KR102553921B1 - 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질을 유효성분으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질(ECM)을 통해 천연 연골조직의 기능적 특성을 그대로 유지할 수 있는 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하고, soluble한 특성을 가지고 있어 다양한 농도의 용액형태로 제작이 가능하므로 주입식 제형으로 다양한 형태의 치료가 가능하며, 염증제어와 조직수복과 같이 복합적인 치료가 가능한 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

Description

연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물{Phamaceutical composition for preventing or treating osteoarthritis comprising extracellular matrix derived cartilage tissue}

본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질을 유효성분으로 하는 관절염 및 통증 치료용 약학조성물에 대한 것이다.

퇴행성 관절염(Osteoarthritis)은 관절염 중 가장 흔한 것으로 관절의 가동을 부드럽게 해주고 충격을 흡수하는 기능을 갖고 있는 관절 연골이 닳아 없어지면서 관절에 부분적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환이다.

최근 인구 고령화 추세에 따라 고령인구가 증가하고 이에 따라 관절염 질환 환자가 급격히 상승하고 있으며, 근골격계 질환으로서 관절운동능력 소실에 따라 활동장애가 일어나고 병변 내 염증발생과 운동에 따른 통증을 수반하여 삶의 질에 많은 영향을 미치는 질환이다.

퇴행성 관절염은 일차성(특발성)과 이차성(속발성)으로 크게 나뉠 수 있으나 퇴행성 관절염의 진행 정도에 따라 초기, 중기 및 말기로 나눌 수 있다. 퇴행성 관절염 초기는 관절이 노화해 단단해야 할 연골이 약해지면서 조금씩 얇아져 곳곳에 미세한 균열이 생기는 단계이고, 중기는 연골 마모 정도가 더 심해지고 균열이 커지면서 연골에 구멍이 뚫리기도 하고 뼈와 뼈 사이가 좁아져 마찰이 생기면서 통증이 더 심해지는 단계이고, 말기는 연골이 거의 닳아 없어져 버리고 뼈와 뼈가 부딪쳐 매우 극심한 통증을 유발하는 단계이다.

퇴행성 관절염은 염증이 수반되는 질환으로 치료를 위해서는 염증 제어가 필수적이지만 연골의 손실도 일어나는 질환으로 연골 조직의 수복이 이루어져야 완전한 치료가 이루어질 수 있는 질환이지만 종래의 관절염 치료제는 염증 제어에 초점이 맞춰져 있고 통증을 완화하기 위한 약물을 함께 투여할 뿐이어서 퇴행성 관절염의 치료효과가 제한적인 문제가 있다.

또한, 종래의 퇴행성 관절염 치료는 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs) 약물을 경구 투여하거나 패취제 또는 관절강 내 직접 주사하는 등 비경구적으로 투여하는 방법을 사용하고 있으나 위염, 소화불량의 문제가 있으며 심할 경우 위장관 출혈이나 천공(perforation)과 같은 심각한 위장관 손상을 일으키는 심각한 부작용이 보고되고 있다.

연골의 유착 방지 및 조직 수복을 위해 연골세포 유래 세포외 기질(Extracellular Matrix : ECM)이 활용되고, 세포외 기질은 생체소재로서 각광을 받고 있다. 특히 연골세포에서 유래한 ECM이 유착 방지를 위해 활용되고 있으나 연골조직에서 분리된 연골세포를 단층배양을 통해 기질막으로 형성한 후 이를 탈세포화하여 제작함에 따라 천연 연골조직(Native Cartilage Tissue)의 기능적 특징이 ECM에 남아 있지 않거나 외과적 시술을 통해서 기질막 형태의 ECM을 적용함에 따라 시술이 제한적이고, 부작용으로 인해 연골에 발생한 질환을 치료하는데 한계가 있어왔다.

