CN107988223B

CN107988223B - 一种激活PTPRO基因表达的saRNA及其在肿瘤干细胞治疗中的应用

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Publication number: CN107988223B
Application number: CN201711280909.7A
Authority: CN
Inventors: 张灏
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Current assignee: Individual
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: CN107988223A

Abstract

本发明公开了一种激活PTPRO基因表达的saRNA，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区‑3000至‑200位点区域互补的核苷酸序列。本发明还公开了saRNA和c‑Met抑制剂的联合使用在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。本发明的靶向PTPRO基因的saRNA和c‑met抑制剂联合使用可显著抑制肿瘤细胞干性，抑制肿瘤细胞生长，而且可显著提高受体酪氨酸激酶c‑met抑制剂疗效，说明saPTPRO和c‑met抑制剂二者联合使用具有协同增加抑制肿瘤细胞生长的作用。

Description

一种激活PTPRO基因表达的saRNA及其在肿瘤干细胞治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是靶向PTPRO基因的saRNA在肿瘤干细胞治疗中的应用。

背景技术

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)是肿瘤细胞中存在的小部分具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能的细胞亚群，是肿瘤形成、复发、恶性转移和耐受放化疗性的细胞学根源。肿瘤干细胞的相关研究为肿瘤的治疗提供了新的思路，肿瘤干细胞靶向治疗可能成为肿瘤根治的希望。目前，针对CSCs的特点，有以下几种靶向肿瘤干细胞的治疗方法：①针对肿瘤干细胞表面标志物的靶向治疗；②针对肿瘤干细胞信号传导通路的靶向治疗；③通过对肿瘤干细胞的诱导分化实现靶向治疗；④针对肿瘤干细胞微环境的靶向治疗；⑤靶向肿瘤干细胞的免疫疗法；⑥针对肿瘤干细胞耐药机制的靶向治疗；⑦针对肿瘤干细胞端粒末端转移酶的靶向治疗；⑧针对CSCs的特定基因的靶向治疗；⑨通过微小 RNA实现靶向治疗。由于传统的肿瘤治疗方法不能有效杀灭CSCs,因此,开发针对CSCs的靶向治疗将有助于提高恶性肿瘤疗效,对肿瘤复发、转移、耐药等具有重要意义。

原癌基因肝细胞生长因子受体c-Met的编码产物是肝细胞生长因子 (hepatocytegrowth factor，HGF)的细胞膜受体，属酪氨酸激酶受体，当HGF与 c-Met结合后，会导致一系列信号途径的激活，从而引起肿瘤干性、血管生成、增殖、细胞运动性增强和侵袭，最终发生转移，因而与人类多种肿瘤的发生、发展有关。大量研究显示很多人类恶性肿瘤都与HGF/c-Met信号通路密切相关，主要是通过以下几种机制：特定的基因缺陷，包括基因易位、基因拷贝数增加、激活突变；非基因拷贝数增加的c-MET转录水平的上调；配体依赖的旁分泌或自分泌机制；与其他信号通路相互作用或者促进血管生成等。其中，HGF/c-Met通路对肿瘤干性有重要作用。最近的一项研究表明，c-Met通路对维持结肠癌组织中的结肠癌干细胞发挥重要的作用，结肠癌组织中的HGF主要来源于组织中的成纤维细胞，这些细胞分泌的HGF作用于肿瘤细胞，引起肿瘤细胞Wnt 通路的活化，从而保持了肿瘤细胞的干细胞特性。有研究也发现在乳腺癌骨转移灶中，骨组织来源或肿瘤细胞自分泌的HGF能够启动c-Met-Src-Wnt信号轴的激活。在非小细胞肺癌中，肿瘤组织中的c-Met和纤维组织中的HGF影响着肿瘤的生长以及患者的预后。在多发性骨髓瘤中，c-Met和Wnt通路都存在异常激活现象，而阻断任一通路都能够有效抑制肿瘤的生长。而且在近两三年内，陆续多项研究表明，HGF/c-Met通路不仅起到调控CSCs的作用，而且 c-Met受体本身也可以作为多种类型肿瘤如脑胶质细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌和头颈部肿瘤的CSCs表面标志。近十年来，CSCs的理论在肿瘤研究领域前景广阔，目前认为肿瘤中的CSCs是介导肿瘤发生耐药、转移和治疗后复发的关键因素，加之越来越多的证据表明c-Met信号通路在CSCs调控中发挥着重要的作用，那么针对c-Met通路的靶向治疗则为以根除CSCs为目标的肿瘤治疗提供了新的方向。

