CN113755493A - 一种抗骨关节炎的重组miR-140及其生产方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗骨关节炎的重组miR‑140,所述重组miR‑140的序列如SEQ ID NO:1所示,或者为与SEQ ID NO:1所示序列相似度达90%以上的序列。另外,本发明还公开了该重组miR‑140的生产方法及应用。本发明采用tRNA为支架,嵌合miR‑140序列,在大肠杆菌中表达重组miR‑140。本发明制备的重组miR‑140通过生物工程技术获得,具有良好的生物学活性,通过维持软骨细胞的合成代谢平衡抑制骨关节炎的发生,且具有设备便捷、生产快、产量高、成本低、功能性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及医学技术领域,具体涉及一种抗骨关节炎的重组miR-140及其生产方法和应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨的破坏和骨质增生为特点的最常见的慢性骨病,是导致老年人关节疼痛及功能障碍的主要原因之一。调查显示:OA的总体患病率为15%,40岁以上患病率为10%-17%,60岁以上患病率为50%,70岁以上患病率则高达80%,OA最终致残率达到53%,成为导致劳动力丧失的重要原因之一,也是老年人群中仅次于心血管疾病导致长期残疾的二号杀手。OA导致的疼痛和功能障碍将影响患者的生活质量并给家庭和社会带来极大的经济负担。目前临床对于OA的治疗标准仅限于疾病进程中的对症姑息治疗,因此研发有效的治疗OA方案具有重要的意义和社会价值。
MicroRNA(miRNA)是一类长度约为18-22个核苷酸小分子的非编码单链RNA,通过特定序列与mRNA结合负调控靶基因在转录后的表达,miRNA不仅参与调控关节软骨的发育,而且与OA的发生发展密切相关。其中,miR-140在软骨细胞中特异性高表达,转基因鼠过表达miR-140可部分纠正抗原诱导的骨关节炎,且OA患者关节液中miR-140表达降低并与OA的严重程度成反比。因此,miR-140是调解软骨内稳态的miRNA,也是早期诊断OA的分子靶点。
RNA类新药开发以及RNA的功能研究已经掣肘于RNA原料的获取。目前用于研究的RNA试剂,主要采用化学或体外转录合成。这些合成方法生产的RNA,不仅价格昂贵产率低,而且为提高稳定性可能带有较多的人工基因修饰,造成RNA折叠、生物活性及安全性受到影响。例如,人工修饰可能引起严重的免疫反应,化学合成的miR-34a模拟物的Ⅰ期临床实验已经被终止。目前,高昂成本及生产的RNA原料功能不确定性使得RNA疗法的发展严重受限。因此,RNA疗法的开展,还需新兴生物技术的介入,以大大降低研究/医疗成本。利用内源性重组tRNA支架在活细胞内生产表达小分子RNA已经应用于多个研究领域,取得了良好的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足,提供一种重组miR-140及其生产方法和应用。本发明的重组miR-140,可以通过提高OA模型软骨细胞中miR-140的表达,抑制蛋白聚糖酶及蛋白水解酶对蛋白聚糖及胶原的破坏,降低炎性因子的表达,维持合成代谢平衡,发挥软骨保护及OA治疗的作用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种抗骨关节炎的重组miR-140,其特征在于,所述重组miR-140的序列如SEQ ID NO:1所示,或者为与SEQ ID NO:1所示序列相似度达90%以上的序列。
另外,本发明还提供了一种上述重组miR-140的生产方法,其特征在于,包括将设计的重组miR-140序列嵌合于tRNA支架,在大肠杆菌中重组表达。
上述的生产方法,其特征在于,所述tRNA支架的序列为与人丝氨酸tRNA序列相似度达90%以上的序列,所述人丝氨酸tRNA序列如SEQ ID NO:2所示。
上述的生产方法,其特征在于,重组miR-140的前体序列为成熟序列部分被取代的hsa-miR-34a前体序列,所述重组miR-140的前体序列如SEQ ID NO:3所示。
上述的生产方法,其特征在于,所述生产方法的具体步骤包括:
步骤一、设计合成嵌合miR-140序列的hsa-miR-34a前体引物;
步骤二、利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点,将重组miR-140的前体序列插入pBSMrnaSeph质粒中,构建表达载体;
步骤三、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌;
步骤四、大肠杆菌培养扩增后,提取菌内总RNA,以FPLC分离纯化目标重组miR-140。
进一步地,本发明提供了一种上述重组miR-140在制备以下应用中所需得试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用:在骨关节炎的软骨细胞模型中评价miR-140通过对其靶基因mRNA水平及蛋白水平的调控,抑制蛋白聚糖酶及蛋白水解酶对蛋白聚糖及胶原的破坏,抑制炎症因子的生成,从而维持软骨细胞的合成代谢平衡,发挥软骨保护及抗骨关节炎作用。
