CN110964726B - 一种重组siMACF1及其生产方法和应用 - Google Patents

一种重组siMACF1及其生产方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组siMACF1，所述重组siMACF1的序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1所示序列相似度达90％以上的序列。另外，本发明还公开了该重组siMACF1的生产方法及应用。本发明通过检测骨肉瘤患者肿瘤组织及正常骨组织样本，发现MACF1在骨肉瘤组织中高表达，且MACF1表达水平与肿瘤细胞迁移及侵袭能力密切相关，提示MACF1可作为骨肉瘤治疗靶点；设计MACF1的siRNA后，以tRNA为支架，嵌合siMACF1序列，在大肠杆菌中表达重组siMACF1。本发明制备的重组siMACF1为通过生物工程技术获得，具有设备简便、产量高、成本低、功能性好等优势。

Description

一种重组siMACF1及其生产方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学及医学技术领域，具体涉及一种重组siMACF1及其生产方法和应用。
背景技术
骨肉瘤是最恶性的骨肿瘤之一，特别是发病人群主要集中于少年和青年阶段，约占整个年龄段的75％左右。骨肉瘤的转移性强，80％的患者都有侵袭周围组织的症状，会特异性的发生肺转移。目前，非转移性骨肉瘤患者的5年生存率已到70％，而发生肺转移的骨肉瘤患者的5年生存率只有20-30％，并成为骨肉瘤治疗的主要挑战。
MACF1是细胞骨架交联蛋白，在不同细胞中广泛表达，参与了细胞定位运动，细胞极化，迁移，细胞信号转导和紧密连接等细胞生理功能，在胚胎发育、组织特异性功能以及人类的疾病中发挥着众多的功能。特别是最近几年，MACF1在肿瘤的发生和发展以及转移过程中的作用受到越来越多的关注，如神经胶质母细胞瘤、结肠癌，肺癌和乳腺癌。特别是Duhamel,S.,et al.研究表明MACF1通过参与乳腺癌细胞上皮型到间充质型的转换，促进癌细胞的转移。而对于MACF1在骨肉瘤的发生发展和转移过程中的功能，以及其在骨肉瘤治疗中的作用尚未见研究和报道。
本发明利用免疫组织化学实验发现MACF1在人骨肉瘤组织中高表达的，并通过实时定量荧光PCR等实验验证了MACF1在骨肉瘤细胞的表达量与肿瘤细胞的迁移及侵袭能力相关。因此，MACF1可能成为骨肉瘤治疗的潜在靶点。
随着对非编码RNA的深入研究，催生了基于RNAi技术开发小RNA分子药物用于疾病治疗的方法，在临床制药应用领域前景广阔。siRNA导入细胞可以干扰肿瘤相关基因表达，从而达到控制肿瘤的目的。siRNA因可调控基因表达而被作为肿瘤基因治疗的有效武器，即RNA疗法。但是小RNA分子的研究依然面临着困境，最突出的就是RNA原料的获取。利用活细胞生物合成的ncRNAs可能更好地应用于生物、医学研究以及小核酸药物开发中，以避免严重的免疫反应。而内源性的tRNA作为支架用于生产小分子RNA已经取得较好的发展
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种重组siMACF1及其生产方法和应用。本发明利用免疫组织化学技术检测组织芯片，测定了MACF1在人骨肉瘤组织及正常骨组织的表达情况，证明了其在骨肉瘤组织中高表达。再通过实时定量荧光PCR检测了正常细胞系hMSC及不同骨肉瘤细胞系MG63,U2OS,143B中MACF1的表达水平；划痕实验和transwell chamber实验检测了四种细胞系的迁移和侵袭能力证明了骨肉瘤的转移与MACF1的表达具有相关性。最后设计并生产了一种靶向MACF1的重组siMACF1，证明了其可以通过抑制MACF1进而抑制骨肉瘤细胞的迁移。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种重组siMACF1，其特征在于，所述重组siMACF1的序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1所示序列相似度达90％以上的序列。
另外，本发明还提供了一种上述重组siMACF1的生产方法，其特征在于，包括：以MACF1为靶基因，设计其小干扰RNA siMACF1，将设计的小干扰RNA siMACF1嵌合于tRNA支架，在大肠杆菌中重组表达；所述小干扰RNA siMACF1的序列如SEQ ID NO：2所示。
上述的生产方法，其特征在于，所述tRNA支架的序列为与人丝氨酸tRNA序列相似度达90％以上的序列，所述人丝氨酸tRNA序列如SEQ ID NO：3所示。
上述的生产方法，其特征在于，小干扰RNA siMACF1的前体序列为成熟序列部分被siMACF1序列取代的hsa-miR-34a前体序列，所述小干扰RNA siMACF1的前体序列如SEQ IDNO：4所示。
上述的生产方法，其特征在于，所述生产方法的具体步骤包括：
步骤一、设计合成嵌合siMACF1序列的hsa-miR-34a前体引物；
