KR20090061745A - 엘라스틴을 안정화제로서 함유하는 반유동성 이식용 조성물 - Google Patents

엘라스틴을 안정화제로서 함유하는 반유동성 이식용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리학적으로-적합한 완충액 중에, (a) 지방줄기세포; 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 및 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 이식-세포, 및 (b) 엘라스틴과 히알루론산과의 혼합물; 엘라스틴과 콜라겐과의 혼합물; 및 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐과의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 반유동성 생체-유래 물질을 포함하는 반유동성 이식용 조성물을 제공한다.
지방줄기세포, 지방세포, 지방조직, 반유동성 생체-유래 물질, 엘라스틴

Description

엘라스틴을 안정화제로서 함유하는 반유동성 이식용 조성물{A semi-floating composition for transplant comprising elastin as a stabilizing agent}
본 발명은 지방줄기세포(adipose stem cells); 지방세포(adipocytes); 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직(adipose tissue)과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물을 포함하는 안정한 이식용 조성물에 관한 것이다.
얼굴 성형, 유방 성형 및 체형보정, 상처로 인한 흔적의 제거, 남성 생식기 성형 등을 위하여, 환자 자신의 피하지방, 예를 들어 복부, 다리 등의 피하지방을 사용한 이식이 성형외과 등에서 통상적으로 행해지고 있다. 일반적으로 튜립 니들(tulip needle) 형태의 끝이 날카롭지 않은 바늘을 갖는 주사기를 사용하여 흡인하여 채취한 피하지방을 원심분리하여 혈액과 지방조직으로 분리한 후, 이를 바로 주사기로 옮겨 원하는 부위에 주입하여 피하지방 이식을 수행한다.
한편, 종래와 같이 피하지방을 채취하여 이식을 수행하는 경우, 피하지방의 채취과정에서 약 50% 이상의 지방세포가 손상될 뿐 아니라, 다양한 크기의 세포 덩어리가 잔존함으로써 이식 부위에 원하는 함량을 정밀하게 이식하는 것이 곤란하 고, 피부가 얇고 피하지방이 적은 이식 부위(예를 들어, 눈아래부위 등)에서는 덩어리들이 만져지는 등의 문제가 발생한다. 또한, 피하지방의 덩어리만을 이식한 경우에는 지방조직 덩어리의 내부에 존재하는 지방세포들이 주변의 환경으로부터 필요한 양분을 받거나 또는 노폐물을 배출하는데 어려움을 겪게 되어 쉽게 괴사하는 문제가 발생한다.
따라서, 지방조직 덩어리를 지방세포 및/또는 지방줄기세포로 분리하여 이식할 경우, 피하지방을 그대로 환자에 이식하는데 따른 문제를 해결할 수 있을 것이다. 더욱이, 지방유래 줄기세포 즉 지방줄기세포(adipose stem cell)는 지방세포로의 분화가 가능하며, 크기가 10 ㎛ 미만의 작은 세포이나 성숙한 지방세포는 100 ㎛ 이상의 크기가 되므로 부피가 이론상 1000배 정도가 커질 수 있으므로 바람직하게 사용될 수 있을 것이다.
그러나 지방세포 및/또는 지방줄기세포를 수액 등의 생리식염수에 분산시켜 이식용 주입액을 제조하는 경우, 상기 세포들이 쉽게 침전됨으로써 환자에게 주입하기가 곤란할 뿐 아니라, 여러 군데의 이식 부위에 주입하는 경우 원하는 부위에 균일한 수의 지방줄기세포를 주입하기가 극히 곤란하다. 더욱이, 이식된 부위에서 지방줄기세포가 지방세포로 분화하게 되면, 이식 부위에 따라 심각한 불균형이 초래되게 된다.
또한 엉덩이, 가슴 등 비교적 다량의 지방이 사용되어야 하는 경우에는 필요에 따라 추출된 지방조직의 일부를 사용하여 줄기세포를 추출한 후 나머지 추출된 지방조직과 섞어 줄기세포의 농도를 높이는 방법을 사용할 수도 있으나, 이 경우에 도 역시 섞어준 줄기세포와 기존의 지방조직들이 균등히 분포되지 않는 문제가 있다.