更进一步地,本发明提供了一种上述重组miR-140在制备体内抗骨关节炎或具有软骨保护作用的试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明设计制备的重组miR-140,可以通过提高OA模型软骨细胞中miR-140的表达,抑制蛋白聚糖酶及蛋白水解酶对蛋白聚糖及胶原的破坏,降低炎性因子的表达,维持合成代谢平衡,发挥软骨保护及OA治疗的作用。
2、本发明利用tRNA支架表达的具有生物学活性的miR-140相比于化学合成的miR-140,设备便捷、生产快、产量高,价格低廉,功能性好、安全性高。
3、本发明以人丝氨酸tRNA嵌合has-miR-34a前体,人丝氨酸tRNA为人源tRNA,用其作为支架生产的重组小RNA的开发前景更好,因为人体细胞中本身含有丝氨酸tRNA,但无细菌来源的甲硫氨酰tRNA,因此用人丝氨酸tRNA为支架其毒性和免疫原性均可更低。
下面结合附图和实施例,对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是本发明实施例1利用引物对含有重组miR-140序列的插入片段进行PCR扩增的凝胶电泳图。
图2是本发明实施例1pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体双酶切鉴定的结果图。
图3是本发明实施例2利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组miR-140的表达。
图4是本发明实施例3利用Bio-Rad NGCTMChromatography System纯化重组miR-140,以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。
图5是本发明实施例4利用qPCR技术检测在小鼠原代软骨细胞中转染重组miR-140后的成熟体miR-140表达含量结果图(数值以“均值±标准差”表示,***P<0.005)。
图6是本发明实施例5利用qPCR技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后成熟体miR-140及其靶基因(ADAMTS5)、炎性因子IL-6、OA相关特征分子(MMP-13、Col2a1)表达含量结果图(数值以“均值±标准差”表示,*P<0.05,**P<0.01)。
图7是本发明实施例5利用WB技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后其靶基因(ADAMTS5)、炎性因子IL-6、OA相关特征分子(MMP-13、Col2a1)蛋白水平表达结果图。
图8是本发明实施例5利用免疫荧光实验技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后炎性因子IL-6、OA特征分子MMP-13的表达进行拍照结果图。
图9是本发明实施例5利用甲苯胺蓝染色技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后对OA治疗作用的结果图。
图10是本发明实施例5利用番红固绿和H&E染色技术检测半月板失稳术诱导的小鼠OA模型中原位注射重组miR-140后对软骨保护及OA治疗作用的结果图。
图11是本发明实施例5利用micro-CT三维重建技术检测半月板失稳术诱导的小鼠OA模型中膝关节原位注射重组miR-140,可抑制软骨下骨的骨丢失作用结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式,除非另外说明,本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。
实施例1:以pBSKrnaSeph/has-mir-34a载体构建重组miR-140表达质粒,表达重组miR-140。
(1)根据重组miR-140的有效序列(SEQ ID NO:1),以及pBSKrnaSeph/has-mir-34a表达载体上的序列设计引物,同时在引物的两端加上1-15nt载体插入位点两侧的同源序列。
表1重组miR-140引物
(2)插入片段的合成
以表1中的两条引物互为模板,利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA(SEQ ID NO:3)反密码子环处具有的酶切位点,将重组miR-140的前体序列插入pBSMrnaSeph质粒中,构建表达载体;反应体系如表2所示,反应过程如表3所示:
表2聚合酶体外扩增链反应体系(50μL)
表3聚合酶体外扩增链反应过程
图1是本实施例对重组miR-140的前体序列(SEQ ID NO:3)插入片段的引物PCR凝胶电泳图。图中M代表DL2000 DNA marker;1代表引物PCR后合成的插入片段。
(3)pBSKrnaSeph/has-mir-34a载体的双酶切
用Eag I-HFTM,Sac II限制性内切酶对载体进行37℃酶切,反应体系如表4所示。
表4 50μL双酶切体系
