CN101563450A - 细胞衍生细胞外基质膜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞衍生细胞外基质膜的制备方法，尤指，一种软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其方法包括下列步骤：借由在试管内培养衍生自动物软骨的高浓度软骨细胞来形成适当厚度的ECM膜，并在去细胞化处理后，予以干燥。本发明的细胞衍生ECM膜的组织工程支架是由软骨细胞分泌的细胞外基质所组成，使得该膜具有良好的生物相容性，尤其对软骨有免疫赦免作用。而且该膜也具有相当的压缩力，其可用来代替骨膜，用于软骨重建或人工胶原膜，也可作为大脑硬膜移植材料、用于修复损伤皮肤的自然ECM膜、用于细胞移植的材料、及生长因子递送工具。

Description

细胞衍生细胞外基质膜的制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞衍生细胞外基质(extracellular matrix，ECM)膜的制备方法，尤指一种软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其包括下列步骤：培养衍生自动物软骨的软骨细胞以形成软骨细胞/ECM膜、将软骨细胞从该膜移除、制造适当厚度的ECM膜、及将的干燥以杀菌。
背景技术
关节软骨细胞为特别的中胚层衍生细胞且只有软骨才有。软骨为一种没有血管的组织，其物理特性随着软骨细胞所产生的细胞外基质而异。一旦软骨遭到损坏，其自我重建能力将非常有限，且将最终导致骨关节炎，让病人生活品质受到很大的影响。
对于损坏的软骨，典型的治疗包含骨髓刺激以诱导骨髓衍生干细胞到受损部位(骨骼钻孔、微骨折、磨平成形术)及自体软骨细胞移植术(ACI)。虽然骨髓刺激法因侵入性程序最少且只需短时间使用关节内窥镜而受到普遍的使用，但骨髓衍生血液凝结(包含干细胞)却无法在手术期间受到良好的维持，使得所产生的软骨变成纤维软骨而非一般软骨。因此，很难期望骨髓刺激法能够获得成功的治愈效果。倘若使用本发明的ECM膜，则重建成为正常软骨的可能性将大为提高，因为衍生自骨髓的血液凝结可完全地受到维持。
虽然自体软骨细胞移植术(ACI)为一种临床肯定的细胞移植治疗法(Brittberg，M.等人，新英格兰医学期刊331：889，1994)，但却有一个问题：由于软骨损伤的部位应在收集骨膜后予以缝合，而骨膜有可能增生过度而造成手术后患部的疼痛。再者，在关节内窥镜手术时，若要在手术过程中进行两个隔离软骨细胞的步骤以将的长时间培养在试管内，再将细胞悬浮物移植到损坏部位，其手续将非常棘手。因此，为了解决上述问题，有必要改善外科手术技术及骨膜替代物。
本案发明人想到若使用结构复杂却组织完整且含多种天然蛋白质的ECM膜做为骨膜替代物，或将软骨细胞附着到ECM膜上以移植，则可成为重建透明软骨组织的成功治疗法。
传统上，同种或异种细胞ECM膜是由活体组织直接取得并作为膜型组织工程支架。相关范例如小肠粘膜下层(SIS)、膀胱粘膜下层(UBS)、人类羊膜(HAM)及的类。HAM对于角膜再生很有用，且SIS可用来作为再生泌尿道及大脑硬膜，及血管重建。此外，也有人提出使用第I、III型胶原双层膜来重建软骨的研究。
软骨细胞衍生ECM组织工程支架基本上包含糖胺聚糖(GAG)及胶原，其为软骨组织细胞外基质的主要成分，并包含软骨细胞新陈代谢重要的微量元素。ECM组织工程支架提供一种软骨细胞分化的天然环境，并可应用于组织工程领域作为一种高品质的组织工程支架。
近年来，韩国第10-2004-7017580号专利公开一种使用羊膜作为细胞培养的基质或基底膜，及制备细胞治疗剂的方法。该羊膜的主要成分为第I型胶原，也因此，其对于软骨细胞相较于ECM膜具有低生物相容性的缺点。此外，由于羊膜的生物分解无法被控制，其可能会在移植后长期保持在身体内。此外，要在捐赠者同意下收集到组织有所困难。
