KR20230054413A - 당뇨병 치료 및 베타 세포 재생을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

당뇨병 치료 및 베타 세포 재생을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230054413A
KR20230054413A KR1020237009236A KR20237009236A KR20230054413A KR 20230054413 A KR20230054413 A KR 20230054413A KR 1020237009236 A KR1020237009236 A KR 1020237009236A KR 20237009236 A KR20237009236 A KR 20237009236A KR 20230054413 A KR20230054413 A KR 20230054413A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
inhibitor
hif1α
pfkfb3
subject
cells
Prior art date
Application number
KR1020237009236A
Other languages
English (en)
Inventor
슬라비카 투드자로바-트라즈코브스카
Original Assignee
더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 filed Critical 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Publication of KR20230054413A publication Critical patent/KR20230054413A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2857—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, orphan receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/444—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring heteroatom, e.g. amrinone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)

Abstract

본 개시의 양태들은 HIF1α-PFKFB3 경로의 억제에 의해 β-세포 재생을 용이하게 하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특정 양태들은 제2형 당뇨병을 포함하는 당뇨병 전증 및 당뇨병의 치료 및 예방을 위한 방법을 기술한다. β-세포 재생을 증진시키기 위한 방법 및 조성물이 또한 개시된다.

Description

당뇨병 치료 및 베타 세포 재생을 위한 방법 및 조성물
본 출원은 2020년 8월 18일에 출원한 미합중국 가출원 제63/067,187호 및 2021년 4월 1일에 출원한 미합중국 가출원 제63/169,776호의 우선권 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 원용된다.
서열목록
본 출원은 ASCII 형식으로 제출되고 그 전체가 본원에 원용된 서열목록을 포함한다. 2021년 8월 16일에 작성된 상기 ASCII 사본은 UCLA_P0116WO_Seq_Listing.txt로 명명되었으며 크기는 22,602바이트이다.
본 발명의 양태들은 적어도 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다.
제2형 당뇨병(T2D)에서 β-세포 기능의 점진적인 감소는 섬 아밀로이드 췌장 폴리펩티드(islet amyloid pancreatic polypeptide, IAPP)의 독성 올리고머의 축적에 일부 관련이 있다[3-5]. 잘 문서화된 β-세포 스트레스(변형된 미토콘드리아 네트워크 및 활성, Ca2+ 독성, 산화성 및 DNA 손상)에도 불구하고[6-9], T2D의 개시 후 수십 년 후에도 35% 내지 76% 사이의 β-세포량이 보존되면서, β-세포 마모가 놀랍게도 느린 속도로 존재한다[4]. 하지만, β-세포량의 상대적 보존은 T2D의 개시 전의 β-세포 글루코스 반응성의 조기 손실과 대조된다. 이는, 생존 가능하지만, T2D 내의 대부분의 β-세포가 기능장애임을 나타낸다.
급성 손상 시, 건강한 조직의 세포에서, 저산소증 유도성 인자-1-알파(HIF1α)는 성공적인 조직 복구를 위해 요구되는 단계의 순서를 개시한다[10, 11]. 첫째, HIF1α 표적 6-포스포프럭토-2-키나제/프럭토스-2,6-비포스파타제 3(PFKFB3)에 의해 매개되는 심오한 대사 재구성이 존재하여 미토콘드리아-의존성 산화적 인산화로부터 호기성 해당과정(aerobic glycolysis)을 통한 높은 흐름으로 산소 이용률과 무관하게 ATP를 생성한다. 호기성 해당작용으로의 에너지 전환은 오탄당 인산 경로를 통한 뉴클레오티드 합성의 증가에 의해 DNA 복구를 가능하게 한다[12]. 또한, 높은 흐름의 해당작용은 미토콘드리아 네트워크가 손상으로 인한 Ca2+ 독성으로부터 미토콘드리아를 보호하는 방어적 파편화된 핵 주위 자세(defensive fragmented perinuclear posture)를 채택하도록 한다[13]. 둘째, DNA 손상을 보유하는 세포는 세포자멸사에 의해 제거되고, DNA 손상이 없는 세포는 손실 조직을 재생하는데 사용된다. 조직 재생은 전구 줄기 세포 증식(progenitor stem cell expansion), 역분화 후 복제 또는 교차-분화에 의해 달성된다. 셋째, 일단 조직 재생이 완료되면, HIF1α-PFKFB3 경로를 유도한 손상 신호가 감소되고, 세포는 그들의 기능적 대사 상태를 재선택한다.
건강한 조직에서와는 달리, T2D를 갖는 인간에서의 β-세포는 β-세포 기능을 희생하여 세포 마멸 속도를 늦추는 미토콘드리아 네트워크 및 변형된 대사를 갖는 HIF1α 손상/회복 반응의 생존 촉진기(pro-survival phase)에 포획된 상태로 유지된다[2]. 광범위한 연구에도 불구하고, β-세포가 성공적인 재생을 할 수 없는 이유는 여전히 명확하지 않다. 인슐린 감수성을 개선하고 당뇨병을 앓고 있는 대상체를 더 잘 치료하기 위해 손상된 세포의 제거 및 건강한 세포(예컨대, β-세포)의 재생을 유도하기 위한 방법 및 조성물에 대한 요구가 존재한다.
본 개시의 양태들은 제2형 당뇨병을 포함하는 당뇨병 및 관련 병태의 치료를 위한 방법, 및 상기 방법에 유용한 조성물을 제공한다. 본 개시의 구현예들은 일부 경우에 PFKFB3 활성의 억제와 조합하여 HIF1α 활성의 억제에 의한 건강한 β-세포의 재생을 용이하게 하기 위한 방법 및 조성물을 제공함으로써 특정 요구를 충족시킨다. 특정 양태들은 HIF1α 억제제를 제공하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 PFKFB3 억제제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, HIF1α 억제제 및 PFKFB3 억제제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 개시된다.
본 개시의 구현예들은 단백질 접힘 오류와 연관된 장애에 대한 대상체를 치료하는 방법, 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법, 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법, 제1형 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법, 제2형 당뇨병을 진단하는 방법, HIF1α 억제제 치료에 대한 제2형 당뇨병을 갖는 대상체의 감수성을 결정하는 방법, 인슐린 감수성을 개선시키는 방법, HIF1α 억제제를 β-세포에 표적화하는 방법, PFKFB3의 발현 수준을 결정하는 방법, 손상된 β-세포를 사멸시키는 방법, 건강한 β-세포의 재생을 자극하는 방법, 하나 이상의 HIF1α 억제제를 포함하는 조성물, 하나 이상의 PFKFB3 억제제를 포함하는 조성물, 및 HIF1α 억제제 및 PFKFB3 억제제를 포함하는 조성물을 포함한다. 개시된 방법들은 하기의 단계들: 유효량의 HIF1α 억제제를 제공하는 단계, 유효량의 PFKFB3 억제제를 제공하는 단계, 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 진단하는 단계, 제1형 당뇨병에 대한 대상체를 진단하는 단계, 대상체를 제2형 당뇨병을 갖는 것으로 식별하는 단계, 대상체를 제2형 당뇨병에 대한 위험이 있는 것으로 식별하는 단계, 대상체를 당뇨병 전증을 갖는 것으로 식별하는 단계, 대상체에서 PFKFB3의 발현 수준을 측정하는 단계, 대상체의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준을 측정하는 단계, 대상체의 β-세포에서 증가된 PFKFB3 발현 수준을 갖는 것으로 대상체를 결정하는 단계, 및 대상체에게 제2형 당뇨병에 대한 하나 이상의 추가 치료를 제공하는 단계 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 포함할 수 있다. 전술한 단계들 중 하나 이상은 본 개시의 구현예들로부터 배제될 수 있다. 본 개시의 조성물은 하기의: HIF1α 억제제, PFKFB3 억제제, 표적화 분자, GLP-1 수용체 항체, 메트포민, GLP-1 수용체 작용제, DPP-4 억제제, 술포닐우레아, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 중 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 전술한 구성요소들 중 하나 이상은 본 개시의 구현예들로부터 배제될 수 있다.
일부 구현예들에서, 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예들에서, 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서, 제2형 당뇨병을 앓고 있지 않은 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준에 비해 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 증가된 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 상기 대상체에게 유효량의 HIF1α 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 또한 본원에 개시된다. 일부 구현예들에서, 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서, (a) 제2형 당뇨병을 앓고 있지 않은 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준에 비해 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 증가된 발현 수준을 갖는 것으로 상기 대상체를 결정하는 단계; 및 (b) 유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 개시된다. 일부 구현예들에서, 제2형 당뇨병을 갖는 대상체에서 건강한 β-세포의 재생을 자극하는 방법으로서, 상기 건강한 β-세포는 PFKFB3을 발현하지 않고, 상기 방법은 유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 개시된다.
일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 HIF1α 분해를 촉진한다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 HIF1α/HIF1β 이량체 형성을 억제한다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 HIF1α 전사 활성을 감소시킨다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 KC7F2, IDF-11774, 아미노플라본, AJM290, AW464, 타네스피마이신, 알베스피마이신, PX-478, 또는 FM19G11이다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 핵산 억제제이다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 EZN-2698이다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA이다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 레스베라트롤, 라파마이신, 에베롤리무스, CCI779, 실리비닌, 디곡신, YC-1, 페네틸 이소티오시아나이트, 케토민, 플라보피리돌, 보르테조밉, 암포테리신 B, 베이 87-2243, PX-478, 또는 가네타시피브이다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 항-HIF1α 항체 또는 항체-유사 분자이다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 나노바디이다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 관절내, 활막내, 경막내, 경구, 국소, 흡입을 통해, 또는 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여된다.
일부 구현예들에서, 상기 방법은 PFKFB3 억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제는 3-(3-피리디닐)-1-(4-피리디닐)-2-프로펜-1-온(3-PO) 또는 이의 유사체이다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제는 3-PO의 유사체이고, 여기서 상기 유사체는 1-(4-피리디닐)-3-(2-퀴놀리닐)-2-프로펜-1-온(PFK 15)이다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제는 BrAcNHEtOP, YN1, YZ9, PQP, PFK-158, 화합물 26, KAN0436151, 또는 KAN0436067이다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제는 핵산 억제제이다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA이다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체의 β-세포에 결합하도록 구성된 표적화 분자에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 상기 대상체의 β-세포에 결합하도록 구성된 표적화 분자에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예들에서, 상기 표적화 분자는 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 표적화 분자는 항체-유사 분자이다. 일부 구현예들에서, 상기 표적화 분자는 GLP-1 수용체에 결합하도록 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제 및 상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체에게 순차적으로 투여된다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제 및 상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체에게 실질적으로 동시에 투여된다.
일부 구현예들에서, 상기 유효량의 HIF1α 억제제를 투여하는 단계는 상기 대상체에서 인슐린 감수성을 증가시킨다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체는 암을 가지지 않거나 암으로 진단되지 않았다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체는 제2형 당뇨병으로 진단되었다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 투여하는 단계 이전에, 상기 제2형 당뇨병을 갖는 대상체를 진단하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체는 제2형 당뇨병에 대해 이전에 치료되었다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체는 상기 이전 치료에 대해 내성을 갖는 것으로 결정되었다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체는 당뇨병성 신증 또는 당뇨병성 망막증을 갖지 않거나 또는 당뇨병성 망막증으로 진단되지 않았다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 상기 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준은 제2형 당뇨병을 앓고 있지 않은 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준에 비해 증가된다.
본 개시의 구현예들은 또한 대상체에서 인슐린 감수성을 증가시키는 방법으로서, 유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체는 당뇨병 전증을 앓고 있다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체는 인슐린 저항성을 앓고 있다. 일부 구현예들에서, PFKFB3을 발현하는 손상된 β-세포에서 세포 사멸을 자극하는 방법으로서, 상기 β-세포에 HIF1α 억제제를 제공하는 단계를 포함하는, 방법이 또한 개시된다. 일부 구현예들에서, PFKFB3을 발현하지 않는 β-세포에서 재생을 자극하는 방법으로서, HIF1α 억제제를 상기 β-세포에 제공하는 단계를 포함하는, 방법이 개시된다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 시험관내에서 상기 β-세포에 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 생체내에서 상기 β-세포에 제공된다.
특정 양태들에서, 당뇨병을 갖는 대상체에서 PFKFB3을 발현하는 손상된 β-세포를 사멸시키는 방법으로서, 유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 개시된다. 일부 구현예들에서, 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 또한 개시된다. 일부 구현예들에서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병이다. 일부 구현예들에서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병이다.
특정 구현예들은 질병 또는 장애의 진단 방법에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 진단하는 방법으로서: (a) 상기 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 발현 수준을 제2형 당뇨병을 앓고 있지 않은 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준을 상기 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준에 비해 증가된 것으로 결정함으로써, 제2형 당뇨병에 대하여 상기 대상체를 진단하는 단계를 포함하는, 방법이 개시된다.
일부 구현예들에서, 다양한 약학적 조성물이 본원에 추가로 개시된다. 일부 구현예들에서, (a) HIF1α 억제제 및 (b) PFKFB3 억제제를 포함하는 약학적 조성물이 개시된다. 상기 HIF1α 억제제는 임의의 HIF1α 억제제일 수 있으며, 이의 예가 본원에 개시된다. 상기 PFKFB3 억제제는 임의의 PFKFB3 억제제일 수 있으며, 이의 예가 본원에 개시된다.
일부 구현예들에서, 세포군으로부터 이중호르몬 세포들을 제거하는 방법으로서, 유효량의 PFKFB3 억제제를 상기 세포군에 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 또한 개시된다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제는 시험관내에서 상기 세포군에 투여된다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제는 생체내에서 상기 세포군에 투여된다. 상기 PFKFB3 억제제는 임의의 PFKFB3 억제제일 수 있으며, 이의 예가 본원에 개시된다. 일부 구현예들에서, 세포군으로부터 이중호르몬 세포들을 제거하는 방법으로서, 유효량의 HIF1α 억제제를 상기 세포군에 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 추가로 개시된다. 상기 HIF1α 억제제는 임의의 HIF1α 억제제일 수 있으며, 이의 예가 본원에 개시된다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 시험관내에서 상기 세포군에 투여된다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제는 생체내에서 상기 세포군에 투여된다. 일부 구현예들에서, 상기 세포군은 췌도 세포군이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포군은 분화된 줄기 세포군이다. 일부 구현예들에서, 상기 분화된 줄기 세포는 분화된 유도만능 줄기세포(iPSCs)이다. 일부 구현예들에서, 상기 분화된 줄기 세포는 분화된 배아줄기세포(ESCs)이다.
본 출원의 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 측정 또는 정량화 방법에 대한 오차의 고유 변화량을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.
용어 "포함하는"과 함께 사용될 때 단어 "한(a)" 또는 "하나(an)"의 사용은 "1개"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와도 일치한다.
문구 "및/또는"은 "및" 또는 "또는"을 의미한다. 예시를 위해, A, B, 및/또는 C는: A 단독, B 단독, C 단독, A와 B의 조합, A와 C의 조합, B와 C의 조합, 또는 A, B, 및 C의 조합을 포함한다. 즉, "및/또는"은 포괄적인 "또는"으로서 쓰인다.
용어 "포함하는(comprising)"(및 "포함하는(comprising)"의 임의의 형태, 예컨대, "포함하다(comprise)" 및 “포함한다(comprise)”), "갖는(having)"(및 “갖는”의 임의의 형태, 예컨대, "갖다(haves)" 및 "가지다(has)"), "포함하는(including)"(및 “포함하는(including)”의 임의의 형태, 예컨대, "포함하다(includes)" 및 "포함한다(include)"), 또는 "함유하는(containing)"(및 “함유하는(containing)의 임의의 형태, 예컨대, "함유하다(contains)" 및 "함유한다(contain)")은 포괄적이거나 개방적이며, 추가적인 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
이들의 사용을 위한 조성물 및 방법은 명세서 전반에 걸쳐 개시된 임의의 성분 또는 단계를 "포함하고", "이로 필수적으로 구성된" 또는 "구성된"일 수 있다. 개시된 임의의 성분 또는 단계로 "필수적으로 이루어진" 조성물 및 방법은 청구항의 범위를 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정된 물질 또는 단계로 제한한다. 본 명세서 및 청구항(들)에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)"(및 "포함하는(comprising)"의 임의의 형태, 예컨대, "포함하다(comprise)" 및 “포함한다(comprise)”), "갖는(having)"(및 “갖는”의 임의의 형태, 예컨대, "갖다(haves)" 및 "가지다(has)"), "포함하는(including)"(및 “포함하는(including)”의 임의의 형태, 예컨대, "포함하다(includes)" 및 "포함한다(include)"), 또는 "함유하는(containing)"(및 “함유하는(containing)의 임의의 형태, 예컨대, "함유하다(contains)" 및 "함유한다(contain)")은 포괄적이거나 개방적이며, 추가적인 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는"의 맥락에서 본원에 기재된 구현들은 또한 용어 "구성된" 또는 "본질적으로 구성되는"의 맥락에서 구현될 수 있다는 것이 고려된다.
본 발명의 일 구현예에 관하여 논의된 임의의 제한이 본 발명의 임의의 다른 구현예들에 적용될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다. 또한, 본 발명의 임의의 조성물은 본 발명의 임의의 방법에 사용될 수 있고, 본 발명의 임의의 방법은 본 발명의 임의의 조성물을 제조하거나 활용하는데 사용될 수 있다. 실시예들에 제시된 구현예의 양태들은 또한 상이한 실시예의 다른 곳 또는 본 출원의 다른 곳, 예컨대, 발명의 내용, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 청구범위, 및 도면의 간단한 설명에서 논의된 구현예들의 맥락에서 구현될 수 있는 구현예들이다.
치료적, 진단적, 또는 생리적 목적 또는 효과의 맥락에서의 임의의 방법은 또한 기재된 치료적, 진단적, 또는 생리적 목적 또는 효과를 달성하거나 구현하기 위해 본원에서 논의된 임의의 화합물, 조성물, 또는 작용제의 "사용"과 같은 "사용"의 청구항에 기재될 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 본 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변경들 및 수정들이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문에, 본 발명의 특정 구현예들을 나타내면서, 상세한 설명 및 특정 실시예들은 단지 예시로서 주어진다는 것이 이해되어야 한다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양태들을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예들의 상세한 설명과 조합된 이들 도면들 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a-도 1d는 T2D 환자 및 설치류 당뇨병 모델(hIAPP 형질전환 래트(HIP) 및 마우스(hTG))에서의 β-세포가 감소된 세포 적합성을 나타낸다는 것을 입증하는 결과를 도시한다. 도 1a는 미토콘드리아 표지 Tom20에 대해 면역염색된 질병 없음(ND)에 비해 T2D 내의 섬-세포들의 공초점 이미지들을 도시하며, 이는 T2D 공여체들로부터의 섬에서 단편화된 미토콘드리아의 감소된 미토콘드리아 영역 및 핵 주위 분포를 나타낸다. 도 1b는 시호스(Seahorse)에 의해 측정된 바와 같은 기초 호흡의 -배로서 제시된 산소 소비율(OCR)을 도시하며, 이는 높은 포도당(16.7 mM)으로 자극한 후 WT 래트와 비교한 4.5개월령 HIP로부터 단리된 섬세포에서의 감소를 나타낸다. 도 1c는 FURA2 AM으로 측정한 바와 같은 시토졸 Ca2+를 도시하며, 이는 대조군 설치류 IAPP(rTG) 형질전환 마우스와 비교한 hIAPP(hTG)로부터의 섬의 증가를 나타낸다. 도 1d는 3개의 인간 비당뇨병(ND) 및 3개의 T2D 공여체 섬세포로부터의 전세포 추출물(WCE) 및 핵 분획물의 면역블롯팅 분석을 도시하며, 이는 손상 표지인: 종양 억제인자 p53, p21WAF1 및 γη2A.X(유전독성 스트레스의 표지)의 증가와 함께 PFKFB3 및 HIF1a의 증가를 나타낸다.
도 2a-도 2d는 T2D를 갖는 인간에서 β-세포가 생존 촉진 HIF1α-PFKFB3 경로에 의한 대사 재구성을 나타낸다는 결과를 도시한다. 도 2a는 PFKFB3, 인슐린 및 핵에 대해 면역염색된 비당뇨병(ND) 및 T2D 대상체로부터 섬세포(nPOD 컬렉션)의 면역형광 이미지를 도시한다. 도 2B는는 스트레스 β-세포에서 Ca2+ 항상성, 미토콘드리아 및 대사체를 제어하는 PFKFB3의 개략도를 도시한다. 도 2c 및 2d는 hIAPP 발현의 존재 또는 부재하에 HIF1α 억제(도 2c) 또는 PFKFB3 siRNA 침묵화(도 2d) 후에 TUNEL 양성 INS 832/13 세포에 의한 세포 사멸의 정량화를 도시한다.
도 3a 및 도 3b는 고지방 식이(HFD) 하에서 PFKFB3βKO hIAPP+/- 마우스의 실험 프로토콜 및 검증 결과를 도시한다. 도 3a는 실험 시각표를 도시한다. 도 3b는 hIAPP+/- 배경 및 PFKFB3(적색), 인슐린(녹색) 및 핵(청색)에 대해 면역염색된 고지방 식이(HFD)에 대한 PFKFB3WT 및 PFKFB3βKO 유래의 섬세포의 면역형광 이미지를 도시한다. PFKFB3WT hIAPP+/+를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 4a-도 4d는 고지방 식이(HFD) 하에 PFKFB3βKO IAPP+/- 마우스가 PFKFB3WT IAPP+/- 마우스에 대해 감소된 공복 혈당, 증가된 인슐린 감수성, 및 유사한 손상된 포도당 내성 및 감소된 C-펩티드 혈장 수준을 나타낸다는 것을 입증하는 결과를 도시한다. 도 4a는 공복 혈당을 도시한다. 도 4b는 복강내 포도당 내성 검사(IP-GTT) 결과를 도시한다. 도 4c는 실험 프로토콜의 말기에 측정된 혈장 C-펩티드 및 글루카곤 및 도 4d는 인슐린 내성 시험(ITT)을 도시한다.
도 5a-도 5e는 PFKFB3βKO IAPP+/- 마우스가 PFKFB3WT IAPP+/- 마우스와 비교하여 증가된 β-세포 복제를 나타낸다는 결과를 도시한다. 도 5a는 hIAPP+/- 또는 hIAPP-/- 배경 및 MCM2, 인슐린 및 핵에 대해 면역염색된 고지방 식이(HFD)에 대한 PFKFB3WT 및 PFKFB3βKO- 마우스 유래의 섬세포의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 도 5b는 부분 β-세포 영역을 도시한다. 도 5c는 β-/ α-세포 비율을 도시한다. 도 5d는 TUNEL 분석법에 의해 측정된 β-세포 비율을 도시한다. 도 5e는 소염색체 관리 단백질 2(minichromosome maintenance protein 2, MCM2) 면역염색 및 정량화(n=4, SEM *p<0.05)에 의해 측정된 β-세포 복제를 도시한다.
도 6a-도 6c는 PFKFB3βKO IAPP+/- 마우스가 남아있는 HIF1α 면역양성을 나타낸다는 결과를 도시한다. 도 6a는 hIAPP+/- 또는 hIAPP-/- 배경 및 HIF1α, 인슐린 및 핵에 대해 면역염색된 고지방 식이(HFD)에 대한 PFKFB3WT 및 PFKFB3βKO- 마우스 유래의 섬세포의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 도 6b는 특이적 항체로 면역염색 후 HIF1α-양성 β-세포의 정량화를 도시한다. 도 6c는 특정 항체로 면역염색 후 c-Myc-양성 β-세포의 정량화를 도시한다(n=4, SEM *p<0.05).
도 7a 및 도 7b는 LDHA 양성 β-세포 하위군이 T2D에서 인슐린 분비 관련 유전자가 풍부하다는 것을 나타내는 결과를 도시한다. 도 7a는 공개된 RNA-Seq 데이터로부터 β-세포의 UMAP 클러스터링이[1] LDHA 양성 β-세포와 중첩되는 클러스터 7 하위군을 식별한다는 것을 도시한다. 도 7b는 클러스터 7 대 1 및 LDHA 양성- 대 음성 β-세포에서 상향조절(UP) 또는 하향조절(DOWN)되는 상이하게 발현된 유전자의 표를 도?點磯?.
도 8a-도 8d는 고지방 식이(HFD) 하에 PFKFB3βKO hIAPP+/- 마우스에서 HIF1가 상향조절된다는 것을 나타내는 결과를 도시한다. 도 8a는 hIAPP+/- 배경 및 PFKFB3(적색), 인슐린(녹색) 및 핵(청색)에 대해 면역염색된 고지방 식이(HFD)에 대한 PFKFB3WT 및 PFKFB3βKO 유래의 섬세포의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 도 8b는 도 8a의 이미지의 정량화를 도시한다. 도 8c는 hIAPP+/- 또는 hIAPP-/- 배경 및 HIF1α, 인슐린 및 핵에 대해 면역염색된 고지방 식이(HFD)에 대한 PFKFB3WT 및 PFKFB3βKO- 마우스 유래의 섬세포의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 도 8d는 도 8a의 이미지의 정량화를 도시한다(PFKFB3βKOhIAPP+/-에 대해 n=3, n=4, SEM *p<0.05).
도 9a-도 9i는 고지방 식이(HFD) 하의 PFKFB3βKOIAPP+/-마우스가 PFKFB3WT IAPP+/- 마우스에 비해 증가된 포도당 내성 장애 및 유사한 인슐린, 감소된 글루카곤 혈장 수준을 나타냄을 입증하는 결과를 도시한다. 도 9a는 고지방 식이(HFD) 개시 후 9주째에 복막내 포도당 내성 시험(IP-GTT)의 결과를 도시한다. 도 9b는 도 9a의 실험군에서 mg/dL x 분으로서 곡선하 면적(AUC)의 정량화를 도시한다. 도 9c는 HFD 개시 이(HFD) 개시 후 12주째에 복막내 포도당 내성 시험(IP-GTT)의 결과를 도시한다. 도 9d는 9c의 실험군에서 mg/dL x 분으로서 곡선하 면적(AUC)의 정량화를 도시한다. 도 9e는 HFD 개시 후 9주째에 인슐린 내성 시험의 결과를 도시한다. 도 9f는 9e의 실험군에서 mg/dL x 분으로서 곡선하 면적(AUC)의 정량화를 도시한다. 도 9g 및 도 9h는 β-세포질량(HFD 개시 후 12주째)에 대해 제시된 공복시 혈장 인슐린(도 9g) 및 C-펩티드(도 9h)를 도시한다. 도 9i는 공복 혈장 글루카곤(HFD 개시 후 12주째)을 도시한다(PFKFB3βKO hIAPP+/-에 대해 n=3, n=4, SEM *p<0.05).
도 10a-도 10f는 PFKFB3WT IAPP+/- 마우스에 비해 세포 사멸의 증가에도 불구하고 PFKFB3βKO IAPP+/- 마우스가 증가된 β-세포/α-세포 비율을 나타냄을 입증하는 결과를 도시한다. 도 10a는 부분 β-세포 면적(%)의 정량화를 도시한다. 도 10b는 β-세포량(mg)의 정량화를 도시한다. 도 10c는 부분 β-세포 면적에 비해 상대적으로 표시되는 TUNEL 분석법(%)으로 표지화하여 측정한 β-세포 사멸의 정량화를 도시한다. 도 10d는 지시된 실험군에서 α-세포 수에 비해 상대적인 β-세포의 정량화를 도시한다. 도 10e는 hIAPP+/- 또는 hIAPP-/- 배경 및 절단된 카스파제-3, 인슐린 및 핵에 대해 면역염색된 고지방 식이(HFD)에 대한 PFKFB3WT 및 PFKFB3βKO- 마우스 유래의 섬세포의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 도 10f는 도 10e의 이미지의 정량화를 도시한다. (PFKFB3βKO hIAPP+/-에 대해 n=3, n=4, SEM *p<0.05).