본 발명자들은 지방줄기세포와 지방세포를 동시에 함유하는 이식용 조성물로서, 히알루론산을 안정화제로서 사용한 반유동성 이식용 조성물을 개발하여 특허출원을 완료한 바 있다 (대한민국 특허출원 제10-2007-0043363호, 미공개).
본 발명자들은 지방줄기세포; 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물이 안정하게 분산된 이식용 조성물을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 엘라스틴을 히알루론산 또는 콜라겐과 함께 혼합하여 얻어진 안정화제를 사용할 경우, 상기 세포 또는 세포 혼합물이 완충액 등의 매질 중에 안정하게 분산될 뿐만 아니라, 얻어지는 이식용 조성물이 천연의 피부 조성과 거의 유사하게 됨으로써, 생체 적합성을 높일 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 지방줄기세포; 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물을 포함하는 안정하고 생체 적합성이 높은 이식용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 생리학적으로-적합한(physiologically- compatible) 완충액 중에, (a) 지방줄기세포; 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 이식-세포(transplant-cell), 및 (b) 엘라스틴과 히알루론산과의 혼합물; 엘라스틴과 콜라겐과의 혼합물; 및 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐과의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 반유동성 생체-유래 물질을 포함하는 반유동성 이식용 조성물이 제공된다.
상기 이식-세포가 지방줄기세포일 때, 상기 반유동성 생체-유래 물질의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ∼ 40 중량%일 수 있다. 또한, 상기 이식-세포가 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물일 때, 상기 반유동성 생체-유래 물질의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.0005 ∼ 5 중량%일 수 있다.
상기 반유동성 생체-유래 물질은 분자량 1 ∼ 100 kDa의 엘라스틴 및 중량평균분자량 200,000 ∼ 400,000의 히알루론산과의 혼합물일 수 있으며, 상기 엘라스틴과 히알루론산의 중량비는 1 : 0.1∼10 의 범위일 수 있다.
또한, 상기 반유동성 생체-유래 물질은 분자량 1 ∼ 100 kDa의 엘라스틴 및 분자량 80 ∼ 3000 kDa의 콜라겐, 바람직하게는 아테로콜라겐(aterocollagen)과의 혼합물일 수 있으며, 상기 엘라스틴과 콜라겐(또는 아테로콜라겐)의 중량비는 1 : 0.1∼10 의 범위일 수 있다.
또한, 상기 반유동성 생체-유래 물질은 분자량 1 ∼ 100 kDa의 엘라스틴, 중량평균분자량 200,000 ∼ 400,000의 히알루론산 및 분자량 80 ∼ 3000 kDa의 콜라 겐, 바람직하게는 아테로콜라겐과의 혼합물일 수 있으며, 상기 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐(또는 아테로콜라겐)의 중량비는 1 : 0.1∼10 : 0.1∼10 의 범위일 수 있다.
본 발명의 조성물은 생리학적으로-적합한 생리식염수 중에 지방줄기세포; 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물이 안정하게 분산됨으로써, 상기 세포 또는 세포 혼합물이 조성물 중에 부유되거나 침강되지 않는다. 따라서, 본 발명의 이식용 조성물은 이식-세포의 함량을 미세하게 조절할 수 있으며, 다양한 이식부위에 원하는 양만큼 정확하게 주입할 수 있으므로, 부작용의 발생을 획기적으로 줄일 수 있다. 또한, 얻어지는 이식용 조성물이 천연의 피부 조성과 거의 유사하게 됨으로써, 생체 적합성을 더욱 높일 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 지방세포, 지방줄기세포 및 지방조직은 공지의 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호에 개시된 바와 같이, 지방조직(adipose tissue)으로부터 지방흡인(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 지방세포 및 지방줄기세포를 분리할 수 있다.
본 발명의 생리학적으로-적합한 완충액은 의료용, 혈관주사용을 포함한 이식 용 주입액에 통상적으로 사용되는 완충액을 포함하며, 예를 들면, 체액의 삼투압과 동일한 삼투압을 가지는 생리식염수를 포함한다.
