KR101555296B1

KR101555296B1 - 연골세포 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하는 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101555296B1
Application number: KR1020130153014A
Authority: KR
Inventors: 양재욱; 김채은; 이지현
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2015-09-23
Also published as: KR20150067519A; WO2015088096A1

Abstract

본 발명은 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular matrix; CDECM)을 유효성분으로 함유하여 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular matrix; CDECM)이 건조안 환자의 눈물생성량을 증가시키고 각막 표면의 불규칙성과 손실된 결막 배상세포를 회복시키며 각막 상피세포의 박리를 억제함으로써 건성안 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 약학조성물을 제공한다.

Description

연골세포 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하는 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating of dry eye comprising chondrocyte derived extracellular matrix}

본 발명은 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular matrix; CDECM)을 함유하여 건성안의 예방 또는 치료에 제공되는 약학조성물에 관한 것이다.

건성안은 나이가 들어감에 따라 발병률이 증가 되는 질환으로 40세 인구의 6% 가 건성안 질환을 나타내고 있으며, 나이 증가에 따라 발병률이 15%로 증가하여 65세 이상에서는 25%까지 건성안이 나타나는 것으로 보고되어졌다.

건성안은 눈물이 부족하거나 눈물이 지나치게 증발하여 눈물 구성성분의 균형이 맞지 않아 안구 표면이 손상되고 이물감, 건조감과 같은 눈의 자극 및 시력저하와 같은 증상을 수반하는 질환이다. 이러한 건성안은 기능적 시력을 감소시키고 운전, 독서 및 텔레비전 시청 등과 같은 일상적인 작업 수행에 어려움을 주어 삶에 질에 영향을 미친다.

건성안의 경우 대부분, 눈물 막을 보완하는 층인 유층, 수층 또는 점막층 중 하나에 이상이 생겨 각막/결막 장애가 야기된다. 그 중에서도 점막층의 이상은 심각한 각막 장애의 원인이 되는데 건성안은 각막 상피 세포의 플루오레세인 투과성, 결막 변형 및 배상세포의 손실을 증가시켜 각막 표면의 상피세포에 병리학적인 변화를 일으킴으로써 각막 상피 장애 또는 각막 상피 진무름 뿐만 아니라 각막 궤양 및 안감염까지 일으킬 수 있으며 일부의 경우 각막 이식이 필요하게 되기도 한다.

현재 가장 많이 사용되는 건성안 치료법은 뮤신의 치환제로서 메틸셀룰로오스, 황산 콘드로이친 및 히알루론산과 같은 점탄성 화합물 함유하는 인공 눈물의 국소 처방이 있으나, 상기 화합물은 물리학적 및 생리학적으로 뮤신과 상이하기 때문에 치료의 효능이 제한적이다.

한국 등록특허 제10-1037095호 공보

상기 문제점을 해결하고자, 본 발명은 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular matrix; CDECM)을 포함하는 약학조성물을 이용하여 안구의 눈물량 감소, 각막 표면의 불규칙성 및 결막 배상세포 손실과 같은 각막 상피세포의 병리학적인 변화를 억제 또는 개선하여 건성안을 예방 또는 치료하는 약학조성물을 제공하고자 한다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 연골세포 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하는 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질은 동물의 무릎관절 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질일 수 있다,

상기 연골세포 유래 세포외 기질은 건성안의 눈물 생성, 각막 표면의 매끄러움 및 결막 배상세포의 밀도를 증가시킬 수 있다.

또한 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 건성안의 각막 상피세포의 박리를 억제할 수 있다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유될 수 있다.

상기 약학조성물은 상기 연골세포 유래 세포외 기질을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 점안제 형태의 안약이나 주사제, 또는 젤 형태의 안연고나 주사제로서 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular matrix; CDECM)을 함유하는 약학조성물은 건조 스트레스로 유도된 건성안의 눈물생성, 각막 표면의 매끄러움 및 결막 배상세포 증가와 각막 상피세포의 박리를 억제함으로써 건조안을 예방 또는 치료하는 약학조성물로 사용할 수 있다.