도 11a-도 11d는 PFKFB3βKO IAPP+/- 마우스가 PFKFB3WT IAPP+/- 마우스와 비교하여 증가된 건강한 β-세포 복제를 나타낸다는 결과를 도시한다. 도 11a는 hIAPP+/- 또는 hIAPP-/- 배경 및 MCM2, 인슐린 및 핵에 대해 면역염색된 고지방 식이(HFD)에 대한 PFKFB3WT 및 PFKFB3βKO- 마우스 유래의 섬세포의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 도 11b는 도 11a 하의 이미지의 정량화를 도시한다. 도 11c는 hIAPP+/- 또는 hIAPP-/- 배경 및 c-Myc, 인슐린 및 핵에 대해 면역염색된 고지방 식이(HFD)에 대한 PFKFB3WT 및 PFKFB3βKO- 마우스 유래의 섬세포의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 도 11d는 도 11c에서 면역염색에 의해 밝혀진 바와 같이 hIAPP-유도된 칼페인 활성화(손상)를 겪고 있는 세포를 나타내는 세포질 c-Myc(Myc-니크)의 정량화를 도시한다(PFKFB3βKO hIAPP+/-에 대해 n=3, n=4, SEM *p<0.05).
도 12a-도 12d는 공개된 RNA-Seq 데이터로부터 β-세포의 UMAP 클러스터링이[26] LDHA 양성(HIF1α 형질이 있는 β-세포)과 중첩되는 클러스터 7 하위군을 식별함을 입증하는 결과를 도시한다. 도 12a는 건강한 및 T2D 공여체로부터의 췌장 세포의 UMAP-2 클러스터 분포를 도시한다. 도 12b는 아이덴티티 마커에 기초한 α-세포(알파), β-세포(베타), 낮은 세포수를 갖는 세포, 불확실한 정체성을 갖는 세포, 샘꽈리 세포 및 췌관 세포의 UMAP-2 분포를 도시한다. 도 12c는 아이덴티티 마커의 발현 수준에 기초한 9개의 췌장 하위군에서 췌장 세포의 UMAP-2 분포를 도시한다. 도 12d는 젖산 탈수소효소 양성 및 음성 췌장 세포(LDHA, HIF1α 형질을 나타내는 HIF1α 표적)의 UMAP-2 분포를 도시한다.
도 13a-도 13d는 ND- 또는 T2D로부터의 β-세포 하위군 간의 차등적 유전자 발현이 클러스터 7 및 LDHA 양성 β-세포가 이중 아이덴티티[인슐린(INS+) 및 글루카곤(GCG+)]을 공유한다는 것을 드러냄을 입증하는 결과를 도시한다. 클러스터 1에 비해 β-세포 클러스터 7 사이의 차등 유전자 발현은 비당뇨병(ND)(도 13a) 및 T2D(도 13b)에서 나타난다. LDHA 양성 및 음성 β-세포 클러스터 사이의 차등 유전자 발현은 비당뇨병(ND)(도 13c) 및 T2D(도 13d)에서 나타난다.
도 14a-도 14e는 PFKFB3βKO IAPP+/- 마우스가 이중 양성 인슐린+/글루카곤+ 세포의 감소를 나타냄을 입증하는 결과를 도시한다. 도 14a는 모든 단일 양성 β- 및 α-세포에 대한 단일 인슐린 양성 β-세포 사이의 비율(%)의 정량화를 도시한다. 도 14b는 모든 단일 양성 β- 및 α-세포에 대한 단일 글루카곤 양성 α-세포 사이의 비율(%)의 정량화를 도시한다. 도 14c는 각각 모든 단일 인슐린 또는 글루카곤 양성 β- 및 α-세포에 대한 이중 인슐린(INS+) 및 글루카곤(GCG+) 양성 세포 사이의 비율의 정량화(%)를 도시한다. 도 14d는 지시된 실험군에서 단일 인슐린 양성 β-세포, 단일 글루카곤 양성 α-세포 및 이중 인슐린 및 글루카곤 양성 세포의 세포 조성을 도시한다. WT, 당뇨병 전증(pre-DM) 및 당뇨병(DM)을 갖는 HFD가 없는 동형접합(hom) hIAPP+/+ 마우스(WT, hom TG-preDM 및 hom TG-DM)를 연구 실험군과의 비교에 사용하였다(PFKFB3βKO hIAPP+/-에 대한 n=3, n=4, SEM *p<0.05). 도 14e는 표시된 실험군에서 단일 인슐린 양성 β-세포, 단일 글루카곤 양성 α-세포 및 이중 인슐린 양성 및 글루카곤 양성 세포의 세포 조성을 도시한다(PFKFB3βKO DS에 대한 n=3, n=4, SEM *p<0.05).
도 15a-도 15d는 실험 과정 동안 실험군 간의 체중이 영향을 받지 않았음을 입증하는 결과를 도시한다. 기저선(t=0)(도 15a), HFD 개시 전 1주일째(도 15b), HFD의 4주(도 15c), 및 HFD의 13주(도 15d)에서 표시된 실험군의 체중을 나타낸다.
도 16a-도 16c는 실험 과정 동안 실험군 간의 장기 무게가 영향을 받지 않았음을 입증하는 결과를 도시한다. 췌장(도 16a), 간(도 16b), 및 비장(도 16c)의 지시된 실험군에서의 무게(g)를 나타낸다.
도 17a-도 17c는 각각의 공여체로부터의 세포에서 유전자 수(도 17a), 전사체 수(도 17b) 및 미토콘드리아 발현 백분율(도 17c)의 분포를 보여주는 바이올린 플롯을 도시한다.
도 18a-도 18c는 각각의 공여체로부터의 세포에서 유전자 수(도 18a), 전사체 수(도 18b) 및 미토콘드리아 발현 백분율(도 18c)의 분포를 보여주는 바이올린 플롯을 도시한다.
도 19는 백분율(%)로 제시된 건강한 및 T2D에서 9개의 주석이 달린 췌장 세포 유형의 상대적 기여를 도시한다.
도 20은 건강한 및 T2D 공여체로부터의 인간 췌도 세포의 단일 세포 RNA 서열 분석 결과를 도시한다. 표시된 클러스터를 다른 모든 클러스터와 비교하여 발현 배수 변화에 의해 마커 유전자의 순위를 매겼다. 점의 크기는 유전자가 검출된 세포의 백분율을 나타낸다. 색상 눈금은 유전자의 확장된 발현을 나타낸다.
도 21은 각 클러스터에 대한 상위 마커 유전자를 나타내는 점선도를 도시한다. 표시된 클러스터를 다른 모든 클러스터와 비교하여 발현 배수 변화에 의해 마커 유전자의 순위를 매겼다. 점의 크기는 유전자가 검출된 세포의 백분율을 나타낸다. 색상 눈금은 유전자의 확장된 발현을 나타낸다.
도 22a 및 도 22b는 건강한(ND)(도 22a) 및 제2형 당뇨병(T2D)(도 22b)에서 클러스터 7 대 클러스터 1에서 상이하게 발현된 유전자 사이의 관계를 제시하기 위한 STRING 분석의 결과를 도시한다.
도 23a 및 도 23b는 건강한(ND)(도 23a) 및 제2형 당뇨병(T2D)(도 23b)에서 LDHA 양성(클러스터 7) 및 LDHA 음성 β-세포(클러스터 1)에서 상이하게 발현된 유전자 사이의 관계를 제시하기 위한 STRING 분석의 결과를 도시한다.
도 24a 및 도 24b는 클러스터 1(도 24a) 또는 LDHA 음성(도 24b) β-세포에서 건강한(ND) 대상체에서 차등적으로 발현된 유전자 사이의 관계를 제시하기 위한 STRING 분석의 결과를 도시한다.
도 25는 스트레스 하에서의 β-세포 보충에서 β-세포 적합성 비교의 역할에 대해 본원에 개시된 모델의 개략도이다.
본 개시는, 적어도 부분적으로, 영향을 받는 β-세포가 HIF1α-PFKFB3 손상/복구 반응의 활성화로 인한 나머지 건강한 β-세포와의 세포 경쟁에 의한 정제 선택을 받지 못한 결과로서 T2D에서의 β-세포 기능장애를 식별하는 것에 기초한다. 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 재구성된 대사를 갖는 손상된 β-세포는 β-세포가 글루코스에 반응하지 않게 하는 TCA 주기로부터 분리되는 높은 해당을 통해 포획되고, HIF1α-PFKFB3 경로의 만성 활성화는 손상된 β-세포를 퍼징하는데 필요한 항상성 세포 경쟁을 방지하는 것으로 여겨진다. T2D에서 손상된 β-세포의 생존이 HIF1α-PFKFB3 경로에 의존한다는 것을 고려하면, 상기 HIF1α-PFKFB3 손상/복구 경로는 손상된 β-세포로 하여금 세포 경쟁에 의한 선택을 피하는 것을 돕고, 재구성된 대사에 의해 세포 경쟁을 억제하는 것은 β-세포 재생을 저해하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예들에서, HIF1α-PFKFB3 경로의 억제, 예컨대, HIF1α 억제, PFKFB3 억제, 및 이들의 조합에 의해 β-세포 재생을 용이하게 하는 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 본 개시의 양태들은 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병을 포함하여, 당뇨병을 앓고 있는 대상체의 치료를 제공함으로써 당업계의 다양한 요구를 처리한다.
I. 치료 방법
본 개시의 양태들은 특정 질병 및 장애의 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 단백질 접힙 오류와 연관된(예컨대, 이를 특징으로 하는) 장애를 갖는 대상체의 치료 방법이 개시된다. 일부 구현예들에서, 단백질 접힘 오류와 연관된 장애는 당뇨병 및 연관된 병태(예컨대, 당뇨병 전증, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병)를 포함한다. 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방과 관련하여 종종 설명되었지만, 개시된 방법 및 조성물은 또한 제1형 당뇨병 및 당뇨병 전증을 포함하는 단백질 접힘 오류와 연관된 다른 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
일부 구현예들에서, 제2형 당뇨병(T2D)에 대한 대상체를 치료하고, 그리고/또는 대상체에게 T2D가 발병하는 것을 예방하는 방법으로서, 상기 대상체의 세포에서 HIF1α-PFKFB3 경로를 억제할 수 있는 하나 이상의 작용제를 제공하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예들에서, 대상체는 T2D에 대해 진단되었다. 일부 구현예들에서, 대상체는 T2D가 발병할 위험이 있다. 일부 구현예들에서, 대상체는 당뇨병 전증을 가진다. 일부 구현예들에서, 대상체는 T2D 하위유형 1, 하위유형 2, 또는 하위유형 3을 가진다. T2D 하위유형은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, Li L, Cheng WY, Glicksberg BS, et al. Sci Transl Med. 2015;7(311):311ra174에 기재되어 있고, 이는 그 전체가 본원에 원용된다. 일부 구현예들에서, 대상체는 T2D 하위유형 1을 가진다. 일부 구현예들에서, 대상체는 T2D 하위유형 2을 가진다. 일부 구현예들에서, 대상체는 T2D 하위유형 3을 가진다. 일부 구현예들에서, 대상체는 T2D 하위유형 1을 갖지 않는다. 일부 구현예들에서, 대상체는 T2D 하위유형 2을 갖지 않는다. 일부 구현예들에서, 대상체는 T2D 하위유형 3을 갖지 않는다.
본원에서 인식되는 바와 같이, HIF1α-PFKFB3 경로의 억제는 건강하지 않은 β-세포의 사멸을 향상시키고 T2D에서 건강한 β-세포의 재생에 기여한다. 일부 구현예들에서, 건강하지 않은 β-세포는 PFKFB3을 발현하는 β-세포(예컨대, T2D를 갖지 않는 대상체로부터의 β-세포보다 더 높은 PFKFB3의 발현 수준을 가짐)를 기재한다. 일부 구현예들에서, 건강한 β-세포는 PFKFB3을 발현하지 않거나 또는 T2D를 갖지 않는 대상체로부터의 β-세포와 유의적으로 상이하지 않은 PFKFB3의 발현 수준을 갖는 β-세포를 기재한다. T2D에 대한 대상체의 치료는 상기 대상체에서 T2D의 증상을 개선하는 것, 예를 들어, 상기 대상체에서 인슐린 감수성을 증가시키는 것을 포함할 수 있다.
T2D에 대한 대상체를 치료하는 방법은 유효량의 HIF1α 억제제를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, HIF1α 억제제를 제공하는 단계는 상기 대상체의 β-세포에서 PFKFB3 수준을 감소시킨다. T2D에 대한 대상체를 치료하는 방법은 유효량의 PFKFB3 억제제를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 개시된 방법은 대상체에게 HIF1α 억제제 및 PFKFB3 억제제 둘 모두를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 HIF1α 억제제 및 상기 PFKFB3 억제제는 순차적으로 또는 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 상기 HIF1α 억제제 및 상기 PFKFB3 억제제는 동일한 조성물로 제공되거나 별도의 조성물로 제공될 수 있다.
일부 구현예들에서, 본원에 기재된 바와 같이 치료되는 대상체는 암을 가지지 않거나 암으로 진단되지 않았다. 일부 구현예들에서, 본원에 기재된 바와 같이 치료되는 대상체는 당뇨병성 신증 또는 당뇨병성 망막증을 갖지 않거나 또는 당뇨병성 망막증으로 진단되지 않았다.
개시된 방법의 양태들은, 추가의 구현예들에서, 대상체에서 PFKFB3의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, PFKFB3 발현 수준은 대상체로부터의 β-세포에서 측정된다. 일부 구현예들에서, PFKFB3 발현 수준은 대상체를 T2D를 갖는 것으로 식별하기 위해 사용된다. 일부 구현예들에서, PFKFB3 발현 수준을 사용하여 대상체가 HIF1α 및/또는 PFKFB3 억제제를 포함하는 치료에 민감할 것인지 여부를 결정한다. 일부 구현예들에서, 대상체로부터의 β-세포는 건강한 또는 대조군 대상체에 비해 증가된 PFKFB3 발현 수준을 갖는 것으로 결정된다. 일부 구현예들에서, 건강한 대상체는 당뇨병 또는 당뇨병 전증을 갖지 않는 대상체이다. 일부 구현예들에서, 건강한 대상체는 T2D를 갖지 않는 대상체이다. 일부 구현예들에서, 대상체로부터의 β-세포는 상기 대상체로부터의 대조군 세포에 비해 증가된 PFKFB3 발현 수준을 갖는 것으로 결정된다.
일부 구현예들에서, 대상체는 하나 이상의 추가의 요법, 예컨대, 제2형 당뇨병 요법과 함께 HIF1α 억제제 및/또는 PFKFB3 억제제로 치료된다. 일부 구현예들에서, 대상체는 GLP-1 수용체 작용제와 함께 HIF1α 억제제 및/또는 PFKFB3 억제제로 치료된다. 일부 구현예들에서, 대상체는 메트포르민과 함께 HIF1α 억제제 및/또는 PFKFB3 억제제로 치료된다. 일부 구현예들에서, 대상체는 인슐린과 함께 HIF1α 억제제 및/또는 PFKFB3 억제제로 치료된다. 일부 구현예들에서, 대상체는 DPP-4 억제제와 함께 HIF1α 억제제 및/또는 PFKFB3 억제제로 치료된다.
II. HIF1α
저산소증 유도성 인자 1-알파(HIF1α; 또한 HIF1A)는 저산소증에 대한 적응 반응에 관여하는 유전자를 포함하는, 다양한 유전자의 전사 조절에 관여하는 전사 인자이다.
하기의 서열은 인간에서 HIF1α mRNA를 예시한다(서열번호 1):
AGTGCACAGTGCTGCCTCGTCTGAGGGGACAGGAGGATCACCCTCTTCGTCGCTTCGGCCAGTGTGTCGGGCTGGGCCCTGACAAGCCACCTGAGGAGAGGCTCGGAGCCGGGCCCGGACCCCGGCGATTGCCGCCCGCTTCTCTCTAGTCTCACGAGGGGTTTCCCGCCTCGCACCCCCACCTCTGGACTTGCCTTTCCTTCTCTTCTCCGCGTGTGGAGGGAGCCAGCGCTTAGGCCGGAGCGAGCCTGGGGGCCGCCCGCCGTGAAGACATCGCGGGGACCGATTCACCATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGAACGACAAGAAAAAGATAAGTTCTGAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGAGATGCAGCCAGATCTCGGCGAAGTAAAGAATCTGAAGTTTTTTATGAGCTTGCTCATCAGTTGCCACTTCCACATAATGTGAGTTCGCATCTTGATAAGGCCTCTGTGATGAGGCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTGAGGAAACTTCTGGATGCTGGTGATTTGGATATTGAAGATGACATGAAAGCACAGATGAATTGCTTTTATTTGAAAGCCTTGGATGGTTTTGTTATGGTTCTCACAGATGATGGTGACATGATTTACATTTCTGATAATGTGAACAAATACATGGGATTAACTCAGTTTGAACTAACTGGACACAGTGTGTTTGATTTTACTCATCCATGTGACCATGAGGAAATGAGAGAAATGCTTACACACAGAAATGGCCTTGTGAAAAAGGGTAAAGAACAAAACACACAGCGAAGCTTTTTTCTCAGAATGAAGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAAGAACTATGAACATAAAGTCTGCAACATGGAAGGTATTGCACTGCACAGGCCACATTCACGTATATGATACCAACAGTAACCAACCTCAGTGTGGGTATAAGAAACCACCTATGACCTGCTTGGTGCTGATTTGTGAACCCATTCCTCACCCATCAAATATTGAAATTCCTTTAGATAGCAAGACTTTCCTCAGTCGACACAGCCTGGATATGAAATTTTCTTATTGTGATGAAAGAATTACCGAATTGATGGGATATGAGCCAGAAGAACTTTTAGGCCGCTCAATTTATGAATATTATCATGCTTTGGACTCTGATCATCTGACCAAAACTCATCATGATATGTTTACTAAAGGACAAGTCACCACAGGACAGTACAGGATGCTTGCCAAAAGAGGTGGATATGTCTGGGTTGAAACTCAAGCAACTGTCATATATAACACCAAGAATTCTCAACCACAGTGCATTGTATGTGTGAATTACGTTGTGAGTGGTATTATTCAGCACGACTTGATTTTCTCCCTTCAACAAACAGAATGTGTCCTTAAACCGGTTGAATCTTCAGATATGAAAATGACTCAGCTATTCACCAAAGTTGAATCAGAAGATACAAGTAGCCTCTTTGACAAACTTAAGAAGGAACCTGATGCTTTAACTTTGCTGGCCCCAGCCGCTGGAGACACAATCATATCTTTAGATTTTGGCAGCAACGACACAGAAACTGATGACCAGCAACTTGAGGAAGTACCATTATATAATGATGTAATGCTCCCCTCACCCAACGAAAAATTACAGAATATAAATTTGGCAATGTCTCCATTACCCACCGCTGAAACGCCAAAGCCACTTCGAAGTAGTGCTGACCCTGCACTCAATCAAGAAGTTGCATTAAAATTAGAACCAAATCCAGAGTCACTGGAACTTTCTTTTACCATGCCCCAGATTCAGGATCAGACACCTAGTCCTTCCGATGGAAGCACTAGACAAAGTTCACCTGAGCCTAATAGTCCCAGTGAATATTGTTTTTATGTGGATAGTGATATGGTCAATGAATTCAAGTTGGAATTGGTAGAAAAACTTTTTGCTGAAGACACAGAAGCAAAGAACCCATTTTCTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAGATGTTAGCTCCCTATATCCCAATGGATGATGACTTCCAGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTCACCATTAGAAAGCAGTTCCGCAAGCCCTGAAAGCGCAAGTCCTCAAAGCACAGTTACAGTATTCCAGCAGACTCAAATACAAGAACCTACTGCTAATGCCACCACTACCACTGCCACCACTGATGAATTAAAAACAGTGACAAAAGACCGTATGGAAGACATTAAAATATTGATTGCATCTCCATCTCCTACCCACATACATAAAGAAACTACTAGTGCCACATCATCACCATATAGAGATACTCAAAGTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGCAGGAAAAGGAGTCATAGAACAGACAGAAAAATCTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTTATCTGTCGCTTTGAGTCAAAGAACTACAGTTCCTGAGGAAGAACTAAATCCAAAGATACTAGCTTTGCAGAATGCTCAGAGAAAGCGAAAAATGGAACATGATGGTTCACTTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGAACATTATTACAGCAGCCAGACGATCATGCAGCTACTACATCACTTTCTTGGAAACGTGTAAAAGGATGCAAATCTAGTGAACAGAATGGAATGGAGCAAAAGACAATTATTTTAATACCCTCTGATTTAGCATGTAGACTGCTGGGGCAATCAATGGATGAAAGTGGATTACCACAGCTGACCAGTTATGATTGTGAAGTTAATGCTCCTATACAAGGCAGCAGAAACCTACTGCAGGGTGAAGAATTACTCAGAGCTTTGGATCAAGTTAACTGAGCTTTTTCTTAATTTCATTCCTTTTTTTGGACACTGGTGGCTCATTACCTAAAGCAGTCTATTTATATTTTCTACATCTAATTTTAGAAGCCTGGCTACAATACTGCACAAACTTGGTTAGTTCAATTTTGATCCCCTTTCTACTTAATTTACATTAATGCTCTTTTTTAGTATGTTCTTTAATGCTGGATCACAGACAGCTCATTTTCTCAGTTTTTTGGTATTTAAACCATTGCATTGCAGTAGCATCATTTTAAAAAATGCACCTTTTTATTTATTTATTTTTGGCTAGGGAGTTTATCCCTTTTTCGAATTATTTTTAAGAAGATGCCAATATAATTTTTGTAAGAAGGCAGTAACCTTTCATCATGATCATAGGCAGTTGAAAAATTTTTACACCTTTTTTTTCACATTTTACATAAATAATAATGCTTTGCCAGCAGTACGTGGTAGCCACAATTGCACAATATATTTTCTTAAAAAATACCAGCAGTTACTCATGGAATATATTCTGCGTTTATAAAACTAGTTTTTAAGAAGAAATTTTTTTTGGCCTATGAAATTGTTAAACCTGGAACATGACATTGTTAATCATATAATAATGATTCTTAAATGCTGTATGGTTTATTATTTAAATGGGTAAAGCCATTTACATAATATAGAAAGATATGCATATATCTAGAAGGTATGTGGCATTTATTTGGATAAAATTCTCAATTCAGAGAAATCATCTGATGTTTCTATAGTCACTTTGCCAGCTCAAAAGAAAACAATACCCTATGTAGTTGTGGAAGTTTATGCTAATATTGTGTAACTGATATTAAACCTAAATGTTCTGCCTACCCTGTTGGTATAAAGATATTTTGAGCAGACTGTAAACAAGAAAAAAAAAATCATGCATTCTTAGCAAAATTGCCTAGTATGTTAATTTGCTCAAAATACAATGTTTGATTTTATGCACTTTGTCGCTATTAACATCCTTTTTTTCATGTAGATTTCAATAATTGAGTAATTTTAGAAGCATTATTTTAGGAATATATAGTTGTCACAGTAAATATCTTGTTTTTTCTATGTACATTGTACAAATTTTTCATTCCTTTTGCTCTTTGTGGTTGGATCTAACACTAACTGTATTGTTTTGTTACATCAAATAAACATCTTCTGTGGACCAGG
단백질 서열은 하기(서열번호 2)에 의해 예시된다:
MEGAGGANDKKKISSERRKEKSRDAARSRRSKESEVFYELAHQLPLPHNVSSHLDKASVMRLTISYLRVRKLLDAGDLDIEDDMKAQMNCFYLKALDGFVMVLTDDGDMIYISDNVNKYMGLTQFELTGHSVFDFTHPCDHEEMREMLTHRNGLVKKGKEQNTQRSFFLRMKCTLTSRGRTMNIKSATWKVLHCTGHIHVYDTNSNQPQCGYKKPPMTCLVLICEPIPHPSNIEIPLDSKTFLSRHSLDMKFSYCDERITELMGYEPEELLGRSIYEYYHALDSDHLTKTHHDMFTKGQVTTGQYRMLAKRGGYVWVETQATVIYNTKNSQPQCIVCVNYVVSGIIQHDLIFSLQQTECVLKPVESSDMKMTQLFTKVESEDTSSLFDKLKKEPDALTLLAPAAGDTIISLDFGSNDTETDDQQLEEVPLYNDVMLPSPNEKLQNINLAMSPLPTAETPKPLRSSADPALNQEVALKLEPNPESLELSFTMPQIQDQTPSPSDGSTRQSSPEPNSPSEYCFYVDSDMVNEFKLELVEKLFAEDTEAKNPFSTQDTDLDLEMLAPYIPMDDDFQLRSFDQLSPLESSSASPESASPQSTVTVFQQTQIQEPTANATTTTATTDELKTVTKDRMEDIKILIASPSPTHIHKETTSATSSPYRDTQSRTASPNRAGKGVIEQTEKSHPRSPNVLSVALSQRTTVPEEELNPKILALQNAQRKRKMEHDGSLFQAVGIGTLLQQPDDHAATTSLSWKRVKGCKSSEQNGMEQKTIILIPSDLACRLLGQSMDESGLPQLTSYDCEVNAPIQGSRNLLQGEELLRALDQVN
A. HIF1α 억제제
HIF1α 억제제는 HIF1α 활성에 대한 IC50이 200 μΜ 이하의 농도, 예를 들어, 적어도 또는 최대 또는 약 200, 100, 80, 50, 40, 20, 10, 5, 1 μΜ, 100, 10, 1 nM 또는 그 미만의 농도(또는 이로부터 추론가능한 임의의 범위 또는 값)인 갖는 화합물 또는 제제의 부류의 임의의 구성요소를 지칭할 수 있다. HIF1α 억제제는 HIF1α의 발현을 억제하는 임의의 화합물 또는 제제를 지칭할 수 있다. HIF1α 활성 또는 기능의 억제제의 예는 HIF1α/HIF1β 이량체화를 방지하는 제제, 단백질 발현을 감소시키거나 제거하는 제제, HIF1α 분해(예컨대, 프로테오좀 분해)를 촉진하는 제제, HIF1α로 하여금 DNA와 상호작용하는 것을 방지하는 제제, 및 HIF1α 전사 활성을 억제하는 제제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예들에서, HIF1α 억제제는 HIF1α에 직접 결합하는 제제이다. 일부 구현예들에서, HIF1α 억제제는 HIF1α에 직접 결합하지 않는다. 예시적인 HIF1α 억제제는, 예를 들어, Onnis et al., J. Cell. Mol. Med. 2009 13(9a): 2780-2786에 기재되어 있고, 이는 그 전체가 본원에 원용된다. 본 개시의 방법 및 조성물은 하나 이상의 HIF1α 억제제를 포함할 수 있다. 개시된 HIF1α 억제제 중 하나 이상은 본 개시의 특정 구현예들로부터 배제될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다. 또한, 본원에 기재된 HIF1α 억제제의 약학적으로 허용가능한 염 및 전구약물이 고려된다. 특정 예시적인 HIF1α 억제제가 본원에 기재되지만, 임의의 HIF1α 억제제가 본 개시의 특정 구현예들에서 구현될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 구현예들에서, HIF1α 억제제는 표적화 분자에 작동적으로 연결(예컨대, 공유적으로 연결, 비공유적으로 연결 등)된다. 표적화 분자는 특정 생물학적 또는 세포성 표적에 결합하도록 설계된 분자를 기재한다. 표적화 분자는 제제(예컨대, 치료제, 예컨대, HIF1α 억제제)를 특정 생물학적 조직 또는 세포 유형(예컨대, β-세포)에 특이적으로 지향시키거나 표적화하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 표적화 분자는 대상체의 β-세포에 결합하도록 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 표적화 분자는 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 수용체에 결합하여, HIF1α 억제제를 상기 대상체의 β-세포에 표적화하도록 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 표적화 분자는 항체, 항체 단편, 또는 항체-유사 분자이다.