目前针对c-Met的抑制剂有很多，包括:(1)小分子c-Met抑制剂；(2)抗 HGF和c-Met抗体；(3)c-Met生物性抑制剂(如核酶、多肽)；(4)c-MET配体 HGF拮抗剂。然而在治疗人类肿瘤中，上述途径仍需要得到进一步证实，其中最可能成功的方法是小分子抑制剂和单克隆抗体。针对以c-Met为靶点的小分子抑制剂的研发已有十几年的历史。根据其c-Met激酶区的结合形式的不同分为ATP竞争性抑制剂和非ATP竞争性抑制剂，作用机制均是通过阻断酪氨酸磷酸化从而抑制c-Met激酶活性。

受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)是PTPs家族的成员之一，在一项筛选肾小球足细胞特异性蛋白的研究中首次被发现并克隆出来，因此也称作 GLEPP1。PTPRO在人类、大鼠、小鼠等各物种间具有高度保守性。在人类基因组中，PTPRO基因位于染色体12p13.3-p13.2，包含6个已知的mRNA变构体，其中2个主要的表达产物分别由全长PTPRO(PTPRO-FL)cDNA和截短型 PTPRO(PTPROt)cDNA编码。在肿瘤研究中，PTPRO基因的表达水平与肿瘤的发生发展密切相关，现已发现，PTPRO在多种癌中有重要的抑癌作用，如：乳腺癌，前列腺癌，食管癌，结肠癌，肝癌，肺癌等。该基因通过去磷酸化作用来调控促癌基因的活性，使这些促癌基因活性下调，从而影响其下游信号通路，对肿瘤的发生发展起到抑制作用。在体内如何安全高效激活该基因的表达对肿瘤的治疗具有重大意义。

近年的研究发现非编码RNA(ncRNA)分子能在多个水平参与基因表达的调控机制，其中小分子双链RNA(dsRNA)对相关蛋白表达的特异性抑制作用已经进行了广泛而深入的研究。最新研究发现dsRNA能特异地将某些沉默或低表达的基因激活的现象，并称之为“RNA激活(RNA activation，RNAa)”，将具有激活功能的小dsRNA称之为小激活RNA(saRNA)。基于肿瘤干细胞靶向治疗恶性肿瘤的方法尚存在一些问题。本发明通过saRNA技术，通过提高抑癌基因PTPRO的表达水平，抑制c-Met活性，为肿瘤干细胞治疗提供新的治疗策略。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可有效靶向肿瘤干细胞，并且能根除肿瘤干细胞的saRNA，其可以避免损伤正常干细胞。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种激活PTPRO基因表达的saRNA，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-3000至-200位点区域互补的核苷酸序列。

优选地，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-220位点至-238位点区域的核苷酸序列。

优选地，所述saRNA包括与PTPRO基因启动子区-658位点至-676位点区域的核苷酸序列。

优选地，所述saRNA由序列如SEQ ID NO:2所示的正义链和序列如SEQ ID NO:3所示的反义链组成，或者由序列如SEQ ID NO:8所示的正义链和序列如SEQ ID NO:9所示的反义链组成。

作为本发明的另一方面，本发明还提供上述saRNA在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

在另一方面，本发明还提供所述的saRNA和c-Met抑制剂的联合使用在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

优选地，所述c-Met抑制剂选自小分子c-Met抑制剂、抗HGF抗体、抗c-Met 抗体、c-Met生物性抑制剂和HGF拮抗剂。应当说明的是，c-Met抑制剂包括但不限于小分子c-Met抑制剂、抗HGF抗体、抗c-Met抗体、c-Met生物性抑制剂和HGF拮抗剂；此处c-Met生物性抑制剂包括但不限于核酶和多肽。

优选地，所述c-Met抑制剂为PHA-665252。应当说明的是，PHA-665752 是一种有效的、选择性的ATP竞争性c-Met抑制剂，在无细胞试验中IC50为9 nM，对c-Met的选择性比对RTKs和STKs高50倍以上，可从sigam公司购买获得。

优选地，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、脑胶质细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明的靶向PTPRO基因的saRNA和c-met抑制剂联合使用可显著抑制肿瘤细胞干性，抑制肿瘤细胞生长，而且可显著提高受体酪氨酸激酶c-met抑制剂疗效,saRNA和c-met抑制剂二者联合使用具有协同增效抑制肿瘤生长的作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中5对saRNA激活PTPRO基因表达的效果对比图；

图2为PTPRO基因敲除后对TE1食管癌细胞系侵袭迁移能力影响的实验结果示意图；

图3为PTPRO基因过表达后对TE1食管癌细胞系侵袭迁移能力影响的实验结果示意图；

图4为干细胞成球实验，证明PTPRO可通过c-MET抑制肿瘤细胞的干性；

图5为干细胞成球实验中，干细胞成球数的定量图；

图6为Western Blotting实验，细胞实验证明saPTPRO可显著提高PTPRO 蛋白水平的表达；PTPRO表达水平的提高可显著降低c-MET蛋白的磷酸化水平，且不影响c-MET总蛋白的表达；