图2是本实施例对pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体进行双酶切鉴定的结果图。图中M代表DL2000 DNA marker;1代表双酶切后的pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a质粒;2代表pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a质粒。结果表明pBSKrnaSeph/hsa-mir-34a表达载体酶切成功。
(4)酶切质粒以及PCR片段的回收及纯化
将PCR产物和酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后,使用OMEGA公司的胶回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)进行回收纯化。在凝胶成像系统中用365nm的紫外光观察琼脂糖凝胶电泳后的DNA分离结果,用刀片小心切下带有目的DNA区带的凝胶,尽可能切下更少的胶,放入1.5mL的EP离心管中;称取凝胶的质量;按照1:1的体积比向装有琼脂糖凝胶的离心管中加入Binding Buffer结合缓冲液,并将混合物放于60℃-65℃水浴中7min,期间每隔两到三分钟振荡混合一次,直至凝胶完全融化;将融化后得到的溶液转移到DNAMini Column离心柱中,并将离心柱放入2mL的Collection Tube收集管中;10000rpm离心1min。每次离心的溶液体积最多为700μL,可将溶液分多次离心,直至全部离心完,并弃去收集管中的滤液,重复利用收集管;在离心柱中加入700μL的添加过无水乙醇的SPW WashBuffer。放于离心机中10000rpm,室温离心1min,重复此步骤一次;弃去滤液,将离心柱以13000rpm的转速室温下离心2min,以彻底除去纯化柱中的乙醇;将离心柱置于全新干净的离心管中。向离心柱中央悬空滴加30~100μL的Elution Buffer洗脱液,静置2min使DNA完全溶解在洗脱液中。放于离心机中以13000rpm的转速室温离心1min,回收管底的洗脱液。取少量洗脱液进行DNA凝胶电泳测定是否为目的产物,贮存于-20℃。
(5)插入片段与载体的连接
表5无缝连接反应体系(20μL)
混匀后,置于37℃孵育30min;转化大肠杆菌HST08感受态细菌;对克隆菌落进行氨苄青霉素抗性筛选。
(6)DNA测序鉴定重组miR-140表达载体
挑取单克隆菌落,于含有氨苄的LB培养基中培养约3h。取100μL菌液,送擎科生物科技有限公司,用测序引物M13Fow-GTAAAACGACGGCCAGT,Rev-CAGGAAACAGCTATGAC进行DNA测序鉴定。
实施例2:重组miR-140的表达
(1)200ng重组miR-140表达质粒转化HST08感受态细菌后,加入5mL LB培养基,在37℃,200rpm震荡培养过夜。菌液经10000g离心2min后,收集沉淀。于沉淀中加入180μL10mM醋酸镁-Tris·HCl溶液重悬,再加入200μL的饱和苯酚,室温振摇20~60min。10000g离心10min后收集水相,加入0.1倍水相体积的5M NaCl沉淀大分子杂质。上清液再加入2倍体积无水乙醇,10000g离心10min后,弃掉上清。吸水纸吸干残留乙醇,待RNA干燥后加入DEPC水溶解RNA,测定浓度,-80℃冰箱保存。
(2)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
将2μg RNA样品与2×RNA上样缓冲液混合,加入变性胶样品孔内。120~150V电泳40~60min后,放入含0.5μg/mL溴化乙锭的溶液中轻摇20~30min,于凝胶成像系统下观测,拍照保存。
图3是本实施例利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大肠杆菌中重组miR-140(SEQID NO:1)的表达。图中M表示RNA marker;1表示野生型HST08 E.coli总RNA;2表示重组miR-140表达质粒转化的HST08E.coli后的总RNA。与未转化重组miR-140表达质粒的细菌总RNA相比,转化后的细菌总RNA在150-300nt之间多了一条条带。结果表明,重组miR-140表达质粒在大肠杆菌中可以高表达重组miR-140。
实施例3:FPLC纯化重组miR-140
(1)采用Bio-Rad NGCTM Chromatography System,以离子交换柱(ENrichTMQ10×100Column)纯化重组miR-140。
流动相A:10mM NaH2PO4溶液,pH7.0。流动相B:10mM NaH2PO4溶液,1M NaCl溶液,pH7.0。
流速为2.0mL/min。以DEPC水,流动相A,流动相B分别交替冲洗色谱柱约1h。每次冲洗5柱体积。
运行以下程序对总RNA进行分离:0~8.9min(0%B),8.9~13.7min(55%B),13.7~53.7min(55~75%B),53.7~73.7min(75~85%B),73.7~83.7min(100%B),83.7~93.7min(0%B)。以260nm的吸光度检测RNA,并收集重组RNA所对应的峰。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度。