B. HIF1α 억제 핵산
당업계에 공지된 HIF1α의 유전자 발현을 억제하는 억제 핵산 또는 임의의 방법이 특정 구현예들에서 고려된다. 억제성 핵산의 예는 안티센스 핵산, 예컨대, siRNA(짧은 간섭 RNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 이중-가닥 RNA, 및 임의의 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 임의의 억제제를 인코딩하는 리보자임 또는 핵산이 또한 포함된다. 억제성 핵산은 유전자의 전사를 억제하거나 세포에서 유전자 전사체의 번역을 방지할 수 있다. 억제성 핵산은 16 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이, 특정 구현예들에서는 18 내지 100개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 상기 핵산은 적어도 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 이로부터 추론가능한 임의의 범위의 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된"은 인간의 개입을 통해 자연 상태로부터 변경되거나 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 자연적으로 존재하는 siRNA는 "단리된" 것이 아니라, 합성 siRNA, 또는 이의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 단리된 siRNA는 "단리된"이다. 단리된 siRNA는 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어, 이에 siRNA가 전달된 세포와 같은 비자연 환경에 존재할 수 있다.
억제 핵산은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, siRNA 및 이중-가닥 RNA는 미국 특허 제6,506,559호 및 6,573,099호, 및 미국 특허 공보 제2003/0051263호, 2003/0055020호, 2004/0265839호, 2002/0168707호, 2003/0159161호, 및 2004/0064842호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 원용된다.
특히, 억제성 핵산은 HIF1α의 발현을 적어도 10%, 20%, 30%, 또는 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 또는 여기서 추론가능한 임의의 범위 또는 값만큼 감소시킬 수 있다.
추가의 구현예들에서, HIF1α 억제제인 합성 핵산이 있다. 억제제는 17 내지 25개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있고, 성숙한 HIF1α mRNA의 5' 내지 3' 서열의 임의의 부분에 적어도 90% 상보적인 5' 내지 3' 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 억제제 분자는 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 뉴클레오티드 길이, 또는 여기서 추론가능한 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다. 또한, 억제제 분자는 성숙한 HIF1α mRNA, 특히 성숙한, 자연 발생 mRNA의 5' 내지 3' 서열 중 임의의 부분에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100% 상보적이거나 적어도 그 이상 상보적이거나 또는 여기서 추론가능한 임의의 범위인 서열(5' 내지 3')을 갖는다. 당업자는 mRNA 억제제에 대한 서열로서 성숙한 mRNA의 서열에 상보적인 프로브 서열의 일부를 사용할 수 있다. 또한, 프로브 서열의 상기 부분은 성숙한 mRNA의 서열에 대해 여전히 90% 상보적이 되도록 변경될 수 있다.
예시적인 HIF1α 억제 핵산은 EZN-2698을 포함한다.
C. HIF1α 억제 폴리펩티드
특정 구현예들에서, HIF1α 억제제 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 일부 구현예들에서, 상기 HIF1α 억제제 폴리펩티드는 HIF1α 항체이다. 일부 구현예들에서, 항-HIF1α 항체는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 키메라 항체, 친화성 성숙된 항체, 인간화된 항체, 또는 인간 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 억제제 폴리펩티드는 항체-유사 분자이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체-유사체는 나노바디이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 항체 단편이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 또는 scFv를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 항체는 키메라 항체, 예를 들어, 이종 비인간, 인간 또는 인간화 서열(예컨대, 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열)에 이식된 비인간 공여체로부터의 항원 결합 서열을 포함하는 항체이다. 일 구현예에서, 상기 비인간 공여체는 마우스이다. 일 구현예에서, 항원 결합 서열은 합성이며, 예컨대, 돌연변이유발(예컨대, 파지 디스플레이 선별검사 등)에 의해 수득된다. 일 구현예에서, 키메라 항체는 뮤린 V 영역 및 인간 C 영역을 가진다. 일 구현예에서, 뮤린 경쇄 V 영역은 인간 카파 경쇄 또는 인간 IgG1 C 영역에 융합된다.
항체 단편의 예는, 제한 없이: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 "Fd" 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 "Fv" 단편; (iv) VH 도메인으로 구성된 "dAb" 단편; (v) 단리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인은 상기 두 도메인으로 하여금 서로 연결되어 결합 도메인을 형성하도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결되는 단일 사슬 Fv 분자("scFv"); (viii) 이중특이적 단일 사슬 Fv 이량체(미국 특허 제5,091,513호를 참조), 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축되는 디아바디, 다가 또는 다중특이적 단편(미국 특허 공보 제2005/0214860호)를 포함한다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 결합의 혼입에 의해 안정화될 수 있다. CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디가 또한 제조될 수 있다(Hu et al, 1996).
일부 구현예들에서, 예컨대, 당뇨병의 치료에 있어서 항-HIF1α 나노바디의 사용이 개시된다.
D. HIF1α 억제성 소분자
본원에 사용되는 바와 같이, "소분자"는 종래의 유기 화학 방법(예컨대, 실험실에서)을 통해 합성되거나 자연에서 발견되는 유기 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 소분자는 여러 개의 탄소-탄소 결합을 함유하고, 약 1500 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 소분자는 약 1000 그램/몰 미만이다. 특정 구현예들에서, 소분자는 약 550 그램/몰 미만이다. 특정 구현예들에서, 소분자는 약 200 내지 약 550 그램/몰이다. 특정 구현예들에서, 소분자는 펩티드(예컨대, 펩티딜 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물)를 배제한다. 특정 구현예들에서, 소분자는 핵산을 배제한다.
예를 들어, 소분자 HIF1α 억제제는 HIF1α 기능 또는 활성을 억제하는 것으로 결정된 임의의 소분자일 수 있다. 상기 소분자는 시험관내 또는 생체내에서 기능적 분석법에 기초하여 결정될 수 있다. 특정 HIF1α 억제 분자(즉, HIF1α 억제제)는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, KC7F2, IDF-11774, 아미노플라본, AJM290, AW464, 타네스피마이신, 알베스피마이신, PX-478, FM19G11, 레스베라트롤, 라파마이신, 에베롤리무스, CCI779, 실리비닌, 디곡신, YC-1, 페네틸 이소티오시아나이트, 케토민, 플라보피리돌, 보르테조밉, 암포테리신 B, 베이 87-2243, PX-478, 및 가네타시피브를 포함한다.
본원에 기재된 하나 이상의 HIF1α 억제제는 본 개시의 특정 구현예들로부터 배제될 수 있다.
III. PFKFB3
PFKFB3는 또한 6-포스포프럭토-2-키나제/프럭토스-2,6-비포스파타제 3, 6PF-2-K/Fru-2,6-P2ase 뇌/태반형 동질효소, 신장 암종 항원 NY-REN-56, 6PF-2-K/Fru-2,6-P2ase 3, PFK/FBPase 3, IPFK-2, 유도성 6-포스포프럭토-2-키나제/프럭토스-2,6-비스포스파타제 3, 프럭토스-6-포스페이트, 2-키나제/프럭토스-2, 6-비스포스파타제 3, 6-포스포프럭토-2-키나제/프럭토스-2,6-비스포스파타제 3, IPFK2 및 PFK2로 지칭된다.
하기의 서열은 인간에서 PFKFB3 mRNA를 예시한다(서열번호 3):
ccctttcccc tccctcgccc gccccgccgc ccgcaggcgc cccgagtcgc ggggctgccg cttggacgtc gtcctgtctg ggtgtcgcgg gccggccccg cggggagcgc ccccggcgcg atgcccttca ggaaagcctg tgggccaaag ctgaccaact cccccaccgt catcgtcatg gtgggcctcc ccgcccgggg caagacctac atctccaaga agctgactcg ctacctcaac tggattggcg tccccacaaa agtgttcaac gtcggggagt atcgccggga ggctgtgaag cagtacagct cctacaactt cttccgcccc gacaatgagg aagccatgaa agtccggaag caatgtgcct tagctgcctt gagagatgtc aaaagctacc tggcgaaaga agggggacaa attgcggttt tcgatgccac caatactact agagagagga gacacatgat ccttcatttt gccaaagaaa atgactttaa ggcgtttttc atcgagtcgg tgtgcgacga ccctacagtt gtggcctcca atatcatgga agttaaaatc tccagcccgg attacaaaga ctgcaactcg gcagaagcca tggacgactt catgaagagg atcagttgct atgaagccag ctaccagccc ctcgaccccg acaaatgcga cagggacttg tcgctgatca aggtgattga cgtgggccgg aggttcctgg tgaaccgggt gcaggaccac atccagagcc gcatcgtgta ctacctgatg aacatccacg tgcagccgcg taccatctac ctgtgccggc acggcgagaa cgagcacaac ctccagggcc gcatcggggg cgactcaggc ctgtccagcc ggggcaagaa gtttgccagt gctctgagca agttcgtgga ggagcagaac ctgaaggacc tgcgcgtgtg gaccagccag ctgaagagca ccatccagac ggccgaggcg ctgcggctgc cctacgagca gtggaaggcg ctcaatgaga tcgacgcggg cgtctgtgag gagctgacct acgaggagat cagggacacc taccctgagg agtatgcgct gcgggagcag gacaagtact attaccgcta ccccaccggg gagtcctacc aggacctggt ccagcgcttg gagccagtga tcatggagct ggagcggcag gagaatgtgc tggtcatctg ccaccaggcc gtcctgcgct gcctgcttgc ctacttcctg gataagagtg cagaggagat gccctacctg aaatgccctc ttcacaccgt cctgaaactg acgcctgtcg cttatggctg ccgtgtggaa tccatctacc tgaacgtgga gtccgtctgc acacaccggg agaggtcaga ggatgcaaag aagggaccta acccgctcat gagacgcaat agtgtcaccc cgctagccag ccccgaaccc accaaaaagc ctcgcatcaa cagctttgag gagcatgtgg cctccacctc ggccgccctg cccagctgcc tgcccccgga ggtgcccacg cagctgcctg gacaaaacat gaaaggctcc cggagcagcg ctgactcctc caggaaacac tgaggcagac gtgtcggttc cattccattt ccatttctgc agcttagctt gtgtcctgcc ctccgcccga ggcaaaacgt atcctgagga cttcttccgg agagggtggg gtggagcagc gggggagcct tggccgaaga gaaccatgct tggcaccgtc tgtgtcccct cggccgctgg acaccagaaa gccacgtggg tccctggcgc cctgccttta gccgtggggc ccccacctcc actctctggg tttcctagga atgtccagcc tcggagacct tcacaaagcc ttgggagggt gatgagtgct ggtcctgaca ggaggccgct ggggacactg tgctgttttg tttcgtttct gtgatctccc ggcacgtttg gagctgggaa gaccacactg gtggcagaat cctaaaatta aaggaggcag gctcctagtt gctgaaagtt aaggaatgtg taaaacctcc acgtgactgt ttggtgcatc ttgacctggg aagacgcctc atgggaacga acttggacag gtgttgggtt gaggcctctt ctgcaggaag tccctgagct gagacgcaag ttggctgggt ggtccgcacc ctggctctcc tgcaggtcca cacaccttcc aggcctgtgg cctgcctcca aagatgtgca agggcaggct ggctgcacgg ggagagggaa gtattttgcc gaaatatgag aactggggcc tcctgctccc agggagctcc agggcccctc tctcctccca cctggacttg gggggaactg agaaacactt tcctggagct gctggctttt gcactttttt gatggcagaa gtgtgacctg agagtcccac cttctcttca ggaacgtaga tgttggggtg tcttgccctg gggggcttgg aacctctgaa ggtggggagc ggaacacctg gcatccttcc ccagcacttg cattaccgtc cctgctcttc ccaggtgggg acagtggccc aagcaaggcc tcactcgcag ccacttcttc aagagctgcc tgcacactgt cttggagcat ctgccttgtg cctggcactc tgccggtgcc ttgggaaggt cggaagagtg gactttgtcc tggccttccc ttcatggcgt ctatgacact tttgtggtga tggaaagcat gggacctgtc gtctcagcct gttggtttct cctcattgcc tcaaaccctg gggtaggtgg gacggggggt ctcgtgccca gatgaaacca tttggaaact cggcagcaga gtttgtccaa atgacccttt tcaggatgtc tcaaagcttg tgccaaaggt cacttttctt tcctgccttc tgctgtgagc cctgagatcc tcctcccagc tcaagggaca ggtcctgggt gagggtggga gatttagaca cctgaaactg ggcgtggaga gaagagccgt tgctgtttgt tttttgggaa gagcttttaa agaatgcatg tttttttcct ggttggaatt gagtaggaac tgaggctgtg cttcaggtat ggtacaatca agtgggggat tttcatgctg aaccattcaa gccctccccg cccgttgcac ccactttggc tggcgtctgc tggagaggat gtctctgtcc gcattcccgt gcagctccag gctcgcgcag ttttctctct ctccctggat gttgagtctc atcagaatat gtgggtaggg ggtggacgtg cacgggtgca tgattgtgct taacttggtt gtatttttcg atttgacatg gaaggcctgt tgctttgctc ttgagaatag tttctcgtgt ccccctcgca ggcctcattc tttgaacatc gactctgaag tttgatacag ataggggctt gatagctgtg gtcccctctc ccctctgact acctaaaatc aatacctaaa tacagaagcc ttggtctaac acgggacttt tagtttgcga agggcctaga tagggagaga ggtaacatga atctggacag ggagggagat actatagaaa ggagaacact gcctactttg caagccagtg acctgccttt tgaggggaca ttggacgggg gccgggggcg ggggttgggt ttgagctaca gtcatgaact tttggcgtct actgattcct ccaactctcc accccacaaa ataacgggga ccaatatttt taactttgcc tatttgtttt tgggtgagtt tcccccctcc ttattctgtc ctgagaccac gggcaaagct cttcattttg agagagaaga aaaactgttt ggaaccacac caatgatatt tttctttgta atacttgaaa tttatttttt tattattttg atagcagatg tgctatttat ttatttaata tgtataagga gcctaaacaa tagaaagctg tagagattgg gtttcattgt taattggttt gggagcctcc tatgtgtgac ttatgacttc tctgtgttct gtgtatttgt ctgaattaat gacctgggat ataaagctat gctagctttc aaacaggaga tgcctttcag aaatttgtat attttgcagt tgccagacca ataaaatacc tggttgaaat acatggacga agtaaa.
단백질 서열은 하기(서열번호 4)에 의해 예시된다:
MPFRKACGPKLTNSPTVIVMVGLPARGKTYISKKLTRYLNWIGVPTKVFNVGEYRREAVKQYSSYNFFRPDNEEAMKVRKQCALAALRDVKSYLAKEGGQIAVFDATNTTRERRHMILHFAKENDFKAFFIESVCDDPTVVASNIMEVKISSPDYKDCNSAEAMDDFMKRISCYEASYQPLDPDKCDRDLSLIKVIDVGRRFLVNRVQDHIQSRIVYYLMNIHVQPRTIYLCRHGENEHNLQGRIGGDSGLSSRGKKFASALSKFVEEQNLKDLRVWTSQLKSTIQTAEALRLPYEQWKALNEIDAGVCEELTYEEIRDTYPEEYALREQDKYYYRYPTGESYQDLVQRLEPVIMELERQENVLVICHQAVLRCLLAYFLDKSAEEMPYLKCPLHTVLKLTPVAYGCRVESIYLNVESVCTHRERSEDAKKGPNPLMRRNSVTPLASPEPTKKPRINSFEEHVASTSAALPSCLPPEVPTQLPGQNMKGSRSSADSSRKH.
상기 단백질 및 mRNA 서열은 상기 유전자의 하나의 동형(동형 2)을 나타내지만, 다른 동형들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 하기의 Genbank 번호는 추가 동형을 나타낸다. 상기 Genbank 번호들과 연관된 서열들은 모든 목적을 위해 원용된다.
Figure pct00001
상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 진핵생물에서 해당을 제어하는 조절 분자인 프럭토스-2,6-비스포스페이트의 합성 및 분해 둘 모두에 관여하는 이기능성 단백질의 계열에 속한다. 인코딩된 단백질은 프럭토스-2,6-비스포스페이트(F2,6BP)의 합성을 촉매하는 6-포스포프럭토-2-키나제 활성 및 F2,6BP의 분해를 촉매하는 프럭토스-2,6-비포스파타제 활성을 갖는다. 상기 단백질은 세포 주기 진행 및 세포자멸사의 예방에 필요하다. 시클린-의존성 키나제 1의 조절제로 기능하여 포도당 대사를 종양 세포에서의 세포 증식 및 생존에 연결시킨다.
A. PFKFB3 억제제
PFKFB3 억제제는 PFKFB3 활성에 대한 IC50이 200 μΜ 이하의 농도, 예를 들어, 적어도 또는 최대 또는 약 200, 100, 80, 50, 40, 20, 10, 5, 1 μΜ, 100, 10, 1 nM 또는 그 미만의 농도(또는 이로부터 추론가능한 임의의 범위 또는 값)인 갖는 화합물 또는 PFKFB3 발현을 억제하는 임의의 화합물 또는 제제를 지칭할 수 있다. PFKFB3 활성 또는 기능의 예는 해당의 조절, 키나제 활성, CDK1, 6-포스포프럭토-2-키나제 활성의 조절, 프럭토스-2,6-비스포스페이트 2-포스파타제 활성, ATP 결합 활성, 및 효소 촉매 활성을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 억제는 대조군 수준 또는 샘플과 비교하여 감소될 수 있다. 추가의 구현예들에서, PFKFB3 억제제를 시험하기 위해 기능적 검정, 예컨대, MTT 검정, 세포 증식 검정, Ki67 면역형광 검정, 세포자멸사 검정, 또는 해당작용 검정이 사용될 수 있다. 본 개시의 방법 및 조성물은 하나 이상의 PFKFB3 억제제를 포함할 수 있다. 개시된 PFKFB3 억제제 중 하나 이상은 본 개시의 특정 구현예들로부터 배제될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다. 또한, 본원에 기재된 PFKFB3 억제제의 약학적으로 허용가능한 염 및 전구약물이 고려된다. 특정 예시적인 PFKFB3 억제제가 본원에 기재되지만, 임의의 PFKFB3 억제제가 본 개시의 특정 구현예들에서 구현될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 구현예들에서, PFKFB3 억제제는 표적화 분자에 작동적으로 연결(예컨대, 공유적으로 연결, 비공유적으로 연결 등)된다. 표적화 분자는 특정 생물학적 또는 세포성 표적에 결합하도록 설계된 분자를 기재한다. 표적화 분자는 제제(예컨대, 치료제, 예컨대, PFKFB3 억제제)를 특정 생물학적 조직 또는 세포 유형(예컨대, β-세포)에 특이적으로 지향시키거나 표적화하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 표적화 분자는 대상체의 β-세포에 결합하도록 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 표적화 분자는 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 수용체에 결합하여, PFKFB3 억제제를 상기 대상체의 β-세포에 표적화하도록 구성된다. 일부 구현예들에서, 상기 표적화 분자는 항체 또는 항체-유사 분자이다.
B. PFKFB3 억제 핵산
당업계에 공지된 PFKFB3의 유전자 발현을 억제하는 억제 핵산 또는 임의의 방법이 특정 구현예들에서 고려된다. 억제성 핵산의 예는 안티센스 핵산, 예컨대, siRNA(짧은 간섭 RNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 이중-가닥 RNA, 임의의 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 임의의 억제제를 인코딩하는 리보자임 또는 핵산이 또한 포함된다. 억제성 핵산은 유전자의 전사를 억제하거나 세포에서 유전자 전사체의 번역을 방지할 수 있다. 억제성 핵산은 16 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이, 특정 구현예들에서는 18 내지 100개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 상기 핵산은 적어도 또는 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 이로부터 추론가능한 임의의 범위의 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된"은 인간의 개입을 통해 자연 상태로부터 변경되거나 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 자연적으로 존재하는 siRNA는 "단리된" 것이 아니라, 합성 siRNA, 또는 이의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 단리된 siRNA는 "단리된"이다. 단리된 siRNA는 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어, 이에 siRNA가 전달된 세포와 같은 비자연 환경에 존재할 수 있다.
억제 핵산은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, siRNA 및 이중-가닥 RNA는 미국 특허 제6,506,559호 및 6,573,099호, 및 미국 특허 공보 제2003/0051263호, 2003/0055020호, 2004/0265839호, 2002/0168707호, 2003/0159161호, 및 2004/0064842호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 원용된다.
특히, 억제성 핵산은 PFKFB3의 발현을 적어도 10%, 20%, 30%, 또는 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 또는 여기서 추론가능한 임의의 범위 또는 값만큼 감소시킬 수 있다.
추가의 구현예들에서, PFKFB3 억제제인 합성 핵산이 있다. 억제제는 17 내지 25개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있고, 성숙한 PFKFB3 mRNA의 5' 내지 3' 서열의 임의의 부분에 적어도 90% 상보적인 5' 내지 3' 서열을 포함한다. 특정 구현예들에서, 억제제 분자는 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 뉴클레오티드 길이, 또는 여기서 추론가능한 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다. 또한, 억제제 분자는 성숙한 PFKFB3 mRNA, 특히 성숙한, 자연 발생 mRNA의 5' 내지 3' 서열 중 임의의 부분에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100% 상보적이거나 적어도 그 이상 상보적이거나 또는 여기서 추론가능한 임의의 범위인 서열(5' 내지 3')을 갖는다. 당업자는 mRNA 억제제에 대한 서열로서 성숙한 mRNA의 서열에 상보적인 프로브 서열의 일부를 사용할 수 있다. 또한, 프로브 서열의 상기 부분은 성숙한 mRNA의 서열에 대해 여전히 90% 상보적이 되도록 변경될 수 있다.
PFKFB3에 대한 억제제 핵산이 또한 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 하기의 miRNA들은 PFKFB3을 억제할 수 있다: hsa-mir-26b-5p(MIRT028775), hsa-mir-330-3p(MIRT043840), hsa-mir-6779-5p(MIRT454747), hsa-mir-6780a-5p(MIRT454748), hsa-mir-3689c(MIRT454749), hsa-mir-3689b-3p(MIRT454750), hsa-mir-3689a-3p(MIRT454751), hsa-mir-30b-3p(MIRT454752), hsa-mir-1273h-5p(MIRT454753), hsa-mir-6778-5p(MIRT454754), hsa-mir-1233-5p(MIRT454755), hsa-mir-6799-5p(MIRT454756), hsa-mir-7106-5p(MIRT454757), hsa-mir-6775-3p(MIRT454758), hsa-mir-1291(MIRT454759), hsa-mir-765(MIRT454760), hsa-mir-423-5p(MIRT454761), hsa-mir-3184-5p(MIRT454762), hsa-mihsa-mir-6856-5p(MIRT454763), hsa-mir-6758-5p(MIRT454764), hsa-mir-3185(MIRT527973), hsa-mir-6892-3p(MIRT527974), hsa-mir-6840-5p(MIRT527975) 및 hsa-mir-6865-3p(MIRT527976).
siRNA 및 shRNA는 또한, 예를 들어, Santa Cruz biotechnology(각각 sc-44011 및 sc-44011-SH)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
C. PFKFB3 억제 폴리펩티드
특정 구현예들에서, PFKFB3 억제제 펩티드가 본원에 개시된다. 일부 구현예들에서, 상기 PFKFB3 억제제 폴리펩티드는 PFKFB3 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 항-PFKFB3 항체는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 키메라 항체, 친화성 성숙된 항체, 인간화된 항체, 또는 인간 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 항체-유사 분자이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 항체 단편이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 또는 scFv를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 항체는 키메라 항체, 예를 들어, 이종 비인간, 인간 또는 인간화 서열(예컨대, 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열)에 이식된 비인간 공여체로부터의 항원 결합 서열을 포함하는 항체이다. 일 구현예에서, 상기 비인간 공여체는 마우스이다. 일 구현예에서, 항원 결합 서열은 합성이며, 예컨대, 돌연변이유발(예컨대, 파지 디스플레이 선별검사 등)에 의해 수득된다. 일 구현예에서, 키메라 항체는 뮤린 V 영역 및 인간 C 영역을 가진다. 일 구현예에서, 뮤린 경쇄 V 영역은 인간 카파 경쇄 또는 인간 IgG1 C 영역에 융합된다.
항체 단편의 예는, 제한 없이: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 "Fd" 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 "Fv" 단편; (iv) VH 도메인으로 구성된 "dAb" 단편; (v) 단리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인은 상기 두 도메인으로 하여금 서로 연결되어 결합 도메인을 형성하도록 하는 펩티드 링커에 의해 연결되는 단일 사슬 Fv 분자("scFv"); (viii) 이중특이적 단일 사슬 Fv 이량체(미국 특허 제5,091,513호를 참조), 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축되는 디아바디, 다가 또는 다중특이적 단편(미국 특허 공보 제2005/0214860호)를 포함한다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 결합의 혼입에 의해 안정화될 수 있다. CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디가 또한 제조될 수 있다(Hu et al, 1996).
D. PFKFB3 억제성 소분자
본원에 사용되는 바와 같이, "소분자"는 종래의 유기 화학 방법(예컨대, 실험실에서)을 통해 합성되거나 자연에서 발견되는 유기 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 소분자는 여러 개의 탄소-탄소 결합을 함유하고, 약 1500 그램/몰 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 소분자는 약 1000 그램/몰 미만이다. 특정 구현예들에서, 소분자는 약 550 그램/몰 미만이다. 특정 구현예들에서, 소분자는 약 200 내지 약 550 그램/몰이다. 특정 구현예들에서, 소분자는 펩티드(예컨대, 펩티딜 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물)를 배제한다. 특정 구현예들에서, 소분자는 핵산을 배제한다.
예를 들어, 소분자 PFKFB3 억제제는 PFKFB3 기능 또는 활성을 억제하는 것으로 결정된 임의의 소분자일 수 있다. 상기 소분자는 시험관내 또는 생체내에서 기능적 분석법에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 개시의 PFKFB3 억제제는 PFKFB3 억제 분자이다. PFKFB3 억제 분자는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 공보 제20130059879호, 20120177749호, 20100267815호, 20100267815호 및 20090074884호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 원용된다.