본 발명의 조성물에 함유되는 이식-세포는 지방줄기세포(adipose stem cells) 또는 지방세포(adipocytes) 단독이거나, 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직(adipose tissue)과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물일 수 있다. 특히, 지방줄기세포와 지방세포를 동시에 포함할 경우, 이식과 동시에 지방세포로 인한 이식부위 부피의 증가를 달성할 수 있어 성형효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 지방줄기세포들이 지방세포로 분화, 성장할 수 있어 이식부위의 부피성장을 도모할 수 있다. 또한, 종래 비교적 다량의 지방세포를 피부 깊이 이식하는 가슴 및 엉덩이 성형의 경우에는 추출한 지방줄기세포와 지방세포 및 지방조직을 동시에 이식하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 이식용 조성물에 사용되는 지방줄기세포, 지방세포 및/또는 지방조직은 피하지방으로부터 지방조직 채취시 손상된 지방세포를 최대한 제거하는 것이 바람직하다. 손상된 지방세포를 최대한 제거한다는 것은 지방세포로부터 유출된 기름, 세포 파쇄물, 혈액을 포함한 체액 및 채취를 위해 투여된 각종 물질 등을 30% 이하, 바람직하게는 5% 이하로 존재하도록 처리하는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물에 함유되는 지방줄기세포; 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물의 함량은 이식이 필요한 환자의 상태, 목적, 성별, 나이 등에 따라 적절히 변경될 수 있다. 예를 들어, 얼굴 성형 등의 목적으로 지방 세포를 이식하는 경우에는 약 1 ∼ 100 ml, 바람직하게는 약 3 ∼ 50 ml의 지방세포를 이식할 수 있다. 지방줄기세포의 경우에는 1 X 103 - 108 cells 의 범위로 사용될 수 있다. 또한, 지방세포와 지방줄기세포를 동시에 사용하는 경우에도 상기 범위에서 적절히 혼합하여 사용될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 지방세포와 지방줄기세포를 동시에 사용하는 경우, 약 50 ml의 지방세포 및 약 1 X 105 cells의 지방줄기세포를 사용할 수도 있다. 본 발명의 이식용 조성물의 장점 중의 하나는 지방세포와 지방줄기세포의 혼합 비율을 필요에 따라 자유로이 조절하여 이식할 수 있다는 점이다.
본 발명의 조성물은 상기 이식-세포를 안정하게 분산시키기 위한 안정화제로서, 엘라스틴과 히알루론산과의 혼합물; 엘라스틴과 콜라겐과의 혼합물; 및 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐과의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 반유동성 생체-유래 물질을 함유한다. 상기 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐은 생체에서 유래되는 물질로서, 생체내에서 자연적으로 분해될 수 있는 생분해성 성질을 가지며, 수친화성 매질중에 함유되었을 때 점도를 높게 유지시킴으로써 전체적인 조성을 반-유동성(semi-floating) 성질을 나타낼 수 있다. 상기 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐은 화학적 합성 또는 반합성된 물질일 수 있으며, 이들이 생분해성의 성질을 갖는 한, 본 발명의 조성물에 함유되는 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐은 상기 합성 또는 반합성된 것들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 조성물에서와 같이, 이들을 지방줄기세포; 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물과 함께 제제화할 경우에는 상기 세포 또는 세포 혼합물이 매질 중에 부유하거나 침강되지 않고 골고루 분산되어 존재할 수 있도록 한다.
본 발명의 조성물에 함유되는 반유동성 생체-유래 물질은 지방줄기세포; 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물이 안정되게 분산될 수 있는 점도를 부여할 수 있도록 농도 및 분자량을 선택할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조성물이 이식-세포로서 지방줄기세포를 함유하는 경우, 상기 반유동성 생체-유래 물질은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ∼ 40 중량%, 바람직하게는 약 0.5 ∼ 35 중량%, 더욱 바람직하게는 약 1 ∼ 25 중량%를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물이 이식-세포로서 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물을 함유하는 경우, 상기 반유동성 생체-유래 물질은 조성물 총 중량에 대하여 0.0005 ∼ 5 중량%, 바람직하게는 0.001 ∼ 1 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.002 ∼ 0.4 중량%, 더 더욱 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.2 중량%를 사용할 수 있다.
또한, 상기 반유동성 생체-유래 물질은 분자량 1 ∼ 100 kDa의 엘라스틴 및 중량평균분자량 200,000 ∼ 400,000의 히알루론산과의 혼합물일 수 있으며, 상기 엘라스틴과 히알루론산의 중량비는 1 : 0.1∼10 의 범위일 수 있다.