한국공개특허 제10-2015-0067519호(2015년 6월 18일 공개)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 연골조직에서 유래된 세포외 기질(ECM)을 통해 천연 연골조직의 기능적 특성을 그대로 유지할 수 있는 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 농도에 따라 생리식염수(saline)를 포함하는 수액을 혼합하여 주입식 제형으로 제작하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 주입식 제형으로 제작된 세포외 기질 용액은 전단박하 유체(shear-thinning flow)인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 돼지 무릎관절에서 추출된 연골조직을 처리하여 얻은 세포외 기질인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 연골조직 유래 세포외 기질은 상기 돼지 무릎관절의 대퇴골과 경골 사이의 연골로부터 연골조직을 추출하고, 동결건조와 동결분쇄된 연골조직으로부터 유래된 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 세포외 기질은 상기 연골조직을 탈세포화하고, 효소처리하여 용해시킨 후 분리 및 정제한 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 효소처리에 사용되는 효소는 콜라게나제 I(collagenase I), 콜라게나제 II(collagenase II), 콜라게나제 B(collagenase B), 프로테이나제 K(proteinase-K) 및 펩신(pepsin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 세포외 기질은 제2형 콜라겐(collagen type II), 섬유상단백질(fibrous protein), 프로테오글린칸(proteoglycans), 히아루론산(hyaluronic acid), 콘드로이친(chondroitin sulfate)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 세포외 기질은 염증을 제어하여 관절염 진행을 억제하고 연골조직을 수복시키는 것을 특징으로 한다.

이상과 같은 구성의 본 발명은 천연 연골조직에 포함된 염증을 제어하는 인자를 그대로 유지하여 염증을 조절함과 동시에 연골조직을 수복하여 퇴행성 관절염에 대한 완벽한 치료를 수행할 수 있는 약학조성물을 제공한다.

또한, 연골조직에서 유래한 세포외 기질을 유효성분으로 함에 따라 생체소재로서 안정성 및 염증제어 기능이 높아 치료효과가 우수한 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 soluble한 특성을 가지고 있어 다양한 농도의 용액형태로 제작이 가능하므로 주입식 제형으로 다양한 형태의 치료가 가능한 특징이 있다.

도 1은 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 용액의 제조과정을 나타내는 도면이고,
도 2는 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 용액의 점도를 측정한 그래프이고,
도 3은 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 용액의 주입력을 측정한 그래프이고,
도 4는 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물의 염증제어에 대한 효과를 확인 하기 위해 인 비보(in vivo) 모델 제작 후 용액을 주입하여 혈청 내에 존재하는 사이토카인(Cytokine)의 양을 측정한 그래프이고,
도 5는 본 발명의 세포외 기질의 농도별 세포독성을 확인하기 위해 연골세포에 주입 후 생존율에 대한 이미지와 그래프이고,
도 6은 본 발명의 세포외 기질의 농도별 연골 세포의 증식에 미치는 영향을 평가하기 위한 세포 증식률에 대한 그래프이고,
도 7은 본 발명의 세포외 기질의 농도별 복합 치료효과를 알아보기 위해 사이토카인을 이용하여 퇴행성 관절염 모델을 제작한 후 인 비트로(in vitro) 상에서 효능을 확인하는 그래프이다.

이하에서 도면을 참조하여 본 발명에 따른 에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 연골세포에서 유래한 세포외 기질(Extracellular matrix: ECM)이 세포배양과정을 거치고, 제조된 ECM이 기질막의 형태 등으로만 제조됨에 따라 제조된 ECM이 외과적 시술을 필수적으로 하는 단점을 극복하기 위해 연골조직에서 유래된 ECM을 유효성분으로 하여 기질막의 형태가 아닌 용액의 형태로 제조하여 외과적 시술이 아닌 주입형으로 제작하여 퇴행성 관절염을 효율적으로 예방하거나 치료할 수 있는 약학조성물에 대한 것이다. 본 발명의 약학조성물은 연골조직의 생화학적 특징 및 분자를 그대로 유지함에 따라 퇴행성 관절염의 치료에 탁월한 효과를 확인하였다.