(2)RNA样品处理方法
总RNA提取步骤同上。所提取的总RNA于4℃13000rpm离心10min后,上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后,每次进样5~10mg。
(3)FPLC组分收集及浓缩去盐
以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。混合后的各组分用2倍体积无水乙醇沉淀RNA,-80℃冰箱放置约1h。以10000g转速于4℃离心10min收集RNA。将所得RNA沉淀用DEPC水溶解,用tra-2mL Centrifugal Filters 4℃7500g离心10min,去滤液,重复此步骤直至所有溶液离心完,再将Filters倒置,2000g离心2min,收集所得溶液,测定浓度后于-80℃保存。
图4是本实施例利用Bio-Rad NGCTM Chromatography System纯化重组miR-140(SEQ ID NO:1),以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所收集组分的纯度。结果表明,经FPLC纯化后,可得到高纯的重组miR-140(SEQ ID NO:1)。
实施例4:重组miR-140在细胞内的加工、成熟
(1)重组miR-140转染
将小鼠原代软骨细胞以1×106接种到6孔板中,待细胞贴壁展开后,更换培养基为含3%血清的DMEM,将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min,然后将孵育物加入到对应的6孔板中,重组miR-140终浓度为20nM,24h后完成转染。
(2)RNA提取
按照RNA提取说明书提取RNA,所得RNA后冻于-80℃冰箱保存。
(3)qPCR检测检测重组miR-140在细胞内的表达
利用反转录试剂盒对RNA进行反转录,反转录产物冻于-20℃,具体过程如下:
a:gDNA消化,在RNase-free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃2min。
表6 Stem loop qPCR gDNA消化反应体系
b:逆转录反应体系配制(20μL体系)
表7 Stem loop qPCR cDNA逆转录反应体系
取上述已反转录好的cDNA,稀释10倍,以U6为内参,利用stem loop qPCR方法检测细胞内重组miR-140的表达量,qPCR反应程序如下:95℃,2min;95℃,5s,60℃,30s,39个循环;95℃,5s;65℃,5s;95℃,50s。所使用的引物序列如下:
表8 Stem loop qPCR引物
图5是本实施例利用Stem loop qPCR技术检测重组miR-140在小鼠原代软骨细胞中的加工和成熟(数值以“均值±标准差”表示,两组间的显著性采用Students’t检验,***P<0.005vs NC)。与空白对照(Blank)相比,成熟miR-140表达显著升高,表明重组miR-140在软骨细胞中被加工为成熟的miR-140。
实施例5:重组miR-140对OA的治疗作用
选用IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞作为OA模型,进行重组miR-140转染,检测其治疗效果。
1、qPCR技术检测重组miR-140及其靶基因、OA相关特征分子、炎性因子的表达情况
(1)OA细胞模型构建及转染
将小鼠原代软骨细胞以1×106接种到6孔板中,待细胞贴壁展开后,更换培养基为含IL-1β10ng/mL的完全DMEM培养基,孵育24h后,更换培养基为含3%血清的DMEM培养基,并将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min,然后将孵育物加入到对应的6孔板中,重组miR-140终浓度为20nM,24h后完成转染。
(2)RNA提取
按照RNA提取说明书提取RNA,所得RNA后冻于-80℃冰箱保存。
(3)qPCR检测相关靶基因表达
利用反转录试剂盒对RNA进行反转录,反转录产物冻于-20℃,具体过程如下:
a:gDNA消化
在RNase-free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃消化反应2min。
表9 Real time qPCR gDNA消化反应体系
b:逆转录反应体系配制(20μL体系)
表10 Real time qPCR cDNA逆转录反应体系
取上述已反转录好的cDNA,稀释10倍,以GAPDH为内参,利用qPCR方法分别检测ADAMTS5、IL-6、Col2a1、MMP-13的表达量,qPCR反应程序如下:95℃,2min;95℃,5s,60℃,30s,39个循环;95℃,5s;65℃,5s;95℃50s。所使用的引物序列如下:
表11 miR-140qPCR引物