步骤二、利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将小干扰RNA siMACF1的前体序列插入pBSMrnaSeph质粒中，构建表达载体；
步骤三、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；
步骤四、大肠杆菌培养扩增后，提取菌内总RNA，以FPLC分离纯化目标重组siMACF1。
本发明提供了一种上述重组siMACF1在制备抑制骨肉瘤细胞中MACF1mRNA水平及蛋白水平表达的前药、药物、原料药或药物组合物中的应用。
本发明提供了一种上述重组siMACF1在制备抑制癌症细胞中MACF1 mRNA水平及蛋白水平表达的前药、药物、原料药或药物组合物中的应用。
本发明提供了一种上述重组siMACF1在制备抑制骨肉瘤细胞迁移的前药、药物、原料药或药物组合物中的应用。
本发明提供了一种上述重组siMACF1在制备治疗MACF1高表达癌症的前药、药物、原料药或药物组合物中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明通过研究发现，MACF1与骨肉瘤的迁移及侵袭能力相关，是潜在的治疗靶点；通过以MACF1为治疗靶点，以人丝氨酸tRNA嵌合含siMACF1的has-mir-34a前体，生产重组siMACF1，人丝氨酸tRNA为人源tRNA，其毒性及免疫原性均更低。
2、本发明设计制备的重组siMACF1为通过生物工程技术获得，具有设备简便、生产快速、产量高、成本低、功能性好等优势。
3、本发明通过免疫组织化学芯片，检测了MACF1在人骨肉瘤组织及正常骨组织的表达情况，证明了其在骨肉瘤组织中高表达。再通过实时定量荧光PCR检测了正常细胞系hMSC及不同骨肉瘤细胞系MG63,U2OS,143B中MACF1的表达水平，划痕实验和transwellchamber实验检测了四种细胞系的迁移和侵袭能力证明了骨肉瘤的转移与MACF1的表达具有相关性。最后设计并生产了一种靶向MACF1的重组siMACF1小RNA，证明了其可以通过抑制MACF1进而抑制骨肉瘤细胞的迁移。
4、本发明生产的重组siMACF1可以有效干扰骨肉瘤细胞中MACF1基因的表达，同时抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭能力。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是本发明实施例1利用免疫组化检测MACF1在人骨肉瘤组织和人正常骨组织中表达的结果图。
图2是本发明实施例2利用qPCR技术检测MACF1在hMSC、MG63、U2OS、143B四种细胞系中的表达结果图。
图3是本发明实施例3利用划痕实验检测了hMSC、MG63、U2OS、143B四种细胞系的迁移能力结果图。
图4是本发明实施例3利用transwell chamber小室检测了MG63、U2OS、143B三种细胞的侵袭能力结果图。
图5是本发明实施例4利用引物PCR对含有siMACF1序列的插入片段扩增的凝胶电泳图。
图6是本发明实施例4对pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体进行双酶切鉴定的结果图。
图7是本发明实施例4利用菌液PCR鉴定重组siMACF1表达质粒的凝胶电泳图。
图8是本发明实施例5利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组siMACF1的表达。
图9是本发明实施例6利用Bio-Rad NGCTMChromatography System纯化重组siMACF1，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。
图10是本发明实施例7利用qPCR技术鉴定转染重组siMACF1小RNA后，其在143B细胞中的加工和成熟(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，***P<0.001)。
图11是本发明实施例8利用qPCR技术检测转染重组siMACF1小RNA后，有效干扰靶基因MACF1的表达结果图(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，***P<0.001)。
图12是本发明实施例8利用Western blot技术检测转染重组siMACF1小RNA后，有效下调靶蛋白MACF1的表达结果图(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，***P<0.001)。
图13是本发明实施例8利用划痕实验检测转染重组siMACF1小RNA后，有效抑制143B细胞迁移能力的结果图(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，***P<0.001)。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。