因此，本案发明人花很多心思才发展出一种可在试管内制备的膜型组织工程支架，其具有适当厚度及压缩力，且移植后无发炎反应，并具有良好的生物相容性，使其可应用于临床试验。因此，发明人借由在试管内高密度下单层培养软骨细胞以产生软骨细胞/ECM膜，再移除细胞并将的自然干燥，制备出一种具有适当厚度及压缩力的ECM膜组织工程支架，并发现当移植制备的ECM膜以用于骨髓刺激后血液凝结保护或骨膜替代物时，软骨细胞可以长时间进行分化，因而借以完成本发明。
发明内容
因此，本发明的主要目标为提供一种借由在试管内培养高密度细胞来制备用于组织工程的ECM膜的方法。
本发明另一目标为提供一种借由从ECM膜移除细胞来制备去细胞ECM膜的方法。
本发明另一目标为提供一种包含ECM膜的细胞治疗剂，其中该ECM膜具有软骨细胞、神经细胞、肌肉细胞、胰脏细胞、肝脏细胞、及干细胞种植于其上。
为了达成上述目标，本发明提供一种软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其方法包括下列步骤：(a)从动物衍生软骨中隔离出软骨细胞后，再培养他们；(b)从培养的软骨细胞中取得软骨细胞/ECM膜；及(c)借由从软骨细胞/ECM膜中移除细胞来取得ECM膜，并干燥该生成膜，及借由相同方法制备的ECM膜。
本发明也提供一种去细胞ECM膜的制备方法，该方法包括从ECM膜移除细胞的步骤，及借由相同方法制备的去细胞ECM膜。
本发明也提供一种去细胞ECM膜的制备方法，其方法包括下列步骤：(a)借由从动物衍生软骨中隔离出软骨细胞以培养来制成软骨细胞/ECM膜；(b)借由从制成的软骨细胞/ECM膜中移除软骨细胞来取得去细胞ECM膜结构；及(c)借由从去细胞ECM膜中移除细胞并干燥其生成膜来取得去细胞ECM膜，及借由相同方法制备的去细胞ECM膜。
本发明也提供一种ECM加强膜的制备方法，该方法包括借由多层堆叠来增加膜的厚度的步骤，其中该多层堆叠至少有一层膜是选自由该ECM膜与该去细胞ECM膜所组成的群组的步骤。
本发明也提供一种制备各种形状ECM膜的方法，该方法包括对至少一选自由该ECM膜与该去细胞ECM膜所组成的群组进行处理的步骤。
本发明也提供一种细胞附着ECM膜的制备方法，该方法包括：在选自由该ECM膜与该去细胞ECM膜所组成的群组的膜在细胞培养皿中予以干燥，再将细胞种植在该ECM膜或该去细胞ECM膜的表面上，及借由相同方法制备包含细胞种植ECM膜的细胞治疗剂。
本发明也提供一种生长因子附着ECM膜的制备方法，该方法包括将生长因子附着到至少一选自由该ECM膜与该去细胞ECM膜所组成的群组的膜的步骤。
本发明也提供一种用于生长因子的控制释放的ECM加强膜的制备方法，该方法包括多层堆叠借由上述方法制备的生长因子附着ECM膜的步骤。
本发明也提供一种用于生长因子的控制释放的药物递送载体，其包括：借由上述方法制备的生长因子附着ECM膜，及用于生长因子的控制释放的药物递送载体，其中该药物递送载体包括用于生长因子的控制释放的ECM加强膜。
本发明其他的特征及实施例将更清楚描述于下述实施方式与权利要求。
附图说明
图1为借由本发明制备的ECM膜的照片。
图2为本发明ECM膜表面(A，50x)的扫描式电子显微镜影像及其剖面图(B，1500x)。
图3为经过苏木精-伊红染色后的本发明ECM膜的组织影像(原始倍率，A：200x，B：400x)。
图4为本发明ECM膜与自然的猪软骨组织借由红外线光谱分析的二级化学结构比较结果。
图5为将兔子软骨细胞培养到本发明ECM膜(A)及一般培养皿(B)后，其细胞增殖力借由MTT测试的检视结果。