예시적인 억제 화합물은 하기를 포함한다: (1H-벤조[g]인돌-2-일)-페닐-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-페닐-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(4-메톡시-페닐)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-피리딘-4-일-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-피리딘-4-일-메타논의 HCl 염; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(3-메톡시-페닐)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-피리딘-3-일-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(2-메톡시-페닐)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(2-히드록시-페닐)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(4-히드록시-페닐)-메타논; (5-메틸-3H-벤조[e]인돌-2-일)-페닐-메타논; 페닐-(7H-피롤로[2,3-h]퀴놀린-8-일)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(3-히드록시-페닐)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(2-클로로-피리딘-4-일)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(1-옥시-피리딘-4-일)-메타논; 페닐-(6,7,8,9-테트라히드로-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(4-히드록시-3-메톡실테닐)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(4-벤질옥시-3-메톡시-페닐)-메타논; 4-(3H-벤조[e]인돌-2-카르보닐)-벤조산 메틸 에스테르; 4-(3H-벤조[e]인돌-2-카르보닐)-벤조산; (4-아미노-페닐)-(3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; 5-(3H-벤조[e]인돌-2-카르보닐)-2-벤질옥시-벤조산 메틸; 5-(3H-벤조[e]인돌-2-카르보닐)-2-벤질옥시-벤조산 메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(2-메톡시-피리딘-4-일)-메타논; (5-플루오로-3H-벤조[e]인돌-2-일)-(3-메톡시-페닐)-메타논; (5-플루오로-3H-벤조[e]인돌-2-일)-피리딘-4-일-메타논; (4-벤질옥시-3-메톡시-페닐)-(5-플루오로-3H-벤조[e]인돌-2-일)- 메타논; (5-플루오로-3H-벤조[e]인돌-2-일)-(4-히드록시-3-메톡시-페닐)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(3-히드록시메틸-페닐)-메타논; 시클로헥실-(5-플루오로-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (5-플루오로-3H-벤조[e]인돌-2-일)-(3-플루오로-4-히드록시-페닐)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-p-톨릴-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(3-메톡시-페닐)-메타논; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-피리딘-4-일-메타논; 3H-벤조[e]인돌-2-카르복실산 페닐아미드; 3H-벤조[e]인돌-2-카르복실산(3-메톡시-페닐)-아미드; (3H-벤조[e]인돌-2-일)-(4-디메틸아미노-페닐)-메타논; (4-아미노-3-메톡시-페닐)-(3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-3-메톡시-페닐)-(5-히드록시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-3-메톡시-페닐)-(5-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; N-[4-(3H-벤조[e]인돌e-2-카르보닐)-페닐]-메탄술폰아미드; 3H-벤조[e]인돌-2-카르복실산(4-아미노-페닐)-아미드; (4-아미노-페닐)-(5-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-2-플루오로-페닐)-(5-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-3-플루오로-페닐)-(5-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-2-메톡시-페닐)-(5-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-페닐)-(9-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-3-메톡시-페닐)-(9-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-2-메톡시-페닐)-(9-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-3-플루오로-페닐)-(9-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-2-플루오로-페닐)-(9-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-3-플루오로-페닐)-(3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-2-플루오로-페닐)-(3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-페닐)-(7-메톡시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (4-아미노-페닐)-(5-히드록시-3-메틸-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논; (7-아미노-5-플루오로-9-히드록시-3H-벤조[e]인돌-2-일)-(3-메틸-피리딘-4-일)-메타논; (5-아미노-3H-피롤로[3,2-f]이소퀴놀린-2-일)-(3-메톡시-피리딘-4-일)-메타논; (4-아미노-2-메틸-페닐)-(9-히드록시-3H-피롤로[2,3-c]퀴놀린-2-일)-메타논; 및 (4-아미노-페닐)-(7-메탄술포닐-3H-벤조[e]인돌-2-일)-메타논.
추가의 예시적인 억제 화합물은 하기를 포함한다: 1-피리딘-4-일-3-퀴놀린-4-일-프로페논; 1-피리딘-4-일-3-퀴놀린-3-일-프로페논; 1-피리딘-3-일-3-퀴놀린-2-일-프로페논; 1-피리딘-3-일-3-퀴놀린-4-일-프로페논; 1-피리딘-3-일-3-퀴놀린-3-일-프로페논; 1-나프탈렌-2-일-3-퀴놀린-2-일-프로페논; 1-나프탈렌-2-일-3-퀴놀린-3-일-프로페논; 1-피리딘-4-일-3-퀴놀린-3-일-프로페논; 3-(4-히드록시-퀴놀린-2-일)-1-피리딘-4-일-프로페논; 3-(8-히드록시-퀴놀린-2-일)-1-피리딘-3-일-프로페논; 3-퀴놀린-2-일-1-p-톨릴-프로페논; 3-(8-히드록시-퀴놀린-2-일)-1-피리딘-4-일-프로페논; 3-(8-히드록시-퀴놀린-2-일)-1-p-톨릴-프로페논; 3-(4-히드록시-퀴놀린-2-일)-1-p-톨릴-프로페논; 1-페닐-3-퀴놀린-2-일-프로페논; 1-피리딘-2-일-3-퀴놀린-2-일-프로페논; 1-(2-히드록시-페닐)-3-퀴놀린-2-일-프로페논; 1-(4-히드록시-페닐)-3-퀴놀린-2-일-프로페논; 1-(2-아미노-페닐)-3-퀴놀린-2-일-프로페논; 1-(4-아미노-페닐)-3-퀴놀린-2-일-프로페논; 4-(3-퀴놀린-2-일-아크릴로일)- 벤즈아미드; 4-(3-퀴놀린-2-일- 아크릴로일)-벤조산; 3-(8-메틸-퀴놀린-2-일)-1-피리딘-4-일-프로페논; 1-(2-플루오로-피리딘-4-일)-3-퀴놀린-2-일-프로페논; 3-(8-플루오로-퀴놀린-2-일)-1-피리딘-4-일-프로페논; 3-(6-히드록시-퀴놀린-2-일)-1-피리딘-4-일-프로페논; 3-(8-메틸아미노-퀴놀린-2-일)-1-피리딘-4-일-프로페논; 3-(7-메틸-퀴놀린-2-일)-1-피리딘-4-일-프로페논; 및 1-메틸-4-[3-(8-메틸-퀴놀린-2-일)-아크릴로일]-피리딘 피리디늄.
추가의 예시적인 억제 화합물은 하기를 포함한다: PFK15 (1-(4-피리디닐)-3-(2-퀴놀리닐)-2-프로펜-1-온); (2S)-N-[4-[[3-시아노-1-(2-메틸프로필)-1H-인돌-5-일]옥시]페닐]-2-피롤리딘카르복사미드 3PO (3-(3-피리디닐)-1-(4-피리디닐)-2-프로펜-1-온); (2S)-N-[4-[[3-시아노-1-[(3,5-디메틸-4-이속사졸릴)메틸]-1H-인돌-5-일]옥시]페닐]-2-피롤리딘카르복사미드; 및 에틸 7-히드록시-2-옥소-2H-1-벤조피란-3-카르복실레이트.
추가의 예시적인 억제 화합물은 하기를 포함한다: N-브로모아세틸에탄올아민 포스페이트(BrAcNHEtOP), 7,8-디히드록시-3-(4-히드록시페닐)크로멘-4-온(YN1), 에틸 7-히드록시-2-옥소크로멘-3-카복실레이트(YZ9), 1-(3-피리디닐)-3-(2-퀴놀리닐)-2-프로펜-1-온(PQP), PFK-158, 화합물 26(Boyd et al. J. Med Chem 2015), KAN0436151, 및 KAN0436067.
본원에 기재된 하나 이상의 PFKFB3 억제 분자는 본 개시의 특정 구현예들로부터 배제될 수 있다.
IV. 이중호르몬 세포의 제거
본 개시의 양태들은 세포군으로부터 이중호르몬 세포를 제거하기 위한 방법뿐만 아니라 이의 사용을 위한 조성물에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중호르몬 세포"(또한 "다호르몬 세포")는 인슐린(즉, "인슐린+"임) 및 글루카곤(즉, "글루카콘+"임) 둘 모두를 생성하는 세포를 지칭한다. 상기 이중호르몬 세포는 당업계에서 인식되고 있고, 예를 들어, JE, Erener S. et al., Stem Cell Res. 2014 Jan;12(1):194-208 and Alvarez-Dominguez JR, et al. Cell Stem Cell. 2020 Jan 2;26(1):108-122.e10에 기재되어 있으며, 이의 각 내용은 본원에 원용된다.
본원에 개시된 바와 같이, PFKFB3 및/또는 HIF1α의 억제는, 예를 들어, 췌도 세포군으로부터 이중호르몬 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 이에 따라, 본 개시의 양태들은 PFKFB3 억제제 및/또는 HIF1α 억제제를 제공하는 단계를 포함하는 세포군으로부터 이중호르몬 세포를 제거하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 억제제는 시험관내에서 세포군에 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 억제제는 생체내에서 세포군에 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 세포군은 분화된 줄기 세포를 포함한다. 상기 분화된 줄기 세포는, 예를 들어, 분화된 줄기 세포로부터 유래된 췌도 세포 및 분화된 줄기 세포로부터 유래된 이중호르몬 세포를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 줄기 세포는 유도만능 줄기세포 (iPSC)이다. 일부 구현예들에서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 구현예들에서, 상기 줄기 세포는 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병을 갖거나, 가질 위험이 있거나, 가질 것으로 의심되는 환자로부터 수득된다. 개시된 방법은 PFKFB3 억제제 및/또는 HIF1α 억제제를 제공한 후, 세포군을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 대상체는 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병을 갖거나, 가질 위험이 있거나, 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예들에서, 상기 세포군은 상기 대상체에 대해 자가유래성이다. 일부 구현예들에서, 상기 세포군은 상기 대상체에 대해 자가유래성이 아니다.
V. 약학적 조성물
구현예들은 HIF1α 억제제 및/또는 PFKFB3 억제제를 포함하는 조성물로 당뇨병을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 구현예들에서, 개시된 조성물은 HIF1α 억제제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 개시된 조성물은 PFKFB3 억제제를 포함한다. 일부 구현예들에서, 개시된 조성물은 HIF1α 억제제 및 PFKFB3 억제제를 포함한다. 상기 조성물의 투여는 전형적으로 임의의 공통 경로를 통해 이루어질 것이다. 이는 경구, 비경구, 동소, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 비강내, 종양내, 또는 정맥내 주사를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 경구용 제형은 통상적으로 사용되는 부형제, 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등을 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제형 또는 분말의 형태를 취하며, 약 10% 내지 약 95%의 활성 성분, 또는 약 25% 내지 약 70%를 함유한다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물은 경구로 투여된다.
전형적으로, 조성물은 투여 제형과 양립가능한 방식으로, 그리고 치료적으로 효과적이고 면역 변형이 가능한 양으로 투여된다. 투여될 량은 치료하고자 하는 대상체에 따라 다르다. 투여되는 데 필요한 활성 성분의 정확한 양은 시술자의 판단에 따른다.
적용 방식은 다양하게 가변될 수 있다. 약학적 조성물의 투여를 위한 종래의 방법들 중 임의의 것이 적용 가능하다. 이들은 고형의 생리학적으로 허용가능한 염기 또는 생리학적으로 허용가능한 분산액, 비경구, 주사 등에 의한 경구 적용을 포함하는 것으로 여겨진다. 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로에 따라 달라질 것이며, 대상체의 크기 및 건강상태에 따라 가변될 것이다.
많은 경우에, 최대 약 또는 적어도 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 다중 투여를 갖는 것이 바람직할 것이다. 상기 투여는 2일 내지 12주 간격, 더 통상적으로는 1주 내지 2주 간격일 수 있다. 투여 과정에 HIF1α 및/또는 PFKFB3 활성에 대한 분석법이 뒤따를 수 있다.
문구 "약학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 허용가능한"은 동물 또는 인간에게 투여될 때 불리한, 알레르기성, 또는 다른 불리한 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 양립가능하지 않는 한, 면역원성 및 치료 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
"약학적으로 허용가능한 염"은 상기 정의된 바와 같이 약학적으로 허용가능한, 및 원하는 약리학적 활성을 가지는 본 발명의 화합물(예컨대, HIF1α 억제제, PFKFB3 억제제)의 염을 의미한다. 상기 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산; 또는 1,2-에탄디설폰산, 2-히드록시에탄설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 3-페닐프로피온산, 4,4'-메틸렌비스(3-히드록시-2-엔-1-카복실산), 4-메틸비시클로[2.2.2]옥트-2-엔-1-카복실산, 아세트산, 지방족 모노- 및 디카복실산, 지방족 황산, 방향족 황산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캠포설폰산, 카본산, 신남산, 시트르산, 시클로펜탄프로피온산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루타민산, 글리콜산, 헵탄산, 헥산산, 히드록시나프토산, 락트산, 라우릴황산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 뮤콘산, o-(4-히드록시벤조일)벤조산, 옥살산, p-클로로벤젠설폰산, 페닐-치환된 알칸산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 3급 부틸아세트산, 트리메틸아세트산 등과 같은 유기산과 함께 형성되는 산 부가염을 포함한다. 약학적 허용가능한 염은 또한 존재하는 산성 양성자가 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있을 때 형성될 수 있는 염기 부가염을 포함한다. 허용가능한 무기 염기는 수산화나트륨, 탄산나트륨, 수산화칼륨, 수산화알루미늄 및 수산화칼슘을 포함한다. 허용가능한 유기 염기는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등을 포함한다. 본 발명의 임의의 염의 일부를 형성하는 특정 음이온 또는 양이온은, 상기 염이 전체적으로 약리학적으로 허용가능한 한, 중요하지 않다는 것을 인식해야 한다. 약학적으로 허용가능한 염의 추가적인 예 및 이의 제조 방법 및 사용 방법은 Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds.,　Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002)에 제시되어 있다.
개시된 조성물은 전구약물을 포함할 수 있다. "전구약물"은 본 발명에 따른 억제제로 생체내 대사적으로 전환가능한 화합물을 의미한다. 상기 전구약물 자체는 주어진 표적 단백질에 대해 활성을 가질 수도 있고 또는 그렇지 않을 수도 있다. 예를 들어, 히드록시기를 포함하는 화합물은 히드록시 화합물에 생체내 가수분해에 의해 전환되는 에스테르로서 투여될 수 있다. 생체내에서 히드록시 화합물로 전환될 수 있는 적합한 에스테르는 아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 포스페이트, 타르트레이트, 말로네이트, 옥살레이트, 살리실레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말레이트, 메틸렌-비스-β-히드록시나프토에이트, 겐티세이트, 이세티오네이트, 디-p-톨루오일타르레이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 시클로헥실설파메이트, 퀴네이트, 아미노산의 에스테르 등을 포함한다. 유사하게, 아민기를 포함하는 화합물은 생체내 가수분해에 의해 아민 화합물로 전환되는 아미드로서 투여될 수 있다.
HIF1α 억제제 및/또는 PFKFB3 억제제는 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있으며, 예컨대, 정맥내, 피내, 근육내, 피하, 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사를 위해 제형화될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 본 개시에 비추어, 활성 성분을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 전형적으로, 상기 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 것으로 제조될 수 있고; 주사 전에 액체를 첨가할 때 용액 또는 현탁액의 제조에 사용하기에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있으며; 상기 제제는 또한 유화될 수 있다.
주사가능한 사용에 적합한 약학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩유, 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 상기 형태는 멸균성이어야 하고, 용이하게 주입될 수 있는 정도의 유체이어야 한다. 이는 또한 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하며 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
상기 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성되는 산부가염(단백질의 유리 아미노기와 함께 형성되는)을 포함한다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화철, 및 유기 염기, 예컨대, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도될 수 있다.
담체는 또한, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 발생될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의해 발생될 수 있다.
멸균 주사 용액은 활성 성분을 적절한 용매에 필요한 양에 포함시키고, 필요에 따라, 상기에 열거된 다양한 다른 성분들을 혼합한 후, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공-건조 및 동결-건조 기술이며, 이는 활성 성분의 분말과 함께, 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 산출한다.
치료 또는 예방 조성물의 유효량은 의도된 목적에 기초하여 결정된다. 용어 "단위 용량" 또는 "투여량"은 대상체에서 사용하기에 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 이의 투여와 관련하여 상기 논의된 원하는 반응, 즉 적절한 경로 및 요법을 생성하기 위해 계산된 조성물의 미리 결정된 양을 함유한다. 치료 횟수 및 단위 용량 둘 모두에 따른 투여되는 양은 원하는 결과 및/또는 보호에 의존한다. 상기 조성물의 정확한 양은 또한 시술자의 판단에 따라 다르며 개인별로 독특하다. 용량에 영향을 미치는 인자는 대상체의 물리적 및 임상적 상태, 투여 경로, 의도된 치료 목표(증상 완화 대 치유), 및 특정 조성물의 효능, 안정성 및 독성을 포함한다. 제형화시, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로 및 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 상기 제형은 다양한 투여 형태, 예컨대, 상기 기재된 주사가능 용액의 형태로 용이하게 투여된다.
제형화시, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로 및 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 상기 제형은 다양한 투여 형태, 예컨대, 상기 기재된 주사가능 용액의 형태로 용이하게 투여된다.
일례로서, 인간 성인(대략 70 킬로그램의 체중)의 경우, 약 0.1 mg 내지 약 3000 mg(그 사이의 모든 값 및 범위를 포함함), 또는 약 5 mg 내지 약 1000 mg(그 사이의 모든 값 및 범위를 포함함), 또는 약 10 mg 내지 약 100 mg(그 사이의 모든 값 및 범위를 포함함)의 화합물이 투여된다. 이들 투여량 범위는 단지 예시일 뿐이며, 투여는 당업자에게 공지된 인자에 따라 조정될 수 있는 것으로 이해된다.
특정 구현예들에서, 대상체는 약, 적어도 약, 또는 최대 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7. 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0. 19.5, 20.0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 425, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 475, 480, 490, 500, 510, 520, 525, 530, 540, 550, 560, 570, 575, 580, 590, 600, 610, 620, 625, 630, 640, 650, 660, 670, 675, 680, 690, 700, 710, 720, 725, 730, 740, 750, 760, 770, 775, 780, 790, 800, 810, 820, 825, 830, 840, 850, 860, 870, 875, 880, 890, 900, 910, 920, 925, 930, 940, 950, 960, 970, 975, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 밀리그램(mg) 또는 마이크로그램(mcg) 또는 μg/kg 또는 마이크로그램/kg/분 또는 mg/kg/분 또는 마이크로그램/kg/시 또는 mg/kg/시, 또는 이로부터 추론가능한 임의의 범위로 투여된다.
용량은 필요에 따라 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 또는 24시간마다(또는 여기서 추론가능한 임의의 범위) 또는 하루에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9회 또는 수회(또는 여기서 추론가능한 임의의 범위) 투여될 수 있다. 용량은 병태의 징후 전 또는 후에 먼저 투여될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 환자는 제1 용량의 요법을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12시간(또는 여기서 추론가능한 임의의 범위) 또는 상기 환자가 병태의 징후 또는 증상을 경험하거나 또는 나타낸 후 1, 2, 3, 4 또는 5일 후에(또는 여기서 추론가능한 임의의 범위) 투여된다. 상기 환자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 또는 그 이상(또는 여기서 추론가능한 임의의 범위) 동안 또는 병태의 증상이 소멸 또는 감소될 때까지, 또는 감염의 증상이 소멸 또는 감소된 후 6, 12, 18, 또는 24시간 또는 1, 2, 3, 4, 또는 5일 후에 치료될 수 있다.
VI. 치료 조성물 및 조합물의 투여
본원에 제공된 요법은 치료제, 예컨대, 제1 치료(예컨대, HIF1α 억제제) 및 제2 치료(예컨대, PFKFB3 억제제)의 조합물의 투여를 포함할 수 있다. 상기 요법은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 및 제2 치료는 순차적으로(상이한 시간에) 또는 동시에(일시에) 투여될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 치료는 별도의 조성물로 투여된다. 일부 구현예들에서, 상기 제1 및 제2 치료는 동일한 조성이다.
본 개시의 구현예들은 치료 조성물을 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상이한 요법은 하나의 조성물 또는 하나 초과의 조성물, 예컨대, 2개의 조성물, 3개의 조성물 또는 4개의 조성물로 투여될 수 있다. 작용제의 다양한 조합이 사용될 수 있다.
본 개시의 치료제는 동일한 투여 경로에 의해 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 요법은 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 비강내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 경막내, 뇌실내 또는 비강내로 투여된다. 일부 구현예들에서, 항생체는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 비강내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 경막내, 뇌실내 또는 비강내로 투여된다. 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 개인의 임상 상태, 개인의 임상 병력 및 치료에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 기초하여 결정될 수 있다.
상기 치료는 다양한 "단위 용량"을 포함할 수 있다. 상기 단위 용량은 소정량의 치료 조성물을 함유하는 것으로 정의된다. 투여되는 양, 및 특정 경로 및 제형은 임상 분야의 숙련자들의 결정 기술 내에 있다. 단위 용량은 단일 주사로서 투여될 필요는 없지만, 설정된 기간에 걸친 연속적인 주입을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 단위 용량은 단일 투여가능한 용량을 포함한다.
치료 횟수 및 단위 용량 둘 모두에 따른 투여되는 양은 원하는 치료 효과에 따라 달라진다. 유효량은 특정 효과를 달성하는 데 필요한 양을 지칭하는 것으로 이해된다. 특정 구현예들의 실시에서, 10 mg/kg 내지 200 mg/kg 범위의 용량은 이들 제제의 보호 능력에 영향을 미칠 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 용량은 약 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 및 200, 300, 400, 500, 1000 μg/kg, mg/kg, μg/일, 또는 mg/일 또는 여기서 추론가능한 임의의 범위를 포함하는 것으로 고려된다. 또한, 상기 용량은 하루 동안 여러 번, 및/또는 여러 날, 몇 주, 또는 몇 달에 투여될 수 있다.
특정 구현예들에서, 약학적 조성물의 유효량은 약 1 μΜ 내지 150 μΜ의 혈액 수준을 제공할 수 있는 것이다. 다른 구현예에서, 상기 유효량은 약 4 μM 내지 100 μM; 또는 약 1 μM 내지 100 μM; 또는 약 1 μM 내지 50 μM; 또는 약 1 μM 내지 40 μM; 또는 약 1 μM 내지 30 μM; 또는 약 1 μM 내지 20 μM; 또는 약 1 μM 내지 10 μM; 또는 약 10 μM 내지 150 μM; 또는 약 10 μM 내지 100 μM; 또는 약 10 μM 내지 50 μM; 또는 약 25 μM 내지 150 μM; 또는 약 25 μM 내지 100 μM; 또는 약 25 μM 내지 50 μM; 또는 약 50 μM 내지 150 μM; 또는 약 50 μM 내지 100 μM(또는 여기서 추론가능한 임의의 범위)의 혈액 수준을 제공한다. 다른 구현예들에서, 상기 용량은 대상체에게 투여되는 치료제로부터 생성되는 제제에 대하여 하기의: 약, 적어도 약 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 μΜ 또는 여기서 추론가능한 임의의 범위의 혈액 수준을 제공할 수 있다. 특정 구현예들에서, 대상체에 투여되는 치료제는 체내에서 대사된 치료제로 대사되고, 이 경우에 혈액 수준은 상기 치료제의 양을 지칭할 수 있다. 대안적으로, 상기 치료제가 대상체에 의해 대사되지 않는 정도까지, 본원에서 논의되는 혈액 수준은 대사되지 않은 치료제를 지칭할 수 있다.
상기 치료 조성물의 정확한 양은 또한 시술자의 판단에 따라 다르며 개인별로 독특하다. 용량에 영향을 미치는 인자는 환자의 물리적 및 임상적 상태, 투여 경로, 의도된 치료 목표(증상 완화 대 치유) 및 특정 치료 물질 또는 대상체가 받고 있을 수 있는 다른 치료법의 효능, 안정성 및 독성을 포함한다.
본 기술 분야의 숙련자는 체중의 μg/kg 또는 mg/kg의 용량 단위를 상응하는 농도 단위 μg/kg 또는 mM(혈액 수준), 예컨대, 4 μΜ 내지 100 μΜ로 전환시키고 발현시킬 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 흡수는 종 및 기관/조직 의존적이라는 것이 이해된다. 흡수 및 농도 측정에 관해 적용가능한 전환 인자 및 생리학적 가정은 일반적으로 공지되어 있고, 당업자로 하여금 하나의 농도 측정을 다른 것으로 전환하고 본원에 기재된 용량, 효능 및 결과에 관한 합리적인 비교 및 결론을 내리게 할 것이다.
VII. 유전자 형질 검출
특정 구현예들은 개체에서 유전자 형질(signature)을 검출하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 유전자 형질을 검출하는 방법은, 예를 들어, 선택적 올리고뉴클레오티드 프로브, 배열, 대립유전자-특이적 혼성화, 분자 비콘, 제한효소 단편 길이 다형성 분석, 효소 연쇄 반응, 플랩 엔도뉴클레아제 분석, 프라이머 연장, 5'-뉴클레아제 분석, 올리고뉴클레오티드 결찰 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석, 온도 구배 겔 전기영동, 변성 고성능 액체 크로마토그래피, 고해상도 용융, DNA 불일치 결합 단백질 분석, 서베이어(surveyor) 뉴클레아제 분석, 서열분석, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유전자 형질을 검출하는 방법은, 예를 들어, 형광 동소 혼성화(fluorescent in situ hybridization), 비교 게놈 혼성화(comparative genomic hybridization), 배열(array), 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction), 서열분석, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 유전자 형질의 검출은 유전자 형질의 하나의 특징을 검출하기 위해 특정 방법을 사용하는 것을 수반할 수 있고, 유전자 형질의 상이한 특징을 검출하기 위해 동일한 방법 또는 상이한 방법을 추가로 사용할 수 있다. 동일한 특징 또는 복수의 특징을 검출하기 위해 독립적으로 또는 조합하여 다수의 상이한 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 개시된 방법은 대상체로부터의 세포(예컨대, β-세포)에서 PFKFB3의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
A. DNA 서열분석
일부 구현예들에서, DNA는 서열분석에 의해 분석될 수 있다. 상기 DNA는 라이브러리 제조, 하이브리드 포획, 샘플 품질 제어, 생성물 이용 결찰 기반 라이브러리 제조, 또는 이들의 조합과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 서열분석을 위해 제조될 수 있다. 상기 DNA는 임의의 서열분석 기술을 위해 제조될 수 있다. 일부 구현예들에서, 서열분석은 20x, 25x, 30x, 35x, 40x, 45x, 50x 초과, 또는 50x 초과의 커버리지에서 대략 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상의 백분율의 표적을 커버하도록 실시될 수 있다. 일부 구현예들에서, DNA 서열분석은 대상체로부터의 세포(예컨대, β-세포)에서 PFKFB3의 발현 수준을 결정하기 위해 사용된다.
B. RNA 서열분석
일부 구현예들에서, RNA는 서열분석에 의해 분석될 수 있다. RNA는 폴리-A 선별, cDNA 합성, 가닥 또는 비가닥 라이브러리 제조, 또는 이들의 조합과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 서열분석을 위해 제조될 수 있다. 상기 RNA는 가닥 특이적 RNA 서열분석을 포함하는 임의의 유형의 RNA 서열분석 기술을 위해 제조될 수 있다. 일부 구현예들에서, 서열분석은 짝지워진 판독들을 포함하여, 대략 10M, 15M, 20M, 25M, 30M, 35M, 40M 또는 그 이상의 판독들을 생성하도록 실시될 수 있다. 상기 서열분석은 대략 50 bp, 55 bp, 60 bp, 65 bp, 70 bp, 75 bp, 80 bp, 85 bp, 90 bp, 95 bp, 100 bp, 105 bp, 110 bp 또는 그 이상의 판독 길이에서 실시될 수 있다. 일부 구현예들에서, 미가공 서열분석 데이터는 추정된 판독 개수(RSEM), 백만 매핑된 판독 당 전사물의 킬로베이스 당 단편(FPKM), 및/또는 백만 매핑된 판독 당 전사물의 킬로베이스 당 판독(RPKM)으로 변환될 수 있다. 일부 구현예들에서, RNA 서열분석은 대상체로부터의 세포(예컨대, β-세포)에서 PFKFB3의 발현 수준을 결정하기 위해 사용된다.