实施例1：利用免疫组化芯片检测人骨肉瘤组织中MACF1的表达。
近期研究表明，MACF1与多种癌症的发生发展相关而关于MACF1在骨肉瘤中的研究尚未见报道。直接检测人骨肉瘤组织中的表达，可提示我们MACF1是否在骨肉瘤的发生发展进程中发挥作用。
收集人骨肉瘤组织样品及正常骨组织样品，对样品进行石蜡包埋，切片，脱蜡，利用Tris-EDTA微波修复抗原；用3％H2O2-甲醇粉笔内源性过氧化物酶，接着进行一抗(anti-MACF1)孵育，4度过夜；再利用生物素标记的二抗IgG以及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶分别进行孵育，最后进行封片保存。
图1是本实施例利用免疫组化芯片检测人骨肉瘤组织中MACF1表达的结果图。其中上图为骨肉瘤组织，下图为正常骨组织，结果表明MACF1在骨肉瘤组织中高表达。
实施例2：MACF1在正常细胞hMSC以及骨肉瘤细胞143B，MG63，U2OS中的表达差异。
(1)将四种细胞接种至12孔板中，每个细胞复3孔，过夜。RNA的提取(E.Z.N.Atotal RNA Kit I,E.Z.N.A total RNA Kit II)，按照试剂盒说明书进行操作。所得mRNA测定浓度后，于-80℃冰箱保存备用。
(2)qPCR检测MACF1在细胞内的表达：
使用TAKARA逆转录试剂盒，将所提mRNA反转录为cDNA。反转录条件为：37℃15min；80℃ 15s。取各组的cDNA为模板，以18s为内参，采用qPCR检测MACF1在细胞中的表达量。qPCR反应条件为：95℃ 30s，变性；95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 10s，40个循环。所用引物序列如表1(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)。
表1 qPCR检测hMSC，143B，MG63，U2OS四种细胞中MACF1表达量所用引物序列
Figure BDA0002348904970000061
图2是本实施例对hMSC，143B，MG63，U2OS四种细胞中MACF1表达量检测结果图。从图中可以看出，与正常细胞hMSC相比，骨肉瘤细胞中的MACF1表达量明显较高(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，***P<0.001)。证明了MACF1在骨肉瘤细胞系也是高表达的。
实施例3：划痕实验、侵袭实验检测hMSC，143B，MG63，U2OS四种细胞迁移和侵袭能力的差异。
(1)划痕实验：
记号笔提前在孔板背面画好直线，然后将细胞以4×105个/孔接种于12孔板。18小时后，用枪头比着直尺垂直于孔板背面的横线在孔中划痕。用PBS洗涤2次，去除划掉的细胞，加入完全培养基，放入37℃,5％CO2培养箱，培养。分别在第0和12小时拍照，利用imageJ计算划痕的宽度。
(2)侵袭实验：取143B，MG63，U2OS三种细胞，用PBS小心地冲洗细胞以彻底去除血清，将培养基更换为无血清培养基，进行细胞饥饿3小时。将饥饿后的细胞进行消化，加入无血清培养基，吹打混匀，离心800rpm，5min；弃上清，离心管中加入无血清培养基，将细胞吹打混匀，并进行计数。饥饿细胞的同时，取出Transwell chamber放入24孔板中，将稀释好的matrigel铺在chamber内，37℃，5％CO2培养箱放置3小时。3小时后，在孔板中加培养基(DMEM含10％FBS)700μL，将chamber中的液体弃去，加入200μL细胞悬液(0.6×105)放入对应的孔中。37℃，5％CO2孵育12小时后，分别取出进行后续0.1％结晶紫染色观察。
图3是本实施例对hMSC，143B，MG63，U2OS四种细胞迁移能力的检测结果图。从图中可以看出，骨肉瘤细胞的迁移能力明显高于正常细胞hMSC，证明了在骨肉瘤中，MACF1与肿瘤细胞迁移的相关性(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，***P<0.001)。图4是本实施例对143B，MG63，U2OS三种细胞侵袭能力的检测结果图。从图中可以看出，MACF1表达量较高的143B细胞的侵袭能力也较强。证明了骨肉瘤细胞中，MACF1与肿瘤细胞侵袭的相关性(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，***P<0.001)，图3，图4的结果提示了MACF1与细胞迁移和侵袭能力的相关性。
实施例4：以pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体构建重组siMACF1质粒，表达重组siMACF1。