图6为将兔子软骨细胞培养到本发明ECM膜后7到14天，借由苏木精-伊红染色(A)及藏红染色(B)，其组织变化及蛋白多糖表现的检视结果。
图7为本发明ECM膜借由去细胞化处理将细胞移除后，其型态分析(A)、扫描式电子显微镜影像(B)、及组织分析(苏木精-伊红染色，C)的结果。
图8为针对本发明ECM膜在去细胞前后残留DNA的量，其DAPI染色(A)及定量分析(B)的结果。
图9为本发明ECM膜在去细胞前后，其样本中胶原含量(A)、蛋白多糖含量(B)、及总蛋白质含量(C)的检视结果。
图10为本发明ECM膜在去细胞前后，借由红外线光谱分析其样本二级化学结构的检视结果。
图11为本发明去细胞ECM膜在变为两层或三层以增加其厚度之后，其张力与延展度的测量结果。
具体实施方式
本发明的一个目标关于一种透过高密度培养用于组织工程的ECM膜的制备方法及借由相同方法制备的ECM膜。尤其，本发明关于一种软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其方法包括下列步骤：(a)从动物衍生软骨中隔离出软骨细胞后，再培养他们；(b)从培养的软骨细胞中取得软骨细胞/ECM膜；及(c)借由从软骨细胞/ECM膜中移除细胞来取得ECM膜，并干燥该生成膜，及借由相同方法制备的ECM膜。
在本发明中，上述方法可包括一额外的步骤(d)：借由将软骨细胞重新种植到所取得的ECM膜上，以重新培养来取得具有高压缩力的厚ECM膜。
在本发明的一个实施例中，借由控制软骨细胞的厚度，以软骨细胞制备具有压缩力适用于移植的ECM膜，该ECM膜为生物性相容、细胞性相容、及免疫性相容。该ECM膜不仅可以代替骨膜，用于软骨重建或人工胶原膜，归因于其可促进软骨细胞增殖并进行长时间的软骨细胞分化，也可以作为细胞移植的组织工程支架，更可作为治疗大脑硬膜损伤、皮肤损伤、及神经组织损坏的移植材料。
在本发明中，该动物可为猪或人类，且培养过程中可额外加入生物活性因子。
在本发明中，培养步骤中的培养液可以超音波或物理压力处理，且步骤(c)可借由在-15～-25℃的温度下，重复3～5次，将软骨细胞/ECM膜冷冻与解冻，以自然干燥或冷冻干燥，来进行干燥。
在本发明的一个ECM膜制备方法实施例中，从猪软骨分离出来的软骨细胞以高密度单层培养3～4周后，以4℃干燥该软骨细胞/ECM膜以制备包含软骨特定细胞外基质的ECM膜。
依据本发明实施例所制备的ECM膜的生物膜厚度为10～20μm，其主要的组成物为胶原及蛋白多糖，且其压缩力为25N/mm2，延展度为10％。
当软骨细胞依据本发明在ECM膜上培养，其细胞的增殖力会等同于在传统动物细胞培养皿上培养，且特别对于软骨细胞的蛋白质诸如蛋白多糖，有良好的表现。
在本发明中，培养软骨细胞的步骤可借由将其与至少一种选自由成肌细胞、肌肉细胞、心肌细胞、神经细胞、纤维母细胞、纤维细胞、成骨细胞、干细胞所组成的群组的细胞培养在一起来进行。
本发明另一目标关于一种去细胞ECM膜的制备方法，其方法包括：从ECM膜移除细胞的步骤，及借由相同方法制备的去细胞ECM膜。
在本发明中，该去细胞化可借由将ECM膜以至少一种选自由离子洗涤剂、非离子洗涤剂、变性剂、低渗透压溶液、去氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)、超音波所组成的群组的方式处理来进行，且该去细胞化可在0～50℃的温度范围内进行。
本发明另一目标关于一种去细胞ECM膜的制备方法，其方法包括下列步骤：(a)借由从动物衍生软骨中隔离出软骨细胞以培养来制成软骨细胞/ECM膜；(b)借由从制成的软骨细胞/ECM膜中移除软骨细胞来取得去细胞ECM膜结构；及(c)借由从去细胞ECM膜中移除细胞并干燥其生成膜来取得去细胞ECM膜，及借由相同方法制备的去细胞ECM膜。