또한, 상기 반유동성 생체-유래 물질은 분자량 1 ∼ 100 kDa의 엘라스틴 및 분자량 80 ∼ 3000 kDa의 콜라겐, 바람직하게는 아테로콜라겐(aterocollagen)과의 혼합물일 수 있으며, 상기 엘라스틴과 콜라겐(또는 아테로콜라겐)의 중량비는 1 : 0.1∼10 의 범위일 수 있다.
또한, 상기 반유동성 생체-유래 물질은 분자량 1 ∼ 100 kDa의 엘라스틴, 중량평균분자량 200,000 ∼ 400,000의 히알루론산 및 분자량 80 ∼ 3000 kDa의 콜라겐, 바람직하게는 아테로콜라겐과의 혼합물일 수 있으며, 상기 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐(또는 아테로콜라겐)의 중량비는 1 : 0.1∼10 : 0.1∼10 의 범위일 수 있다.
상기 이식-세포를 안정하게 분산시키기 위한 안정화제로서 사용되는 반유동성 생체-유래 물질 중 하나인 엘라스틴은 황색의 망상구조로 된 탄성섬유를 구성하며, 고등동물의 결합조직 중에 많이 함유되어 있는, 조직 중에 콜라겐과 함께 존재하여 피부의 중요 성분을 이루는 물질이다. 아미노산 조성은 글리신과 프롤린 함량이 많은 점이 콜라겐과 비슷하며 콜라겐 분자가 아르기닌과 히드록시프롤린 함량이 많은 부분을 잃고 엘라스틴이 되는 것으로 추측되며, 열 ·알칼리 ·단백질 분해효소에 대한 저항성은 콜라겐보다 강하다. 본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 엘라스틴은 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어진 엘라스틴, 유전자 재조합 방법을 사용한 미생물 또는 세포를 배양하여 얻은 엘라스틴 등을 모두 사용할 수 있다. 엘라스틴의 분자량은 크게 제한되지 아니하며, 예를 들어 1 ∼ 100 kDa의 범위일 수 있으며, 분자량 10 ∼ 60 kDa인 알파형 및 분자량 3 ∼ 10 kDa인 베타형 엘라스틴 각각 또는 혼합물일 수 있다. 또한 약 71 kDa (71,927 Da)인 엘라스틴을 사용할 수 도 있으며, 조성물 중의 엘라스틴 함량, 즉 농도에 따라 적절하게 변경시켜 사용할 수도 있다.
히아루론산은 식품의약품안전청으로부터 체내 주입이 허가된 생분해성 중합체로서, 생체에서 유래되는 물질이다. 본 발명의 조성물에 함유되는 히아루론산은 인간을 포함한 포유동물의 체액 또는 조직으로부터 정제된 히아루론산, 재조합 미생물 또는 세포를 배양하여 얻은 히아루론산, 또는 화학적 합성방법에 의해 얻어진 히아루론산 모두를 사용할 수 있다. 히아루론산의 중량평균분자량은 약 200,000 ∼ 400,000 의 범위일 수 있으며, 조성물 중의 히아루론산 함량, 즉 농도에 따라 적절하게 변경시켜 사용할 수도 있다.
콜라겐은 인간을 포함한 포유동물의 뼈 연골, 건(tendon), 피부 등에 다량으로 함유되어 있는 경단백질로서 융해시키게 되면 젤라틴으로 변환되는 성질을 갖는다. 본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 콜라겐은 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어진 콜라젠, 유전자 재조합 방법을 사용한 미생물 또는 세포를 배양하여 얻은 콜라겐 등을 모두 사용할 수 있다. 콜라겐의 분자량은 80 ∼ 3000 kDa, 바람직하게는 80 ∼ 200 kDa, 더욱 바람직하게는 약 90 ∼ 130 kDa의 범위일 수 있으며, 조성물 중의 콜라겐 함량, 즉 농도에 따라 적절하게 변경시켜 사용할 수도 있다.