C. 단백질체학
일부 구현예들에서, 단백질은 질량 분석법에 의해 분석될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 질량 분석법을 위해 단백질을 제조할 수 있다. 본원에 포함된 임의의 단리된 단백질을 포함하는 단백질은 DTT에 이어서 요오도아세트아미드로 처리될 수 있다. 상기 단백질은 엔도펩티다제(endopeptidase), 프로테이나제(proteinase), 프로테아제(protease), 또는 단백질을 절단하는 임의의 효소를 포함하는 적어도 하나의 펩티다제와 함께 인큐베이션될 수 있다. 일부 구현예들에서, 단백질은 엔도펩티다제, LysC 및/또는 트립신과 함께 인큐베이션된다. 상기 단백질은 약 1:1000, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:1, 또는 그 사이의 임의의 범위에서 μg의 효소 대 μg 단백질의 비율을 포함하는 임의의 비율로 하나 이상의 단백질 절단 효소와 함께 인큐베이션될 수 있다. 일부 구현예들에서, 절단된 단백질은 컬럼 정제와 같은 것에 의해 정제될 수 있다. 특정 구현예들에서, 정제된 펩티드는 급속 동결 및/또는 건조되고, 예컨대, 진공하에서 건조될 수 있다. 일부 구현예들에서, 정제된 펩티드는 역상 크로마토그래피 또는 염기성 역상 크로마토그래피와 같이 분별될 수 있다. 분획은 본 개시의 방법을 실시하기 위해 조합될 수 있다. 일부 구현예들에서, 조합된 분획을 포함하는 하나 이상의 분획은 친화성 크로마토그래피 및/또는 결합, 이온 교환 크로마토그래피, 화학적 유도체화, 면역침전, 공침전, 또는 이들의 조합에 의한 인산-농축을 포함하는 인산펩티드 농축에 적용된다. 조합된 분획 및/또는 인산-농축된 분획을 포함하는 하나 이상의 분획의 전부 또는 일부는 질량 분광분석법을 받을 수 있다. 일부 구현예들에서, 원시 질량 분광분석법 데이터는 적어도 하나의 관련 생물정보학 도구를 사용하여 처리 및 정규화될 수 있다. 일부 구현예들에서, 대상체로부터의 세포(예컨대, β-세포)에서 PFKFB3의 양을 결정하기 위해 단백질체학이 사용된다.
VIII. 키트
본 발명의 특정 양태들은 또한 본 개시의 조성물 또는 본 개시의 방법을 구현하기 위한 조성물을 함유하는 키트에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 키트는 하나 이상의 바이오마커를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예들에서, 키트는 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 100, 500, 1,000개 또는 그 이상의 프로브, 프라이머 또는 프라이머 세트, 합성 분자 또는 억제제, 또는 여기서 추론가능한 임의의 값 또는 범위 및 조합을 함유한다. 일부 구현예들에서, 세포에서 바이오마커 활성을 평가하기 위한 키트가 있다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 바이오마커 활성의 발현 수준을 평가하기 위한 키트가 개시된다. 일부 구현예들에서, 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준을 평가하기 위한 키트가 개시된다.
키트는 개별적으로 포장되거나 튜브, 병, 바이알, 주사기 또는 다른 적합한 용기 수단과 같은 용기에 배치될 수 있는 성분을 포함할 수 있다.
개별 성분은 또한 농축된 양으로 키트 내에 제공될 수 있고; 일부 구현예들에서, 성분은 다른 성분과의 용액 중에 있을 것과 동일한 농도로 개별적으로 제공된다. 성분의 농도는 1x, 2x, 5x, 10x 또는 20x, 또는 그 이상으로 제공될 수 있다.
예후 또는 진단 적용을 위해 본 개시의 프로브, 합성 핵산, 비합성 핵산, 및/또는 억제제를 사용하기 위한 키트가 본 개시의 일부로서 포함된다. 바이오마커의 코딩 서열뿐만 아니라 바이오마커의 비코딩 서열을 포함할 수 있는, 바이오마커의 전부 또는 일부와 동일하거나 이에 상보적인 핵산 프라이머/프라이머 세트 및 프로브를 포함하는, 본원에 식별된 임의의 바이오마커에 상응하는 임의의 이러한 분자가 구체적으로 고려된다. 특정 양태들에서, 음성 및/또는 양성 대조군 핵산, 프로브, 및 억제제는 일부 키트 구현예들에 포함된다.
명칭에 의한 특이적 바이오마커를 포함하는 개시의 임의의 구현예는 또한 특정 핵산의 성숙한 서열과 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 동일한 서열을 갖는 바이오마커를 포함하는 구현예들을 포괄하는 것으로 고려된다.
본 개시의 구현예들은 적합한 용기 수단 내에 2개 이상의 바이오마커 프로브를 포함하는 샘플에 대한 바이오마커 프로파일을 평가함으로써 병리학적 샘플의 분석을 위한 키트를 포함하며, 여기서 상기 바이오마커 프로브는 본원에서 식별된 바이오마커 중 하나 이상을 검출한다. 상기 키트는 상기 샘플 중 핵산을 표지하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 아민-변형된 뉴클레오티드, 폴리(A) 폴리머라제 및 폴리(A) 폴리머라제 완충제 중 적어도 하나를 포함하는 표지 시약을 포함할 수 있다. 표지 시약은 아민-반응성 염료를 포함할 수 있다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예들을 입증하기 위해 포함된다. 이하의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 상기 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 하지만, 당업자는 본 개시에 비추어, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 구현예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 여전히 유사하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1 - 제2형 당뇨병의 β-세포 분석
방법
조직학적 평가
더 작은 조각의 절제 후, 췌장을 4% 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences 19202, Hatfield, PA, USA)에서 밤새 4°C에서 고정시키고, 파라핀-포매하고, 4 μm 두께로 절단하였다. β-세포 영역에 대해, 토끼 항-인슐린 항체(Cell Signaling Technology C27C9, Danvers, MA, USA, 1:400)와 함께, 이어서 F(ab')2 접합체와 비오틴(Biotin)-SP(Jackson ImmunoResearch 711-066-152, West Grove, PA, USA, IHC에 대해 1:100)와 함께 순차적으로 인큐베이션된 탈파라핀화된 절편에 대해 퍼옥시다제- 및 헤마톡실린 염색을 실시하였으며, 그 후 퍼마운트(Permount, Fisher SP15-100, Hampton, NH, USA)로 절편을 장착하기 전에 VECTASTAIN ABC 키트(HRP)(Vector Laboratories PK-4000, Burlingame, CA, USA), 및 DAB 기질 키트(HRP)(Vector Laboratories SK-4100, Burlingame, CA, USA), 및 해리스 헤마톡실린(Harris Hematoxylin)의 단계들을 적용하였다. 올림푸스(Olympus) IX70 조직 배양 도립 현미경(Olympus, Center Valley, PA, USA)에서 이미지-프로 플러스(Image-Pro Plus) 5.1 소프트웨어를 사용하여 형태 측정 분석을 실시하였다. 이미징 및 데이터 분석은 각 섹션의 실험적 마우스 유전자형에 대해 맹검 방식으로 2명의 관찰자에 의해 실시하였다. 섬 엣지(islet edge)는 다중채널 이미지를 사용하여 수동으로 외접하였다. 인슐린- 및 헤마톡실린-양성 영역을 픽셀 임계화(pixel thresholding)를 이용하여 각 섬에 대해 결정하였다. 그런 다음, β-세포 면적을 인슐린-양성 면적/헤마톡실린-양성 면적 x 100%로서 계산하였다.
면역형광 분석은 라이카(Leica) DM6000 B 연구 현미경 상에서 오픈랩(Openlab) 5.5.0 소프트웨어로 실시하였다. 하기의 항체: 토끼 항-PFKFB3(Origene AP15137PU-N, Rockville, MD, USA, 1:100); 마우스 항-MCM2(BD Transduction Laboratories 610700, San Diego, CA, USA, 1:100); 토끼 항-절단된 카스파제-3(Cell Signaling Technology 9664S, Danvers, MA, USA, 1:400); 기니아-피그 항-인슐린(Abcam ab195956, Cambridge, MA, USA, 1:400); 마우스 항-글루카곤(Sigma-Aldrich G2654, St.Louis, MO, USA, IF에 대하여 1:1000), 마우스 항-c-Myc(Santa Cruz Biotechnology Inc 9E10 sc-40, Dallas, Texas, USA, 1:100); 마우스 항-HIF1α(Novus Biologicals NB100-105, Centennial, CO, USA, 1:50)를 사용하였다. 2차 항체는: FITC를 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 706-096-148, West Grove, PA, USA, 1:200 for IF); Cy3을 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 711-166-152, West Grove, PA, USA, 1:200 for IF) 및 알렉사(Alexa) 647을 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 715-606-150, West Grove, PA, USA, 1:100 for IF)였다. TUNEL 분석을 통해 세포사멸을 측정하기 위하여 인시츄 세포사멸 검출 키트(In Situ Cell Death Detection Kit, Roche Diagnostics Corporation 12156792910, Indianapolis, IN, USA)를 사용하였다. DAPI(Vector Laboratories H1200, Burlingame, CA, USA)를 이용한 벡타실드(Vectashield)를 사용하여 슬라이드를 장착하였다.
결과
hIAPP의 독성 올리고머의 축적과 부분적으로 관련이 있는 T2D에서의 β-세포 기능의 점진적인 감소가 존재한다[3-5]. hIAPP는 T2D에서 잘못 접힌 단백질 스트레스와 관련된 막-투과성 독성 올리고머를 형성한다. hIAPP에 의한 잘못 접힌 단백질 스트레스에 대한 반응으로, T2D를 갖는 인간으로부터의 β-세포 내 미토콘드리아는 30%의 미토콘드리아 호흡의 감쇠를 발생시키는 미토콘드리아 네트워크 단편화(도 1a)를 통해 방어 자세를 획득하였다(도 1b). 미토콘드리아 형태 및 기능의 변화는 Ca2+ 독성에 노출된 뉴런과 매우 유사하며, 따라서 높은 세포질 Ca2+에 대한 적응을 반영한다. 실제로, 인간 IAPP 형질전환 마우스(hTG)로부터의 섬세포는 설치류 IAPP(rTG) 대조군 한배 새끼와 비교하여 더 높은 세포질 Ca2+ 수준을 나타내었다(도 1c). 산화성 및 DNA 손상은 DNA 손상 반응 단백질인 p53, p21WAF1 및 2A.X의 발현 증가에 의해 나타낸 바와 같이, 비당뇨병성(ND) 공여체에 비해 T2D를 갖는 공여체의 섬세포로부터 유래된 세포내 분획에서 명백하게 나타났다(도 1d).
DNA 손상 반응(p53/p21WAF1 축 및 gH2A.X의 축적)은 T2D 및 T2D의 설치류 모델에서 β-세포의 손상을 입증한다. 단백질 접힘 오류에 의한 스트레스 및 세포질 Ca2+의 급증은 보존된 HIF1α-PFKFB3 손상/복구 프로그램에 의해 T2D에서 모든 β-세포의 약 1/3에 대하여 보호성 대사 재프로그래밍을 촉발시켰다(도 2a). PFKFB3는 스트레스 하의 β-세포에서 Ca2+ 항상성, 미토콘드리아 재구성 및 대사체 변화에 대한 원인이 되는 것으로 확인되었고(도 2b), 궁극적으로 손상된 β-세포의 생존을 유도하였다. 이는 HIF1α 억제 또는 PFKFB3의 존재 또는 부재 하에 hIAPP를 발현하도록 아데노바이러스로 형질감염된 INS 832/13 세포를 이용한 시험관내 분석에 의해 확인되었고(도 2c) 또는 PFKFB3 전사후 침묵화(도 2d)는 TUNEL 분석에 의해 입증되는 바와 같이 hIAPP 발현 세포에서 세포 사멸을 증가시켰다.
실시예 2 - PFKFB3 βKO hIAPP +/- +HFD 마우스의 분석
방법
동물
동형접합성 hIAPP+/+ 마우스는 Dr. Peter Butler's 연구소로부터 수득하였고, 이전에 [15]에 기재되었다. β-세포-특이적 유도성 PFKFB3 녹아웃 마우스 모델(RIP-CreERT:PFKFB3fl/fl)은 플록스된(floxed) PFKFB3 유전자를 보유하는 마우스(JAX Laboratories)를 래트 인슐린 프로모터의 제어하에 Cre 재조합효소를 발현하는 마우스(RIP-CreERT)와 교배시켜 개발하였다. 동형접합성 hIAPP+/+ 배경 상의 마우스를 PFKFB3fl/fl 또는 RIP-CreERT 마우스와 교배시킨 후, PFKFB3fl/fl hIAPP+/- 및 PFKFB3fl/fl RIP-CreERT 마우스를 함께 교배시켜 3개의 실험 유전자형: RIP-CreERT PFKFB3wt/wt hIAPP-/-, RIP-CreERT PFKFB3wt/wt hIAPP+/- 및 RIP-CreERT PFKFB3fl/fl hIAPP+/-(본원에서는 PFKFB3WT hIAPP-/-, PFKFB3WT hIAPP+/-, 및 PFKFB3βKO hIAPP+/-로 지칭됨)을 생성하였다. 모든 실험군은 고지방 식이를 실시하였다. Pfkfb3에서 플록스된 부위의 Cre-loxP 재조합은 20-27주령에 복막내 타목시펜 주사에 의해 유도되었다. 마우스는 타목시펜 주사 후 10주 동안 사료 섭취한 후, hIAPP(hIAPP+/+)에 대해 동형접합성인 수컷 마우스만이 자발적으로 당뇨병을 발병하기 때문에, hIAPP+/- 및 HFD에 반응하여 당뇨병을 유도하기 위해, 모든 마우스를 고지방 식이를 위해 추가 13주 동안 노출시켰다(HFD, Research Diets Inc, New Brunswick, NJ, USA)[15]. 상기 마우스를 UCLA 동물윤리통합위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, ARC)의 승인된 마우스 집락 시설에서 12시간 주/야간 주기로 유지하였다. 30-37주령에, 모든 마우스는 많은 양의 지방(지방으로부터 35% w/w 또는 60% 칼로리; 번호 D12492)을 함유하는 먹이를 받도록 할당되었다. 고지방 식이의 지방조성은 포화상태가 32.2%, 단일불포화상태가 35.9%, 다중불포화지방이 31.9%로 나타났다. 마우스는 연구 기간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근하였다. 체중 및 공복 혈장 포도당 수준을 매주 평가하였으며, 포도당- 및 인슐린 내성 시험(각각 IP-GTT 및 ITT)을 포함하는 일에 추가 측정을 실시하였다.
인슐린 및 포도당 내성 시험
HFD 후 9주 및 12주(타목시펜 주사 후 19주 및 22주)에 복강내 포도당 내성 검사(IP-GTT)를 실시하였다. 꼬리 정맥 혈당을 포도당 볼루스(bolus) 주사 전 및 15, 30, 60, 90, 120분 후에 채취하였다. 포도당 볼루스 주사 전 및 30분 후에 제2 IP-GTT에 대한 혈액을 채취하기 위해 안구뒤두통 출혈을 사용하였다. 마우스를 이소플루란(10초)에 간단히 노출시켜 마취시켰다. 혈액을 EDTA 코팅된 마이크로원심분리 튜브에 수집하고, 샘플을 10분 동안 원심분리하여 혈장을 수득하였다(5000 RCF, 10분, 4°C).
포도당 및 인슐린 분석
혈장 포도당은 포도당 산화효소 방법을 사용하여 결정되었고 YSI 2300 STAT PLUS 글루코오스 및 L-락테이트 분석기(Glucose & L-Lactate Analyzer)로 분석하였다.
공복 혈당은 자유형 혈당 측정기(Abbott Diabetes Care Inc, Alameda, CA, USA)를 이용하여 꼬리에서 채취한 혈액으로부터 18시간 동안 밤새 단식한 후(케이지 및 침구를 규칙적으로 교체하고 물을 자유롭게 제공하면서 음식을 뺀 후) 매주 측정하였다.
혈장에서의 인슐린, c-펩티드, 및 글루카곤 수준을 마우스 인슐린(Mercodia 10-1247-01, Uppsala, Sweden), 마우스 c-펩티드(Crystal Chem 90050, IL, USA), 및 마우스 글루카곤(Mercodia 10-1281-01, Uppsala, Sweden)에 대한 극히 민감한(Ultrasensitive) ELISA를 사용하여 결정하였다.
HFD후 10주(타목시펜 주사 후 19주)에, 6시간 금식시킨 의식이 있는 마우스에서 복강내 인슐린 내성 시험(0.75 IU/kg)(Lilly insulin Lispro, LLC, Indianapolis, USA)을 실시하였다. 꼬리 정맥 혈액을 글루코스 측정을 위해 인슐린 투여 전 및 투여 후 0, 20, 40, 60분에 채취하였다.
췌장 관류 및 격리
IP-GTT 및 ITT 후 1주일에, 마우스를 자궁경부 탈구에 의해 안락사시켰다. 중간 절단을 이용하여 복부와 흉강을 벌리고, 우심실을 절단한 후 좌심실을 바늘로 찔러 췌장 관류를 위해 10 ml의 차가운 인산 완충 심역수(PBS)를 천천히 주입하였다. 관류 후, 췌장을 차가운 PBS에 넣어 주변 지방을 포함한 다른 조직으로부터 분리하였다. 그런 다음, 췌장을, 여분의 PBS를 조직으로 흡수한 후에 칭량하였다.
조직학적 평가
더 작은 조각의 절제 후, 췌장을 4% 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences 19202, Hatfield, PA, USA)에서 밤새 4°C에서 고정시키고, 파라핀-포매하고, 4 μm 두께로 절단하였다. β-세포 영역에 대해, 토끼 항-인슐린 항체(Cell Signaling Technology C27C9, Danvers, MA, USA, 1:400)와 함께, 이어서 F(ab')2 접합체와 비오틴(Biotin)-SP(Jackson ImmunoResearch 711-066-152, West Grove, PA, USA, IHC에 대해 1:100)와 함께 순차적으로 인큐베이션된 탈파라핀화된 절편에 대해 퍼옥시다제- 및 헤마톡실린 염색을 실시하였으며, 그 후 퍼마운트(Permount, Fisher SP15-100, Hampton, NH, USA)로 절편을 장착하기 전에 VECTASTAIN ABC 키트(HRP)(Vector Laboratories PK-4000, Burlingame, CA, USA), 및 DAB 기질 키트(HRP)(Vector Laboratories SK-4100, Burlingame, CA, USA), 및 해리스 헤마톡실린(Harris Hematoxylin)의 단계들을 적용하였다. 올림푸스(Olympus) IX70 조직 배양 도립 현미경(Olympus, Center Valley, PA, USA)에서 이미지-프로 플러스(Image-Pro Plus) 5.1 소프트웨어를 사용하여 형태 측정 분석을 실시하였다. 이미징 및 데이터 분석은 각 섹션의 실험적 마우스 유전자형에 대해 맹검 방식으로 2명의 관찰자에 의해 실시하였다. 섬 엣지(islet edge)는 다중채널 이미지를 사용하여 수동으로 외접하였다. 인슐린- 및 헤마톡실린-양성 영역을 픽셀 임계화(pixel thresholding)를 이용하여 각 섬에 대해 결정하였다. 그런 다음, β-세포 면적을 인슐린-양성 면적/헤마톡실린-양성 면적 x 100%로서 계산하였다.
면역형광 분석은 라이카(Leica) DM6000 B 연구 현미경 상에서 오픈랩(Openlab) 5.5.0 소프트웨어로 실시하였다. 하기의 항체: 토끼 항-PFKFB3(Origene AP15137PU-N, Rockville, MD, USA, 1:100); 마우스 항-MCM2(BD Transduction Laboratories 610700, San Diego, CA, USA, 1:100); 토끼 항-절단된 카스파제-3(Cell Signaling Technology 9664S, Danvers, MA, USA, 1:400); 기니아-피그 항-인슐린(Abcam ab195956, Cambridge, MA, USA, 1:400); 마우스 항-글루카곤(Sigma-Aldrich G2654, St.Louis, MO, USA, IF에 대하여 1:1000), 마우스 항-c-Myc(Santa Cruz Biotechnology Inc 9E10 sc-40, Dallas, Texas, USA, 1:100); 마우스 항-HIF1(Novus Biologicals NB100-105, Centennial, CO, USA, 1:50)를 사용하였다. 2차 항체는: FITC를 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 706-096-148, West Grove, PA, USA, 1:200 for IF); Cy3을 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 711-166-152, West Grove, PA, USA, 1:200 for IF) 및 알렉사(Alexa) 647을 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 715-606-150, West Grove, PA, USA, IF에 대하여 1:100)였다. TUNEL 분석을 통해 세포사멸을 측정하기 위하여 인시츄 세포사멸 검출 키트(In Situ Cell Death Detection Kit, Roche Diagnostics Corporation 12156792910, Indianapolis, IN, USA)를 사용하였다. DAPI(Vector Laboratories H1200, Burlingame, CA, USA)를 이용한 벡타실드(Vectashield)를 사용하여 슬라이드를 장착하였다.
통계 분석
데이터는 표시된 마우스의 수에 대한 평균의 오차(표준 오차, SEM)로서 제시된다. IP-GTT 및 ITT의 경우, 포도당, 인슐린, C-펩티드 및 글루카곤에 대한 곡선하 면적(AUC)은 사다리꼴 규칙을 사용하여 계산하였다. 평균 데이터는 스튜던트 티이 검정을 이용한 분석을 통해 군 간에 비교하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
당뇨병에서 인슐린 저항성, 잘못 접힌 단백질 스트레스, 및 노령의 영향을 누적 위험 인자로서 모방하고 높은 당뇨병 유발 스트레스 하에 손상된 β-세포의 보존에서 PFKFB3의 역할을 연구하기 위해, 마우스를 hIAPP +/- 배경에서 Pfkfb3 유전자의 β-세포-특이적 조건부 파괴로 발생시키고(방법 섹션을 참조), 13주 동안 고지방 식이에 노출시키고(PFKFB3 βKO hIAPP +/- +HFD), PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 및 PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군과 비교하였다(도 3a에 제시된 실험 시각표). PFKFB3 발현의 효율적인 파괴는 지시된 실험군으로부터의 마우스의 췌장 절편의 PFKFB3 면역염색에 의해 및 양성 대조군으로서 PFKFB3WT hIAPP+/+를 사용하여 확인하였다(도 3b).
PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스의 대사 성능의 분석은 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD에 비해 낮은 공복 포도당 수준(도 4a), 증가된 인슐린 감수성(도 4d), 및 증가된 비교가능한 포도당 불내성(도 4b)을 나타내었다. PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 및 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스 둘 모두는 PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군과 비교할 때 감소된 C-펩티드 수준을 보였다(도 4c). 증가된 인슐린 감수성과 함께 이러한 결과는 잠재적으로 PFKFB3의 부재하에 당뇨병 유발 스트레스 하에 β-세포량을 확장시키지 못함으로 인한 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 손상된 인슐린 분비를 시사하였다. 하지만, β-세포 분획 면적 및 질량은 실험군들 사이에서 변경되지 않았다(도 5b).
PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD- 및 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스 사이에서 비교할 만한 β-세포량으로 궁극적으로 유도되는 성장 역학을 조사하기 위해, β-세포 사멸을 결정하기 위해 TUNEL 염색을 실시하고, β-세포 복제를 결정하기 위해 MCM2 면역염색을 실시하였다. TUNEL 분석에 따르면, β-세포 사멸은 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스와 비교할만 하면서도 PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군에 비해 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 증가되었다(도 5d). PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD- 및 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스 둘 모두에서 β-/α 세포 비율이 감소되는 경향이 있었기 때문에 세포 사멸은 주로 β-세포에 기인하였다(도 5c). PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스로부터의 β-세포는 MCM2 표지의 3배 증가를 나타내었고(*p < 0.05), 이는 hIAPP+/-+HFD 마우스에 비해 β-세포 복제의 증가를 나타내었고, PFKFB3WT IAPP-/-+HFD 대조군과 유사하였다(도 5a 및 도 5e). PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 세포 사멸 및 β-세포 복제 둘 모두에서의 증가에도 불구하고, β-세포 분획 면적은 3개의 군 모두에서 비교할만 하였다(도 5b).
β-세포량의 회복에도 불구하고 β-세포 기능을 회복하지 못하는 것을 명확히 하기 위해, HIF1α 면역염색을 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스의 췌장 절편에서 실시하였고, 모든 β-세포의 약 10%가 HIF1α에 대해 양성으로 남아있음을 발견하였으며, 이는 PFKFB3 유전적 감소 후에 남아있는 HIF1α 양성- 및 PFKFB3 음성 β-세포의 분획을 나타낸다(도 6a 및 도 6b). 남아있는 HIF1α 면역염색은 β-세포 기능을 회복시키지 못하는 원인이 되는 지속적인 손상(스트레스)을 나타내었다. β-세포에서 지속적인 손상이 있는지 여부를 결정하기 위해, β-세포 손상의 마커, Myc-니크(nick)[14]로 불리는 절단된 c-myc를 사용하였다. 절반으로 감소하였지만, Myc-니크 발현은 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 여전히 유지되었다(도 6c). 지속적인 HIF1α-양성 β-세포 분획과 함께, Myc-니크 상향조절은 PFKFB3 녹아웃에도 불구하고 여전히 완전한 기능을 회복하지 못한 PFKFB3βKO 세포 분획을 나타내었다. 이는 PFKFB3의 부재하에서도 β-세포 기능의 손실에서 HIF1α의 역할을 나타내었다.
실시예 3 - 제2형 당뇨병 환자의 RNA-seq 데이터 분석
기능 손실에 대한 HIF1 양성 β-세포의 잠재적 기여를 특성화하기 위해, 인간 T2D로부터의 공개된 RNA Seq 데이터를 분석하였다[1]. 건강한 및 T2D 공여체로부터의 β-세포를 재클러스터링하고(umap_cluster), β-세포에 대한 인슐린(INS)과 같은 유전자 마커에 기초하여 특정 세포 유형에 주석을 달았다(umap_celltype, 도 7a). β-세포는 건강한 및 T2D 상태로부터 분리되었다(umap_disease, 미도시). 각각의 조건에 대해, 그리고 각각의 유전자(예컨대, 예시로서 LDHA)에 대해, 세포를 유전자(예컨대, LDHA) 양성- 및 유전자(예컨대, LDHA) 음성 세포로 분리하고 두 군 사이에서 차등 발현 분석을 실시하였다. LDHA가 스트레스를 받은 β-세포의 호기성 해당작용 및 대사적 재형성의 최종 단계를 이어지는 HIF1의 전사 표적이기 때문에, LDHA 발현은 스트레스를 받은 β-세포로부터 건강하게 분화하는데 사용되었다. 클러스터 7과 중첩된 LDHA-양성 세포는 β-세포 하위군을 기술하고, 대사, Ca2+ 항상성 및 이온 채널- 뿐만 아니라 인슐린 분비 조절에 관련된 유전자와 공동-응집되었다(도 7a 및 도 7b). 이러한 결과는, 당뇨병의 마우스 모델과 유사하게, T2D를 갖는 인간에서, β-세포의 분획(클러스터 7 내의 LDHA-양성 세포)은 β-세포 기능의 손실을 부분적으로 설명하는 유전자 형질을 나타낸다는 것을 정확히 지적하였다.