在本发明中，步骤(b)可借由将软骨细胞/ECM膜以至少一种选自由离子洗涤剂、非离子洗涤剂、变性剂、低渗透压溶液、去氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)、超音波所组成的群组的方式处理来将软骨细胞移除，且该去细胞化可在0～50℃的温度范围内进行。
借由将本发明ECM膜或去细胞ECM膜多层堆叠，可制备一厚度较厚的ECM膜。因此，本发明另一目标关于一种ECM加强膜的制备方法，其方法包括：借由多层堆叠该ECM膜或该去细胞ECM膜来增加膜的厚度。
再者，当依据本发明处理该ECM膜或该去细胞ECM膜，将可得到各种形状的ECM膜。因此，本发明另一目标关于一种制备各种形状ECM膜的方法，其方法包括：对该ECM膜或该去细胞ECM膜进行处理。
同时，既然依据本发明该ECM膜或该去细胞膜在试管内具有高细胞增殖率且良好的细胞表型维持力，借由将欲进行处理的细胞附着到该膜的表面，可制备应用于临床试验的细胞治疗剂。因此，本发明另一目标关于一种细胞附着ECM膜的制备方法，其方法包括：将该ECM膜或该去细胞ECM膜予以在细胞培养皿中干燥，然后，将细胞种植到该ECM膜或该去细胞ECM膜的表面上，及关于一种细胞治疗剂，包含借由相同方法制备的细胞种植ECM膜。
在本发明中，该细胞选自由软骨细胞、皮肤细胞、神经细胞、肌肉细胞、胰脏细胞、肝脏细胞、及干细胞所组成的群组。
在本发明中，该细胞治疗剂可用来治疗或重建大脑硬膜、重建皮肤及软骨、对内部器官止血、及重建内部器官组织。
此外，借由将细胞增殖所需的生长因子附着到该ECM膜或该去细胞ECM膜上，该膜可用来作为生物体内的药物递送载体以释放生长因子。因此，本发明另一目标关于一种生长因子附着ECM膜的制备方法，其方法包括：将生长因子附着到该ECM膜或该去细胞ECM膜，及关于一种用于生长因子的控制释放的药物递送载体，其包括：具有生长因子附着于其上的ECM膜。
在本发明的一个目标中，附着于该ECM膜的生长因子包含类胰岛素生长因子(IGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形成蛋白(BMP)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素(EPO)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、颗粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)、肝素结合表皮生长因子(肝素结合EGF)及的类，但却不拘限于此。
在本发明一个实施例中，借由在ECM膜上施加物理压力以产生多层结构的方式来制作具有高压缩力的ECM加强膜。由于借由多层堆叠生长因子附着ECM膜的方式来制备该ECM加强膜，使得其可作为一逐渐释放生长因子的缓慢释放药物递送载体。因此，本发明另一目标关于一种用于生长因子的控制释放的ECM加强膜的制备方法，其方法包括：多层堆叠生长因子附着ECM膜，及用于生长因子的控制释放的药物递送载体，其中该药物递送载体包含借由上述方法用于生长因子的控制释放的ECM加强膜制备。
实施例
本发明将借由以下的实施例做更详细的说明。然而，熟悉此领域的人应该知道这些实施例只是用来描述说明之用，不是用来限制本发明。
更明确的说，以下的实施例描述依据本发明一种使用猪关节软骨来制备ECM膜的方法，然而，熟悉此领域的人应该知道也可以从其他动物软骨来制备ECM膜。
此外，以下的实施例依据本发明实施例示范一种ECM膜及去细胞ECM膜的制备方法，然而，熟悉此领域的人应该知道可借由将软骨细胞经由数次培养种植到本实施例软骨细胞/ECM膜上来制备具有高压缩力的厚ECM膜。
此外，熟悉此领域的人应该知道除了软骨，可使用其他足以产生细胞外基质的身体细胞，并依据本发明的方法来制备ECM膜。
实施例1：隔离猪软骨细胞