상기 콜라겐으로는 아테로콜라겐을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 아테로콜라젠은 콜라젠의 펩티드 결합을 절단해 분자량을 작게 하여 수용성으로 만든 것으로서 콜라겐과 마찬가지로 3개의 펩티드 쇠사슬 구조를 유지하고 있다. 또한 생체 조직과의 친화성이 뛰어나며, 펩티드를 구성하는 아미노산은 3분의 1이 글리신 으로 다른 단백질에는 없는 히드록시 프롤린을 함유하고 있는 특징을 지닌다. 본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 아테로콜라겐은 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어진 아테로콜라겐, 유전자 재조합 방법을 사용한 미생물 또는 세포를 배양하여 얻은 아테로콜라겐 등을 모두 사용할 수 있다. 상기 콜라겐의 예와 마찬가지로 아테로콜라겐의 분자량은 80 ∼ 3000 kDa, 바람직하게는 80 ∼ 200 kDa, 더욱 바람직하게는 약 90 ∼ 130 kDa의 범위일 수 있으며, 조성물 중의 아테로콜라겐 함량, 즉 농도에 따라 적절하게 변경시켜 사용할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 필요에 따라 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면 덱스트란 등의 등장화제, 벤질알코올 등의 무통화제를 함유할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 본 발명의 조성물은 생리학적으로-적합한 완충액 중에 지방줄기세포; 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물이 조성물 중에 부유되거나 침강되지 않는다. 따라서, 본 발명의 이식용 조성물은 이식-세포의 함량을 미세하게 조절할 수 있으며, 다양한 이식부위에 원하는 양만큼 정확하게 주입할 수 있으므로, 종래 피하지방을 이식했을 때 발생하는 부작용을 획기적으로 줄일 수 있다.
또한, 이식-세포가 골고루 분산되어 주입됨으로써, 지방줄기세포, 지방세포 및/또는 지방조직이 비균등하게 이식되는 것을 원천적으로 방지할 수 있으며, 이식된 세포들의 틈을 통해 줄기세포 및 지방세포들이 쉽게 외부 체액에 존재하는 영양 분을 공급받거나 노폐물을 배출할 수 있다. 또한, 주입된 지방세포 및 줄기세포들이 기존의 지방조직 및 결합조직 사이로 넓게 펴져 나갈 수 있어 혈관의 도움을 받아서 생존할 수 있는 확률을 높일 수 있으므로 세포의 생착율을 높일 수 있어 이식 후 부피의 감소를 줄일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 지방세포 및 지방줄기세포의 채취
피하지방 제거 시술을 받은 환자로부터 동의를 얻고, 해당 환자로부터 지방흡인(liposuction)방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 수거한 지방조직은 10 - 200 g정도씩 프로세싱 백에 옮겨 생리완충액을 가하여 체액과 혈액 부분을 제거하는 과정을 새로운 생리완충액으로 3회 반복하고, 체액과 혈액이 제거된 지방조직을 수거하였다. 상기 채취단계에서, 수거된 지방조직에 생리완충액을 가했을 때의 성상은 도 1과 같으며, 이를 3회 반복하여 지방조직만을 수거한 결과는 도 2와 같다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 지방조직은 위로, 혈구등 혈액유래물질들은 아래로 완충액과 함께 가라앉는다. 또한, 도 2에서 알 수 있는 바와 같이 분리과정을 통해 얻어진 지방조직은 지방세포들이 전반적으로 균질화 되어 있지 않고 비중에 의해 조성물의 상부에 치우쳐 있어, 이식 시 균일한 주입 곤란하다.
상기 체액과 혈액이 제거된 지방조직만을 모아 0.05 - 0.2 중량%가 되도록 콜라게나제를 가한 후, 37 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 지방세포층과 지방줄기세포층을 분리한 후, 각각의 층에 생리식염수를 가하여 콜라게나제를 제거하였다. 지방조직에 콜라게나제를 처리하여 위부터 차례로 기름, 지방세포 및 지방줄기세포 층으로 나뉜 모습은 도 3에 나타내었다.
위에서 얻어진 지방세포층은 다시 50 x g로 원심분리하여 채취 및 효소처리 과정에서 발생한 파괴된 지방세포와 순수기름을 제거하였다. 또한, 위에서 얻어진 지방줄기세포층은 역시 다시 50 x g로 원심분리하여 채취 및 효소처리 과정에서 발생한 파괴된 지방세포와 순수기름을 제거하였다.