실시예 4 - 당뇨병 유발 스트레스에서 HIF1α-PFKFB3 신호전달의 역할 분석
방법
동물
동형접합성 hIAPP+/+ 마우스는 Dr. Peter Butler's 연구소로부터 수득하였고, 이전에 (Janson et al., 1996)에 기재되었다. β-세포-특이적 유도성 PFKFB3 녹아웃 마우스 모델(RIP-CreERT:PFKFB3fl/fl)은 플록스된(floxed) Pfkfb3 유전자를 보유하는 마우스(JAX Laboratories)를 래트 인슐린 프로모터의 제어하에 Cre 재조합효소를 발현하는 마우스(RIP-CreERT)와 교배시켜 생성하였다. 동형접합성 hIAPP+/+ 배경 상의 마우스를 PFKFB3fl/f 또는 RIP-CreERT 마우스와 교배시킨 후, PFKFB3fl/fl hIAPP+/- 및 PFKFB3fl/fl RIP-CreERT 마우스를 함께 교배시켜 3개의 실험 유전자형: RIP-CreERT PFKFB3fl/fl hIAPP-/-, RIP-CreERT PFKFB3wt/wt hIAPP+/- 및 RIP-CreERT PFKFB3fl/fl hIAPP+/-(본원에서는 PFKFB3WT hIAPP-/-, PFKFB3WT hIAPP+/- (PFKFB3WT 당뇨병 유발 스트레스, 또는 PFKFB3WT DS로 지칭됨), 및 PFKFB3βKO hIAPP+/-(PFKFB3βKO DS)를 각각 생성하였다. Pfkfb3에서 플록스된 부위의 Cre-loxP 재조합은 20-27주령에 복막내 타목시펜 주사에 의해 유도되었다. 마우스는 타목시펜 주사 후 10주 동안 사료 섭취한 후, hIAPP(hIAPP+/+)에 대해 동형접합성인 수컷 마우스만이 자발적으로 당뇨병을 발병하기 때문에, hIAPP+/- 및 HFD에 반응하여 당뇨병을 유도하기 위해, 마우스를 고지방 식이를 추가 13주 동안 섭취시켰다(HFD, Research Diets Inc, New Brunswick, NJ, USA). 상기 마우스를 UCLA 동물윤리통합위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, ARC)의 승인된 마우스 집락 시설에서 12시간 주/야간 주기로 유지하였다. 30-37주령에, 모든 마우스는 높은 지방(지방으로부터 35% w/w 또는 60% 칼로리; D12492)을 함유하는 먹이를 받도록 할당되었다. 고지방 식이의 지방조성은 포화상태가 32.2%, 단일불포화상태가 35.9%, 다중불포화지방이 31.9%로 나타났다. 마우스는 연구 기간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근하였다. 체중 및 공복 혈당 수준을 매주 평가하였으며, 포도당- 및 인슐린 내성 시험(각각 IP-GTT 및 ITT)을 포함하는 일에 추가 측정을 실시하였다.
인슐린 및 포도당 내성 시험
HFD 후 9주 및 12주(타목시펜 주사 후 19주 및 22주)에 복강내 포도당 내성 검사(IP-GTT)를 실시하였다. 꼬리 정맥 혈당을 포도당 볼루스(bolus) 주사 전 및 15, 30, 60, 90, 120분 후에 채취하였다. 포도당 볼루스 주사 전 및 30분 후에 제2 IP-GTT에 대한 혈액을 채취하기 위해 안구뒤두통 출혈을 사용하였다. 마우스를 이소플루란(10초)에 간단히 노출시켜 마취시켰다. 혈액을 EDTA 코팅된 마이크로원심분리 튜브에 수집하고, 샘플을 10분 동안 원심분리하여 혈장을 수득하였다(5000 RCF, 10분, 4°C).
포도당 및 인슐린 분석
공복 혈당은 자유형 혈당 측정기(Abbott Diabetes Care Inc, Alameda, CA, USA)를 이용하여 꼬리에서 채취한 혈액으로부터 18시간 동안 밤새 단식한 후(케이지 및 침구를 규칙적으로 교체하고 물을 자유롭게 제공하면서 음식을 뺀 후) 매주 측정하였다. 혈당이 혈당 측정기의 검출 범위를 초과한 경우에는, 포도당 산화효소법을 이용하여 혈장 포도당을 측정하고 YSI 2300 STAT PLUS 글루코오스 및 L-락테이트 분석기(Glucose & L-Lactate Analyzer)로 분석하였다.
혈장에서의 인슐린, C-펩티드, 및 글루카곤 수준을 마우스 인슐린(Mercodia 10-1247-01, Uppsala, Sweden), 마우스 C-펩티드(Crystal Chem 90050, IL, USA), 및 마우스 글루카곤(Mercodia 10-1281-01, Uppsala, Sweden)에 대한 극히 민감한(Ultrasensitive) ELISA를 사용하여 결정하였다.
HFD후 10주(타목시펜 주사 후 19주)에, 6시간 금식시킨 의식이 있는 마우스에서 복강내 인슐린 내성 시험(0.75 IU/kg)(Lilly insulin Lispro, LLC, Indianapolis, USA)을 실시하였다. 꼬리 정맥 혈액을 글루코스 측정을 위해 인슐린 투여 전 및 투여 후 0, 20, 40, 60분에 채취하였다.
췌장 관류 및 격리
IP-GTT 및 ITT 후 1주일에, 마우스를 자궁경부 탈구에 의해 안락사시켰다. 중간 절단을 이용하여 복부와 흉강을 벌리고, 우심실을 절단한 후 좌심실을 바늘로 찔러 췌장 관류를 위해 10 ml의 차가운 인산 완충 심역수(PBS)를 천천히 주입하였다. 관류 후, 췌장을 차가운 PBS에 넣어 주변 지방을 포함한 다른 조직으로부터 분리하였다. 그런 다음, 췌장을, 여분의 PBS를 조직으로 흡수한 후에 칭량하였다.
조직학적 평가
더 작은 조각의 절제 후, 췌장을 4% 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences 19202, Hatfield, PA, USA)에서 밤새 4°C에서 고정시키고, 파라핀-포매하고, 4 μm 두께로 절단하였다. β-세포 영역에 대해, 토끼 항-인슐린 항체(Cell Signaling Technology C27C9, Danvers, MA, USA, 1:400)와 함께, 이어서 F(ab')2 접합체와 비오틴(Biotin)-SP(Jackson ImmunoResearch 711-066-152, West Grove, PA, USA, IHC에 대해 1:100)와 함께 순차적으로 인큐베이션된 탈파라핀화된 절편에 대해 퍼옥시다제- 및 헤마톡실린 염색을 실시하였으며, 그 후 퍼마운트(Permount, Fisher SP15-100, Hampton, NH, USA)로 절편을 장착하기 전에 VECTASTAIN ABC 키트(HRP)(Vector Laboratories PK-4000, Burlingame, CA, USA), 및 DAB 기질 키트(HRP)(Vector Laboratories SK-4100, Burlingame, CA, USA), 및 해리스 헤마톡실린(Harris Hematoxylin)의 단계들을 적용하였다. 올림푸스(Olympus) IX70 조직 배양 도립 현미경(Olympus, Center Valley, PA, USA)에서 이미지-프로 플러스(Image-Pro Plus) 5.1 소프트웨어를 사용하여 형태 측정 분석을 실시하였다. 이미징 및 데이터 분석은 각 섹션의 실험적 마우스 유전자형에 대해 맹검 방식으로 2명의 관찰자에 의해 실시하였다. 섬 엣지(islet edge)는 다중채널 이미지를 사용하여 수동으로 외접하였다. 인슐린- 및 헤마톡실린-양성 영역을 픽셀 임계화(pixel thresholding)를 이용하여 각 섬에 대해 결정하였다. 그런 다음, β-세포 면적을 인슐린-양성 면적/헤마톡실린-양성 면적 * 100%로서 계산하였다.
면역형광 분석은 라이카(Leica) DM6000 B 연구 현미경 상에서 오픈랩(Openlab) 5.5.0 소프트웨어로 실시하였다. 하기의 항체: 토끼 항-PFKFB3(Abcam ab181861, Cambridge, MA, USA, 1:100); 마우스 항-MCM2(BD Transduction Laboratories 610700, San Diego, CA, USA, 1:100); 토끼 항-절단된 카스파제-3(Cell Signaling Technology 9664S, Danvers, MA, USA, 1:400); 기니아-피그 항-인슐린(Abcam ab195956, Cambridge, MA, USA, 1:400); 마우스 항-글루카곤(Sigma-Aldrich G2654, St.Louis, MO, USA, 1:1000), 마우스 항-c-Myc(Santa Cruz Biotechnology Inc 9E10 sc-40, Dallas, Texas, USA, 1:100); 마우스 항-HIF1(Novus Biologicals NB100-105, Centennial, CO, USA, 1:50)를 사용하였다. 2차 항체는: FITC 당나귀 항기니피그(Donkey Anti-Guinea Pig) IgG(H+L)를 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 706-096-148, West Grove, PA, USA, IF에 대하여 1:200); Cy3 당나귀 항토끼 IgG(H+L)를 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 711-166-152, West Grove, PA, USA, IF에 대하여 1:200); Cy3 당나귀 항마우스 IgG(H+L)를 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 711-165-151, West Grove, PA, USA, IF에 대하여 1:200) 및 알렉사(Alexa) 647 당나귀 항마우스 IgG(H+L)를 갖는 F(ab’)2 접합체(Jackson ImmunoResearch 715-606-150, West Grove, PA, USA, IF에 대하여 1:100)였다. TUNEL 분석을 통해 세포사멸을 측정하기 위하여 인시츄 세포사멸 검출 키트(In Situ Cell Death Detection Kit, Roche Diagnostics Corporation 12156792910, Indianapolis, IN, USA)를 사용하였다. DAPI(Vector Laboratories H1200, Burlingame, CA, USA)를 이용한 벡타실드(Vectashield)를 사용하여 슬라이드를 장착하였다.
단일 세포 RNA 서열 데이터 분석
단일-세포 RNA-seq 데이터세트는 GEO 수탁번호 GSE124742로부터 수득하였으며, 여기서 건강한 및 제2형 당뇨병 세포가 사용되었다. 상이한 세포 유형을 식별하고 각 세포 유형에 대한 형질 유전자를 찾기 위해, R 패키지 Seurat(버전 3.1.2)을 이용하여 발현 매트릭스를 분석하였다. 검출된 100개 미만의 유전자 및 500개의 UMI를 갖는 세포를 추가 분석으로부터 제거하였다. Seurat 함수 NormalizeData를 사용하여 원시 카운트를 정규화하였다. 가변 유전자는 FindVariableGenes 기능을 이용하여 식별하였다. Seurat ScaleData 함수를 사용하여 치수 감소를 위한 데이터 집합의 표현식 값을 조정하고 중심에 배치하였다. 상기 Seurat 함수에는 기본 매개 변수가 사용되었다. 주요 성분 분석(PCA) 및 균일 매니폴드 근사 및 투영법(uniform manifold approximation and projection, UMAP)를 사용하여 데이터의 치수를 감소시켰으며, 처음 2개의 치수는 플롯에서 사용되었다. FindClusters 함수는 나중에 셀을 클러스터링하는 데 사용되었다. FindAllMarkers 함수를 사용하여 각 클러스터에 대한 마커 유전자를 결정하고, 이어서 이를 사용하여 세포 유형을 정의하였다. FindMarkers 함수를 사용하여 두 군의 세포 사이의 차별적 발현 분석을 실시하였다. 윌콕슨의 순위합 검증(Wilcoxon rank sum test)은 시차 분석에서 실시하였고, 벤자미니 호크버그(Benjamini-Hochberg) 절차를 적용하여 오발견율을 조정하였다.
통계 분석
데이터는 표시된 마우스의 수에 대한 평균의 오차(표준 오차, SEM)로서 제시된다. IP-GTT 및 ITT의 경우, 포도당, 인슐린, C-펩티드 및 글루카곤에 대한 곡선하 면적(AUC)은 사다리꼴 규칙을 사용하여 계산하였다. 평균 데이터는 스튜던트 티이 검정을 이용한 분석을 통해 군 간에 비교하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주하였다.
결과
생체내 당뇨병 유발 스트레스 하에 손상된 β-세포의 생존에서 HIF1α로부터 PFKFB3의 역할을 연구 및 해부하기 위해, 마우스를 hIAPP +/- 배경에서 Pfkfb3 유전자의 β-세포-특이적 조건부 파괴로 생성시키고 13주 동안 고지방 식이에 노출시켰다(PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD). 당뇨병 유발 스트레스는 인슐린 저항성(비만) 및 hIAPP+/- 발현을 통한 잘못 접힌 단백질 노출을 포함하기 때문에 높은 것으로 간주되었으며, 둘 모두 당뇨병의 누적 위험 인자로 공지된 고지방 식이 및 노령 모두를 통해 영향을 받았다[16-18].
PFKFB3fl/fl hIAPP+/- 마우스는 예상된 멘델 비로 태어났다. 마우스를 모니터링 하기 1주일 전부터 실험이 끝날 때까지, 서로 상이한 실험군간의 체중 차이는 없었다(도 15a-15d). 췌장 무게에서는 차이가 관찰되지 않았지만, 비장 및 간 둘 모두는 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스 및 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군과 비교하여 더 낮은 체중을 보였지만, 유의적인 차이에 도달하지 않았다(도 16a-도 16c).
PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스를 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 및 PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군과 비교하였다. PFKFB3 발현의 효율적인 파괴는 양성 대조군으로서 PFKFB3WT hIAPP+/+를 사용하여 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스의 췌장 절편의 PFKFB3 면역염색에 의해 확인하였다(도 8a). 당뇨병 유발 스트레스는 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스 (p<0.05)에서 33.9 ± 6.4% PFKFB3 면역표지로 이어졌고, 이는 T2D를 갖는 인간을 위해 이전에 보고된 것과 유사하였다[18]. PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 처리 마우스로부터의 β-세포의 PFKFB3 면역표지화는 3.7 ± 1.9%인 반면, PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 이는 성공적으로 제거되었고 1.0 ± 0.8%를 차지하였다(도 8a 및 도 8b).
이 모델에서 PFKFB3이 HIF1α 발현에 연결되는지를 확립하기 위해, 모든 실험군으로부터의 췌장 절편을 HIF1α 항체로 면역염색하였다. HIF1α 발현은 PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군과 비교하여 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스로부터의 β-세포에서 18.4 ± 4.2%로 증가하였다(*p<0.05). PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서, 모든 β-세포 중 14.2 ± 3.8%(도 8c 및 도 8d)가 HIF1α 면역양성 세포질 및 핵을 계속 나타내었다. 이는 PFKFB3 녹아웃이 스트레스에 반응하여 보상적 HIF1α 발현을 촉발한다는 것을 명확하게 나타내었다.
PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스의 대사 성능의 분석은 고지방 식이 개시 후 9(*p < 0.05, n = 4) 및 12주 둘 모두에서 증가된 글루코스 불내성을 나타내었다(도 9a-도 9d). 인슐린 저항성 시험은 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 더 높은 인슐린 감수성을 나타내었고, 유의하지는 않지만 더 낮은 공복 포도당 수준이며, 차이는 후기 시점에서 실험군 사이에서 감소되었다(도 9c 및 도 9d). 혈장 인슐린 수준은 C-펩티드 수준을 반영하고, PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군(p<0.05)과 비교하여 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 및 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD에서 더 낮았다(도 9g-도 2h). 흥미롭게도, 혈장 인슐린은 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 및 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스에 대하여 낮았지만, 나중에 훨씬 더 높은 혈장 글루카곤 수준을 갖는 반면, PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD는 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 및 PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군에서 관찰된 것과 동일한 수준과 비교하여 급격한 감소를 나타내었다(도 9I). 증가된 인슐린 감수성과 함께, 이러한 결과는 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 손상된 인슐린 분비를 시사하였다. 다음으로, 본 발명자들은 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 손상된 인슐린 분비가 PFKFB3의 부재 하에 당뇨병 유발 스트레스 하에 β-세포량을 확장시키지 못함에 기인하는지 물었다.
따라서, β-세포 분획 면적 및 질량을 비교하는 것이 중요해졌다. β-세포 분획 면적 및 질량은 실험군들 사이에서 변화하지 않았다(도 10a 및 도 10b). 궁극적으로 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD- 및 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스 사이에서 비교할 만한 β-세포량의 성장 역학을 조사하기 위해, 과거 세포 사멸의 측정으로서 TUNEL 염색을 실시하고(도 10c), 활성 β-세포 사멸의 측정으로서 절단된 카스파제 3을 실시하였다(도 10e 및 도 10f). β-세포 사멸은 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스에 비해 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 증가하였다(도 10c). 놀랍게도, β-/α 세포 비율은 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스에 비해 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD-에서 증가하였다(도 10d). 모든 실험 마우스 군의 절단된 카스파제 3 면역염색에 기초하여 활성 세포 사멸의 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스로부터의 β-세포는 다른 군에 비해 증가된 과거 세포 사멸에 의해 표시되었고 진행중인 세포 사멸에서 차이가 없었다.
β-/α-세포 비율의 증가가 β-세포의 증가된 생성에 의존하는지를 더 밝히기 위해, 조기 복제 개시 마커인 소염색체 관리 단백질 2(MCM2)를 사용하여 면역표지화를 실시하였다[19, 20]. 그 결과, PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스로부터의 β-세포가 MCM2 표지화의 3배 증가를 나타내었으며(5.3% ± 0.8%, *p<0.05), 이는 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스와 비교하여 증가된 β-세포 복제를 나타내었고(1.9 ± 0.04%) PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군과 유사하였다(7.0 ± 1.3%, 도 11a 및 도 11b). PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 세포 사멸 및 β-세포 복제 둘 모두에서의 증가에도 불구하고, β-세포 분획 면적은 3개의 군 모두에서 비교할만 하였다(도 10a). 따라서, PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 β-세포 복제의 증가는 PFKFB3 보호 및 프로서바이벌 역할의 부재 하에 손상된 β-세포의 초기 손실 및 증가된 세포 사멸에도 불구하고 β-세포량을 유지하는 것으로 나타났다(TUNEL 검정에 의해 측정됨).
β-세포를 복제하는 것이 임의의 잔류 손상을 갖는지를 밝히기 위해, 본 발명자들은 β-세포에서 hIAPP-유발된 손상의 특이적 마커 - Myc-니크라 불리는 단백질 c-Myc의 칼페인-매개 절단의 세포질 축적을 이용하였다[14]. c-Myc 염색의 분석은 당뇨병 유발 스트레스 하에서 PFKFB3WT hIAPP+/-(3.3 ± 0.5%, *p<0.05)에서 Myc-니크 발현의 증가를 나타내었지만, PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군 마우스 수준으로의 역전을 나타내었다(각각 0.8 ± 0.4% 및 0.7 ± 0.6%, 도 11c 및 도 11d). 이들 결과는 건강한 β-세포가 아마도 감소된 hIAPP 단백질 접힘 오류 스트레스 후에 복제의 증가에 기여하였음을 나타내었다.
PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD의 췌장 절편에서 HIF1α 면역염색은 모든 β-세포의 약 14%에 영향을 미쳤고 세포질 c-Myc에 의해 측정된 감소된 접힘 오류 단백질 스트레스와 일치하였지만, 이는 잠재적으로 β-세포를 복제하는 데 있어서 회복되지 않은 대사 기능에 대한 이유를 나타내었다(도 8c 및 도 8d). 기능 손실에 대한 이들 HIF1α-양성 β-세포의 잠재적 기여를 특성화하기 위해, T2D를 갖는 인간으로부터의 공개된 단일 세포 RNA 서열(scRNA 서열) 데이터를 비당뇨병과 비교하여 사용하였다[1]. 먼저, 본 발명자들은 품질을 분석하고 scRNA Seq 데이터를 확인하였다(도 11a-도 12d). 건강한 및 T2D 공여체로부터의 췌장 세포를 재클러스터링하고(umap_cluster), β-세포에 대한 인슐린(INS)과 같은 유전자 마커에 기초하여 특정 세포 유형에 주석을 달았다(umap_celltype, 도 12a-도 12d). 9가지 상이한 세포 유형이 식별되었고 그들의 차이를 묘사한 유전자 발현이 도 12c, 도 20, 및 도 21에 제시되었다. β-세포 마커로서 INS를 사용하여, β-세포의 2개의 클러스터, 즉 클러스터 1 및 클러스터 7을 식별한 반면, 클러스터 2-6, 8 및 9는 다른 췌장 세포 유형으로 언급되었다(도 12b 및 도 12c). 클러스터 6(α-세포 하위군), 7(β-세포 하위군) 및 8(δ-세포)에서의 조성은 건강한 공여체와 T2D 공여체 사이에서 가장 차이가 있었다(도 19). HIF1α은 주로 번역후 조절되므로, 호기성 해당과정에서 HIF1α 전사대상인 락테이트 디하이드로게나아제 A(LDHA)의 발현 여부에 따라 β-세포를 추가로 구분하였다(도 12d). 각 조건에 대해, 그리고 LDHA 발현에 기초하여, 세포를 LDHA-양성 및 LDHA-음성 세포로 분할하고, 두 군 사이에서 차등 발현 분석을 실시하였다. 클러스터 7의 묘사된 β-세포 하위군과 중첩되는 LDHA 양성 β-세포는 질병 상태와 무관하게, 대사와 관련된 유전자, 예컨대 LDHA, 아릴 탄화수소 핵 수송체 2(ARNT2, 즉, HIF1α), 글루코키나제(GK), 포스포프럭토키나제 1 혈소판 유형(PFKFP), 피루베이트 데하이드로게나제 키나제 4(PDK4), 또는 포스포에놀피루베이트 풀을 통한 FBP1과 같은 인슐린 분비와 관련된 유전자, 또는 글루카곤(GCG, pro-α-세포 식별) 및 아리스타리스 관련 호메오박스(Aristaless Related Homeobox, ARX, pro-α-세포 식별) 및 INS(더 낮은 발현, β-세포 식별)와 관련되었다. LDHA-양성 또는 클러스터 7 β-세포는 알데히드 데하이드로게나제 1A1(ALDH1A1)과 같은 유전자의 상향조절과 관련하여 미성숙한 표현형을 나타내었다. 이러한 결과는 T2D를 갖는 인간에서, β-세포(클러스터 7 β-세포와 중첩되는 LDHA-양성 세포)의 분획이 감소된 INS 발현 및 증가된 GCG 및 ARX 발현을 갖는 유전자 형질을 가짐을 시사하였다. 신규 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis, IPA)에 의한 풍부화 데이터는 클러스터 1 및 7에서 유의하게 변경된 유전자들 사이 및 LDHA 양성 및 음성 세포들 사이의 차이가 LXR/RXR 레티노이드 수용체에 의해 재현된다는 것을 보여주었고, 이는 이 상류 조절제가 상위성 HIF1α-PFKFB3 비정규 대사 경로의 일부임을 나타낸다. 또한, 스트링 분석은 클러스터 1과 7 사이의 차이뿐만 아니라 LDHA 음성 및 양성 β-세포 사이의 차이가 건강한 경우에서 잘 보존되는 반면, 이들 차이는 T2D에서 강하게 감소되었음을 명확하게 나타내었다. 이러한 데이터는 T2D에서 β-세포의 클러스터가 서로 유사해지기 시작하고, 그 차이가 스트레스 하에서 감소된다는 것을 시사하였다(도 22a-도 23b). T2D와 건강한 개체 간에 비교할 때, 클러스터 1 또는 LDHA-음성 β-세포에서 차별적으로 발현된 유전자는 유의한 중첩을 나타내었다.
클러스터 7 또는 LDHA 양성 세포에서 β-세포군의 보체를 찾기 위해, 본 발명자들은 특이적 인슐린 및 글루카곤 항체로 실험 마우스군으로부터의 췌장 절편을 이중 염색하였다. 당뇨병 유발 스트레스는 PFKFB3WT hIAPP-/-+HFD 대조군에 비해 PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD에서 이중 양성 세포 수의 2배로 증가하였다(각각 2.7 ± 1.8%에 비해 5.7 ± 2.8%). PFKFB3 녹아웃은 PFKFB3WT DS와 비교할 때 수반되는 인슐린 및 글루카곤 면역양성을 갖는 세포의 감소를 유도하였다(5.7 ± 2.8%에 비해 0.8 ± 0.3%, 도 13a). PFKFB3 양성 손상된 β-세포의 제거시 이중호르몬(인슐린+ 글루카곤+) 세포의 분획이 파괴되었을 뿐만 아니라, β-세포의 유의한 증가와 상관관계가 있었다(*p<0.05). 이는 PFKFB3 파괴가 이중 인슐린 및 글루카곤 아이덴티티를 갖는 β-세포의 특이적 도태를 유발하고, 그리고/또는 복제가 인슐린 단독 양성 β-세포로부터 자극된다는 것을 나타내었다. 그 반대의 경우도 모든 α-, β-, 및 이중호르몬 세포와 함께 비교하여 α-세포에 대해 사실이었다(도 13b). 이 비율은 대조군 수준에 도달하였고, PFKFB3WT hIAPP+/-+HFD 마우스에 비해 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD 마우스에서 감소되었다(*p<0.05). 이중 인슐린 및 글루카곤 염색된 세포는 고지방 식이에 노출된 실험 마우스에서 명백하게 존재하였고, 당뇨병전 또는 당뇨병성 연령의 WT 대조군 또는 hIAPP+/+에서 검출되지 않았다(도 13c 및 도 13d).
따라서, PFKFB3 녹아웃은 이중 인슐린 및 글루카곤 아이덴티티를 갖는 β-세포의 소실을 유도하였으며, 이 세포는 hIAPP 손상에 대해 PFKFB3-매개 생존에 의존할 뿐만 아니라 이중 아이덴티티를 통해 생존을 수용하는 세포이며, 아마도 둘 모두 이의 손상된 기능에 기여한다는 것을 나타낸다.
흥미롭게도, 이러한 데이타는 PFKFB3βKO hIAPP+/-+HFD에서 HIF1α-양성 세포가 이중 β- 및 a-아이덴티티를 갖지 않음을 지적하였는데, 이는 이중 β- 및 a-아이덴티티 보유 세포의 생존이 HIF1α이 아니라 PFKFB3에 의존함을 나타낸다.
이러한 분석은 또한 당뇨병의 마우스 모델에서 HIF1α-양성 세포의 축적이 PFKFB3 유전자 감소 후 β-세포량 회복에도 불구하고 β-세포 기능의 손실의 원인이 될 수 있음을 나타내었다. PFKFB3 감소는 복제에 의해 건강한 β-세포를 보충하기에 충분하고 필요한 β-세포 및 α-세포 아이덴티티 둘 모두를 갖는 손상된 β-세포의 도태를 촉발시키는 것으로 보인다. 하지만, HIF1α에 의한 독립적인 면역표지화는 β-세포 인슐린 분비를 추가로 손상시킨다.
이러한 연구는 PFKFB3의 공동-표적화와 함께 또는 공동-표적화 없이 HIF1α를 표적화(즉, 억제)하는 것이 기능적으로 적격 β-세포량의 회복 및 당뇨병의 역전을 발생시킬 것임을 강하게 시사한다.
논의
이러한 연구에서, 본 발명자들은 높은 당뇨병 유발 스트레스 하의 성체 마우스에서 Pfkfb3 유전자의 특이적 β-세포 파괴가 부분 섬세포 재생을 발생시킨다는 것을 입증한다. 이는 손상 및 이중호르몬(인슐린 및 글루카곤 양성) 세포의 도태 및 나머지 건강한 β-세포의 복제를 통해 달성된다.