图7为saPTPRO-220与c-Met小分子抑制剂PHA-665252联合使用后，小鼠肿瘤体积生长示意图；

图8为PTPRO干扰质粒的结构图；

图9为PTPRO过表达质粒的结构图；

图10为c-MET过表达质粒的结构图。

具体实施方式

本发明提供了靶向PTPRO基因saRNA在肿瘤干细胞治疗中的应用，以及一种全新的，高效的，安全的清除肿瘤干细胞的方法，为针对c-Met通路的靶向治疗、根除CSCs为目标的肿瘤治疗提供了新的方向。本发明中的PTPRO基因可抑制肿瘤的侵袭和转移能力，抑制肿瘤细胞干性，而靶向PTPRO基因 saRNA能够激活PTPRO基因的表达，通过提高PTPRO基因的表达或活性，抑制受体酪氨酸激酶c-Met的活性，达到治疗肿瘤的目的。

为证实上述目的，本发明分别采用细胞侵袭迁移实验，证明PTPRO可抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力；进一步地，细胞悬浮培养实验证明，PTPRO可通过抑制c-Met活性抑制干细胞球的形成，抑制肿瘤细胞干性；western blotting实验检测saPTPRO可显著降低c-MET蛋白的磷酸化水平，抑制其活性；体内裸鼠皮下成瘤模型实验证实saPTPRO与c-Met小分子抑制剂PHA-665252联合使用，可显著提高PHA-665252的抗肿瘤疗效，抑制小鼠肿瘤生长。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应当说明的是，本发明中涉及的化学品，细胞，耗材等，如无特别说明，均可从市场购买获得。

实施例1saRNA分子的设计及其对PTPRO表达的影响

一、saRNA的设计

在网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得PTPRO启动子区序列。

根据按照RNA序列的设计原则，设计获得PTPRO的5对双链小RNA激活序列以及该5对序列对应PTPRO启动区位点。PTPRO启动子区位点-3000位点至-1位点的序列(SEQ IDNO:1)如下所示：