실시예 2. 지방줄기세포-함유 이식용 조성물의 제조
중량평균분자량 300,000의 2 중량% 의료용 생체주입용 히아루론산 용액과 20 중량% 엘라스틴(Sigma사, E6527) 용액과의 1:1(v/v) 혼합액 2.5 ml에 실시예 1에서 얻어진 지방줄기세포 1 X 107 을 함유하는 생리완충액 0.5 ml을 가하고, 10 분 동안 교반하여, 지방줄기세포-함유 이식용 조성물을 제조하였다. 얻어진 지방줄기세포-함유 이식용 조성물의 성상은 도 4와 같다.
상기에서 얻어진 이식용 조성물을 시험관(높이 10 cm, 직경 0.4 cm)에 넣은 직후(0 시간), 이식용 조성물을 최상층, 중상층, 중하층 및 최하층으로 4등분하여 동일부피에 포함된 지방줄기세포의 중량을 측정하여 지방줄기세포의 분포를 측정하 고, 이를 실온에서 24 시간 보존한 후 지방줄기세포의 분포를 측정한 결과는 도 5a와 같다. 비교예로서, 상기 히알루론산과 엘라스틴의 혼합물 대신 생리완충액 2.5 ml를 첨가하여 제조한 이식용 조성물에 대하여 동일한 시험을 수행한 결과는 도 5b와 같다. 도 5a 및 5b로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 이식용 조성물은 제조 후 24시간이 경과한 시점에서도 지방줄기세포가 침전되지 않고 고루 분포함을 알 수 있다.
실시예 3. 지방세포-함유 이식용 조성물의 제조
중량평균분자량 300,000의 2 중량% 의료용 생체주입용 히아루론산 용액과 20 중량% 엘라스틴(Sigma사, E6527) 용액과의 1:1(v/v) 혼합액 1 ml에 실시예 1에서 얻어진 지방세포 15 ml을 가하고, 10 분 동안 교반하여, 지방세포-함유 이식용 조성물을 제조하였다.
실시예 4. 지방세포 및 지방줄기세포-함유 이식용 조성물의 제조
중량평균분자량 300,000의 2 중량% 의료용 생체주입용 히아루론산 용액과 20 중량% 엘라스틴(Sigma사, E6527) 용액과의 1:1(v/v) 혼합액 0.5 ml에 실시예 1에서 얻어진 지방줄기세포 1 X 107 을 함유하는 생리완충액 0.5 ml, 및 실시예 1에서 얻어진 지방세포 15 ml를 가하고, 5 분 동안 교반하여, 지방세포 및 지방줄기세포-함유 이식용 조성물을 제조하였다.
상기에서 얻어진 이식용 조성물을 시험관(높이 10 cm, 직경 0.4 cm)에 넣은 직후(0 시간), 이식용 조성물을 최상층, 중상층, 중하층 및 최하층으로 4등분하여 동일부피에 포함된 지방줄기세포 및 지방세포의 중량을 측정하여 지방줄기세포의 분포를 측정하고, 이를 실온에서 24 시간 보존한 후 지방줄기세포 및 지방세포의 분포를 촬영한 결과는 도 6a와 같다 . 비교예로서, 상기 히알루론산과 엘라스틴의 혼합물 대신 생리완충액 2.5 ml를 첨가하여 제조한 이식용 조성물에 대하여 동일한 시험을 수행한 결과는 도 6b와 같다. 도 6a 및 6b로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 이식용 조성물은 제조 후 24시간이 경과한 시점에서도 지방줄기세포 및 지방세포층이 분리되지 않고 고루 분포함을 알 수 있다.
실시예 5. 지방줄기세포-함유 이식용 조성물의 제조
동량의 분자량 130 kDa의 콜라겐과 엘라스틴(Sigma사, E6527)을 생리식염수에 녹여 2 중량% 의 용액을 제조하였다. 얻어진 용액 1 ml에 실시예 1에서 얻어진 지방줄기세포 1 X 105 을 함유하는 생리완충액 1 ml을 가하고, 10 분 동안 교반하여, 지방줄기세포-함유 이식용 조성물을 제조하였다.