본 발명은 연골조직에서 유래된 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 제공하는데, 본 발명에서 “연골조직(Cartilaginous tissue)”은 연골세포(chondrocyte)와 그에 따라 생산된 연골기질(cartilage matrix)로 된 섬유성 결합조직의 일종으로 주로 척추동물에서 잘 발달한 조직을 의미한다.

이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 연골조직 유래 세포외 기질을 포함하는 용액의 제조

본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 용액의 제조과정을 나타내는 도면으로 연골조직을 추출하여 동결건조, 동결분쇄한 후 연골조직을 탈세포화(decellularization)하여 연골 무세포 기질(Cartilage acellular matrix: CAM)을 제조한 후 효소처리(Enzymatic digestion)를 하여 ECM을 얻고, 투석을 통해 정제된 ECM을 추출한 후 용액으로 제조한다.

- 연골조직의 추출

우선, 블레이드로 돼지의 대퇴골과 경골에 있는 연골을 깎고, 깎은 연골 조직은 마르지 않게 3차 증류수에 넣어 보관한 후 연골을 분리하여 분리된 연골을 비커에 담아 3차 증류수로 반복 세척한다. 세척한 연골 조각을 냉동실 보관 후 동결건조(Freeze Dryer, ilShinBioBase)를 진행하고, 동결건조가 끝난 연골 조직을 동결분쇄(6875 Freezer/Mill, SPEX SamplePrep)를 진행한다.

- 탈세포화

저장성 완충용액(Tris, 10 mmol/L; Sodium Chloride, 10 mmol/L)에 분쇄한 연골 가루를 넣고 교반한다. 교반이 끝나면 플라스틱 튜브에 나눠 담고, 그 후 원심분리기(2236R, LABOGENE)를 통해 원심분리하여 상층액을 제거한다. 원심분리한 후 얻은 연골 가루를 비커에 옮긴 후 Sodium dodecylsulfate (SDS)가 첨가된 저장성 완충용액으로 옮겨 다시 교반한다. 이후 플라스틱 튜브에 소분한 후 원심분리를 다시 진행하고, 상층액 제거 후 3차 증류수를 넣고 스패출러를 이용하여 연골 가루를 현탁시킨 뒤 원심분리를 통해 연골가루를 반복 세척한다. 반복 세척이 끝나면 상층액 제거 후 연골 가루를 비커에 옮긴 후 DNase 처리용액(DNase I Reaction Buffer, Elpis Biotech; DNase I recombinant, Roche)을 첨가하여 교반하고, 교반 후 플라스틱 튜브에 소분하여 원심분리를 진행한 후 3차 증류수, 스패출러, 원심분리기를 이용하여 반복 세척한다. 반복 세척을 통해 원심분리가 끝나면 상층액 제거 후 스패출러를 이용하여 specimen cup에 연골 가루를 옮긴 후 3차 증류수를 첨가하여 냉동실 보관 후 동결건조를 진행하여 연골 무세포 기질(Cartilage acellular matrix: CAM)을 제조한다.

- 효소처리

동결 건조한 CAM을 pepsin 용액을 첨가하여 교반하고, Sodium hydroxide를 첨가하여 pH 7.7로 맞춰 중화하여 효소처리를 진행한다.

- 투석

Dialysis membrane(Spectra Por, Spectrum Labs)을 약 20cm로 자른 후 한쪽 끝을 holder로 고정하고 membrane 안에 중화시킨 CAM 용액을 부어준 후 나머지 다른 한쪽 끝도 holder로 고정한다. 고정 후 Membrane이 잠길 때까지 3차 증류수를 넣어 10~15℃에서 교반하고, 투석이 끝나면 한쪽 끝의 holder를 제거하고 용액을 specimen cup에 담은 후 냉동실 보관 후 동결건조를 진행한다.

- 용액 제작

50 ml Conical tube에 saline을 넣고 제작 농도에 맞는 CAM-ws를 넣고, 4℃에서 교반한 후 원심분리하여 본 발명의 세포외 기질이 포함된 용액을 얻는다.

<실시예 2> CAM-ws 용액의 물리적 특성

도 2는 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 용액의 점도를 측정한 그래프이고, 도 3은 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 용액의 주입력을 측정한 그래프이다.