将未经霍乱、其他病毒、传染疾病感染的2周大的猪，配合动物保育法，以过度麻痹的方式予以处死。在无菌环境中，将软骨从后膝关节取出。再将所取出的软骨在干净的工作台面上切割成小块并以0.1％胶原酶处理12个小时。在以0.4μm的过滤器将细胞过滤后，借由离心机将软骨细胞予以隔离出来。
实施例2：制备软骨细胞衍生ECM膜
将实施例1中所隔离出来的软骨细胞在0.7×105细胞/平方厘米的浓度下种植到6孔培养皿上，再于培养基中(DMEM+20％ FBS+1％青霉素-链霉素+5μg/mL抗坏血酸)培养3周。该培养基每三天会更换一次。3周后，将该ECM薄膜以PBS冲洗三次并从6孔培养皿分离。所制备的ECM膜呈现一种半透明薄膜型式(图1)。
实施例3：分析ECM膜的物化特性
3-1：ECM膜的显微结构分析
借由扫描式电子显微镜(SEM)分析ECM膜的显微结构。将实施例2中所制备的ECM膜以2.5％戊醛处置1小时并以磷酸盐缓冲溶液冲洗。在将样本以乙醇脱水以干燥后，借由电子显微镜(JEOL，JSM-6380，20KV，日本)观察其表面与剖面图。结果，归因于看似细胞的结构体及其约10～20μm厚度的剖面，使得其观察到的表面呈现粗糙。
3-2：ECM膜的组织观察
将实施例2中所制备的ECM膜以4％福尔马林溶液处置24小时，再嵌入石蜡中并切块。其剖面再以苏木精-伊红(H&E)染色。观察结果发现到具有细胞核的细胞分布于结构体的中，其所显示应为ECM膜(图3)。
3-3：ECM膜的压缩力测量
借由万能试验机(H5K-T，HTE，Salfords，英国)来测量ECM膜的压缩力。将实施例2中所制备的ECM膜切割成一样大小的矩形(30×5mm)并垂直置放在50N的荷重元(load cell)上。再以10mm/min的冲头速度进行轴向拉出试验测量切割样本的张力。此外，在测量几个样本以取得一平均值后，将可计算其单位面积的压缩力，借以取得约25N/mm2的压缩力及10％的延展度。
3-4：ECM膜与软骨组织二级结构的比较
借由红外线光谱分析来比较实施例2中所制备的ECM膜与猪软骨组织的二级结构。再借由FT-IR分析仪(Bomem，MB104)以8cm-I解析度分析蛋白质主要成分的氨基化合物，结果发现制备的ECM膜与自然的猪软骨组织具有相似的二级化学结构(图4)。
实施例4：以ECM膜培养软骨细胞
使用如实施例1中所述的方法，将软骨细胞从纽西兰白色兔子(约3～4公斤)的软骨组织中隔离出来。再将隔离出来的兔子软骨细胞在1×105细胞/30平方毫米的浓度下种植到实施例2中所制备的ECM膜上，并检测细胞增殖力、组织变化、及蛋白多糖表现。
4-1：检测细胞增殖力随着时间的变化
兔子软骨细胞分别以动物细胞专用的传统培养皿(控制组，6孔培养皿，BDfalcon，美国)及ECM膜培养，并借由MTT测试(Roche，德国)检测其培养后第1、2、4、6、8、12、14天的细胞增殖力。结果发现ECM膜与一般培养皿上的细胞在第5～6天达到一个高点，且两组的OD值也都近似于0.4(图5)。从结果得知，ECM膜可提供类似于传统培养皿的软骨细胞增殖环境。
4-2：检测组织变化及蛋白多糖表现
在将软骨细胞如上所述培养到ECM膜上后，在第7、14天将细胞收集，并以相同于实施例3-2的方法将组织作切割。再将剖面以苏木精-伊红染色，结果发现厚细胞层随着时间形成于ECM膜的表面上(图6A)。此外，特别用于蛋白多糖的藏红O染色法显示蛋白多糖明显遍布于样本上(图6B)。
实施例5：去细胞ECM膜的制备及其特性分析
5-1：ECM膜的去细胞化
为了移除ECM膜中的软骨细胞并取得纯的ECM膜，如下所述进行一去细胞化过程。将实施例2中所制备的ECM膜放到0.1％SDS溶液中，并以150rpm，37℃下震荡24小时。接下来，将该膜以下列步骤处理：置于超音波清洗机内1分钟、置于0.05％胰蛋白酵素EDTA溶液内30分钟、置于超音波清洗机内1分钟、置于0.07mg/mL去氧核糖核酸酶(DNase)溶液内24小时、及置于超音波清洗机内1分钟。之后，该膜以PBS冲洗至少五次。将去细胞化过程处理的ECM膜在烘罩下烘干12小时并将的储存于电子干燥器中。
5-2：去细胞ECM膜的型态与组织分析
虽然该去细胞ECM膜相较于去细胞化之前的ECM膜变薄了(1/3)，两者之间的型态、颜色、触感却无显着的差异(图7A)。如同实施例3-1的方法，利用扫描式电子显微镜分析表面的显微结构后，发现去细胞化之前的样本(图2A)中的白色细胞体，并未如同去细胞膜般呈现一个光滑的形状(图7B)。此外，利用如同实施例3-2所述的H&E染色法来观察组织后，发现在去细胞化之前的样本中所出现密而小的细胞核体，在此并未出现(图7C)。
5-3：去细胞ECM膜的DNA含量分析
使用如同实施例3-2的方法，将去细胞化之前的ECM膜及去细胞化之后的ECM膜的剖面以200ng/ml的DAPI[4，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸]溶液染色，再以荧光显微镜观察。结果发现在去细胞化之前的样本中，细胞核体内的DNA含量可清楚看见，但去细胞化之后(图8A)的样本中，却未曾检测到任何荧光标示的DNA含量。DNA从去细胞ECM膜中移除的现象也出现于使用Hoechst332582染色材料对DNA含量的定量分析结果(图8B)。
5-4：去细胞ECM膜的成分分析
分别利用去细胞化前后的ECM膜样本比较与分析软骨组织中主要ECM成分的胶原及蛋白多糖含量与总蛋白质含量。结果发现去细胞ECM膜中每单位重量的胶原及蛋白多糖含量明显减少，但其总蛋白质含量相较于去细胞化之前的ECM膜却没有差异(图9)。
胶原含量以下列方式测量。将干燥后的ECM膜样本放在1mL的1N次胆酸(choleric acid)溶液中，并在60℃下置放24小时，再借由在2N氢氧化钠溶液(NaOH)120℃下高压消毒处理20分钟来水解。在将450μL的氯胺T试剂加入到样本并在室温下置放25分钟后，加入500μL的Endlich试剂以产生颜色并在60℃下置放20分钟，再测量其于550nm波长的吸收率。利用羟基脯氨酸标准曲线来计算胶原的最后浓度。
蛋白多糖含量以下列方式测量。将干燥后的ECM膜溶解于1mL的木瓜蛋白酵素溶液中，并在60℃下置放24小时，再以10,000rpm离心3分钟以分离作为样本的悬浮物。将50μL的悬浮物分配到96孔培养皿中的每一个孔中。将200μL的DMB有色定型溶液(借由将16mg的DMB、5mL的95％乙醇、3mL的甲酸、及25.6mL的1M氢氧化钠加入到1L的超纯水中来取得；pH 3.5)加入到每一个孔中以允许其在室温下反应30分钟，借以测量其于530nm波长的吸收率。借由利用硫酸软骨素C所形成的标准曲线来产生样本浓度。
样本的总蛋白质含量以下列方式测量。使用相同于蛋白多糖含量的测量方法，将从木瓜蛋白酵素溶液蒸馏洗提的ECM膜分别以1/10、1/20、及1/40的比例稀释，再将20μL的各个稀释液分配到96孔培养皿中的每一个孔中。然后，将BCA反应溶液(Pierce，美国)加入到每一个孔中以允许其在室温下反应30分钟，借以测量其于562nm波长的吸收率。借由利用牛血清蛋白(BSA，2mg/mL)所形成的标准曲线来产生最后浓度。
5-5：去细胞ECM膜的二级结构分析
利用相同于实施例3-4的方法，借由FT-IR分析仪来分析去细胞化前后的ECM膜二级结构。结果发现两组样本的整体吸收率相近(去细胞化之前与之后)。氨基化合物分析也发现两组具有相似的结构(图10)。
实施例6：重叠ECM加强膜的制备