실시예 6. 지방세포 및 지방줄기세포-함유 이식용 조성물의 제조
실시예 5에서 얻어진 이식용 조성물에 실시예 1에서 얻어진 지방세포 15 ml 를 가하고, 5 분 동안 교반하여, 지방세포 및 지방줄기세포-함유 이식용 조성물을 제조하였다.
실시예 7. 지방조직 및 지방줄기세포-함유 이식용 조성물의 제조
중량평균분자량 300,000의 2 중량% 의료용 생체주입용 히아루론산 용액과 20 중량% 엘라스틴(Sigma사, E6527) 용액과의 1:1(v/v) 혼합액 0.5 ml에 실시예 1에서 얻어진 지방줄기세포 1 X 107 을 함유하는 생리완충액 0.5 ml, 및 환자로부터 추출되어 수세과정을 거쳐 콜라제나제 처리 없이 얻어진 지방조직 15 ml를 가하고, 5 분 동안 교반하여, 지방조직 및 지방줄기세포-함유 이식용 조성물을 제조하였다.
도 1은 수거된 지방조직에 생리완충액을 가했을 때의 성상을 나타낸다.
도 2는 혈구를 제거하는 단계를 거쳐 지방조직만을 수거한 결과를 나타낸다.
도 3은 지방조직에 콜라게나제를 처리한 후 손상된 지방세포에서 유래된 기름층 및 지방세포 하층에 가라앉은 줄기세포의 성상을 나타낸다.
도 4는 실시예 2에서 제조한 지방줄기세포-함유 이식용 조성물의 성상을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 각각 실시예 2에서 제조한 지방줄기세포-함유 이식용 조성물(도 5a) 및 안정화제를 함유하지 않은 지방줄기세포-함유 이식용 조성물(즉 비교예, 도 5b)를 0시간과 24 시간 동안 수직으로 보관한 후의 지방줄기세포의 분포를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 각각 실시예 7에서 제조한 이식용 조성물(도 6a) 및 비교예(히알루론산과 엘라스틴의 혼합물 대신 생리완충액 함유, 도 6b)의 제조 직후와 24시간 보존 후의 성상을 촬영한 결과를 나타낸다.

Claims (11)

  1. 생리학적으로-적합한(physiologically-compatible) 완충액 중에,
    (a) 지방줄기세포(adipose stem cells); 지방세포(adipocytes); 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직(adipose tissue)과의 혼합물; 및 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 이식-세포(transplant-cell), 및
    (b) 엘라스틴과 히알루론산과의 혼합물; 엘라스틴과 콜라겐과의 혼합물; 및 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐과의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 반유동성 생체-유래 물질을 포함하는 반유동성 이식용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이식-세포가 지방줄기세포이고, 상기 반유동성 생체-유래 물질의 함량이 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ∼ 40 중량%인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이식-세포가 지방세포; 지방줄기세포와 지방세포와의 혼합물; 지방줄기세포와 지방조직과의 혼합물; 또는 지방줄기세포, 지방세포, 및 지방조직과의 혼합물이고, 상기 반유동성 생체-유래 물질의 함량이 조성물 총 중량에 대하여 0.0005 ∼ 5 중량%인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반유동성 생체-유래 물질이 분자량 1 ∼ 100 kDa의 엘라스틴 및 중량평균분자량 200,000 ∼ 400,000의 히알루론산과의 혼합물인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 엘라스틴과 히알루론산의 중량비가 1 : 0.1∼10인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반유동성 생체-유래 물질이 분자량 1 ∼ 100 kDa의 엘라스틴 및 분자량 80 ∼ 3000 kDa의 콜라겐과의 혼합물인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 콜라겐이 아테로콜라겐(aterocollagen)인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 엘라스틴과 콜라겐의 중량비가 1 : 0.1∼10 인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반유동성 생체-유래 물질이 분자량 1 ∼ 100 kDa의 엘라스틴, 중량평균분자량 200,000 ∼ 400,000의 히알루론산 및 분자량 80 ∼ 3000 kDa의 콜라겐과의 혼합물인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 콜라겐이 아테로콜라겐(aterocollagen)인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 엘라스틴, 히알루론산, 및 콜라겐의 중량비가 1 : 0.1∼10 : 0.1∼10인 것을 특징으로 하는 이식용 조성물.
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