达，可能是Star-PAP敲除导致脂肪萎缩的关键机制。

Claims

1.Star-PAP在制备提高脂肪胰岛素敏感性药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药学上可接受的载体和/或辅料包括稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂中的至少一种。

4.一种提高脂肪胰岛素敏感性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效量的如权利要求1所述的Star-PAP。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型包括片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂中的至少一种。