利用相同于实施例5的方法，借由压缩方法将两层或三层去细胞ECM膜堆叠在一起以制备具有强化厚度与张力的ECM膜。该多层加强ECM膜具有相似的形状(与去细胞化之前的膜并无太大的差异)，且其厚度分别为3.3μm(1层)、6.6μm(2层)、及10μm(3层)。在此3层样本中，其显示与去细胞化之前的ECM膜具有相近的厚度。
借由相同于实施例3-3的方法来测量该膜的压缩力及延展度。结果发现去细胞ECM膜的压缩力相较于去细胞化之前的ECM膜变小了，但其单位面积的压缩力却没有明显的差异(图11)。此外，当去细胞ECM膜多层堆叠后(2层及3层)，总压缩力及单位面积的压缩力都增加了。在此具有相近于去细胞化之前的样本厚度的3层样本中，大约显示3.5皱折压缩力。其延展度也在去细胞化之后稍微减小，但借由多层堆叠其延展度却增加。
产业利用性
如上所述，本发明提供一种借由软骨细胞分泌包含细胞外基质的膜型组织工程支架的制备方法及借由相同方法制备的细胞衍生ECM膜。本发明的细胞衍生ECM膜组织工程支架是由软骨细胞分泌的细胞外基质所组成，使得该膜具有良好的生物相容性，尤其对软骨有免疫赦免作用。既然该膜也具有相当的压缩力适当用于移植，其可用来代替骨膜，用于软骨重建或人工胶原膜，也可作为大脑硬膜移植材料、用于修复损伤皮肤的自然ECM膜、用于细胞移植的材料、及生长因子递送工具。
虽然本发明已透过上述实施方式详细叙述，但是本领域技术人员在不脱离本发明权利要求的前提下，可以进行各种修改。

Claims (26)

1.一种软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其方法包括下列步骤：
(a)从动物衍生软骨中隔离出软骨细胞后，再进行培养；
(b)从培养的软骨细胞中取得软骨细胞/ECM膜；及
(c)借由从软骨细胞/ECM膜中移除细胞来取得ECM膜，并干燥该生成膜。
2.如权利要求1所述的软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，更进一步包括一步骤(d)借由将软骨细胞重新种植到所取得的ECM膜上，以重新培养来取得具有高压缩力的厚ECM膜。
3.如权利要求1所述的软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其中该动物为猪。
4.如权利要求1所述的软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其中该动物为人类。
5.如权利要求1或2所述的软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其中在该培养步骤中，额外加入生物活性因子。
6.如权利要求5所述的软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其中至少一个该生物活性因子选自由类胰岛素生长因子(IGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形成蛋白(BMP)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素(EPO)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、颗粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)、肝素结合表皮生长因子(肝素结合EGF)、干扰素、组织活化缩氨酸、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)、及白介素8(IL-8)所组成的群组。
7.如权利要求1或2所述的软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其中该培养步骤中，以超音波或物理压力处理其培养液。