도 1은 CDECM의 눈물 생성 증가 효과를 나타낸 그래프로 NOD.B10.H2 ^b 생쥐 동물 모델에 건조 스트레스(DS) 제거 후 각각 PBS와 CDECM 처리한 그룹의 눈물량을 3일, 5일, 7일 및 10일 마다 측정한 그래프로 A는 건조 스트레스 후 PBS 처리 그룹의 눈물량을 나타낸 그래프이며 B는 건조 스트레스 후 CDECM 처리 그룹의 눈물량을 나타낸 그래프이다. 0과 비교하여 P < 0.05 이다.
도 2는 CDECM의 각막 표면의 불규칙성 변화 효과를 확인한 결과로 NOD.B10.H2 ^b 생쥐 동물 모델에 건조 스트레스(DS) 제거 후 각각 PBS 처리 그룹(A 및 B)과 CDECM 처리한 그룹(C 및 D)의 각막 매끄러움 등급을 3일, 5일, 7일 및 10일 마다 측정한 결과이다. 0과 비교하여 P < 0.05 이다.
도 3은 결막 배상세포의 밀도확인을 위한 과요오드산 시프 시약(periodic acid-Schiff reagent; PAS) 염색 결과로 A는 NOD.B10.H2 ^b 생쥐의 건조 스트레스 전 정상 결막을 염색한 결과이며 B는 건조 스트레스(DS) 제거 후 결막 염색 결과이다. 또한 C는 PBS 처리 그룹의 10일 후 결막을 염색한 결과이며 D는 CDECM 처리한 그룹의 10일 후 결막 염색 결과이다. 상기 결과는 가상 현미경을 이용하여 ×200배 하였으며 화살표 부분은 결막 배상세포를 나타낸다.
도 4는 NOD.B10.H2 ^b 생쥐 동물모델의 각막을 염색하여 CDECM의 각막 상피세포 박리효과를 확인하기 위한 결과로 A는 건조 스트레스 전 정상각막(C), 건조 스트레스 제거 후(DS), PBS 처리 그룹(PBS) 및 CDECM 처리한 그룹(CDECM)을 헤모톡실린 & 에오신(H&E)염색결과이며 B는 과요오드산 시프 시약(periodic acid-Schiff reagent; PAS)염색 결과이다. 상기 결과는 가상 현미경을 이용하여 ×400배 하였으며 화살표 부분은 박리된 각막 상피세포를 나타낸다.

본 발명은 연골세포 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하는 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질은 동물의 무릎 관절 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질일 수 있다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질은 건성안의 눈물 생성, 각막 표면의 매끄러움 및 결막 배상세포의 밀도를 증가시키고 건성안의 각막 상피세포의 박리를 억제하여 건성안을 예방 또는 치료할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular matrix; CDECM)을 건조 스트레스에 의하여 유도된 동물 모델의 건성안에 건조 스트레스 제거 후 하루 5번씩 10일간 투여한 결과, 도 1과 같이 CDECM 처리한 그룹이 PBS 처리 그룹보다 눈물 생성량이 증가되었으며 건조 스트레스 전 과 같은 수준으로 회복된 것을 확인할 수 있다.

또한 건성안 각막 표면의 매끄러움을 등급화한 도 2 결과, 도 2A 및 도 2B와 같이 CDECM 처리 그룹의 각막 매끄러움이 10일 후 건조 스트레스 전의 각막 매끄러움과 유사하게 개선된 반면, 도 2C 및 도 2D의 PBS 처리 그룹은 여전히 불규칙한 각막 표면을 나타내었다.

CDECM의 결막 배상세포 손실 회복 효과를 확인하기 위하여 진행한 과요오드산 시프 시약(periodic acid-Schiff reagent; PAS)염색결과 도 3과 같이 CDECM 처리 그룹의 10일 후 배상세포가 건조 스트레스 전과 유사한 수준으로 회복되었으며 각막 상피세포의 박리억제 효과를 확인하기 위하여 진행한 헤모톡실린 & 에오신(H&E)과 과요오드산 시프 시약(periodic acid-Schiff reagent; PAS)조직 염색결과에서도 도 4와 같이 건조 스트레스 후와 PBS 처리 그룹보다 CDECM 처리 그룹의 박리 억제효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유될 수 있으며 상기 약학조성물은 상기 연골세포 유래 세포외 기질을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 점안제 형태의 안약이나 주사제, 또는 젤 형태의 안연고나 주사제로서 제공될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 CDECM을 유효성분으로 함유하는 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 점안제, 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, CDECM을 유효성분으로 함유하는 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 CDECM의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기의 참조예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 적용되는 참조예를 제공하기 위한 것이다.

< 참조예 > 통계 분석

눈물 생성과 각막 매끄러움의 통계 비교를 위하여 Tukey's post hoc testing(ANOVA)을 이용하여 변화량에 대한 일원 분석을 수행하였으며, 그 결과를 Windows(SPSS, Chicago, IL)사의 SPSS version 18.0으로 분석하고 값을 ±표준편차로 나타내었다. 또한 p<0.05 값을 통계적으로 유의한 값으로 보았다.

< 실시예 1> 건성안 동물 모델 제작

NOD.B10.H2 ^b 생쥐를 Orient Bio Inc (Seongnam, Korea)에서 구입하였다.

본 동물 실험은 눈과 시력 연구를 위한 동물 사용에 대하여 인제대학교 의과대학(No.; 2012-053)과 ARVO에 승인된 지침에 따라 수행되었다.

12 내지 16 주령의 NOD.B10.H2 ^b 생쥐에게 건조 스트레스로 하루 18시간 동안 40-50% 주위습도와 팬을 이용한 통풍에 노출시켰으며 피하에 0.5 mg/0.2 mL 무스카린 수용체 차단제를 주사하였다. 또한 10일 동안 오전 9시, 오후 12시, 오후 3시 및 오후 6시 하루 4번 브롬화수소산 스코폴라민(scopolamine hydrobromide; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 생쥐 엉덩이쪽에 번갈아가며 주사하였다.

상기 방법으로 처리된 생쥐를 10일 후 안락사시켰으며 실험기간 동안 동물의 행동과 음식 및 물 섭취를 제한하지 않았다.

안구 건조 스트레스 10일 후 스코폴라민 주사를 중단하고 일반 습도와 온도 환경으로 전환하고 건조 스트레스를 제거하였으며 건조 스트레스 제거 후 CDECM 처리 그룹은 10mg/ml CDECM을 PBS에 용해하여 5μL씩 하루에 5번 10일간 안구에 투여하였으며 대조군인 PBS 처리 그룹은 PBS를 5μL씩 하루에 5번 10일간 안구에 투여하였다.

두 실험군은 각각 4마리씩 생쥐의 양쪽 눈을 이용하여 상기 실험을 진행하였으며 모든 실험은 반복적으로 진행되었다.

< 실시예 2> 눈물 생성 측정

눈물 생성을 페놀 레드-침윤 면 스레드 (phenol red-impregnated cotton threads; Zone-Quick; Oasis, Glendora, CA)를 이용하여 보고되어진 방법(Villareal AL, Farley W, Pflugfelder SC. Effect of topical ophthalmic epinastine and olopatadine on tear volume in mice. Eye Contact Lens. 2006;32(6):272-276.)으로 측정하였다.

눈물량은 의료용 핀셋을 이용하여 스레드를 20초 동안 측면 안각에 위치시키고 눈물에 젖어 적색으로 변한 스레드를 현미경(SZX7; Olympus corp, Tokyo, Japan)으로 관찰하여 밀리미터로 표시하였다.

상기 측정된 밀리미터내 누액을 20초 동안 생쥐의 눈물량으로 예상되는 용량의 염기성 용액(0.9% 염분 1500 mL와 5 mL의 5 N NaOH)을 적신 면 스레드로 나타낸 표준곡선과 비교하였다.

먼저, CDECM 처리 그룹과 PBS 처리 그룹 모두 건조 스트레스 전보다 건조 스트레스 10일 후 눈물량이 유의하게 감소한 것이 확인되었다.

상기 눈물량의 감소가 확인된 두 실험 그룹에 실시예 1의 방법으로 건조 스트레스 제거 후 PBS를 점안한 PBS 처리 그룹은 도 1A와 같이 3일, 5일, 7일 및 10일 마다 측정한 결과, 눈물량의 감소가 유지된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 건조 스트레스 제거 후 CDECM을 점안한 CDECM 처리 그룹은 도 1B와 같이 3일, 5일, 7일 및 10일 마다 측정한 결과, 0 수준의 눈물량이 점차 개선된 것을 확인할 수 있었다.