도태는 아마도 상당한 수의 β-세포에 영향을 미칠 것이다. 재구성된 대사에서 PFKFB3의 영향은 이의 생존에 미치는 영향을 설명하지만[13], β 세포 기능의 보존과 관련된 질문도 제기한다. 따라서, 잘못 접힌 단백질 스트레스(hIAPP)에서 HIF1α-PFKFB3 경로에 의한 대사 재구성은 폰 히펠 린다우 유전자(Vhl)의 조건부 불활성화 후 HIF1α 발현의 결과를 재현한다[13, 31]. 당뇨병 유발 스트레스의 존재 또는 부재하에, HIF1α 활성화는 췌장 β-세포에서 손상된 전신 포도당 내성에서 절정을 이루는 세포질 Ca2+ 농도, 전기 활성 및 인슐린 분비의 감소된 포도당-자극 변화를 초래하였다[13, 31].
HIF1α은 PFKFB3βKO DS 마우스로부터 유의한 수의 β-세포에서 연속적으로 발현되었다(~14%). 이는 당뇨병의 이러한 마우스 모델에서, 지속된 HIF1α 반응이 PFKFB3과 무관함을 나타내었다. PFKFB3βKO DS 및 PFKFB3WT DS 마우스에서의 HIF1α 발현 수준(각각 14% 및 18%)은 WT 대조군과 비교하여 글루코스 불내성 및 더 낮은 혈장 인슐린- 및 C-펩티드 수준과 유사하였다(p0.05).
β-세포 기능부전에 대한 분자 기반에서 HIF1α의 역할을 조사하기 위해, 비만-T2D 및 비당뇨병(ND)을 갖는 인간의 sc RNA Seq 데이터를 분석하였다. 본 발명자들은 LDHA가 HIF1α에 대한 대체 마커로서 작용하는 진정한 표적이기 때문에 LDHA 양성- 대 음성 β-세포의 구별을 이용하였다. HIF1α은 전사체 수준의 변화 없이 주로 번역 후 조절된다. LDHA 양성 β-세포는 클러스터 7 β-세포 하위군과 중첩되었고, HIF1α-(ARNT2, GK, PFKFP, PDK4) 및 이중호르몬 형질(a 및 β-세포 아이덴티티)(GCG, ARX 및 INS) 및 일부 미성숙 마커(ALDH1A1)에 의해 나타내었다. 마우스 모델에서의 이중 인슐린- 및 글루카곤 양성 세포는 LDHA 양성 또는 클러스터 7 β-세포와 유사하였고, 이는 전사분화에 적용된 탈분화 또는 β-세포로부터 유래할 수 있다[32].
건강한 및 T2D 둘 모두에서 LDHA 양성(클러스터 7) 및 LDHA 음성(클러스터 1) β-세포 사이의 비교를 위해 사용된 신규 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis, IPA)은 잠재적으로 상위성 HIF1α 대사 경로의 일부인 마스터 상류 조절제, 간 X 수용체, 레티노이드 수용체의 유형(LXR /RXR)[33]의 존재를 나타내었다. 이러한 수용체의 활성화는 헥소키나아제 1 및 3(HK1 및 3) 및 SLC2A1(GLUT1))의 전사 상향조절 및 HIF1α와의 상호작용을 통해 고지방 식이에 반응하여 독립적으로 호기성 해당작용을 증가시킬 수 있다[34].
흥미롭게도, 이중호르몬 β-세포 하위군은 비만 비당뇨병 및 HFD 하의 WT 대조군에 존재하였으며, 이는 이중호르몬 세포의 형성이 증가된 지방형성 및 고지방 식이에 대한 적응성 반응일 수 있음을 나타낸다. 이와 같이, 이중 인슐린 및 글루카곤 양성 세포는 WT 대조군 또는 HFD의 부재 하에서 hIAPP+/+(음성 대조군으로 사용됨)에서 검출되지 않았고, 당뇨병전 또는 당뇨병 연령에서도 검출되지 않았다. 건강한 또는 T2D이든 관계없이, LXR/RXR의 영향에 의해 클러스터 1로부터 이중호르몬 β-세포 클러스터 7(LDHA 양성 β-세포)을 구별할 수 있었다. 이전의 보고는 인슐린 분비에 대한 요구 증가에 따른 적응성 반응인 급성 활성화와 달리, LXR의 만성 활성화는 유리 지방산 및 트리글리세라드의 축적에 의해 β-세포 기능장애에 기여할 수 있음을 나타내었다[33]. 또한, STRING 분석은 클러스터 1과 7 사이의 차이뿐만 아니라 LDHA 음성 및 양성 β-세포 사이의 차이가 건강한 경우에서 잘 보존되는 반면, 이들 차이는 T2D에서 감소되었음을 나타내었다. 이중호르몬 세포의 보존된 특징은 세포 적합성 경쟁의 맥락에서 관련될 수 있으며, 여기서 본 발명가들은 이중호르몬 세포의 인식 및 항상성 제어를 위한 기초를 구성할 수 있다고 제안한다.
세포 적합성 경쟁은 우수한 적합성(생존) 특성을 갖는 세포군 대 열등한 세포군 간의 구별에 기초한 중요한 외인성 세포 품질 조절이다. 이러한 구별은 열등한 적합성 특성을 갖는 세포군의 선택적 도태를 촉발하고(패자), 우수한 적합성 특성을 갖는 세포군의 확장을 촉진하는데(승자) 있어 핵심이 된다. "패자"를 "승자"로 대체하는 것은 항상성 조직의 유지를 가능하게 한다. T2D(클러스터 1 및 7과 유사함)에서 본 바와 같은 세포 경쟁적 조직 구성을 역전시킴으로써 세포 경쟁의 억제를 유도하고, 이어서 시간이 지남에 따라 조직 기능부전을 발생시킬 수 있다.
당뇨병의 마우스 모델에서, 성체 β-세포에서의 PFKFB3 녹아웃은 손상된 β-세포 및 이중호르몬(인슐린 및 글루카곤 양성) 세포의 강한 감소 및 건강한 β-세포 복제에서의 부수적인 증가를 유도하였다. 본 발명자들은 칼페인(hIAPP)에 의해 매개된 세포질 c-Myc의 절단 정도를 측정함으로써 손상된 β-세포를 모니터링하였다[26]. 칼페인은 이전에 hIAPP 잘못 접힌 단백질 독성을 직접적으로 반영하는 것으로 보고되었다[35, 36]. PFKFB3βKO DS 마우스에서, 세포질 c-Myc는 WT 대조군에서 측정된 바와 같이 거의 검출가능하지 않은 수준으로 역전되었다(각각 0.8 ± 0.4% 및 0.7 ± 0.6%).
이들 결과는 복제의 증가가 건강한 β-세포에 의해 기여되고 진행 중인 칼페인 활성화 및 따라서 hIAPP 손상으로 β-세포의 탁월한 손실에 의해 가능하게 촉진된다는 것을 나타내었다. 따라서, 이러한 결과는 PFKFB3 놋아웃 후 손상된 β-세포를 도태시켜 세포경쟁에 의존하는 β-세포 재생을 제안하였다. 따라서, 추가로 PFKFB3βKO DS 마우스에서 PFKFB3WT DS와 비교하여 β-/α 비율의 증가 및 글루카곤 수준의 감소가 보다 높은 인슐린 감수성이 관찰되는 경향을 설명했을 수 있다[37-39].
결론적으로, PFKFB3βKO DS 마우스에서 β-세포량의 보존 및 β-/α 비율의 증가는 손상된 β-세포의 초기 손실 및 이중호르몬 세포의 감소를 극복하는 β-세포 복제로부터 누적적으로 발생한다.
당뇨병 유발 스트레스에서의 재생 성장은 PFKFB3에 결정적으로 의존적이었지만, 매치되지 않은 대사 기능은 PFKFB3와 독립적인 HIF1α-양성 세포의 분획으로 설명될 수 있다. 따라서, 당뇨병의 마우스 모델에서 HIF1α은 PFKFB3 유전자 감소 후 β-세포량 회복에도 불구하고 β-세포 기능의 손실의 원인이 될 수 있다.
이러한 연구는 PFKFB3의 공동-표적화와 함께 또는 공동-표적화 없이 HIF1α를 표적화하는 것이 기능적으로 적격 β-세포량의 회복 및 당뇨병의 역전을 발생시킬 것임을 강하게 시사한다.
실시예 5 - 스트레스 하의 β-세포 보충에서 β-세포 적합성 비교의 역할에 대한 모델의 생성
스트레스 하의 β-세포 복제에서 β-세포 적합성 비교의 역할에 대한 모델은 실시예 1 내지 4에 기재된 연구를 기초로 하여 생성되었다. 도 25는 생성된 모델의 개략도를 도시한다. 상단 패널은 건강한 비당뇨병에서 고지방 식이(HFD)와 같은 대사 스트레스 후, 손실된 조직을 재생하기 위해 복제하는 건강한 β-세포(밝은)와의 경쟁에 의해 최적이 아닌 세포(어두운)가 조직으로부터 제거되는 방법을 도시한다. 중간 패널은 손상이 지속되는 세포 경쟁에서(T1D 및 T2D), 손상된, 최적이 아닌 β-세포(어두운)가 감소된 적합성에도 불구하고 생존하고 HIF1α-PFKFB3 경로에 의한 대사 재형성으로 인해 조직으로부터 제거될 수 없는 방법을 도시한다. 이러한 손상된 β-세포는 건강한 β-세포 보충(복제)을 방해할 수 있다. 하단 패널은 스트레스 및 손상 조건하에서, 생존 촉진 PFKFB3 및/또는 HIF1α 경로의 표적화가 세포 경쟁의 활성화 및 최적이 아닌(손상된) β-세포 (어두운)의 제거를 발생시키는 방법을 도시한다. 최적이 아닌(손상된) β-세포의 제거는 나머지 건강한 β-세포(MCM2-양성 세포)의 복제를 발생시킨다.
* * *
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재된 방법 및 단계 또는 단계의 순서를 변형시킬 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 제제가 본원에 기재된 제제로 치환될 수 있는 한편, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 것임이 명백할 것이다. 당업자들에게 명백한 모든 이러한 유사한 대체물 및 수정물들은 첨부된 청구항들에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참조문헌
본원에 기재된 것에 보충적인 예시적인 절차적 또는 다른 세부사항들을 제공하는 정도까지, 다음의 참조문헌들은 본원에 구체적으로 원용된다.
1. Camunas-Soler, J., et al., Patch-Seq Links Single-Cell Transcriptomes to Human Islet Dysfunction in Diabetes. Cell Metab, 2020. 31(5): p. 1017-1031 e4.
2. Montemurro, C., et al., IAPP toxicity activates HIF1alpha/PFKFB3 signaling delaying beta-cell loss at the expense of beta-cell function. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 2679.
3. Matveyenko, A.V. and P.C. Butler, Beta-cell deficit due to increased apoptosis in the human islet amyloid polypeptide transgenic (HIP) rat recapitulates the metabolic defects present in type 2 diabetes. Diabetes, 2006. 55(7): p. 2106-14.
4. Butler, A.E., et al., Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes, 2003. 52(1): p. 102-10.
5. Butler, A.E., et al., Diabetes due to a progressive defect in beta-cell mass in rats transgenic for human islet amyloid polypeptide (HIP Rat): a new model for type 2 diabetes. Diabetes, 2004. 53(6): p. 1509-16.
6. Donath, M.Y., et al., Mechanisms of beta-cell death in type 2 diabetes. Diabetes, 2005. 54 Suppl 2: p. S108-13.
7. Donath, M.Y., et al., Islet inflammation impairs the pancreatic beta-cell in type 2 diabetes. Physiology (Bethesda), 2009. 24: p. 325-31.
8. Laybutt, D.R., et al., Endoplasmic reticulum stress contributes to beta cell apoptosis in type 2 diabetes. Diabetologia, 2007. 50(4): p. 752-63.
9. Harmon, J.S., R. Stein, and R.P. Robertson, Oxidative stress-mediated, post-translational loss of MafA protein as a contributing mechanism to loss of insulin gene expression in glucotoxic beta cells. J Biol Chem, 2005. 280(12): p. 11107-13.
10. Nauta, T.D., V.W. van Hinsbergh, and P. Koolwijk, Hypoxic signaling during tissue repair and regenerative medicine. Int J Mol Sci, 2014. 15(11): p. 19791-815.
11. Botusan, I.R., et al., Stabilization of HIF-1alpha is critical to improve wound healing in diabetic mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(49): p. 19426-31.
12. Lane, A.N. and T.W. Fan, Regulation of mammalian nucleotide metabolism and biosynthesis. Nucleic Acids Res, 2015. 43(4): p. 2466-85.
13. Farber, J.L., The role of calcium ions in toxic cell injury. Environ Health Perspect, 1990. 84: p. 107-11.
14. Conacci-Sorrell, M., C. Ngouenet, and R.N. Eisenman, Myc-nick: a cytoplasmic cleavage product of Myc that promotes alpha-tubulin acetylation and cell differentiation. Cell, 2010. 142(3): p. 480-93.
15. Janson J, Soeller WC, Roche PC, et al. Spontaneous diabetes mellitus in transgenic mice expressing human islet amyloid polypeptide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996. 93(14): p. 7283-7288.
16. Bellou, V., et al., Risk factors for type 2 diabetes mellitus: An exposure-wide umbrella review of meta-analyses. PLoS One, 2018. 13(3): p. e0194127.
17. Fletcher, B., M. Gulanick, and C. Lamendola, Risk factors for type 2 diabetes mellitus. J Cardiovasc Nurs, 2002. 16(2): p. 17-23.
18. Wu, Y., et al., Risk factors contributing to type 2 diabetes and recent advances in the treatment and prevention. Int J Med Sci, 2014. 11(11): p. 1185-200.
19. Bleichert, F., Mechanisms of replication origin licensing: a structural perspective. Curr Opin Struct Biol, 2019. 59: p. 195-204.
20. Shetty, A., et al., DNA replication licensing and cell cycle kinetics of normal and neoplastic breast. Br J Cancer, 2005. 93(11): p. 1295-300.
21. Ortiz-Barahona, A., et al., Genome-wide identification of hypoxia-inducible factor binding sites and target genes by a probabilistic model integrating transcription-profiling data and in silico binding site prediction. Nucleic Acids Res, 2010. 38(7): p. 2332-45.
22. Valvona, C.J., et al., The Regulation and Function of Lactate Dehydrogenase A: Therapeutic Potential in Brain Tumor. Brain Pathol, 2016. 26(1): p. 3-17.
23. Zehetner, J., et al., PVHL is a regulator of glucose metabolism and insulin secretion in pancreatic beta cells. Genes Dev, 2008. 22(22): p. 3135-46.
24. Schuit, F.C., et al., Glucose sensing in pancreatic beta-cells: a model for the study of other glucose-regulated cells in gut, pancreas, and hypothalamus. Diabetes, 2001. 50(1): p. 1-11.
25. Adeva-Andany, M.M., et al., Metabolic effects of glucagon in humans. J Clin Transl Endocrinol, 2019. 15: p. 45-53.
26. Faerch, K., et al., Insulin Resistance Is Accompanied by Increased Fasting Glucagon and Delayed Glucagon Suppression in Individuals With Normal and Impaired Glucose Regulation. Diabetes, 2016. 65(11): p. 3473-3481.
27. Ahren, B. and O. Thorsson, Increased insulin sensitivity is associated with reduced insulin and glucagon secretion and increased insulin clearance in man. J Clin Endocrinol Metab, 2003. 88(3): p. 1264-70.
28. Choe, S.S., et al., Chronic activation of liver X receptor induces beta-cell apoptosis through hyperactivation of lipogenesis: liver X receptor-mediated lipotoxicity in pancreatic beta-cells. Diabetes, 2007. 56(6): p. 1534-43.
29. Miyazaki, S., et al., Nuclear hormone retinoid X receptor (RXR) negatively regulates the glucose-stimulated insulin secretion of pancreatic ss-cells. Diabetes, 2010. 59(11): p. 2854-61.
30. Dusaulcy, R., et al., High-fat diet impacts more changes in beta-cell compared to alpha-cell transcriptome. PLoS One, 2019. 14(3): p. e0213299.
31. Talchai, C., et al., Pancreatic beta cell dedifferentiation as a mechanism of diabetic beta cell failure. Cell, 2012. 150(6): p. 1223-34.
32. Coelho, D.S., et al., Culling Less Fit Neurons Protects against Amyloid-beta-Induced Brain Damage and Cognitive and Motor Decline. Cell Rep, 2018. 25(13): p. 3661-3673 e3.
SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIABETES TREATMENT AND BETA-CELL REGENERATION <130> UCLA.P0116WO (1001177507) <140> <141> 2021-08-17 <150> 63/067,187 <151> 2020-08-18 <150> 63/169,776 <151> 2021-04-01 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3946 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 agtgcacagt gctgcctcgt ctgaggggac aggaggatca ccctcttcgt cgcttcggcc 60 agtgtgtcgg gctgggccct gacaagccac ctgaggagag gctcggagcc gggcccggac 120 cccggcgatt gccgcccgct tctctctagt ctcacgaggg gtttcccgcc tcgcaccccc 180 acctctggac ttgcctttcc ttctcttctc cgcgtgtgga gggagccagc gcttaggccg 240 gagcgagcct gggggccgcc cgccgtgaag acatcgcggg gaccgattca ccatggaggg 300 cgccggcggc gcgaacgaca agaaaaagat aagttctgaa cgtcgaaaag aaaagtctcg 360 agatgcagcc agatctcggc gaagtaaaga atctgaagtt ttttatgagc ttgctcatca 420 gttgccactt ccacataatg tgagttcgca tcttgataag gcctctgtga tgaggcttac 480 catcagctat ttgcgtgtga ggaaacttct ggatgctggt gatttggata ttgaagatga 540 catgaaagca cagatgaatt gcttttattt gaaagccttg gatggttttg ttatggttct 600 cacagatgat ggtgacatga tttacatttc tgataatgtg aacaaataca tgggattaac 660 tcagtttgaa ctaactggac acagtgtgtt tgattttact catccatgtg accatgagga 720 aatgagagaa atgcttacac acagaaatgg ccttgtgaaa aagggtaaag aacaaaacac 780 acagcgaagc ttttttctca gaatgaagtg taccctaact agccgaggaa gaactatgaa 840 cataaagtct gcaacatgga aggtattgca ctgcacaggc cacattcacg tatatgatac 900 caacagtaac caacctcagt gtgggtataa gaaaccacct atgacctgct tggtgctgat 960 ttgtgaaccc attcctcacc catcaaatat tgaaattcct ttagatagca agactttcct 1020 cagtcgacac agcctggata tgaaattttc ttattgtgat gaaagaatta ccgaattgat 1080 gggatatgag ccagaagaac ttttaggccg ctcaatttat gaatattatc atgctttgga 1140 ctctgatcat ctgaccaaaa ctcatcatga tatgtttact aaaggacaag tcaccacagg 1200 acagtacagg atgcttgcca aaagaggtgg atatgtctgg gttgaaactc aagcaactgt 1260 catatataac accaagaatt ctcaaccaca gtgcattgta tgtgtgaatt acgttgtgag 1320 tggtattatt cagcacgact tgattttctc ccttcaacaa acagaatgtg tccttaaacc 1380 ggttgaatct tcagatatga aaatgactca gctattcacc aaagttgaat cagaagatac 1440 aagtagcctc tttgacaaac ttaagaagga acctgatgct ttaactttgc tggccccagc 1500 cgctggagac acaatcatat ctttagattt tggcagcaac gacacagaaa ctgatgacca 1560 gcaacttgag gaagtaccat tatataatga tgtaatgctc ccctcaccca acgaaaaatt 1620 acagaatata aatttggcaa tgtctccatt acccaccgct gaaacgccaa agccacttcg 1680 aagtagtgct gaccctgcac tcaatcaaga agttgcatta aaattagaac caaatccaga 1740 gtcactggaa ctttctttta ccatgcccca gattcaggat cagacaccta gtccttccga 1800 tggaagcact agacaaagtt cacctgagcc taatagtccc agtgaatatt gtttttatgt 1860 ggatagtgat atggtcaatg aattcaagtt ggaattggta gaaaaacttt ttgctgaaga 1920 cacagaagca aagaacccat tttctactca ggacacagat ttagacttgg agatgttagc 1980 tccctatatc ccaatggatg atgacttcca gttacgttcc ttcgatcagt tgtcaccatt 2040 agaaagcagt tccgcaagcc ctgaaagcgc aagtcctcaa agcacagtta cagtattcca 2100 gcagactcaa atacaagaac ctactgctaa tgccaccact accactgcca ccactgatga 2160 attaaaaaca gtgacaaaag accgtatgga agacattaaa atattgattg catctccatc 2220 tcctacccac atacataaag aaactactag tgccacatca tcaccatata gagatactca 2280 aagtcggaca gcctcaccaa acagagcagg aaaaggagtc atagaacaga cagaaaaatc 2340 tcatccaaga agccctaacg tgttatctgt cgctttgagt caaagaacta cagttcctga 2400 ggaagaacta aatccaaaga tactagcttt gcagaatgct cagagaaagc gaaaaatgga 2460 acatgatggt tcactttttc aagcagtagg aattggaaca ttattacagc agccagacga 2520 tcatgcagct actacatcac tttcttggaa acgtgtaaaa ggatgcaaat ctagtgaaca 2580 gaatggaatg gagcaaaaga caattatttt aataccctct gatttagcat gtagactgct 2640 ggggcaatca atggatgaaa gtggattacc acagctgacc agttatgatt gtgaagttaa 2700 tgctcctata caaggcagca gaaacctact gcagggtgaa gaattactca gagctttgga 2760 tcaagttaac tgagcttttt cttaatttca ttcctttttt tggacactgg tggctcatta 2820 cctaaagcag tctatttata ttttctacat ctaattttag aagcctggct acaatactgc 2880 acaaacttgg ttagttcaat tttgatcccc tttctactta atttacatta atgctctttt 2940 ttagtatgtt ctttaatgct ggatcacaga cagctcattt tctcagtttt ttggtattta 3000 aaccattgca ttgcagtagc atcattttaa aaaatgcacc tttttattta tttatttttg 3060 gctagggagt ttatcccttt ttcgaattat ttttaagaag atgccaatat aatttttgta 3120 agaaggcagt aacctttcat catgatcata ggcagttgaa aaatttttac accttttttt 3180 tcacatttta cataaataat aatgctttgc cagcagtacg tggtagccac aattgcacaa 3240 tatattttct taaaaaatac cagcagttac tcatggaata tattctgcgt ttataaaact 3300 agtttttaag aagaaatttt ttttggccta tgaaattgtt aaacctggaa catgacattg 3360 ttaatcatat aataatgatt cttaaatgct gtatggttta ttatttaaat gggtaaagcc 3420 atttacataa tatagaaaga tatgcatata tctagaaggt atgtggcatt tatttggata 3480 aaattctcaa ttcagagaaa tcatctgatg tttctatagt cactttgcca gctcaaaaga 3540 aaacaatacc ctatgtagtt gtggaagttt atgctaatat tgtgtaactg atattaaacc 3600 taaatgttct gcctaccctg ttggtataaa gatattttga gcagactgta aacaagaaaa 3660 aaaaaatcat gcattcttag caaaattgcc tagtatgtta atttgctcaa aatacaatgt 3720 ttgattttat gcactttgtc gctattaaca tccttttttt catgtagatt tcaataattg 3780 agtaatttta gaagcattat tttaggaata tatagttgtc acagtaaata tcttgttttt 3840 tctatgtaca ttgtacaaat ttttcattcc ttttgctctt tgtggttgga tctaacacta 3900 actgtattgt tttgttacat caaataaaca tcttctgtgg accagg 3946 <210> 2 <211> 826 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys Lys Ile Ser Ser Glu 1 5 10 15 Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys 20 25 30 Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His 35 40 45 Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile 50 55 60 Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile 65 70 75 80 Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Asp Gly Phe Val Met Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile 100 105 110 Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr 115 120 125 Gly His Ser Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met 130 135 140 Arg Glu Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu 145 150 155 160 Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr 165 170 175 Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu 180 185 190 His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn Gln Pro 195 200 205 Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys 210 215 220 Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys 225 230 235 240 Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp 245 250 255 Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Leu Gly 260 265 270 Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr 275 280 285 Lys Thr His His Asp Met Phe Thr Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln 290 295 300 Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln 305 310 315 320 Ala Thr Val Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val 325 330 335 Cys Val Asn Tyr Val Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe 340 345 350 Ser Leu Gln Gln Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp 355 360 365 Met Lys Met Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser 370 375 380 Ser Leu Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu 385 390 395 400 Ala Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn 405 410 415 Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr Asn 420 425 430 Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile Asn Leu 435 440 445 Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Ser 450 455 460 Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu Lys Leu Glu Pro 465 470 475 480 Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met Pro Gln Ile Gln Asp 485 490 495 Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr Arg Gln Ser Ser Pro Glu 500 505 510 Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr Val Asp Ser Asp Met Val 515 520 525 Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr 530 535 540 Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu 545 550 555 560 Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser 565 570 575 Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser 580 585 590 Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln 595 600 605 Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu 610 615 620 Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala 625 630 635 640 Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser 645 650 655 Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala 660 665 670 Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro 675 680 685 Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu 690 695 700 Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg 705 710 715 720 Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr 725 730 735 Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp 740 745 750 Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln 755 760 765 Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly 770 775 780 Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys 785 790 795 800 Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu 805 810 815 Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn 820 825 <210> 3 <211> 4226 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 3 ccctttcccc tccctcgccc gccccgccgc ccgcaggcgc cccgagtcgc ggggctgccg 60 cttggacgtc gtcctgtctg ggtgtcgcgg gccggccccg cggggagcgc ccccggcgcg 120 atgcccttca ggaaagcctg tgggccaaag ctgaccaact cccccaccgt catcgtcatg 180 gtgggcctcc ccgcccgggg caagacctac atctccaaga agctgactcg ctacctcaac 240 tggattggcg tccccacaaa agtgttcaac gtcggggagt atcgccggga ggctgtgaag 300 cagtacagct cctacaactt cttccgcccc gacaatgagg aagccatgaa agtccggaag 360 caatgtgcct tagctgcctt gagagatgtc aaaagctacc tggcgaaaga agggggacaa 420 attgcggttt tcgatgccac caatactact agagagagga gacacatgat ccttcatttt 480 gccaaagaaa atgactttaa ggcgtttttc atcgagtcgg tgtgcgacga ccctacagtt 540 gtggcctcca atatcatgga agttaaaatc tccagcccgg attacaaaga ctgcaactcg 600 gcagaagcca tggacgactt catgaagagg atcagttgct atgaagccag ctaccagccc 660 ctcgaccccg acaaatgcga cagggacttg tcgctgatca aggtgattga cgtgggccgg 720 aggttcctgg tgaaccgggt gcaggaccac atccagagcc gcatcgtgta ctacctgatg 780 aacatccacg tgcagccgcg taccatctac ctgtgccggc acggcgagaa cgagcacaac 840 ctccagggcc gcatcggggg cgactcaggc ctgtccagcc ggggcaagaa gtttgccagt 900 gctctgagca agttcgtgga ggagcagaac ctgaaggacc tgcgcgtgtg gaccagccag 960 ctgaagagca ccatccagac ggccgaggcg ctgcggctgc cctacgagca gtggaaggcg 1020 ctcaatgaga tcgacgcggg cgtctgtgag gagctgacct acgaggagat cagggacacc 1080 taccctgagg agtatgcgct gcgggagcag gacaagtact attaccgcta ccccaccggg 1140 gagtcctacc aggacctggt ccagcgcttg gagccagtga tcatggagct ggagcggcag 1200 gagaatgtgc tggtcatctg ccaccaggcc gtcctgcgct gcctgcttgc ctacttcctg 1260 gataagagtg cagaggagat gccctacctg aaatgccctc ttcacaccgt cctgaaactg 1320 acgcctgtcg cttatggctg ccgtgtggaa tccatctacc tgaacgtgga gtccgtctgc 1380 acacaccggg agaggtcaga ggatgcaaag aagggaccta acccgctcat gagacgcaat 1440 agtgtcaccc cgctagccag ccccgaaccc accaaaaagc ctcgcatcaa cagctttgag 1500 gagcatgtgg cctccacctc ggccgccctg cccagctgcc tgcccccgga ggtgcccacg 1560 cagctgcctg gacaaaacat gaaaggctcc cggagcagcg ctgactcctc caggaaacac 1620 tgaggcagac gtgtcggttc cattccattt ccatttctgc agcttagctt gtgtcctgcc 1680 ctccgcccga ggcaaaacgt atcctgagga cttcttccgg agagggtggg gtggagcagc 1740 gggggagcct tggccgaaga gaaccatgct tggcaccgtc tgtgtcccct cggccgctgg 1800 acaccagaaa gccacgtggg tccctggcgc cctgccttta gccgtggggc ccccacctcc 1860 actctctggg tttcctagga atgtccagcc tcggagacct tcacaaagcc ttgggagggt 1920 gatgagtgct ggtcctgaca ggaggccgct ggggacactg tgctgttttg tttcgtttct 1980 gtgatctccc ggcacgtttg gagctgggaa gaccacactg gtggcagaat cctaaaatta 2040 aaggaggcag gctcctagtt gctgaaagtt aaggaatgtg taaaacctcc acgtgactgt 2100 ttggtgcatc ttgacctggg aagacgcctc atgggaacga acttggacag gtgttgggtt 2160 gaggcctctt ctgcaggaag tccctgagct gagacgcaag ttggctgggt ggtccgcacc 2220 ctggctctcc tgcaggtcca cacaccttcc aggcctgtgg cctgcctcca aagatgtgca 2280 agggcaggct ggctgcacgg ggagagggaa gtattttgcc gaaatatgag aactggggcc 2340 tcctgctccc agggagctcc agggcccctc tctcctccca cctggacttg gggggaactg 2400 agaaacactt tcctggagct gctggctttt gcactttttt gatggcagaa gtgtgacctg 2460 agagtcccac cttctcttca ggaacgtaga tgttggggtg tcttgccctg gggggcttgg 2520 aacctctgaa ggtggggagc ggaacacctg gcatccttcc ccagcacttg cattaccgtc 2580 cctgctcttc ccaggtgggg acagtggccc aagcaaggcc tcactcgcag ccacttcttc 2640 aagagctgcc tgcacactgt cttggagcat