TGATTTGGAGTCTTGAAAATAGCATAATAAGATTTATCATACTTTGGAA GTATTGTATTGAAAAACCAGTCAATAGCTCAAAGAAACACAAAACATGCTC TATGAATTGAAAACCCCACACTGTGGATGACACAGCATTCACATTCTTTATG AGAATCTCTTCTAGGACACTGTTATGGTTTAAGTGCAATAAAAACAAATGA AAGTATTTTATCCAGCAATAGCAATGTAAAATACTTTTCTCTAGAGAGGAAA TTTTCTGTGATTATAAAATAATACTTTCAGTCTTCAGCCCATCTAACCACAAT GTTACTAATAAAATAACAACAATGCCAATTACTAATGCTTTACTACTTACTG TTTACTGTTATTGTTCCTCCAAAGTGGTCCACATAATATATATATATATATATAT ATATATACATATATATATATATGCACAAAGACAGAAAGAGCTGAACAAATTG TGATGTATGACTAAGAGAAAAACAGAAAGACGCAGCAGAATATGATTATTT AAAAGGGAGCCTCATTGTGAAAGTTCTTTTAGCATTTACAAGATTAATTTAT GATCAGAACTGCTTTAAACGCCCTACGCACATCAGGCAAGGCTATATCCAT GTATACACACAGACATATGCATACACACAAATGAATATCATCATACAGACCC ATAATTCACAGACACATTTTAAAATTAAATGCTACTCCAAAGAGAAATTGTT GGCATCCTGTGAGTGTGATTGTTGCCCTTGGCCTATATATATCTTATGTTCTA GAGATTAGATCACTTTACAGCCACTTCTGAGGGCGAGTGGGAATAAAATGC TGCTTCAGGAGCGTCAAAATAAAAAGAAAACATATTAAACCAAAGTTCCTA TAAGTGCAATCCCAAGGATTAAATGTTCAGATAGCCCGTAAGTCTAACCCA GAGGGAGGGAGGAGCAGTTAACATTTTCTCAAAAGAAAGAAAATGTCCA AACCAATGATGAGTGGACATGAGGGACCTGAAGAGAGCATGTGATGGGAA TGTGAAAACAAAAGAAGCTTCTAAAAGAAGACACCAAGGATAATATTCTC ACAAAAATTCAGACCATCATTCTATATTTTCATGCATATGAATTTTGGTACAT ATTTCATGCATATGAAATTTGGTACATATATACATATATGTACCATGCATATACATATGCGTACATATACATATACGTATGCATACACATATGTATCTATGTACACAC ATACACATATGTGTACACACATATGTACATGCACACACATATGTGTACACATA TGTACATGCACACACATGTGTGTACACATATGTACATGTACACATATGTGTA CATGTACACATGTGTATATATACATATTCACACTTATGTAAACATATTCAATCT AAAGCTTCCTTAAGACACATACAAACAACAACCAAATGATTAGTGTTTGGC CATTGCTCATGCAGCAAAAGCTGAGTAAACACAGCTCTGGATCCTTTTCTC AGGCCACCACTCCCTAGCTGTGTGACTGACAAAGTCTATGCCTGAACACCT ACATTCATGACCAGGGTGGCCTTTCCTGTCTCCTGTTGCCCAAGCATGTCT CAGGTATAAATAAGTTCCAATACTGACAGGGCACAGCAAGGGTAATTTACA TGACAATAAGAAATGATTTCTATCTGAACAGTGCATACCAGAGTTGATTTC GACAGACTTATCTTTAAAAAAATACACATAACAAAAAAGGAGACAAGTAG TAGATTGGGGACCCACAGCTTGAAAGTCGTTGCTTGTGATTCTAAAACATC CCAGTAAAATTATTCACAGATAATTGTTTAAAAATATAACTGTACATACCGTTGACACTTGGACAACACAGAGAATCACGTAGTTGAAAATCCACATATAACTT TGAACTCATCAAAACCTTAACTACTAATAGCCTACTCTTGACCGGAAACCT TACTGATAACATAATAAACAGTTGATTAACACACATTTTGTGTTGTATGTATT GTATACTGTATTCTTACAATAAAGTACGCTAGAGAACAGAAAATATTATTAA GAAAACCATAAAGAGGAGAAAATACATTTATATTCATTGAGTGGAAGTGAA TTATCATAAAAGTCTTTAACGTCATCCTTTTCAGGCTGAGCAGGCAGAGGA GGAGGAAGAGGGTTTGGTCTTGCTGTCTCAAGGCTGGCAAAGGTGGAAG AAAATCTGCATATAACTGGACCCAACAGTTCAAACCCGTGTTGTTCAAGGG TCATACATGTAAAATACTGTGATTTTTCCCCCTTCTATATTCAGCTTCAGGTG ACCCGACACACTTTGGTATCAAAAGAGAATCTGAAATGTACAAGAACTG CGGATTTCAAATGGAAAAGGTGCATAATTGTGCTATTTGTTCCTGGGTGAG TGTGGGACGGAGACGGTGAGAGTGTTGAAATGGGATGGAGATAATGGAA GCAGTGGGGAAGGAGAGAAAATACCCTTCCTATCACACACACTCACACAC TCACACTACACACTATTTCTACAGTCACAACTACCCAACTGTTATTGATCCT TTATAACTGCAATTGAGTACAGATGTAGGAAGATTGAGAGGGAACTGGGAT CTGGCGCCTGGATTGCTCAAGAGAGGTCAGGGAAACCCCTCAGAACTCCT GAGACCCAGAGATTGAGGGAGGGGTTGAGGCGGAGTCTGCAATGGGGGC TGTCCAGCAGTAGCAAGCAGCGGGCCGATCCTGGTGGAGGGTTGGGAGG CTGCTGTCATTTTATGGGTCGGCAGCCAGAGTGAGAGTGTCCCTGCTGCC AGAGGACTACGGCGGGCTGGGCGCGGGGTCCCCGCCTCTCGCTCACCACA CAGACCCCGCGCCTCCTCTGGCAGCCGCGGTGGTGGCGGCGGCAGAGCCT CGCCCACTCCAATCCCCACCCTCTCCATCCTTAGTCATTAAAGAACAGCAGCGCCTGGCACGTTCTTGGAGGACCCCG。

saPTPRO-220：

正义链：5’-GGU UGG GAG GCU GCU GUC A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:2)

反义链：5’-UGA CAG CAG CCU CCC AAC C[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:3)

(PTPRO启动子区-220位点至-238位点)。

saPTPRO-398：

正义链：5’-AUU GAG UAC AGA UGU AGG A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:4)

反义链：5’-UCC UAC AUC UCU ACU CAA U[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:5)

(PTPRO启动子区-398位点至-416位点)。

saPTPRO-550：

正义链：5’-AGA CGG UGA GAG UGU UGA A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:6)

反义链：5’-UUC AAC ACU CUC ACC GUC U[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:7)

(PTPRO启动子区-550位点至-568位点)。

saPTPRO-658：

正义链：5’-CCG ACA CAC UUU GGU AUC A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:8)

反义链：5’-UGA UAC CAA AGU GUG UCG G[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:9)

(PTPRO启动子区-658位点至-676位点)。

saPTPRO-1026：

正义链：5’-AAA CCU UAC UGA UAA CAU A[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:10)

反义链：5’-UAU GUU AUC AGU AAG GUU U[dT][dT]-3’(SEQ ID NO:11)

(PTPRO启动子区-1026位点至-1044位点)。

二、上述saRNA对PTPRO表达的影响

食管癌细胞系TE1培养于含有10％胚牛血清的DMEM/F12完全培养基中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞按 2×10⁵个/ml接种于6孔培养板培养过夜。次日以上saRNA和dscontrol以50nM 的终浓度，转染细胞，转染5天后收获细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，并反转录为cDNA荧光定量PCR法分析靶基因的PTPROmRNA的差异表达。荧光定量PCR所使用的引物见下表:

表1荧光定量PCR所使用的引物

结果如图1所示，saPTPRO-220、saPTPRO-658激活效果明显优于其他3 对，且saPTPRO-220效果最优，其他三对saPTPRO-398，saPTPRO-550， saPTPRO-1026效果不明显。

实施例2对PTPRO基因进行敲除和过表达，并验证其对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响

3.1用PTPRO干扰质粒(参见图8)对HK1细胞系的PTPRO进行敲除，培养48h后进行侵袭迁移实验；

3.2细胞基底膜侵袭实验

3.2.1基质胶准备：将冻存于－20℃冰箱的matrigel 4℃过夜(24h)，变成液态；

3.2.2无血清培养基和基质胶按3：1稀释，每孔铺30～50ul Matrigel于Transwell培养小室(Millipore)内表面，在37℃培养箱中30min～60min。此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态；

3.2.3加每孔加入30ul质量分数为1％的BSA，在37℃培养箱中30min，吸取BSA；

3.2.4用无血清培养基洗Matrigel洗1次；

3.2.5消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液；

3.2.6于每个Transwell上室内加入含1×10⁵个细胞的200μl细胞悬液；

3.2.7再将整个Transwell小室放入含500μl体积分数为10％FBS的培养基的24孔板内，置37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养24h～48h；

3.2.8取出上室，用1×PBS洗3遍，以甲醇固定15min，质量分数为0.1％结晶紫染色15min，用棉签仔细擦掉位于上室面未穿过膜的细胞后封片，光学显微镜(Olympus CK2)下计数5个400倍视野的迁移细胞数，计算出每视野细胞的平均值。

镜下观察结果及迁移细胞数量统计如图2、3所示，分别将PTPRO基因进行过表达和敲降处理，比较HK1食管癌细胞系侵袭迁移能力的变化。结果显示，过表达PTPRO基因表达后，食管癌细胞系的侵袭迁移能力下降，敲降PTPRO 基因表达后，食管癌细胞系的侵袭迁移能力提高。

实施例3干细胞成球实验验证PTPRO通过c-met影响肿瘤细胞干性

5.1利用过表达质粒构建PTPRO过表达质粒和c-met过表达质粒(两种过表达质粒的构建方法类似实施例4中的干扰质粒的构建方法，此处省略)，将质粒转染进入HK1细胞，嘌呤霉素筛选构建稳定细胞系。

5.2取生长状态良好的细胞制成单细胞悬液，计数。取10⁴个细胞放入低黏附6孔板，用肿瘤干细胞培养基悬浮培养。培养两周后计算成球率(干细胞球的直径>＝50um)。

细胞成球状态及成球数量如图4、5所示，结果显示，当过表达PTPRO时，成球能力下降，当过表达c-met时，可恢复成球能力，证明PTPRO可通过抑制 c-Met活性抑制干细胞球的形成，抑制肿瘤细胞干性。

实施例4saPTPRO对PTPRO蛋白水平的表达以及对c-MET蛋白磷酸化水平的影响

1.细胞培养和转染

将人肝癌细胞TE1细胞系分别培养于含体积分数10％胎牛血清和质量分数1％青霉素/链霉素的DMEM培养液中，在37℃、体积分数5％CO₂条件下培养，隔日换液。将处于对数生长期的细胞接种于6孔板，细胞培养箱继续培养，细胞丰度为50％-60％时转染，每个细胞系分为3个组(对照组、空白对照组，转染组以下实验分组均同)。转染前，将细胞培养基更换为不含抗生素的生长培养基。dsRNA转染浓度为50nmol/L，根据lipofectamine2000转染说明书进行转染，6h后观察细胞状态，并更换培养基。

2.Western Blot实验检测PTPRO蛋白以及c-MET蛋白磷酸化水平

转染72h后，弃培养基，PBS洗孔2次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,4℃裂解30min，300xg离心15min。取上清液采用BCA法进行蛋白定量，每个样品提取20μg蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜转膜，采用含质量分数5％奶粉的TBST缓冲液4℃封闭过夜。加入1∶1000稀释的PTPRO 一抗、c-MET、P-c-MET一抗。4℃孵育过夜，继而加之HRP标记的二抗(1:2000 稀释)，37℃孵育1h。显色，结果分析。结果如图6所示，saRNA可显著提高 PTPRO蛋白的表达水平，PTPRO表达水平提高可显著降低c-MET蛋白的磷酸化水平，且不影响c-MET总蛋白的表达。

实施例5质粒的构建

(1)引物设计:

1、选择合适的载体，酶切位点及其顺序(酶切位点的顺序不能颠倒)；

2、在NCBI上确认目的片段的碱基序列；

3、设计引物：

4、核对----送公司合成；

5、对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水(ddH₂O)，再把上游引物和下游引物混在一起，在4℃ 保存。

(2)PCR(P出目的片段)：

1、摇菌过夜：向15ml离心管中加入2ul菌液、3ml LB和Xul相应的抗生素。2、PCR:其中，PCR(50ul)反应体系包括1ul菌液、1ul Primer、23ul 2d H2O以及25ul 2x PFU mix；

PCR反应温度体系为：94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃X min，33cycles；72℃5min。

(3)跑胶与回收:

1)配胶：配制1％的琼脂糖胶(大块)，方法为：称0.6g的琼脂糖，加入60ml的1XTAE，煮沸3次；待温度降到50-60℃时，加入0.6ul 的EB；25分钟后，即可点样跑胶。

(2)跑胶：130-150V、25-30分钟。

(3)紫外灯下观察，切胶。

(4)做胶回收:

按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温箱中2min；

对胶回收的产物跑胶验证，可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloading buffer2ul、2d H₂O 6ul。

(4)酶切与连接：

1、目的片段酶切：37℃酶切过夜或者4小时；

50ul的体系：上述胶回收产物，35ul；10x H buffer(1.5x)，7ul；dd H2O 6ul；

酶1(KpnI)，1ul；酶2(BamHI)，1ul。

2、载体酶切：(37℃酶切过夜或者4小时)

20ul的体系：Vector(即Ppc3.1-HA)(1ug/ul)，2ul；10x buffer(1.5x)， 3ul；ddH2O，13ul；酶1(KpnI)，1ul；酶2(BamHI)，1ul。

3、连接：

12ul的体系：2x Rapid Ligation，6ul；连接载体，0.8ul；目的片段4.5ul； T4DNALignase，1ul。。

(5)转化：

⑴、10ul感受态细菌和10ul质粒在冰上20分钟后热激：42℃、90秒，然后在冰上放置2分钟；

⑵、加1ml SOC(或者1ml LB)，37℃、180rpm、45分钟；

⑶、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中，再按抗生素：LB＝1:1000的比例加入抗生素(100ml的LB加50ul的2Kx的氨苄抗生素)；

⑷、250rpm、过夜。

(6)质粒大抽：

1、在选择平板上挑选一个单克隆，在含有相应抗性的2—5ml中液体LB培养基初培养：37℃摇床200-300rpm下培养约8h。

2.将初培养菌液用选择性LB培养基稀释到1/500到1/1000。

3、4℃离心机6000g离心15min收集细菌细胞。

4、10ml Buffer P1重悬细菌细胞。

5、加入10ml Buffer P2，轻轻上下颠倒封盖的管子4-6次彻底混合溶液，室温(15-25℃)下放置5min。

6、加10ml预冷的Buffer P3，立即轻轻上下颠倒4-6次混匀，冰上放置20min。

7、20min后，6000g 4℃离心25min。同时，向柱子中加入10ml Buffer QBT，使其全部流过柱子，平衡柱子。

8、剪一小块纱布，折叠4层，放于柱子上部。将离心后的液体缓慢倒入纱布中，最后挤压纱布使其中的液体全部直接过滤到柱子中，使其充分流过柱子。 (如果此步不只1个质粒时，挤压不同质粒的纱布时，一定要换手套，避免污染质粒)。

9、用2×30mlBuffer QC(wash buffer)洗柱子。

10、洗脱质粒：向柱子中加15ml Buffer QF，靠重力作用使其全部通过柱子，收集洗脱液。(注：要收集到一个新的管中。)

11、沉淀质粒：向收集的液体中，加入0.7倍体积(即10.5ml)异丙醇，轻轻混匀，6000g 4℃离心25min。(异丙醇可以充分沉淀质粒，但同时会沉淀很多盐分)；

12、清洗质粒：离心后，注意质粒贴壁的方向，应从其侧面倒掉废液。用 5ml70％室温保存的乙醇洗涤DNA颗粒，将含有DNA的乙醇转移到1.5ml的EP 管中，6000g 4℃离心10min，轻轻吸弃废液。(残留的乙醇会影响后续反应中的酶活性)。

13、将EP管倒扣于吸水纸上，空气干燥5-10min，用适当体积的TE溶解 DNA。

14、柱子回收。

质粒大抽中涉及的试剂的配制方法如下：

Buffer QBT(1000ml)：分别称取NaCl 43.83g，MOPS 10.46g，加入600ml双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。

Buffer QC(1000ml)：分别称取NaCl 58.44g，MOPS 10.46g，加入600ml双蒸水，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。

Buffer QF(1000ml)：称取NaCl 73.05g，量取2M Tris-HCl 25ml，加入800ml 双蒸水，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。

1M NaOH(400ml)：分子量：40，秤取16g NaOH，溶于400ml双蒸水中。

2M Tris-HCl(500ml)：分子量为121.14，秤取121.14g Tris，溶于400ml双蒸水中，用HCl调节pH值为8.0，定容至500ml。

10×TE Buffer：量取1MTris-HCl(pH8.0)100ml，500mM EDTA(pH8.0)20ml，加入800ml双蒸水，均匀混合后定容至1L。

Buffer P1(1000ml)：用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M的Tris-HCl，加入700ml双蒸水，用HCl调节pH值为8.0，定容至1000ml。

Buffer P2(1000ml)：称取10g SDS，放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入 750ml双蒸水，最后加入200ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。 (注：不需要定容，严格按步骤操作)。

Buffer P3(1000ml)：秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml双蒸水中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。

配制RNase：

1)将RNase粉末溶于10mM的乙酸钾(即Buffer P3)，配制成浓度为 10mg/ml的溶液。

2)将配好的RNase溶液100℃加热10min,随后冷却至室温。

3)用1M的Tris-HCl调节pH值至7.4，大约需要0.1体积的Tris-HCl。

4)分装RNase溶液于1.5ml EP管中，-20℃保存。

(7)收菌：

取过夜菌至50毫升离心管，离心：6000g、3-5分钟、4℃。再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀(倒置于草纸上使液体流尽)。

(8)重悬：

每管加入8ml的RES-EF(RnaseA)，重悬细菌沉淀—充分Vortex或用枪头吹打沉淀；确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

(9)裂解：

每管加入等量的LYS-EF bufffer，即8ml。轻轻上下颠倒离心管4-6次，室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明，无团块或絮状物。

注意：vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。

(10)平衡：

1)：滤芯插入柱子，将柱子驾于50ml离心管上(或者直接架于50ml离心管架上)；

2)：取15ml EQU-EF buffer沿滤芯四周加入—充分平衡滤芯。

(11)中和：

在等待EQU-EF buffer滤完时，往裂解好的菌液中加入8ml NEU-EF buffer，颠倒混匀，冰上孵育5min。

(12)离心、过滤：

1)：离心中和过的菌液：10000rpm、5-10min、存放于4℃--质粒存在于上清中；

2)：将上清吸入到平衡好的滤芯中，重力自流尽。

(13)一洗：

过滤完毕后，吸取5ml的FIL-EF buffer，沿滤芯四周加入(将粘在滤芯上的质粒洗下来)，过滤完后，将滤芯弃掉。

(14)二洗：

往滤柱中加入35ml的ENDO-EF buffer，以去内毒素。

(15)三洗：

待滤完后再加入15ml的wash-EF buffer，再过滤。

(16)洗脱：

取一支干净的15ml超速离心管，将滤完的柱子插入到离心管中，用高压条将二者绑好，往滤柱中加入5ml Elu-EF buffer.

(17)沉淀：

待Elu-EF buffer滤完后，弃滤柱，往离心管中加入5ml的异丙醇(将质粒沉淀下来)，混匀(充分vortex)，静止10min；10000rpm、30min、4℃离心，弃上清。

(18)洗涤：

加5ml的70％酒精(ETOH)或用15ml三蒸水(高压过)+35ml的无水乙醇配制(在超净台进行)，混匀(上下颠倒即可)，离心：10000rpm、10min、常温。

弃上清，重复上述步骤一次(再洗涤一次)弃上清，到超净台用200ul枪头把上清尽量洗净，再空离一次，在超净台用小枪头把液体洗净、吹干。

(19)溶解：

取100-300ul高压过的H₂O-EF溶解质粒；定量后，将得到的干扰质粒的浓度调至1ug/ul备用，保存到-20℃。选取生长良好的食管癌细胞系，利用 PCRDNA3.1-HA、PCRcDNA3.1-PTPRO-HA、PCRcDNA3.1-PTPRO-CS-HA、PCRcDNA3.1-PTPRO-DA-HA、PCRcDNA3.1-PTPRO-DA+CS-HA五种干扰质粒进行转染，G418筛选构建稳定细胞系，37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