상기 실험결과로부터 건성안의 CDECM 투여가 눈물 생성량 개선에 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

< 실시예 3> 각막 표면의 매끄러움 평가

CDECM 처리 그룹과 대조군인 PBS 처리 그룹의 각막 표면의 매끄러움을 평가하였다. 두 그룹의 동물을 안락사 후 즉시 실체현미경(SZX7; Olympus)의 광섬유 링 조명으로부터 흰색 링의 반사이미지를 얻었다.

각막 매끄러움을 디지털 이미지의 흰색 링에 반사된 각막상피 세포의 불규칙성을 등급화하여 평가하였다. 각막 불규칙성 심각도 점수는 반사 링을 4등분으로 나누어 불규칙성 정도에 따라 5등급으로 계산하였다.

불규칙성 없음은 0등급, 1/4등분의 불규칙성을 1등급; 2/4등분의 불규칙성은 2등급; 3/4 등분의 불규칙성을 3등급; 모두 불규칙한 정도를 4등급; 심각한 정도를 5등급으로 하여 모든 링을 확인하였다.

먼저, CDECM 처리 그룹과 PBS 처리 그룹 모두 건조 스트레스 전 정상각막과 건조 스트레스 10일 후를 비교한 결과, 각막 표면의 매끄러움이 높은 등급으로 확인되었다.

건조 스트레스 제거 후 실시예 1의 방법으로 각각 PBS와 CDECM를 처리하고 표면 매끄러움 등급을 3일, 5일, 7일 및 10일 마다 측정한 결과, 건조 스트레스 제거 후 PBS 처리 그룹은 도 2A 및 도 2B와 같이 등급의 변화가 없었던 반면, 건조 스트레스 제거 후 CDECM 처리 그룹은 도 2C 및 도 2D를 참조하면, CDECM 처리 7일과 10일 후 0등급에 가깝게 각막 표면 매끄러움 정도가 개선된 것이 확인되었다.

상기 실험결과로부터 건성안의 CDECM 투여가 각막 표면 불규칙성 개선에 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

< 실시예 4> 조직학적 분석

PBS 처리 그룹과 CDECM 처리 그룹의 눈과 부속기를 외과적으로 적출하여 10% 포르말린으로 고정시키고 파라핀과 OCT 혼합물에 깊숙이 박았다.

상기 방법으로 처리된 6μm 조직 시료를 헤마톡실린&에오신(H&E)과 과요오드산 시프 시약(periodic acid-Schiff reagent; PAS)을 사용하여 염색하였다. 각 그룹의 동물 4마리를 상기 방법으로 염색하고 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)을 이용하여 촬영 및 분석을 수행하였다.

과요오드산 시프 시약(periodic acid-Schiff reagent; PAS)염색을 이용하여 건조 스트레스 제거 후 각각 PBS와 CDECM을 처리한 두 그룹의 10일 후 결막상피 배상세포의 밀도를 확인 결과, PBS 처리 그룹의 결막 상피 배상세포 밀도는 도 3C에서 확인할 수 있듯이, 10일 후에도 여전히 감소해 있었던 반면, CDECM 처리 그룹의 결막 상피 배상세포의 밀도는 도 3D와 같이 회복되고 있는 것을 확인하였다.

또한 각막 상피세포의 박리 효과를 확인하기 위하여 수행한 도 4A의 헤모톡실린 & 에오신(H&E)염색 결과 및 도 4B의 PAS 염색 결과, 건조 스트레스 전(C)보다 건조 스트레스 제거 후(DS) 다량으로 박리된 각막 상피세포가 생성된 것이 확인되었다.

상기 염색 결과, PBS 처리 그룹은 건조 스트레스 제거 후(DS)와 유사하게 박리된 각막 상피세포의 증가가 확인된 반면, CDECM 처리 그룹은 건조 스트레스 제거후(DS) 보다 박리된 각막 상피세포가 감소한 것을 확인할 수 있었다.

상기 실험결과로부터 건성안의 CDECM 투여가 건조 스트레스에 의한 각막 표면 손상을 개선하는데 효과가 있음이 확인되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

동물의 무릎 관절 연골세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하는 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 건성안의 눈물 생성, 각막 표면의 매끄러움 및 결막 배상세포의 밀도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 건성안의 각막 상피세포의 박리를 억제하는 것을 특징으로 하는 건성안 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 상기 연골세포 유래 세포외 기질을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 점안제 형태의 안약이나 주사제, 또는 젤 형태의 안연고나 주사제로서 제공되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.