ctgccttgtg cctggcactc tgccggtgcc 2700 ttgggaaggt cggaagagtg gactttgtcc tggccttccc ttcatggcgt ctatgacact 2760 tttgtggtga tggaaagcat gggacctgtc gtctcagcct gttggtttct cctcattgcc 2820 tcaaaccctg gggtaggtgg gacggggggt ctcgtgccca gatgaaacca tttggaaact 2880 cggcagcaga gtttgtccaa atgacccttt tcaggatgtc tcaaagcttg tgccaaaggt 2940 cacttttctt tcctgccttc tgctgtgagc cctgagatcc tcctcccagc tcaagggaca 3000 ggtcctgggt gagggtggga gatttagaca cctgaaactg ggcgtggaga gaagagccgt 3060 tgctgtttgt tttttgggaa gagcttttaa agaatgcatg tttttttcct ggttggaatt 3120 gagtaggaac tgaggctgtg cttcaggtat ggtacaatca agtgggggat tttcatgctg 3180 aaccattcaa gccctccccg cccgttgcac ccactttggc tggcgtctgc tggagaggat 3240 gtctctgtcc gcattcccgt gcagctccag gctcgcgcag ttttctctct ctccctggat 3300 gttgagtctc atcagaatat gtgggtaggg ggtggacgtg cacgggtgca tgattgtgct 3360 taacttggtt gtatttttcg atttgacatg gaaggcctgt tgctttgctc ttgagaatag 3420 tttctcgtgt ccccctcgca ggcctcattc tttgaacatc gactctgaag tttgatacag 3480 ataggggctt gatagctgtg gtcccctctc ccctctgact acctaaaatc aatacctaaa 3540 tacagaagcc ttggtctaac acgggacttt tagtttgcga agggcctaga tagggagaga 3600 ggtaacatga atctggacag ggagggagat actatagaaa ggagaacact gcctactttg 3660 caagccagtg acctgccttt tgaggggaca ttggacgggg gccgggggcg ggggttgggt 3720 ttgagctaca gtcatgaact tttggcgtct actgattcct ccaactctcc accccacaaa 3780 ataacgggga ccaatatttt taactttgcc tatttgtttt tgggtgagtt tcccccctcc 3840 ttattctgtc ctgagaccac gggcaaagct cttcattttg agagagaaga aaaactgttt 3900 ggaaccacac caatgatatt tttctttgta atacttgaaa tttatttttt tattattttg 3960 atagcagatg tgctatttat ttatttaata tgtataagga gcctaaacaa tagaaagctg 4020 tagagattgg gtttcattgt taattggttt gggagcctcc tatgtgtgac ttatgacttc 4080 tctgtgttct gtgtatttgt ctgaattaat gacctgggat ataaagctat gctagctttc 4140 aaacaggaga tgcctttcag aaatttgtat attttgcagt tgccagacca ataaaatacc 4200 tggttgaaat acatggacga agtaaa 4226 <210> 4 <211> 500 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Met Pro Phe Arg Lys Ala Cys Gly Pro Lys Leu Thr Asn Ser Pro Thr 1 5 10 15 Val Ile Val Met Val Gly Leu Pro Ala Arg Gly Lys Thr Tyr Ile Ser 20 25 30 Lys Lys Leu Thr Arg Tyr Leu Asn Trp Ile Gly Val Pro Thr Lys Val 35 40 45 Phe Asn Val Gly Glu Tyr Arg Arg Glu Ala Val Lys Gln Tyr Ser Ser 50 55 60 Tyr Asn Phe Phe Arg Pro Asp Asn Glu Glu Ala Met Lys Val Arg Lys 65 70 75 80 Gln Cys Ala Leu Ala Ala Leu Arg Asp Val Lys Ser Tyr Leu Ala Lys 85 90 95 Glu Gly Gly Gln Ile Ala Val Phe Asp Ala Thr Asn Thr Thr Arg Glu 100 105 110 Arg Arg His Met Ile Leu His Phe Ala Lys Glu Asn Asp Phe Lys Ala 115 120 125 Phe Phe Ile Glu Ser Val Cys Asp Asp Pro Thr Val Val Ala Ser Asn 130 135 140 Ile Met Glu Val Lys Ile Ser Ser Pro Asp Tyr Lys Asp Cys Asn Ser 145 150 155 160 Ala Glu Ala Met Asp Asp Phe Met Lys Arg Ile Ser Cys Tyr Glu Ala 165 170 175 Ser Tyr Gln Pro Leu Asp Pro Asp Lys Cys Asp Arg Asp Leu Ser Leu 180 185 190 Ile Lys Val Ile Asp Val Gly Arg Arg Phe Leu Val Asn Arg Val Gln 195 200 205 Asp His Ile Gln Ser Arg Ile Val Tyr Tyr Leu Met Asn Ile His Val 210 215 220 Gln Pro Arg Thr Ile Tyr Leu Cys Arg His Gly Glu Asn Glu His Asn 225 230 235 240 Leu Gln Gly Arg Ile Gly Gly Asp Ser Gly Leu Ser Ser Arg Gly Lys 245 250 255 Lys Phe Ala Ser Ala Leu Ser Lys Phe Val Glu Glu Gln Asn Leu Lys 260 265 270 Asp Leu Arg Val Trp Thr Ser Gln Leu Lys Ser Thr Ile Gln Thr Ala 275 280 285 Glu Ala Leu Arg Leu Pro Tyr Glu Gln Trp Lys Ala Leu Asn Glu Ile 290 295 300 Asp Ala Gly Val Cys Glu Glu Leu Thr Tyr Glu Glu Ile Arg Asp Thr 305 310 315 320 Tyr Pro Glu Glu Tyr Ala Leu Arg Glu Gln Asp Lys Tyr Tyr Tyr Arg 325 330 335 Tyr Pro Thr Gly Glu Ser Tyr Gln Asp Leu Val Gln Arg Leu Glu Pro 340 345 350 Val Ile Met Glu Leu Glu Arg Gln Glu Asn Val Leu Val Ile Cys His 355 360 365 Gln Ala Val Leu Arg Cys Leu Leu Ala Tyr Phe Leu Asp Lys Ser Ala 370 375 380 Glu Glu Met Pro Tyr Leu Lys Cys Pro Leu His Thr Val Leu Lys Leu 385 390 395 400 Thr Pro Val Ala Tyr Gly Cys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Leu Asn Val 405 410 415 Glu Ser Val Cys Thr His Arg Glu Arg Ser Glu Asp Ala Lys Lys Gly 420 425 430 Pro Asn Pro Leu Met Arg Arg Asn Ser Val Thr Pro Leu Ala Ser Pro 435 440 445 Glu Pro Thr Lys Lys Pro Arg Ile Asn Ser Phe Glu Glu His Val Ala 450 455 460 Ser Thr Ser Ala Ala Leu Pro Ser Cys Leu Pro Pro Glu Val Pro Thr 465 470 475 480 Gln Leu Pro Gly Gln Asn Met Lys Gly Ser Arg Ser Ser Ala Asp Ser 485 490 495 Ser Arg Lys His 500

Claims (139)

  1. 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서,
    유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 HIF1α 분해를 촉진하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 HIF1α/HIF1β 이량체 형성을 억제하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 HIF1α 전사 활성을 감소시키는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 KC7F2, IDF-11774, 아미노플라본, AJM290, AW464, 타네스피마이신, 알베스피마이신, PX-478, 또는 FM19G11인, 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 핵산 억제제인, 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 EZN-2698인, 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA인, 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 레스베라트롤, 라파마이신, 에베롤리무스, CCI779, 실리비닌, 디곡신, YC-1, 페네틸 이소티오시아나이트, 케토민, 플라보피리돌, 보르테조밉, 암포테리신 B, 베이 87-2243, PX-478, 또는 가네타시피브인, 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 항-HIF1α 항체 또는 항체-유사 분자인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 나노바디인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 관절내, 활막내, 경막내, 경구, 국소, 흡입을 통해, 또는 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    PFKFB3 억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 3-(3-피리디닐)-1-(4-피리디닐)-2-프로펜-1-온(3-PO) 또는 이의 유사체인, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 3-PO의 유사체이고, 여기서 상기 유사체는 1-(4-피리디닐)-3-(2-퀴놀리닐)-2-프로펜-1-온(PFK 15)인, 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 BrAcNHEtOP, YN1, YZ9, PQP, PFK-158, 화합물 26, KAN0436151, 또는 KAN0436067인, 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 핵산 억제제인, 방법.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  20. 제14항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA인, 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체의 β 세포에 결합하도록 구성된 표적화 분자에 작동적으로 연결되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체인, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체-유사 분자인, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 GLP-1 수용체에 결합하도록 구성되는, 방법.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제 및 상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체에게 순차적으로 투여되는, 방법.
  26. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제 및 상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체에게 실질적으로 동시에 투여되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 상기 대상체의 β 세포에 결합하도록 구성된 표적화 분자에 작동적으로 연결되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체인, 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체-유사 분자인, 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 GLP-1 수용체에 결합하도록 구성되는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유효량의 HIF1α 억제제를 투여하는 단계는 상기 대상체에서 인슐린 감수성을 증가시키는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 암을 가지지 않거나 암을 갖는 것으로 진단되지 않은, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 제2형 당뇨병을 갖는 것으로 진단된, 방법.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투여하는 단계 이전에, 상기 제2형 당뇨병을 갖는 대상체를 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서,
    상기 대상체는 제2형 당뇨병에 대해 이전에 치료되었던, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 대상체는 상기 이전 치료에 대해 내성을 갖는 것으로 결정되었던, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 당뇨병성 신병증 또는 당뇨병성 망막증을 갖지 않거나 이로 진단되지 않은, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준은 제2형 당뇨병을 앓고 있지 않은 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준에 비해 증가되는, 방법.
  40. 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서,
    제2형 당뇨병을 앓고 있지 않은 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준에 비해, 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 증가된 발현 수준을 갖는 것으로 결정된 대상체에게 유효량의 HIF1α 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 HIF1α 분해를 촉진하는, 방법.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 HIF1α/HIF1β 이량체 형성을 억제하는, 방법.
  43. 제40항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 HIF1α 전사 활성을 감소시키는, 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 KC7F2, IDF-11774, 아미노플라본, AJM290, AW464, 타네스피마이신, 알베스피마이신, 히스톤 데아세틸라제 억제제, PX-478, FM19G11인, 방법.
  45. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 핵산 억제제인, 방법.
  46. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 HIF1a 억제제는 EZN-2698인, 방법.
  48. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA인, 방법.
  49. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 레스베라트롤, 라파마이신, 에베롤리무스, CCI779, 실리비닌, 디곡신, YC-1, 페네틸 이소티오시아나이트, 케토민, 플라보피리돌, 보르테조밉, 암포테리신 B, 베이 87-2243, PX-478, 또는 가네타시피브인, 방법.
  50. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 항-HIF1α 항체 또는 항체-유사 분자인, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 나노바디인, 방법.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 억제제는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 관절내, 활막내, 경막내, 경구, 국소, 흡입을 통해, 또는 2개 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여되는, 방법.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    PFKFB3 억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 3-(3-피리디닐)-1-(4-피리디닐)-2-프로펜-1-온(3-PO) 또는 이의 유사체인, 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 3-PO의 유사체이고, 여기서 상기 유사체는 1-(4-피리디닐)-3-(2-퀴놀리닐)-2-프로펜-1-온(PFK 15)인, 방법.
  56. 제53항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 핵산 억제제인, 방법.
  57. 제53항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  58. 제53항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA인, 방법.
  59. 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체의 β-세포에 결합하도록 구성된 표적화 분자에 작동적으로 연결되는, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체인, 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체-유사 분자인, 방법.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 GLP-1 수용체에 결합하도록 구성되는, 방법.
  63. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제 및 상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체에게 순차적으로 투여되는, 방법.
  64. 제53항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제 및 상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체에게 실질적으로 동시에 투여되는, 방법.
  65. 제40항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 상기 대상체의 β 세포에 결합하도록 구성된 표적화 분자에 작동적으로 연결되는, 방법.
  66. 제65항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체인, 방법.
  67. 제65항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체-유사 분자인, 방법.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 GLP-1 수용체에 결합하도록 구성되는, 방법.
  69. 제40항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유효량의 HIF1α 억제제를 투여하는 단계는 상기 대상체에서 인슐린 감수성을 증가시키는, 방법.
  70. 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서:
    (a) 제2형 당뇨병을 앓고 있지 않은 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준에 비해 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 증가된 발현 수준을 갖는 것으로 상기 대상체를 결정하는 단계; 및
    (b) 유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 대상체에서 인슐린 감수성을 증가시키는 방법으로서,
    유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  72. 제71항에 있어서,
    상기 대상체는 당뇨병 전증을 앓고 있는, 방법.
  73. 제71항에 있어서,
    상기 대상체는 인슐린 내성을 앓고 있는, 방법.
  74. PFKFB3을 발현하는 손상된 β-세포에서 세포 사멸을 자극하는 방법으로서,
    상기 손상된 β-세포에 HIF1α 억제제를 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 시험관내에서 상기 손상된 β-세포에 제공되는, 방법.
  76. 제74항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 생체내에서 상기 손상된 β-세포에 제공되는, 방법.
  77. PFKFB3을 발현하지 않는 β-세포에서 재생을 자극하는 방법으로서,
    HIF1α 억제제를 상기 β-세포에 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 시험관내에서 상기 β-세포에 제공되는, 방법.
  79. 제77항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 생체내에서 상기 β-세포에 제공되는, 방법.
  80. 제2형 당뇨병을 갖는 대상체에서 β-세포의 재생을 자극하는 방법으로서,
    상기 β-세포는 PFKFB3을 발현하지 않고, 상기 방법은 유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  81. 당뇨병을 갖는 대상체에서 PFKFB3을 발현하는 손상된 β-세포를 사멸시키는 방법으로서,
    유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  82. 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서,
    유효량의 HIF1α 억제제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 제82항에 있어서,
    상기 당뇨병은 제1형 당뇨병인, 방법.
  84. 제82항에 있어서,
    상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인, 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 제2형 당뇨병을 앓고 있지 않은 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준에 비해 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 증가된 발현 수준을 갖는 것으로 결정되었던, 방법.
  86. 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 진단하는 방법으로서:
    (a) 상기 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 발현 수준을 제2형 당뇨병을 앓고 있지 않은 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준을 상기 건강한 대상체로부터의 β-세포에서 PFKFB3의 발현 수준에 비해 증가된 것으로 결정함으로써, 제2형 당뇨병에 대하여 상기 대상체를 진단하는 단계를 포함하는, 방법.
  87. (a) HIF1α 억제제 및 (b) PFKFB3 억제제를 포함하는, 약학적 조성물.
  88. 제87항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 HIF1α 분해를 촉진하는, 약학적 조성물.
  89. 제87항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 HIF1α/HIF1β 이량체 형성을 억제하는, 약학적 조성물.
  90. 제87항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 HIF1α 전사 활성을 감소시키는, 약학적 조성물.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 KC7F2, IDF-11774, 아미노플라본, AJM290, AW464, 타네스피마이신, 알베스피마이신, PX-478, 또는 FM19G11인, 약학적 조성물.
  92. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 핵산 억제제인, 약학적 조성물.
  93. 제92항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 약학적 조성물.
  94. 제93항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 EZN-2698인, 약학적 조성물.
  95. 제92항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA인, 약학적 조성물.
  96. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 레스베라트롤, 라파마이신, 에베롤리무스, CCI779, 실리비닌, 디곡신, YC-1, 페네틸 이소티오시아나이트, 케토민, 플라보피리돌, 보르테조밉, 암포테리신 B, 베이 87-2243, PX-478, 또는 가네타시피브인, 약학적 조성물.
  97. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 항-HIF1α 항체 또는 항체-유사 분자인, 약학적 조성물.
  98. 제97항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 나노바디인, 약학적 조성물.
  99. 제87항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 3-(3-피리디닐)-1-(4-피리디닐)-2-프로펜-1-온(3-PO) 또는 이의 유사체인, 약학적 조성물.
  100. 제87항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 3-PO의 유사체이고, 여기서 상기 유사체는 1-(4-피리디닐)-3-(2-퀴놀리닐)-2-프로펜-1-온(PFK 15)인, 약학적 조성물.
  101. 제87항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 BrAcNHEtOP, YN1, YZ9, PQP, PFK-158, 화합물 26, KAN0436151, 또는 KAN0436067인, 약학적 조성물.
  102. 제87항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 핵산 억제제인, 약학적 조성물.
  103. 제102항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 약학적 조성물.
  104. 제102항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA인, 약학적 조성물.
  105. 제87항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 상기 대상체의 β-세포에 결합하도록 구성된 표적화 분자에 작동적으로 연결되는, 약학적 조성물.
  106. 제105항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체인, 약학적 조성물.
  107. 제105항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 항체-유사 분자인, 약학적 조성물.
  108. 제105항에 있어서,
    상기 표적화 분자는 GLP-1 수용체에 결합하도록 구성되는, 약학적 조성물.
  109. 제2형 당뇨병에 대한 대상체를 치료하는 방법으로서,
    제87항 내지 제108항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 약학적 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  110. 세포군으로부터 이중호르몬 세포들을 제거하는 방법으로서,
    유효량의 PFKFB3 억제제를 상기 세포군에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  111. 제110항에 있어서,
    상기 세포군은 췌도 세포군인, 방법.
  112. 제110항에 있어서,
    상기 세포군은 분화된 줄기 세포군인, 방법.
  113. 제112항에 있어서,
    상기 분화된 줄기 세포는 분화된 유도만능 줄기세포(iPSCs)인, 방법.
  114. 제112항에 있어서,
    상기 분화된 줄기 세포는 분화된 배아줄기세포(ESCs)인, 방법.
  115. 제110항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 시험관내에서 상기 세포군에 투여되는, 방법.
  116. 제110항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 생체내에서 상기 세포군에 투여되는, 방법.
  117. 제110항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 3-(3-피리디닐)-1-(4-피리디닐)-2-프로펜-1-온(3-PO) 또는 이의 유사체인, 방법.
  118. 제110항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 3-PO의 유사체이고, 여기서 상기 유사체는 1-(4-피리디닐)-3-(2-퀴놀리닐)-2-프로펜-1-온(PFK 15)인, 방법.
  119. 제110항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 BrAcNHEtOP, YN1, YZ9, PQP, PFK-158, 화합물 26, KAN0436151, 또는 KAN0436067인, 방법.
  120. 제110항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 핵산 억제제인, 방법.
  121. 제120항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  122. 제120항에 있어서,
    상기 PFKFB3 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA인, 방법.
  123. 제110항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서,
    유효량의 HIF1α 억제제를 상기 세포군에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  124. 세포군으로부터 이중호르몬 세포들을 제거하는 방법으로서,
    유효량의 HIF1α 억제제를 상기 세포군에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  125. 제124항에 있어서,
    상기 세포군은 췌도 세포군인, 방법.
  126. 제124항에 있어서,
    상기 세포군은 분화된 줄기 세포군인, 방법.
  127. 제126항에 있어서,
    상기 분화된 줄기 세포는 분화된 iPSCs인, 방법.
  128. 제112항에 있어서,
    상기 분화된 줄기 세포는 분화된 ESCs인, 방법.
  129. 제124항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 시험관내에서 상기 세포군에 투여되는, 방법.
  130. 제124항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 생체내에서 상기 세포군에 투여되는, 방법.
  131. 제124항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 KC7F2, IDF-11774, 아미노플라본, AJM290, AW464, 타네스피마이신, 알베스피마이신, PX-478, 또는 FM19G11인, 방법.
  132. 제124항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 핵산 억제제인, 방법.
  133. 제132항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  134. 제133항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 EZN-2698인, 방법.
  135. 제132항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 siRNA 또는 짧은 헤어핀 RNA인, 방법.
  136. 제124항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 레스베라트롤, 라파마이신, 에베롤리무스, CCI779, 실리비닌, 디곡신, YC-1, 페네틸 이소티오시아나이트, 케토민, 플라보피리돌, 보르테조밉, 암포테리신 B, 베이 87-2243, PX-478, 또는 가네타시피브인, 방법.
  137. 제124항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 항-HIF1α 항체 또는 항체-유사 분자인, 방법.
  138. 제137항에 있어서,
    상기 HIF1α 억제제는 나노바디인, 방법.
  139. 제124항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서,
    유효량의 PFKFB3 억제제를 상기 세포군에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
KR1020237009236A 2020-08-18 2021-08-17 당뇨병 치료 및 베타 세포 재생을 위한 방법 및 조성물 KR20230054413A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063067187P 2020-08-18 2020-08-18
US63/067,187 2020-08-18
US202163169776P 2021-04-01 2021-04-01
US63/169,776 2021-04-01
PCT/US2021/046267 WO2022040161A1 (en) 2020-08-18 2021-08-17 Methods and compositions for diabetes treatment and beta-cell regeneration

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230054413A true KR20230054413A (ko) 2023-04-24

Family

ID=80323200

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237009236A KR20230054413A (ko) 2020-08-18 2021-08-17 당뇨병 치료 및 베타 세포 재생을 위한 방법 및 조성물

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230312728A1 (ko)
EP (1) EP4200016A4 (ko)
JP (1) JP2023538612A (ko)
KR (1) KR20230054413A (ko)
AU (1) AU2021328265A1 (ko)
CA (1) CA3192353A1 (ko)
WO (1) WO2022040161A1 (ko)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012082765A2 (en) * 2010-12-16 2012-06-21 The United State Of America. As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Methods for decreasing body weight and treating diabetes
EA201590459A1 (ru) * 2012-09-12 2015-11-30 Нейриммьюн Холдинг Аг Специфические антитела к островковому амилоидному полипептиду человека (hiapp) и их применение
WO2015171723A1 (en) * 2014-05-06 2015-11-12 Research Development Foundation Methods for treating insulin resistance and for sensitizing patients to glp1 agonist therapy
WO2017208174A2 (en) * 2016-05-31 2017-12-07 The Regents Of The University Of California Methods of treating disease with pfkfb3 inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
CA3192353A1 (en) 2022-02-24
AU2021328265A1 (en) 2023-04-20
EP4200016A1 (en) 2023-06-28
US20230312728A1 (en) 2023-10-05
JP2023538612A (ja) 2023-09-08
EP4200016A4 (en) 2024-08-28
WO2022040161A1 (en) 2022-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Leonhard et al. Inhibition of activin signaling slows progression of polycystic kidney disease
Bastos et al. Molecular and cellular pathogenesis of autosomal dominant polycystic kidney disease
Chen et al. Muscle‐restricted nuclear receptor interaction protein knockout causes motor neuron degeneration through down‐regulation of myogenin at the neuromuscular junction
Bresciani et al. The Slc25a47 locus is a novel determinant of hepatic mitochondrial function implicated in liver fibrosis
WO2019217907A1 (en) Methods and compositions for the treatment of hepatic and metabolic diseases
Noguchi et al. Muscle weakness and fibrosis due to cell autonomous and non-cell autonomous events in collagen VI deficient congenital muscular dystrophy
US9187784B2 (en) EphA4 is a disease modifier in motor neuron disease
Cao et al. Integrin β8 prevents pericyte-myofibroblast transition and renal fibrosis through inhibiting the TGF-β1/TGFBR1/Smad3 pathway in diabetic kidney disease
KR20230054413A (ko) 당뇨병 치료 및 베타 세포 재생을 위한 방법 및 조성물
JP2012171895A (ja) 毛細血管拡張性失調症治療薬及びその用途
US20240335505A1 (en) Products and methods for promoting myogenesis
CN116615241A (zh) 用于糖尿病治疗和β细胞再生的方法和组合物
Zhou et al. Deletion of serine racemase reverses neuronal insulin signaling inhibition by amyloid‐β oligomers
WO2021067590A1 (en) Method for treatment of alzheimer&#39;s disease
US20140147434A1 (en) NCoR1 is a Physiological Modulator of Muscle Mass and Oxidative Function
US20140294854A1 (en) Target directed to adipocytes, methods and assays for treatment of obesity
US12202867B2 (en) Adeno-associated viral chimeric TDP-43 proteins
US20180289702A1 (en) Lpa level reduction for treating central nervous system disorders
US20220275034A1 (en) Adenoviral chimeric tdp-43 proteins
Li et al. Chronic pharmacologic manipulation of dopamine transmission ameliorates metabolic disturbance in syndrome caused by mutated trappc9
Wahhab Investigating the Role of Dysregulated Protein Translation in the Pathogenesis of X-linked Myotubular Myopathy
Li et al. NLRP3 inflammasome-modulated angiogenic function of EPC via PI3K/Akt/mTOR pathway in diabetic myocardial infarction
Cunningham Exploring Retromer Deficiency as a Mechanism of LRRK2-Induced Parkinson’s Disease
Huo et al. Delta Opioid Peptide [d-Ala2, d-Leu5]-Enkephalin Improves Physical and Cognitive Function and Increases Lifespan in Aged Female Mice
Chen et al. The Role and Mechanism of DcR2-Positive Failed Repair Cells in AKI: PO0412

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination