CN110241128B

CN110241128B - 一种含有cbd的融合基因、细胞系、液态ecm与应用

Info

Publication number: CN110241128B
Application number: CN201810186004.1A
Authority: CN
Inventors: 索广力; 张书忙; 乔勇; 肖同乾
Original assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS; University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: Suzhou Institute of Nano Tech and Nano Bionics of CAS; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2018-03-07
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2038-03-07
Also published as: CN110241128A

Abstract

本发明公开了一种含有CBD的融合基因、细胞系、液态ECM与应用。所述含有CBD的融合基因为CBD‑IDE融合基因或CBD‑NEP融合基因，所述CBD‑IDE和CBD‑NEP融合基因的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。含有前述CBD的融合基因的细胞系能够稳定表达且分泌生长因子IDE和NEP并结合在细胞外基质上。所述液态ECM由前述细胞系合成并分泌到胞外。本发明通过基因技术构建了携带有CBD的融合基因，进而使其所表达的IDE和NEP蛋白结合到ECM的胶原I上，达到在ECM上富集的目的，实现对阿尔兹海默症的治疗。

Description

一种含有CBD的融合基因、细胞系、液态ECM与应用

技术领域

本发明涉及一种液态ECM的制备方法，具体涉及一种含有CBD(Collagen BindingDomain，胶原结合域的简称，一段可以和胶原I结合的肽段)的融合基因、质粒、细胞系、液态ECM及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease，以下简称为AD)是老年人中最常见且最严重的系统退行性疾病之一。AD的病理特征主要是细胞内淀粉样前体蛋白错误剪切产生有毒性的淀粉样蛋白amyloid bata 42(简称Aβ42)并分泌到胞外沉积形成淀粉样蛋白斑块以及tau蛋白过度磷酸化而最终导致神经元之间相互黏连，阻碍神经传导，进而导致记忆丧失(Association A.Alzheimer's disease facts and figures.Alzheimers Dement.,2012,8(2):131-168.)。目前针对AD的发病机理所采用的治疗策略主要有三种：①消减Aβ,降解沉淀；②抑制tau过度磷酸化，防止神经元黏连；③两种治疗策略同步进行。治疗方法中可用于消减Aβ蛋白的酶主要有脑啡肽酶((Neprilysin，以下简称NEP)：一种可降解淀粉样蛋白的中性硫醇金属蛋白酶)和胰岛素降解酶((Insulin Degrading Enzyme，以下简称IDE)：一种可降解淀粉样蛋白的金属酶)(Dorfman V.B.,Pasquini L.,Riudavets M.,etal.Differential cerebral deposition of IDE and NEP in sporadic and familialAlzheimer's disease.Neurobiol.Aging,2010,31(10):1743-1757.)。

细胞外基质(Extracellular Matrix,以下简称ECM)，由细胞合成并分泌到胞外，分布在细胞表面或细胞之间的大分子物质。ECM由三类成分组成：结构蛋白,如胶原等；专一蛋白，如纤维蛋白等；蛋白聚糖。ECM是细胞赖以生存的外部环境，为细胞生长提供物理支持和适宜场所，通过信号转导调控细胞的生长、增殖和分化，并且可为组织的再生提供良好的微环境。近年来，ECM已广泛应用于组织工程的再生修复，并展现出了其良好的应用前景。其中不乏有大量的有关ECM制备方法与应用的研究(崔秉显，朴索拉，闵炳显；细胞衍生细胞外基质膜的制备方法：CN 101563450A；Xu Y.,Xu G.Y.,Tang C.,et al.Preparation andcharacterization of bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellularmatrix scaffolds.J.Biomed.Mater.Res.B,2015,103(3):670-678.)。ECM材料的来源主要有两大类：一种是有特定组织器官直接脱细胞制备而成；另一种则是由细胞衍生制备的ECM。大体流程为：首先体外培养细胞生产ECM，其次去细胞制备ECM，最后冻干保存ECM。

虽然细胞外基质的制备技术已经相当成熟了，但也存在一些不足和劣势。主要问题为：(1)目前所制备的ECM绝大多数为固态ECM，主要用于为组织工程提供支架材料，很少将ECM制备成液态ECM，作为药物或药物载体直接用于治疗疾病；(2)目前所制备的ECM主要通过外加生长因子来实现其特定功能；(3)作为分泌型的NEP和IDE很难在病理位置富集，无法发挥其生物学功能。

2012年Lin等人发明了一种制备液体ECM的方法(Lin H.,Yang G.,Tan J.,etal.Influence of decellularized matrix derived from human mesenchymal stemcells on their proliferation,migration and multi-lineage differentiationpotential.Biomaterials,2012,33(18):4480-4489.)，其主要操作为(1)细胞长满继续培养2周后，PBS清洗几遍，加0.5％Triton x-100进行脱细胞处理；(2)刮下细胞，加100unit/ml的脱氧核糖核酸酶I，室温1h除去DNA；(3)离心去除脱氧核糖核酸酶I，再用PBS清洗几遍，离心；(4)沉淀用含有2M尿素的150mM氯化钠水溶液，4℃孵育2天,离心收集上清，上清在PBS中透析过夜，所制备的为上层ECM；(5)将(4)中沉淀用含有为0.1％(质量与体积比)胃蛋白酶的0.01N盐酸溶液溶解，之后调节PH为中性，用PBS中透析过夜，制备的ECM为下层ECM。但是此方法的不足之处在于仅是单纯的制备ECM，并未加入任何生长因子，仅研究了ECM蛋白对干细胞增殖、迁移和分化等细胞行为的影响，并未将其作为一种载药物质，用于治疗特定的疾病。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种含有CBD的融合基因、细胞系、液态ECM与应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种含有CBD的融合基因，所述融合基因为CBD-IDE融合基因或CBD-NEP融合基因，其中，所述CBD-IDE融合基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述CBD-NEP融合基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明实施例还提供了一种携带有前述的含有CBD的融合基因的重组表达载体。

本发明实施例还提供了一种转化或转染有前述重组表达载体的宿主菌。

本发明实施例还提供了一种含有前述的CBD的融合基因或重组表达载体的细胞系，所述细胞系能够稳定表达且能够分泌生长因子IDE和NEP并结合在ECM上。

本发明实施例还提供了一种液态ECM，它是由前述的细胞系合成并分泌到胞外。

进一步地，所述液态ECM富集有所要表达的、带有CBD的IDE蛋白和带有CBD的NEP蛋白。

本发明实施例还提供了前述的液态ECM在消减淀粉样蛋白沉淀中的应用。

进一步地，本发明实施例还提供了前述的液态ECM在用于制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。

本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包括前述的液态ECM。

本发明实施例还提供了前述的液态ECM的制备方法，其包括：

(1)用引物通过聚合酶链式反应对APP、NEP基因和IDE基因的cDNA进行扩增，再根据引物所选用的酶切位点将扩增出来的基因和原始载体骨架同时进行酶切，之后回收酶切片段，并使酶切片段与载体酶切片段在DNA连接酶的作用下进行酶连反应，酶连反应结束后，酶连产物转化进入感受态细胞中并扩增质粒，之后进行PCR扩增，构建得到重组质粒或重组表达载体；

(2)通过病毒包装体系将重组质粒或重组表达载体整合到细胞基因组中，构建含有IDE和NEP生长因子的细胞以及过表达APP的AD细胞模型，使其稳定表达APP基因、NEP基因和IDE基因，并产生Aβ蛋白、NEP蛋白和IDE蛋白，获得稳转细胞系；

(3)对稳定表达NEP蛋白和IDE蛋白的细胞系进行培养，以提取液进行提取，获得液态ECM。

进一步地，所述引物的序列分别如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:12所示。

与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：

1)本发明通过基因技术构建了携带有胶原结合区域CBD的融合基因，进而使其所表达的IDE和NEP蛋白结合到ECM的胶原I上，达到在ECM上富集的目的，制得了一种富集脑啡肽酶和胰岛素降解酶的液体细胞外基质及其制备方法，融合了胶原结合区域的NEP和IDE可以和细胞外基质ECM中胶原I相结合，从而实现在ECM中的富集；

2)本发明制备的液态ECM无需另加生长因子IDE和NEP，CBD-IDE/NEP的稳转细胞本身就可以往外分泌生长因子IDE和NEP的融合蛋白，并可富集在ECM上。

3)本发明制备的液态ECM可作为药物，用于消减淀粉样蛋白沉淀，实现对阿尔兹海默症的治疗，本发明制备的液态ECM对淀粉样蛋白的消减效果较目前已有的方法高三倍以上。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案中重组质粒的构建流程示意图。

图2是本发明一典型实施方案中病毒包装流程示意图。

图3a-图3d分别是本发明一典型实施方案中所需稳定表达生长因子的稳转细胞系的QPCR验证结果示意图。

图3e-图3f分别是本发明一典型实施方案中所需稳定表达生长因子的稳转细胞系的WB验证结果示意图。

图4a-图4b分别是本发明一典型实施方案中所需AD稳转细胞系的QPCR验证结果示意图。

图4c-图4d分别是本发明一典型实施方案中所需AD稳转细胞系的WB验证结果示意图。

图4e-图4h分别是本发明一典型实施方案中所需AD稳转细胞系的ELISA验证结果示意图。

图5a-图5d分别是本发明一典型实施方案中液态ECM的标志蛋白的WB验证结果示意图。

图6a-图6b分别是本发明一典型实施方案中液态ECM中含有生长因子IDE和NEP蛋白的WB验证结果示意图。

图6c-图6d分别是本发明一典型实施方案中液态ECM中含有生长因子IDE和NEP蛋白的ELISA定量结果示意图。

图7a-图7d分别是本发明一典型实施方案中液态ECM消减淀粉样蛋白的ELISA结果示意图。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是提供一种富集脑啡肽酶和胰岛素降解酶的液体细胞外基质制备方法，用于载药治疗阿尔兹海默症的技术方法，其原理在于融合了胶原结合区域的NEP和IDE可以和细胞外基质ECM中胶原I相结合，从而实现在ECM中的富集，内容涉及液体细胞外基质制备方法的摸索优化及其在病理细胞模型中消减淀粉样沉淀的应用。

本发明实施例的一个方面提供的一种利用分子生物学技术构建的含有CBD的融合基因，所述融合基因为CBD-IDE融合基因或CBD-NEP融合基因，其中，所述CBD-IDE融合基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述CBD-NEP融合基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

本案发明人是在IDE和NEP的序列中加入胶原结合区域(CBD)和连接序列(liner)构建出CBD-IDE融合基因和CBD-NEP融合基因。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种构建的可以结合在ECM上的、携带有前述的含有CBD的融合基因的重组表达载体。

进一步地，所述重组表达载体包括重组质粒。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种转化或转染有前述重组表达载体的宿主菌。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种含有前述的CBD的融合基因或重组表达载体的细胞系，所述细胞系能够稳定表达且能够分泌生长因子IDE和NEP并结合在ECM上。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种可富集生长因子IDE和NEP的液态ECM，它是由前述的细胞系合成并分泌到胞外。

进一步地，所述液态ECM中IDE蛋白和NEP蛋白的总含量为5～20ng/mg。

进一步地，所述液态ECM主要包含胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维蛋白。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的液态ECM在消减淀粉样蛋白沉淀中的应用。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种药物组合物，其包括前述的液态ECM。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述的液态ECM的制备方法，其包括：

进一步地，所述载体骨架可以包括慢病毒载体、逆转录病毒载体，也可以是非病毒的载体，但不限于此。

进一步地，所述细胞选用间充质干细胞。

以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例提供的一种富集脑啡肽酶和胰岛素降解酶的液态细胞外基质ECM的制备方法主要技术流程可分为四个步骤：1、载体构建；2、细胞构建；3、制备ECM；4、ECM性能检测。

下面将对每个步骤进行详细描述：

1、载体构建

(1)选择合适的载体骨架。本发明选取的是慢病毒载体pLVX-IRES-Puro(以下表示为PLVX)和逆转录病毒载体pQCXIH(以下表示为PQH)作为所构重组载体的基本骨架。

(2)国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找到APP,NEP和IDE的编码序列(codingsequence,CDS)序列。

(3)利用Primer5引物设计软件设计APP、NEP和IDE所需要的引物，再交由公司合成引物，引物列表如表1所示。

表1：本发明构建载体所需引物列表

(4)进行一系列的生物分子实验操作构建重组质粒，原理参见图1。构建流程主要包括：①用引物通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)将APP、NEP和IDE基因的cDNA从正常细胞中扩增出来并回收。②据引物所选用的酶切位点将扩增出来的基因和原始载体同时进行酶切，之后回收酶切片段。③因酶切片段与载体酶切片段在DNA连接酶的作用下进行酶连反应。④酶连反应结束后，酶连产物转化进入感受态细胞中并涂板扩增质粒。⑤挑取单菌落进行菌落PCR，检测出成功连接APP、NEP和IDE基因的单菌落。⑥挑取含APP、NEP和IDE基因的菌落进行菌落扩大培养，之后提质粒测序，确定APP、NEP和IDE基因成功连接到了载体上并且没有突变后，载体构建完成。

2、细胞构建

(1)选择合适的细胞。本发明选择的是人包皮成纤维细胞(human foreskinfibroblast,HFF)。

(2)参见图2所示，通过病毒包装体系(如表2所示)将重组载体整合到细胞基因组中，构建PQH-HFF、PQH-IDE-HFF、PQH-NEP-HFF、PLVX-HFF、PLVX-CBD-IDE-HFF、PLVX-CBD-NEP等含有IDE和NEP生长因子的细胞以及PLVX-APP-HFF、PLVX-CHO、PLVX-APP-CHO等过表达APP的AD细胞模型，使其稳定表达APP、NEP和IDE基因，并产生Aβ、NEP和IDE蛋白。

表2：本发明选用的病毒包装体系

(3)病毒侵染细胞24h后，加入抗生素进行药筛3天以上，获得稳转细胞系。

(4)本发明中所需的稳定过表达APP、NEP和IDE基因的细胞系经过实时荧光定量核酸扩增反应(Real-time Quantitative PCR,QPCR)在中检测到其对应的信使RNA均过表达，及蛋白印记实验(Western Blot,WB)检测到APP、NEP和IDE蛋白也都过表达。其间用ELISA检测了AD细胞模型的淀粉样蛋白的分泌情况，所构AD细胞系的淀粉样蛋白均有高表达，结果可参见图3a-图3f和图4a-图4h所示。

3、制备ECM

(1)将稳定表达NEP和IDE蛋白的HFF细胞接种在10cm的培养皿中，在37℃无菌培养箱中培养，待细胞长满后加入含有50μM维生素C的完全培养基(DMEM+20％FBS+1％青霉素-链霉素)，培养三周，每3天换一液。

(2)培养完成后，吸去培养基废液，磷酸缓冲液(PBS)清洗3-5遍，加入3ml的0.5％Tritonx-100室温孵育5分钟，以除去细胞内溶物及细胞骨架。

(3)吸去0.5％Triton x-100，PBS清洗3-5遍，用蛋白刮子刮下ECM，加入100unit/ml的脱氧核糖核酸酶I，室温1h除去DNA。

(4)PBS清洗3-5遍，加1ml含有2M尿素的150mM氯化钠水溶液，4℃孵育24h,离心收集上清，沉淀用含有为0.1％(质量与体积比)胃蛋白酶的0.01N盐酸溶液溶解。

(5)提取出的ECM-尿素水溶液和沉淀-胃蛋白酶盐酸溶液置于磷酸缓冲液中且在4℃环境下透析过夜，最后收集的液体即为液态ECM。

(6)WB检测所制备的液态ECM的主要蛋白如胶原蛋白，层粘连蛋白，纤维蛋白等，发现尿素所提取的ECM含有大量的ECM标志蛋白，如图5a-图5d所示，而下层沉淀无ECM标志蛋白，这表明液态ECM存在于尿素提取液中，下层沉淀无ECM；以及检测到尿素所提取的液态ECM中含有所要表达的IDE和NEP蛋白，同时利用ELISA测定了液态ECM中IDE和NEP蛋白的含量，发现带有胶原结合区域CBD的IDE和NEP蛋白在ECM中含量明显高于不带胶原结合区域CBD的IDE和NEP蛋白，这说明胶原结合区域CBD有利于生长因子IDE和NEP富集在ECM上，如图6a-图6d所示。

4、ECM性能检测

AD细胞模型培养在6孔板中，待长满后更换新鲜培养基培养12h，之后加入含有生长因子的液态ECM，再培养12h，取上清检测Aβ含量。如图7a-图7d所示，经过ELISA检测AD细胞模型培养的上清发现含有生长因子的液态ECM大大消减了上清中淀粉样蛋白的含量，这说明所提取的液态ECM中IDE和NEP蛋白是具有消减淀粉样蛋白的生物学功能。

本发明发现携带CBD的生长因子IDE和NEP相对对照组和不带CBD的生长因子IDE和NEP在ECM中富集高出十倍以上。

藉由上述技术方案，本发明通过基因技术构建了携带有胶原结合区域CBD的IDE和NEP融合基因，进而使其所表达的IDE和NEP蛋白结合到ECM的胶原I上，达到在ECM上富集的目的。本发明制备的ECM无需另加生长因子IDE和NEP，CBD-IDE/NEP的稳转细胞本身就可以往外分泌生长因子IDE和NEP的融合蛋白，并可富集在ECM上。同时，本发明制备的液态ECM可作为药物，用于消减淀粉样蛋白沉淀，实现对阿尔兹海默症的治疗。本发明制备的液态ECM对淀粉样蛋白的消减效果较目前已有的方法高三倍以上。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本领域技术人员应当理解，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 上海大学

中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所

<120> 一种含有CBD的IDE和NEP融合基因、细胞系、液态ECM与应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3126

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atgaccaaga agaccctgag actgggagga ggtggcagcg gaggtggcgg atctggtgga 60

ggcggatcac ggtaccggct agcgtggctt ctgcaccccg cactgcccag caccttccgc 120

tcagtcctcg gcgcccgcct gccgcctccg gagcgcctgt gtggtttcca aaaaaagact 180

tacagcaaaa tgaataatcc agccatcaag agaataggaa atcacattac caagtctcct 240

gaagacaagc gagaatatcg agggctagag ctggccaatg gtatcaaagt acttcttatc 300

agtgatccca ccacggataa gtcatcagca gcacttgatg tgcacatagg ttcattgtcg 360

gatcctccaa atattgctgg cttaagtcat ttttgtgaac atatgctttt tttgggaaca 420

aagaaatacc ctaaagaaaa tgaatacagc cagtttctca gtgagcatgc aggaagttca 480

aatgccttta ctagtggaga gcataccaat tactattttg atgtttctca tgaacaccta 540

gaaggtgccc tagacaggtt tgcacagttt tttctgtgcc ccttgttcga tgaaagttgc 600

aaagacagag aggtgaatgc agttgattca gaacatgaga agaatgtgat gaatgatgcc 660

tggagactct ttcaattgga aaaagctaca gggaatccta aacacccctt cagtaaattt 720

gggacaggta acaaatatac tctggagact agaccaaacc aagaaggcat tgatgtaaga 780

caagagctac tgaaattcca ttctgcttac tattcatcca acttaatggc tgtttgtgtt 840

ttaggtcgag aatctttaga tgacttgact aatctggtgg taaagttatt ttctgaagta 900

gagaacaaaa atgttccatt gccagaattt cctgaacacc ctttccaaga agaacatctt 960

aaacaacttt acaaaatagt acccattaaa gatattagga atctctatgt gacatttccc 1020

atacctgacc ttcagaaata ctacaaatca aatcctggtc attatcttgg tcatctcatt 1080

gggcatgaag gtcctggaag tctgttatca gaacttaagt caaagggctg ggttaatact 1140

cttgttggtg ggcagaagga aggagcccga ggttttatgt tttttatcat taatgtggac 1200

ttgaccgagg aaggattatt acatgttgaa gatataattt tgcacatgtt tcaatacatt 1260

cagaagttac gtgcagaagg acctcaagaa tgggttttcc aagagtgcaa ggacttgaat 1320

gctgttgctt ttaggtttaa agacaaagag aggccacggg gctatacatc taagattgca 1380

ggaatattgc attattatcc cctagaagag gtgctcacag cggaatattt actggaagaa 1440

tttagacctg acttaataga gatggttctc gataaactca gaccagaaaa tgtccgggtt 1500

gccatagttt ctaaatcttt tgaaggaaaa actgatcgca cagaagagtg gtatggaacc 1560

cagtacaaac aagaagctat accggatgaa gtcatcaaga aatggcaaaa tgctgacctg 1620

aatgggaaat ttaaacttcc tacaaagaat gaatttattc ctacgaattt tgagatttta 1680

ccgttagaaa aagaggcgac accataccct gctcttatta aggatacagc tatgagcaaa 1740

ctttggttca aacaagatga taagtttttt ttgccgaagg cttgtctcaa ctttgaattt 1800

ttcagcccat ttgcttatgt ggaccccttg cactgtaaca tggcctattt gtaccttgag 1860

ctcctcaaag actcactcaa cgagtatgca tatgcagcag agctagcagg cttgagctat 1920

gatctccaaa ataccatcta tgggatgtat ctttcagtga aaggttacaa tgacaagcag 1980

ccaattttac taaagaagat tattgagaaa atggctacct ttgagattga tgaaaaaaga 2040

tttgaaatta tcaaagaagc atatatgcga tctcttaaca atttccgggc tgaacagcct 2100

caccagcatg ccatgtacta cctccgcttg ctgatgactg aagtggcctg gactaaagat 2160

gagttaaaag aagctctgga tgatgtaacc cttcctcgcc ttaaggcctt catacctcag 2220

ctcctgtcac ggctgcacat tgaagccctt ctccatggaa acataacaaa gcaggctgca 2280

ttaggaatta tgcagatggt tgaagacacc ctcattgaac atgctcatac caaacctctc 2340

cttccaagtc agctggttcg gtatagagaa gttcagctcc ctgacagagg atggtttgtt 2400

tatcagcaga gaaatgaagt tcacaataac tgtggcatcg agatatacta ccaaacagac 2460

atgcaaagca cctcagagaa tatgtttctg gagctcttct gtcagattat ctcggaacct 2520

tgcttcaaca ccctgcgcac caaggagcag ttgggctata tcgtcttcag cgggccacgt 2580

cgagctaatg gcatacaggg cttgagattc atcatccagt cagaaaagcc acctcactac 2640

ctagaaagca gagtggaagc tttcttaatt accatggaaa agtccataga ggacatgaca 2700

gaagaggcct tccaaaaaca cattcaggca ttagcaattc gtcgactaga caaaccaaag 2760

aagctatctg ctgagtgtgc taaatactgg ggagaaatca tctcccagca atataatttt 2820

gacagagata acactgaggt tgcatattta aagacactta ccaaggaaga tatcatcaaa 2880

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aatttgtcac aagcaccagc cttgccacaa cctgaagtga ttcagaacat gaccgaattc 3060