(1)根据siMACF1的有效siRNA序列(SEQ ID NO：2)，以及pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体上的序列设计引物，命名为mir-34a/siMACF1，同时在引物的两端加上1-15nt载体插入位点两侧的同源序列，序列见表2(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)。同源序列的加入可采用网站http://bioinfo.clontech.com/infusion/convertPcrPrimersInit.do辅助设计；
表2插入片段含siMACF1序列的引物序列
Figure BDA0002348904970000081
(2)插入片段的合成
以表2中的两条引物互为模板，利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA(SEQ ID NO：3)反密码子环处具有的酶切位点，将小干扰RNA siMACF1的前体序列插入pBSMrnaSeph质粒中，构建表达载体；反应体系如表3所示，反应过程如表4所示：
表3聚合酶体外扩增链反应体系(50μL)
Figure BDA0002348904970000082
Figure BDA0002348904970000091
表4聚合酶体外扩增链反应过程
Figure BDA0002348904970000092
图5是本实施例对小干扰RNA siMACF1的前体序列(SEQ ID NO：4)插入片段的引物PCR凝胶电泳图。图总M代表DL2000DNA marker；1代表引物PCR后合成的插入片段。
(3)pBSKrnaSeph/has-mir-34a载体的双酶切
用Eag I-HFTM，Sac II限制性内切酶对载体进行37℃酶切，反应体系如表5所示。
表5 50μL双酶切体系
Figure BDA0002348904970000093
图6是本实施例对pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体进行双酶切鉴定的结果图。图中M代表DL2000 DNA marker；1代表双酶切后的pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a质粒；2代表pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a质粒。结果表明，pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体酶切成功。
(4)酶切质粒以及PCR片段的回收及纯化
将PCR产物和酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，使用OMEGA公司的胶回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)进行回收纯化。在凝胶成像系统中用365nm的紫外光观察琼脂糖凝胶电泳后的DNA分离结果，用刀片小心切下带有目的DNA区带的凝胶，尽可能切下更少的胶，放入1.5mL的EP离心管中；称取凝胶的质量；按照1:1的体积比向装有琼脂糖凝胶的离心管中加入Binding Buffer结合缓冲液，并将混合物放于60℃-65℃水浴中7min，期间每隔两到三分钟振荡混合一次，直至凝胶完全融化；将融化后得到的溶液转移到DNAMini Column离心柱中，并将离心柱放入2ml的Collection Tube收集管中；10000rpm离心1min。每次离心的溶液体积最多为700μL，可将溶液分多次离心，直至全部离心完，并弃去收集管中的滤液，重复利用收集管；在离心柱中加入700μL的添加过无水乙醇的SPW WashBuffer。放于离心机中10000rpm，室温离心1min，重复此步骤一次；弃去滤液，将离心柱以13000rpm的转速室温下离心2min，以彻底除去纯化柱中的乙醇；将离心柱置于全新干净的离心管中。向离心柱中央悬空滴加30～100μL的Elution Buffer洗脱液，静置2min使DNA完全溶解在洗脱液中。放于离心机中以13000rpm的转速室温离心1min，回收管底的洗脱液。取少量洗脱液进行DNA凝胶电泳测定是否为目的产物，贮存于-20℃。
(5)插入片段与载体的连接
胶回收片段用
Figure BDA0002348904970000101
Ligation-Free Cloning System进行连接，反应体系如表6所示。
表6无缝连接反应体系(20μL)
Figure BDA0002348904970000102
Figure BDA0002348904970000111
混匀后，置于37℃孵育30分钟；转化大肠杆菌HST08感受态细菌；对克隆菌落进行氨苄青霉素抗性筛选。
(6)菌液PCR与DNA测序鉴定重组siMACF1(SEQ ID NO：1)表达载体
挑取单克隆菌落，于含有氨苄的LB培养基中培养约3h。取20μL菌液，加入180μL水，95℃放置10min，作为模板。用测序引物M13 Fow-GTAAAACGACGGCCAGT，Rev-CAGGAAACAGCTATGAC进行菌液PCR鉴定。反应体系和反应条件如表3和表4。另取100uL菌液，送擎科生物科技有限公司，用相同的引物进行DNA测序鉴定。