도 2는 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 용액의 점도를 측정한 그래프인데, 수분을 축적할 수 있는 성질을 가지고 있는 CAM-ws의 특성을 이용해 점도가 있는 주입식 제형을 제작하기 위해 점도를 측정하였다. Rheometer(HR-2, TA Instruments)를 사용하여 CAM-ws의 농도별 점도를 측정하였고, 발진 주파수는 0.01~100Hz의 범위로 설정하였으며, 사람의 체온을 고려하여 37℃에서 진행하였다. 유변학적 변화를 측정한 결과 CAM-ws의 농도가 높을수록 더 높은 점도를 보이며, 전단응력의 증가에 따라 점도는 감소하는 것을 통하여 전단박하 유체임을 알 수 있고, 높은 점도를 바탕으로 주입 이후에 다른 조직으로 이탈할 가능성이 낮음을 확인하였다.

도 3은 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물을 포함하는 용액의 주입력을 측정한 그래프이인데, 만능재료시험기(Instron 5966; Universal testing machine)를 사용하여 CAM-ws의 농도별, 주삿바늘의 크기별 주입력을 측정하였다. 18G 주삿바늘, CAM-ws 1, 2, 4%의 최대 주입력은 4.19, 5.10, 4.87N이며, 19G 주삿바늘, CAM-ws 1, 2, 4%의 최대 주입력은 7.59, 4.02, 4.50N이다. 따라서, 주사기 이외에 다른 장치 없이도 점성이 존재하는 연골 치료제를 전달할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 3> CAM-ws 용액의 염증제어 또는 조직재생에 대한 치료효과 분석

도 4는 본 발명의 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 하는 약학조성물의 염증제어에 대한 효과를 확인 하기 위해 인 비보(in vivo) 모델 제작 후 용액을 주입하여 혈청 내에 존재하는 사이토카인(Cytokine)의 양을 측정한 그래프이다.

CAM-ws의 유효성을 평가하기 위해 골관절염 in vivo 모델 제작 이후 CAM-ws 용액을 주입하였으며 랫드의 혈청 내에 존재하는 사이토카인의 양을 측정하였다. 랫드의 혈청 내 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β의 농도를 바탕으로 CAM-ws의 염증 제어 효과를 알아보기 위해 시험을 진행하였는데 시험은 랫드의 심장에서 3~5ml의 혈액을 채혈하고, 원심분리기(2236R, LABOGENE)를 사용하여 혈청을 분리하였고, Rat TNF-α ELISA Kit, Rat IL-1β ELISA Kit를 사용하여 농도를 측정하였다. 결과적으로 CAM-ws를 사용한 실험동물 군에서 통계적으로 유의미한 감소를 확인하여 염증제어에 대한 효과를 확인하였다.

<실시예 4> 세포 독성, 세포 생존율, 세포 증식률 분석

도 5는 본 발명의 세포외 기질의 농도별 세포독성을 확인하기 위해 연골세포에 주입 후 생존율에 대한 이미지와 그래프이고, 도 6은 본 발명의 세포외 기질의 농도별 연골 세포의 증식에 미치는 영향을 평가하기 위한 세포 증식률에 대한 그래프이고, 도 7은 본 발명의 세포외 기질의 농도별 복합 치료효과를 알아보기 위해 사이토카인을 이용하여 퇴행성 관절염 모델을 제작한 후 인 비트로(in vitro) 상에서 효능을 확인하는 그래프이다.

도 5는 본 발명의 세포외 기질의 농도별 세포독성을 확인하기 위해 연골세포에 주입 후 생존율에 대한 이미지와 그래프인데, CAM-ws의 농도별 처리에 의한 연골 세포의 생존능력을 알아보기 위하여 진행하였다. Confocal dish에 세포 수 5x104cells/ml를 37℃, 5%의 CO2incubator에서 배양하였고, 1, 2, 4% CAM-ws를 처리하고, 7일 후 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kit를 사용하여 형광 분석을 수행하였다. 실험 결과 대조군과 CAM-ws를 처리한 실험군과의 차이가 없는 것을 확인하였고 이를 통해 CAM-ws는 세포의 성장에 영향을 미치는 독성이 없음을 확인하였다.