aagcgtggtc tgccactgtt tccccttgtg aaaccacata ttaacttcat ggctgcaaaa 3120

ctctga 3126

<210> 2

<211> 2319

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

atgaccaaga agaccctgag actgggagga ggtggcagcg gaggtggcgg atctggtgga 60

ggcggatcag gcaagtcaga aagtcagatg gatataactg atatcaacac tccaaagcca 120

aagaagaaac agcgatggac tccactggag atcagcctct cggtccttgt cctgctcctc 180

accatcatag ctgtgacaat gatcgcactc tatgcaacct acgatgatgg tatttgcaag 240

tcatcagact gcataaaatc agctgctcga ctgatccaaa acatggatgc caccactgag 300

ccttgtacag actttttcaa atatgcttgc ggaggctggt tgaaacgtaa tgtcattccc 360

gagaccagct cccgttacgg caactttgac attttaagag atgaactaga agtcgttttg 420

aaagatgtcc ttcaagaacc caaaactgaa gatatagtag cagtgcagaa agcaaaagca 480

ttgtacaggt cttgtataaa tgaatctgct attgatagca gaggtggaga acctctactc 540

aaactgttac cagacatata tgggtggcca gtagcaacag aaaactggga gcaaaaatat 600

ggtgcttctt ggacagctga aaaagctatt gcacaactga attctaaata tgggaaaaaa 660

gtccttatta atttgtttgt tggcactgat gataagaatt ctgtgaatca tgtaattcat 720

attgaccaac ctcgacttgg cctcccttct agagattact atgaatgcac tggaatctat 780

aaagaggctt gtacagcata tgtggatttt atgatttctg tggccagatt gattcgtcag 840

gaagaaagat tgcccatcga tgaaaaccag cttgctttgg aaatgaataa agttatggaa 900

ttggaaaaag aaattgccaa tgctacggct aaacctgaag atcgaaatga tccaatgctt 960

ctgtataaca agatgacatt ggcccagatc caaaataact tttcactaga gatcaatggg 1020

aagccattca gctggttgaa tttcacaaat gaaatcatgt caactgtgaa tattagtatt 1080

acaaatgagg aagatgtggt tgtttatgct ccagaatatt taaccaaact taagcccatt 1140

cttaccaaat attctgccag agatcttcaa aatttaatgt cctggagatt cataatggat 1200

cttgtaagca gcctcagccg aacctacaag gagtccagaa atgctttccg caaggccctt 1260

tatggtacaa cctcagaaac agcaacttgg agacgttgtg caaactatgt caatgggaat 1320

atggaaaatg ctgtggggag gctttatgtg gaagcagcat ttgctggaga gagtaaacat 1380

gtggtcgagg atttgattgc acagatccga gaagttttta ttcagacttt agatgacctc 1440

acttggatgg atgccgagac aaaaaagaga gctgaagaaa aggccttagc aattaaagaa 1500

aggatcggct atcctgatga cattgtttca aatgataaca aactgaataa tgagtacctc 1560

gagttgaact acaaagaaga tgaatacttc gagaacataa ttcaaaattt gaaattcagc 1620

caaagtaaac aactgaagaa gctccgagaa aaggtggaca aagatgagtg gataagtgga 1680

gcagctgtag tcaatgcatt ttactcttca ggaagaaatc agatagtctt cccagccggc 1740

attctgcagc cccccttctt tagtgcccag cagtccaact cattgaacta tgggggcatc 1800

ggcatggtca taggacacga aatcacccat ggcttcgatg acaatggcag aaactttaac 1860

aaagatggag acctcgttga ctggtggact caacagtctg caagtaactt taaggagcaa 1920

tcccagtgca tggtgtatca gtatggaaac ttttcctggg acctggcagg tggacagcac 1980

cttaatggaa ttaatacact gggagaaaac attgctgata atggaggtct tggtcaagca 2040