图7是本实施例利用琼脂糖凝胶电泳对菌液PCR的产物进行鉴定的结果图。图中M代表DL2000 DNA marker；1，2，3，4分别代表标记的单克隆；结果表明1，2，3为含有目的条带的单克隆。
实施例5：重组siMACF1的表达
(1)200ng重组siMACF1表达质粒转化HST08感受态细菌后，加入5mL LB培养基在37℃，200rpm震荡培养过夜。菌液经10000g离心2min后，收集沉淀。于沉淀中加入180uL 10mM醋酸镁-Tris·HCl溶液重悬，再加入200uL的饱和苯酚，室温振摇20-60min。10000g离心10min后收集水相，加入0.1倍水相体积的5M NaCl沉淀大分子杂质。上清液再加入2倍体积无水乙醇，10000g离心10min后，弃掉上清。吸水纸吸干残留乙醇，待RNA干燥后加入DEPC水溶解RNA，测定浓度，-80℃冰箱保存。
(2)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
将2μg RNA样品与2xRNA上样缓冲液混合，加入变性胶样品孔内。120～150V电泳40～60min后，放入含0.5μg/mL溴化乙锭的溶液中轻摇20～30min，于凝胶成像系统下观测，拍照保存。
图8是本实施例利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组siMACF1(SEQID NO：1)的表达。图中M表示RNA marker；1表示重组siMACF1表达质粒转化的HST08E.coli后的总RNA；2表示野生型HST08E.coli总RNA。与未转化重组siMACF1表达质粒的细菌总RNA相比，转化后的细菌总RNA在150-300nt之间多了一条条带。结果表明，重组siMACF1表达质粒在大肠杆菌中可以高表达重组siMACF1。
实施例6：FPLC纯化重组siMACF1(SEQ ID NO：1)
(1)采用Bio-Rad NGCTM Chromatography System，以离子交换柱(ENrichTMQ10×100Column)纯化重组siMACF1(SEQ ID NO：1)。
流动相A：10mM NaH2PO4溶液，pH7.0。流动相B：10mM NaH2PO4溶液，1M NaCl溶液，pH7.0。
流速为2.0mL/min。以DEPC水，流动相A，流动相B分别交替冲洗色谱柱约1h。每次冲洗5柱体积。
运行以下程序对总RNA进行分离：0～8.9min(0％B)，8.9～13.7min(55％B)，13.7～53.7min(55～75％B)，53.7～73.7min(75～85％B)，73.7～83.7min(100％B)，83.7～93.7min(0％B)。以260nm的吸光度检测RNA，并收集重组RNA所对应的峰。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度。
(2)RNA样品处理方法
总RNA提取步骤同上。所提取的总RNA于4℃ 13000rpm离心10min后，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，每次进样5-10mg。
(3)FPLC组分收集及浓缩去盐
以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。混合后的各组分用2倍体积无水乙醇沉淀RNA，-80℃冰箱放置约1h。以10000g转速于4℃离心10min收集RNA。将所得RNA沉淀用DEPC水溶解，用Ultra-2mL Centrifugal Filters 4℃ 7500g离心10min，去滤液，重复此步骤直至所有溶液离心完，再将Filters倒置，2000g离心2min，收集所得溶液，测定浓度后于-80℃保存。
图9是本实施例利用Bio-Rad NGCTM Chromatography System纯化重组siMACF1(SEQ ID NO：1)，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。结果表明，经FPLC纯化后，可得到高纯的重组siMACF1(SEQ ID NO：1)。
实施例7：重组siMACF1(SEQ ID NO：1)在细胞内的加工成熟
(1)重组siMACF1(SEQ ID NO：1)在143B细胞中的转染
将细胞以4x105个/孔接种于24孔板。按照lipofectamine 2000操作说明书进行细胞转染。重组siMACF1(SEQ ID NO：1)的转染浓度为40nM。
(2)RNA的提取(E.Z.N.A miRNA Kit)
按照试剂盒说明书进行操作。所得miRNA测定浓度后，于-80℃冰箱保存备用。
(3)qPCR检测重组siMACF1在细胞内的加工成熟