图6是本实例利用q-PCR技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后靶基因(ADAMTS5)、炎性因子IL-6、OA相关特征分子(MMP-13、Col2a1)表达量结果图(数值以“均值±标准差”表示,两组间的显著性采用Students’t检验,*P<0.05,**P<0.01vs Model)。与IL-1β刺激的模型组(Model)相比,实验组ADAMTS5、IL-6、MMP-13表达显著降低,Col2a1表达增加,表明重组miR-140在mRNA水平通过对靶基因调控,抑制蛋白聚糖酶及蛋白水解酶对蛋白聚糖及胶原的破坏,抑制炎症因子的生成,从而维持软骨细胞的合成代谢平衡,发挥抗骨关节炎作用。
2.WB检测重组miR-140的OA治疗作用
(1)OA细胞模型构建及转染
将小鼠原代软骨细胞以1×106接种到6孔板中,待细胞贴壁展开后,更换培养基为含IL-1β10ng/mL的完全DMEM培养基,孵育24h后,更换培养基为含3%血清的DMEM培养基,并将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min,然后将孵育物加入到对应的6孔板中,重组miR-140终浓度为20nM,24h后完成转染。
(2)蛋白提取
24h后,弃掉6孔板中的培养基,DPBS洗一遍,加入含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上裂解30min,用细胞刮将细胞刮下来加入到1.5mL EP管中,在日立离心机上离心(12000rpm,15min,4℃),将上清转移至新准备的EP管中,利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。将蛋白定量加入loading buffer煮沸10min后,在10%的分离胶的蛋白胶中每个泳道加入30μg蛋白进行电泳(70V,30min;120V,1.3h)、PVDF膜转膜(200mA,2h)。将膜转移到20%脱脂牛奶(TBST)中封闭1h,随后移除20%脱脂牛奶,按分子量进行裁膜,分别加入TBST稀释的一抗GAPDH(1:2000,Proteintech,10494-1-AP)、IL-6(1:1000,Abclonal,A0286)、MMP-13(1:1000,Abclonal,A16920)、Col2a1(1:1000,Abclonal,A1560)、ADAMTS5(1:250,Abcam,Ab41037),4℃摇床过夜,第二天回收一抗,TBST洗三遍,加入二抗(TBST稀释,1:1000,壮志)室温摇床孵育2h,TBST洗三遍,利用Tanon 4600SF成像仪进行扫膜。
图7是本实例利用WB技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后靶基因(ADAMTS5)、炎性因子IL-6、OA相关特征分子(MMP-13、Col2a1)蛋白表达量图。与IL-1β刺激的模型组(model)相比,实验组ADAMTS5、IL-6、MMP-13表达显著降低,Col2a1表达增加,表明在蛋白水平通过对靶基因调控,抑制蛋白聚糖酶及蛋白水解酶对蛋白聚糖及胶原的破坏,抑制炎症因子的生成,从而维持软骨细胞的合成代谢平衡,发挥抗骨关节炎作用。
3.免疫荧光(IF)实验评价重组miR-140的OA治疗作用
(1)OA细胞模型构建及转染
将小鼠原代软骨细胞以1×106接种到6孔板中,待细胞贴壁展开后,更换培养基为含IL-1β10ng/mL的完全DMEM培养基,孵育24h后,更换培养基为含3%血清的DMEM培养基,并将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min,然后将孵育物加入到对应的6孔板中,重组miR-140终浓度为20nM,24h后完成转染。
(2)免疫荧光染色
24h后,弃掉6孔板中的培养基,PBS洗2遍,加入4%多聚甲醛固定20min,PBS洗2遍,加入0.5%Triton-X100室温破膜10min,PBS洗2遍,加入3%BSA封闭30min,PBS洗2遍,加入MMP-13和IL-6的一抗稀释液室温摇床孵育2h,PBS洗3遍,加入FITC标记的二抗(1:500,CST)室温避光孵育1h,弃去二抗,PBS洗3遍,加入细胞核染料Heochst33342(1:1000)室温孵育5min,弃去染料,PBS洗3遍,利用激光共聚焦显微镜进行观察拍照。
图8是本实例利用免疫荧光染色技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后炎性因子IL-6和OA相关特征分子MMP-13的表达结果图。与IL-1β刺激的模型组(Model)相比,实验组IL-6和MMP-13表达显著降低,表明重组miR-140具有抑制炎症因子生成及蛋白聚糖酶活性的作用。
4.甲苯胺蓝染色实验评价重组miR-140的体外OA治疗作用