tacagagcct atcagaatta tattaaaaag aatggcgaag aaaaattact tcctggactt 2100

gacctaaatc acaaacaact atttttcttg aactttgcac aggtgtggtg tggaacctat 2160

aggccagagt atgcggttaa ctccattaaa acagatgtgc acagtccagg caatttcagg 2220

attattggga ctttgcagaa ctctgcagag ttttcagaag cctttcactg ccgcaagaat 2280

tcatacatga atccagaaaa gaagtgccgg gtttggtga 2319

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

ggactagtgc caccatgctg cccggtttgg cac 33

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

tgctctagac tagttctgca tctgctcaaa gaacttg 37

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

gcaccggtgc caccatgggc aagtcagaaa gtcagat 37

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

cgggatcctc accaaacccg gcactt 26

<210> 7

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

ggactagtgc caccatgacc aagaagaccc tgagactggg aggaggtggc agcggaggtg 60

gcggatctgg tggaggcgga tcaggcaagt cagaaagtca gat 103

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

cgggatcctc accaaacccg gcactt 26

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

gcaccggtgc caccatgcgg taccggctag cgt 33

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

ccttaattaa tcagagtttt gcagccatga agtta 35

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 11

ccgctcgagg ccaccatgac caagaagacc ctgagactgg gaggaggtgg cagcggaggt 60

ggcggatctg gtggaggcgg atcacggtac cggctagcgt 100

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 12

gctctagatc agagttttgc agccatgaag tta 33

Claims

1.一种含有CBD的融合基因，其特征在于，所述融合基因为CBD-IDE融合基因或CBD-NEP融合基因，其中，所述CBD-IDE融合基因的序列如SEQ ID NO:1所示，所述CBD-NEP融合基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.携带有权利要求1所述的含有CBD的融合基因的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的含有CBD的融合基因的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包括重组质粒。

4.转化或转染有权利要求2所述重组表达载体的宿主菌。

5.含有权利要求1所述的CBD的融合基因或权利要求2所述的重组表达载体的细胞系，所述细胞系能够稳定表达且能够分泌生长因子IDE和NEP并结合在ECM上。

6.一种液态ECM，其特征在于它是由权利要求5所述的细胞系合成并分泌到胞外。

7.根据权利要求6所述的液态ECM，其特征在于它富集有所要表达的、带有CBD的IDE蛋白和带有CBD的NEP蛋白。

8.根据权利要求6或7所述的液态ECM，其特征在于：所述液态ECM中IDE蛋白和NEP蛋白的总含量为5～20ng/mg。

9.根据权利要求6所述的液态ECM，其特征在于：所述液态ECM主要包含胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维蛋白。

10.权利要求6-9中任一项所述的液态ECM在消减淀粉样蛋白沉淀中的应用。

11.权利要求6-9中任一项所述的液态ECM在用于制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。

12.一种药物组合物，其特征在于包括权利要求6-9中任一项所述的液态ECM。

13.权利要求6-9中任一项所述的液态ECM的制备方法，其特征在于包括：

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：所述引物的序列分别如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:12所示。

15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：所述载体骨架包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒的载体。

16.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：所述细胞选用间充质干细胞。