CS：Cysteine to serine(C/S)mutants，CS突变使得PTPRO失去脱磷酸化作用；

DA：Aspartate to alanine(D/A)mutants，DA突变增强PTPRO识别磷酸化位点的能力。

实施例6小鼠皮下成瘤实验证明saRNA在抑制肿瘤生长中的作用

6.1选取6周龄，体重18～20g，健康状态相似，生长状态良好的裸鼠24只，随机分成四组，于SPF级动物房饲养；

6.2选取对数期生长TE1细胞，PBS重悬计数，制成2×10⁶个/200ul的细胞悬液，在小鼠腹股沟外侧皮下注射，每个注射部位注射量为200ul；

6.3皮下注射后第7天开始，每3天测量一次瘤的大小并计算瘤子体积，待瘤体积达50mm³时，分别分成给四组小鼠尾静脉注射saRNA，PHA-665252， saRNA+PHA-665252，PBS，其中，saRNA的注射剂量为50nmol/kg体重， PHA-665252和PBS的注射剂量按体重计算为5mg/kg体重，每3天注射一次； saRNA+PHA-665252中saRNA的注射剂量按体重计算为25nmol/kg体重， PHA-665252的注射剂量按体重计算为2.5mg/kg体重，每3天注射一次。

6.4实验进行到第五周时，处死小鼠并取瘤，测量瘤体大小，记录数据。将每次测量肿瘤大小的数据绘制成生长曲线，如图7所示，其中，1为PBS，2为 PHA-665252，3为saPTPRO-220，4为saPTPRO-220与PHA-665252联合使用；

从附图7中可以看出，相对于PBS，PHA-665252、saPTPRO-220、 saPTPRO-220+cPHA-665252联合使用后，能有效抑制肿瘤的生长。其中，单独使用PHA-665252、saPTPRO-220时，对肿瘤生长的抑制效果几乎相同，当同时使用saPTPRO-220和PHA-665252后，肿瘤体积增长速度显著降低；甚至，大约15天后，肿瘤体积开始逐渐减小，说明saPTPRO-220和PHA-665252同时使用时，两者之间具有协同增效的抗肿瘤作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

<110> 汕头大学

<120> 一种激活PTPRO基因表达的saRNA及其在肿瘤干细胞治疗中的应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3000

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

tgatttggag tcttgaaaat agcataataa gatttatcat actttggaag tattgtattg 60

aaaaaccagt caatagctca aagaaacaca aaacatgctc tatgaattga aaaccccaca 120

ctgtggatga cacagcattc acattcttta tgagaatctc ttctaggaca ctgttatggt 180

ttaagtgcaa taaaaacaaa tgaaagtatt ttatccagca atagcaatgt aaaatacttt 240

tctctagaga ggaaattttc tgtgattata aaataatact ttcagtcttc agcccatcta 300

accacaatgt tactaataaa ataacaacaa tgccaattac taatgcttta ctacttactg 360

tttactgtta ttgttcctcc aaagtggtcc acataatata tatatatata tatatatata 420

tacatatata tatatatgca caaagacaga aagagctgaa caaattgtga tgtatgacta 480

agagaaaaac agaaagacgc agcagaatat gattatttaa aagggagcct cattgtgaaa 540

gttcttttag catttacaag attaatttat gatcagaact gctttaaacg ccctacgcac 600

atcaggcaag gctatatcca tgtatacaca cagacatatg catacacaca aatgaatatc 660

atcatacaga cccataattc acagacacat tttaaaatta aatgctactc caaagagaaa 720

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gattagatca ctttacagcc acttctgagg gcgagtggga ataaaatgct gcttcaggag 840

cgtcaaaata aaaagaaaac atattaaacc aaagttccta taagtgcaat cccaaggatt 900

aaatgttcag atagcccgta agtctaaccc agagggaggg aggagcagtt aacattttct 960

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acaaaaattc agaccatcat tctatatttt catgcatatg aattttggta catatttcat 1140

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catatgtaca tgtacacata tgtgtacatg tacacatgtg tatatataca tattcacact 1380

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gacacttgga caacacagag aatcacgtag ttgaaaatcc acatataact ttgaactcat 1920

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gtgctatttg ttcctgggtg agtgtgggac ggagacggtg agagtgttga aatgggatgg 2460

agataatgga agcagtgggg aaggagagaa aatacccttc ctatcacaca cactcacaca 2520

ctcacactac acactatttc tacagtcaca actacccaac tgttattgat cctttataac 2580

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tcaagagagg tcagggaaac ccctcagaac tcctgagacc cagagattga gggaggggtt 2700

gaggcggagt ctgcaatggg ggctgtccag cagtagcaag cagcgggccg atcctggtgg 2760

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ccctctccat ccttagtcat taaagaacag cagcgcctgg cacgttcttg gaggaccccg 3000

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

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Claims

1.一种激活PTPRO基因表达的saRNA和c-Met抑制剂的联合使用在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述saRNA由序列如SEQ ID NO:2所示的正义链和序列如SEQID NO:3所示的反义链组成；所述c-Met抑制剂为PHA-665252；所述肿瘤为食管癌。