도 6은 본 발명의 세포외 기질의 농도별 연골 세포의 증식에 미치는 영향을 평가하기 위한 세포 증식률에 대한 그래프인데, CAM-ws의 농도별 처리가 연골 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 진행하였다. 48 well plate에 세포 수 5x103cells/ml를 37℃, 5%의 CO2incubator에서 배양하였다. 1, 2, 4% CAM-ws를 처리하고, 1, 4, 7일 후 WST 시약을 20μl씩 각각의 well에 첨가하고 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 4시간 더 배양한 후 96 well plate에 100μl의 배지를 첨가하고 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 증식률은 CAM-ws의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다. 도 6의 그래프로부터 세포증식이 유의미하게 증가하고 있음을 알 수 있다.

도 7은 본 발명의 세포외 기질의 농도별 복합 치료효과를 알아보기 위해 사이토카인을 이용하여 퇴행성 관절염 모델을 제작한 후 인 비트로(in vitro) 상에서 효능을 확인하는 그래프인데, 골관절염이 발생한 세포에 대한 영향을 확인하기 위해 다양한 농도의 사이토카인을 이용해 골관절염 모델을 제작하고, 48 well plate에 세포 수 5x103 cells/ml를 37℃, 5%의 CO2incubator에서 배양하였다. CAM-ws 1, 2, 4%, TNF-α 0.6, 6, 60ng/ml를 실험군별로 처리하고, 7일 후 WST 시약을 20μl씩 각각의 well에 첨가하고 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 4시간 더 배양하였다. 배양 후 96 well plate에 100μl의 배지를 첨가하고 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. CAM-ws의 농도가 높을수록 TNF-α에 의한 연골 세포 사멸은 줄어드는 것을 확인하였고, 결과적으로 in vitro상에서 효능을 확인하였다.

도 5, 6, 7로부터 본 발명의 약학조성물 용액이 세포독성이 없어 치료제로서 적합하고, 연골세포의 증식에 도움을 줘 연골조직의 수복효과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (9)

1. 연골조직 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하고, 염증 제어를 통해 관절염을 예방 또는 치료하는 약학조성물로서,
   상기 연골조직 유래 세포외 기질은 연골조직을 탈세포화하고, 효소처리하여 용해시킨 후 분리 및 정제하고,
   상기 약학조성물은 연골조직 유래 세포외 기질의 농도에 따라 연골조직 유래 세포외 기질에 생리식염수(saline)를 포함하는 수액을 혼합한 주입식 제형인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
2. 삭제
3. 청구항 1에서,
   상기 주입식 제형으로 제작된 세포외 기질 용액은 전단박하 유체(shear-thinning flow)인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
4. 청구항 1에서,
   상기 연골조직 유래 세포외 기질은 돼지 무릎관절에서 추출된 연골조직을 처리하여 얻은 세포외 기질인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
5. 청구항 4에서,
   상기 연골조직 유래 세포외 기질은 상기 돼지 무릎관절의 대퇴골과 경골 사이의 연골로부터 연골조직을 추출하고, 동결건조와 동결분쇄된 연골조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
6. 삭제
7. 청구항 4에서,
   상기 효소처리에 사용되는 효소는 콜라게나제 I(collagenase I), 콜라게나제 II(collagenase II), 콜라게나제 B(collagenase B), 프로테이나제 K(proteinase-K) 및 펩신(pepsin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
8. 청구항 1에서,
   상기 세포외 기질은 제2형 콜라겐(collagen type II), 섬유상단백질(fibrous protein), 프로테오글린칸(proteoglycans), 히아루론산(hyaluronic acid), 콘드로이친(chondroitin sulfate)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
9. 청구항 1에서,
   상기 세포외 기질은 염증을 제어하여 관절염 진행을 억제하고 연골조직을 수복시키는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
   
   
   

Images