8.如权利要求1所述的软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其中步骤(c)借由在-15～-25℃的温度下，重复3～5次，将软骨细胞/ECM膜冷冻与解冻，以自然干燥或冷冻干燥，来进行干燥。
9.如权利要求1或2所述的软骨细胞衍生ECM膜的制备方法，其中该培养软骨细胞的步骤是借由将其与至少一种选自由成肌细胞、肌肉细胞、心肌细胞、神经细胞、纤维母细胞、纤维细胞、成骨细胞、干细胞所组成的群组的细胞培养在一起来进行。
10.一种ECM膜，借由如权利要求1或2所述的方法制备。
11.一种去细胞ECM膜的制备方法，其包括从如权利要求10所述的ECM膜移除细胞的步骤。
12.如权利要求11所述的去细胞ECM膜的制备方法，其中该去细胞化是借由将ECM膜以至少一种选自由离子洗涤剂、非离子洗涤剂、变性剂、低渗透压溶液、去氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)、超音波所组成的群组的方式处理来进行。
13.一种去细胞ECM膜，借由如权利要求11所述的方法制备。
14.一种去细胞ECM膜的制备方法，其方法包括下列步骤：
(a)借由从动物衍生软骨中隔离出软骨细胞以培养来制成软骨细胞/ECM膜；
(b)借由从制成的软骨细胞/ECM膜中移除软骨细胞来取得去细胞ECM膜结构；及
(c)借由从去细胞ECM膜中移除细胞并干燥其生成膜来取得去细胞ECM膜。
15.如权利要求14所述的去细胞ECM膜的制备方法，其中步骤(b)借由将软骨细胞/ECM膜以至少一种选自由离子洗涤剂、非离子洗涤剂、变性剂、低渗透压溶液、去氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶(RNase)、超音波所组成的群组的方式处理来将软骨细胞移除。
16.一种去细胞ECM膜，借由如权利要求14所述的方法制备。
17.一种ECM加强膜的制备方法，其包括借由多层堆叠来增加膜的厚度的步骤，其中该多层堆叠至少有一层膜是选自由如权利要求10所述的ECM膜与如权利要求13、16所述的去细胞ECM膜所组成的群组。
18.一种制备各种形状ECM膜的方法，其包括对至少一选自由如权利要求10所述的ECM膜与如权利要求13、16所述的去细胞ECM膜所组成的群组进行处理的步骤。
19.一种细胞附着ECM膜的制备方法，其方法包括下列步骤(a)将至少一选自由如权利要求10所述的ECM膜与如权利要求13、16所述的去细胞ECM膜所组成的群组的膜在细胞培养皿中予以干燥，(b)将细胞种植在该ECM膜或该去细胞ECM膜的表面上。
20.如权利要求19所述的方法，其中该细胞是选自由软骨细胞、皮肤细胞、神经细胞、肌肉细胞、胰脏细胞、肝脏细胞、干细胞所组成的群组。
21.一种包含细胞种植ECM膜的细胞治疗剂，借由如权利要求19所述的方法制备。
22.如权利要求19所述的细胞治疗剂，其中该细胞治疗剂是用来治疗或重建大脑硬膜、重建皮肤及软骨、对内部器官止血、重建内部器官组织。
23.一种生长因子附着ECM膜的制备方法，其包括将生长因子附着到至少一种选自由如权利要求10所述的ECM膜与如权利要求13、16所述的去细胞ECM膜所组成的群组的膜的步骤。
24.一种用于生长因子的控制释放的ECM加强膜的制备方法，其包括多层堆叠借由如权利要求23所述的方法所制备的生长因子附着ECM膜的步骤。
25.一种用于生长因子的控制释放的药物递送载体，其包含借由如权利要求23所述的方法所制备的生长因子附着ECM膜。
26.一种用于生长因子的控制释放的药物递送载体，其包含如权利要求24所述用于生长因子的控制释放的ECM加强膜。
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