将小鼠原代软骨细胞以1×105接种到24孔板中,待细胞贴壁展开后,更换培养基为含IL-1β10ng/mL的完全DMEM培养基,孵育24h后,更换培养基为含3%血清的DMEM培养基,并将重组miR-140加入到一定量的空白DMEM培养基及转染试剂加入到一定量的空白DMEM培养基中混合孵育15min,然后将孵育物加入到对应的24孔板中,重组miR-140终浓度为20nM,24h后完成转染,PBS洗3遍,每孔加入1%甲苯胺蓝染色液(索莱宝)500μL,室温孵育30min,PBS洗5遍,加入4%多聚甲醛固定20min,PBS洗2遍后普通显微镜下明场拍摄。
图9是本实例利用甲苯胺蓝染色技术检测在IL-1β刺激24h后的小鼠原代软骨细胞OA模型中转染重组miR-140后对OA的治疗作用。与IL-1β刺激的模型组(Model)相比,实验组的蓝色明显加深,接近正常对照组(Control),表明重组miR-140具有抑制蛋白聚糖流失的作用。
5.重组miR-140对半月板失稳术诱导的OA小鼠的软骨保护及治疗作用
将6-8周大的C57BL/6小鼠右后肢行半月板失稳手术,手术两周后,隔日关节腔原位注射miR-140或MSA(20mg/Kg),完成7次给药后安乐处死小鼠,收集右后肢关节,4%多聚甲醛固定24h后,先进行micro-CT三维重建扫描,再将关节组织石蜡包埋,切片后,进行番红固绿和H&E染色。
图10是本实例利用番红固绿和H&E染色技术检测经过miR-140治疗后对OA小鼠软骨的保护作用。与造模后saline组相比,小鼠胫骨软骨部位的红色明显恢复,颜色接近正常对照组;通过对H&E染色结果统计分析软骨退化面积、软骨退化宽度、滑膜炎性评分,miR-140治疗组的上述三个指标明显低于saline组,表明miR-140治疗具有软骨保护及OA治疗作用。
图11是本实例利用micro-CT三维重建技术比较不同治疗组软骨下骨的骨力学参数,经miR-140治疗后小鼠的骨小梁厚度、骨小梁数量、骨体积比都具有明显的回升,接近正常对照组,说明miR-140具有抑制OA小鼠软骨下骨的骨丢失作用。
本发明以改良tRNA为支架,嵌合miR-140序列,在大肠杆菌中表达重组miR-140。生产的重组miR-140能够在小鼠原代细胞中加工成熟,同时维持OA中软骨细胞的合成代谢平衡,在体内发挥软骨保护作用,进一步治疗OA。其可以用于制备骨关节炎模型中调控miR-140水平及其靶基因表达的试剂、前药、药物、原料药或药物组合,或者用作骨关节炎模型中用来维持软骨细胞合成代谢平衡、保护软骨从而治疗OA的试剂、前药、药物、原料药或药物组合。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明做任何限制,凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化,均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西北工业大学
<120> 一种抗骨关节炎的重组miR-140及其生产方法和应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 190
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagcgaugg ccgagugguu aaggcguugg acuggccagc ugugaguguu ucuucagugg 60
uuuuacccua ugguagugug agcaauagua aggaacuacc auaggguaaa accacugaga 120
agugcugcac guuguuggcc caauccaaug gggucucccc gcgcagguuc gaacccugcu 180
cgcugcgcca 190
<210> 2
<211> 98
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcagcgaugg ccgagugguu aaggcguugg acunnnnnnn nnnnnnnnna auccaauggg 60
gucuccccgc gcagguucga acccugcucg cugcgcca 98
<210> 3
<211> 108
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggccagcugu gaguguuucu ucagugguuu uacccuaugg uagugugagc aauaguaagg 60
aacuaccaua ggguaaaacc acugagaagu gcugcacguu guuggccc 108
<210> 4
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgtaacgct gaattcggct acgtagctca gttggttaga gcagcggccg ggccagctgt 60
gagtgtttct tcagtggttt taccctatgg tagtgtgagc aatagtaagg aa 112
<210> 5
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctttcgctaa ggatctgcag tggtggctac gacgggattc gaacctgtga cccgcggggg 60