使用TAKARA逆转录试剂盒，采用茎环法将所提miRNA反转录为cDNA。反转录条件为：37℃ 15min；80℃ 15s。取各组的cDNA为模板，以U6为内参，采用qPCR检测siMACF1(SEQID NO：2)在细胞中的表达量。qPCR反应条件为：95℃ 30s，变性；95℃ 10s；60℃ 30s，72℃10s40个循环。所用引物序列如表7(SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12,SEQ ID NO.13,SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15)。
表7重组siMACF1逆转录及Q-PCR检测中所用引物序列
Figure BDA0002348904970000131
图10是本实施例利用qPCR技术检测重组siMACF1在143B细胞中的加工和成熟(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，***P<0.001)。与阴性对照(NC相比)，成熟siMACF1表达水平显著升高。说明重组siMACF1(SEQ ID NO：1)在细胞内可被正确加工为成熟siMACF1(SEQ ID NO：2)。
实施例8：重组siMACF1对靶分子MACF1的调控活性
MACF1是siMACF1的直接靶分子，且MACF1参与了细胞运动，抑制MACF1可以有效抑制细胞的迁移能力。因此检测MACF1的表达以及细胞的迁移能力的变化，可反映重组siMACF1对靶分子MACF1的调控活性。
(1)qPCR检测重组siMACF1(SEQ ID NO：1)对靶分子MACF1的调控
143B细胞转染、RNA提取、逆转录及qPCR过程同上。qPCR中使用的引物序列如表1。
(2)Western blot检测重组siMACF1对靶分子蛋白表达的调控
用40nM重组siMACF1/阴性对照(NC)转染143B，细胞转染方法同上。48小时后，使用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液制备裂解细胞用于Western blot分析。通过BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。在10％SDS-PAGE上分离30μg/泳道细胞总蛋白并转移到PVDF上。将膜在5％脱脂牛奶中在TBST缓冲液中封闭2小时。在4℃下将膜与相应的一抗(anti-MACF1，anti-GAPDH)孵育过夜。PVDF膜用TBST洗涤五次后，与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体在室温下孵育2小时。通过增强化学发光检测系统(Bio-Rad)检测蛋白质条带，并通过ChemiDoc MP成像系统(Bio-Rad)分析结果。
(3)划痕实验检测重组siMACF1对细胞迁移能力的抑制
记号笔提前在孔板背面画好直线，然后将细胞以4×105个/孔接种于12孔板。按照lipofectamine 2000操作说明书进行细胞转染。重组siMACF1的转染浓度为40nM。转染24小时后，用枪头比着直尺垂直于孔板背面的横线在孔中划痕。用PBS洗涤2次，去除划掉的细胞，加入无血清培养基，放入37℃ 5％CO2培养箱，培养。在第0和12小时拍照，计算划痕的宽度。
图11至图13，结果表明，重组siMACF1可有效下调靶分子的表达，抑制了细胞的迁移。
本发明通过检测骨肉瘤患者肿瘤组织及正常骨组织样本，发现MACF1在骨肉瘤组织中高表达，且MACF1表达水平与肿瘤细胞迁移及侵袭能力密切相关，提示MACF1可作为骨肉瘤治疗靶点；设计MACF1的siRNA后，以tRNA为支架，嵌合siMACF1序列，在大肠杆菌中表达重组siMACF1。生产的重组siMACF1可以有效干扰骨肉瘤细胞中MACF1基因的表达，同时抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭能力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西北工业大学
西安荣清畅生物科技有限公司
<120> 一种重组siMACF1及其生产方法和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 197
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
nnngcagcga uggccgagug guuaaggcgu uggacuggcc agcugugagu guuucuuaau 60
uuccauuaug ucacgagcuu gugagcaaua guaaggaagg cucgugacau aauggaaauu 120
uagaagugcu gcacguuguu ggcccaaucc aauggggucu ccccgcgcag guucgaaccc 180
ugcucgcugc gccannn 197
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aauuuccauu augucacgag c 21
<210> 3