ccaacaacgt gcagcacttc tagagtggtt tgtacctatg gtagttcctt actattgc 118
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctctgactt caacagcgac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcctcttgtg ctcttgctgg 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcgtatcca gtgcagggtc cgag 24
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtattcgcac tggatacgac ctacct 26
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacgcacagt ggttttac 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccagtgcagg gtccgaggta 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctctgactt caacagcgac 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcctcttgtg ctcttgctgg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccaggataa aaccaggcag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cggccaaggg ttgtaaatgg 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggagcccacc aagaacgata g 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtgaagtagg gaaggccgtg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acaccgctaa cgtccagatg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcggtactcg atgacggtct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
taccatcctg cgactcttgc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttcacccaca tcaggcactc 20
Claims (7)
1.一种抗骨关节炎的重组miR-140,其特征在于,所述重组miR-140的序列如SEQ IDNO:1所示,或者为与SEQ ID NO:1所示序列相似度达90%以上的序列。
2.一种如权利要求1所述重组miR-140的生产方法,其特征在于,包括将设计的重组miR-140序列嵌合于tRNA支架,在大肠杆菌中重组表达。
3.根据权利要求2所述的生产方法,其特征在于,所述tRNA支架的序列为与人丝氨酸tRNA序列相似度达90%以上的序列,所述人丝氨酸tRNA序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求2所述的生产方法,其特征在于,重组miR-140的前体序列为成熟序列部分被取代的hsa-miR-34a前体序列,所述重组miR-140的前体序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求2至4中任一权利要求所述的生产方法,其特征在于,所述生产方法的具体步骤包括:
步骤一、设计合成嵌合miR-140序列的hsa-miR-34a前体引物;
步骤二、利用pBSMrnaSeph质粒在tRNA反密码子环处具有的酶切位点,将重组miR-140的前体序列插入pBSMrnaSeph质粒中,构建表达载体;
步骤三、将嵌合目标序列的表达载体转化感受态大肠杆菌;
步骤四、大肠杆菌培养扩增后,提取菌内总RNA,以FPLC分离纯化目标重组miR-140。
6.一种如权利要求1所述重组miR-140在制备以下应用中所需得试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用:在骨关节炎的软骨细胞模型中评价miR-140通过对其靶基因mRNA水平及蛋白水平的调控,抑制蛋白聚糖酶及蛋白水解酶对蛋白聚糖及胶原的破坏,抑制炎症因子的生成,从而维持软骨细胞的合成代谢平衡,发挥软骨保护及抗骨关节炎作用。
7.一种如权利要求1所述重组miR-140在制备体内抗骨关节炎或具有软骨保护作用的试剂、前药、药物、原料药或药物组合中的应用。
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