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
nnngcagcga uggccgagug guuaaggcgu uggacunnnn nnnnnnnnnn nnaauccaau 60
ggggucuccc cgcgcagguu cgaacccugc ucgcugcgcc annn 104
<210> 4
<211> 109
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggccagcugu gaguguuucu uaauuuccau uaugucacga gcuugugagc aauaguaagg 60
aaggcucgug aauauaugga aaucuagaag ugcugcacgu uguuggccc 109
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaacccgtt gaaccccatt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccatccaatc ggtagtagcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaccaaggca acccattctt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actctgctcg ctccagtttc 20
<210> 9
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagcagcggc cgggccagct gtgagtgttt cttaatttcc attatgtcac gagcttgtga 60
gcaatagtaa ggaagg 76
<210> 10
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtgacccgc gggggccaac aacgtgcagc acttctaaat ttccattatg tcacgagcct 60
tccttact 68
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgctcgt 50
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catgcaaatt tccattatgt cacg 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccagtgcagg gtccgaggta 20

Claims (3)

1.一种重组siMACF1，其特征在于，所述重组siMACF1的序列如SEQ ID NO：1所示，SEQID NO：1：
nnngcagcga uggccgagug guuaaggcgu uggacuggcc agcugugagu guuucuuaau
uuccauuaug ucacgagcuu gugagcaaua guaaggaagg cucgugacau aauggaaauu
uagaagugcu gcacguuguu ggcccaaucc aauggggucu ccccgcgcag guucgaaccc
ugcucgcugc gccannn；
所述重组siMACF1的生产方法包括：以MACF1为靶基因，设计其小干扰RNA siMACF1，将设计的小干扰RNA siMACF1嵌合于tRNA支架，在大肠杆菌中重组表达；所述小干扰RNAsiMACF1的序列如SEQ ID NO：2所示；所述tRNA支架的序列为与人丝氨酸tRNA序列相似度达90%以上的序列，所述人丝氨酸tRNA序列如SEQ ID NO：3所示；小干扰RNA siMACF1的前体序列为成熟序列部分被siMACF1序列取代的hsa-miR-34a前体序列，所述小干扰RNA siMACF1的前体序列如SEQ ID NO：4所示；
生产方法的具体步骤包括：
步骤一、设计合成嵌合siMACF1序列的hsa-miR-34a前体引物；
步骤二、利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点，将小干扰RNAsiMACF1的前体序列插入pBSMrnaSeph质粒中，构建表达载体；
步骤三、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌；
步骤四、大肠杆菌培养扩增后，提取菌内总RNA，以FPLC分离纯化目标重组siMACF1。
2.一种如权利要求1所述重组siMACF1在制备抑制骨肉瘤细胞中MACF1 mRNA水平及蛋白水平表达的前药、药物、原料药或药物组合物中的应用。
3.一种如权利要求1所述重组siMACF1在制备抑制骨肉瘤细胞迁移的前药、药物、原料药或药物组合物中的应用。
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