TWI839378B

TWI839378B - 交聯玻尿酸及與prp/bmc的組合

Info

Publication number: TWI839378B
Application number: TW108128394A
Authority: TW
Inventors: 安東尼塔爾奇; 馬爾他馬梅莉
Original assignee: 瑞士商雷根實驗室公司
Priority date: 2019-02-06
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2024-04-21
Also published as: TW202042823A; GB201901671D0

Abstract

本發明提供合成交聯玻尿酸之新穎方法、其組成物、含有單獨此類組成物或與PRP/BMC組合之此類組成物之管子及注射器、用於PRP/BMC製備之新穎裝置、及其在細胞培養、皮膚護理及關節保護中之用途。特別地，本發明提供用於由至少一種第一聚合物（較佳玻尿酸）製造交聯凝膠（較佳具有所欲分子量及/或濃度）之方法，其包含以下步驟： viii）使該第一聚合物均質化， ix）使該第一聚合物在鹼性溶液中水合， x）藉由在高於室溫之溫度下添加至少一種交聯劑來使該鹼性溶液交聯， xi）使該鹼性溶液在酸性溶液中中和， xii）使該溶液均質化， xiii）混合該溶液與補充量之第二聚合物（較佳為具有與該第一聚合物實質上相同之分子量及/或濃度之第二聚合物），及 xiv）純化該溶液。

Description

交聯玻尿酸及與PRP/BMC的組合

本發明提供合成交聯玻尿酸之新穎方法、其組成物、含有單獨此類組成物或與PRP/BMC組合之此類組成物之管子及注射器、用於PRP/BMC製備之新穎裝置、及其在細胞培養、皮膚護理及關節保護中之用途。

交聯玻尿酸(本文亦稱為XLHA(crosslinked hyaluronic acid))已由許多公司利用不同方法生產。所獲得之凝膠大多用於製備用於皮膚治療之注射器。一般而言，視用於合成之所用BDDE之量及/或所採用之物理參數而定，可調整交聯百分比且可產生具有不同黏彈特性及滯留時間之凝膠。

一般而言，所有所報導之方法均具有一些共同步驟，諸如：

1)初始水合步驟，在此期間將呈粉末或纖維物理形式之聚合物溶解至緩衝液介質中；

2)交聯步驟，其中添加交聯劑且反應在特定溫度下在特定pH條件下進行特定時間；

3)鑒於應用環境典型地為人體而必需之中和階段

4)及用於消除未反應交聯劑之最後必需純化階段。

視諸如所需最終調配物及所瞄準之特性(黏度、滯留時間、預期用途等)而定，包括一些中間階段另一聚合物或麻醉劑之溶脹或添加。

分析此等方法，明顯地涉及大量操作。考慮到所執行之操作之重要數目、合成程序(耗時方法)長度及產物爆裂，提出製備交聯玻尿酸之替代性方法及所獲得之具有使得能夠與富血小板血漿及骨髓濃縮物混合之特點之組成物。

此外，細胞療法及再生療法研究意味著用於自體療法之試管內培養及幹細胞、先驅細胞或經分化細胞增殖。

目前用作用於試管內培養之營養素及生長因子之主要源之胎牛血清(FBS)引發數種道德問題(自活動物抽取血液)、安全問題(病毒、黴漿菌、蛋白質污染)，造成可再生性問題(批次之間之組成變化)及財務問題(主要成本)。出於此等原因，衛生當局希望在人類臨床方案使用情況中去除細胞療法中之FBS。因此，保證相比於FBS之使得能夠製備該等培養基之醫學裝置之替代性培養基。

最後，保證尤其適於與血小板濃縮物(platelet concentrate；PC)或骨髓濃縮物(bone marrow concentrate；BMC)混合之玻尿酸組成物。

I.交聯玻尿酸(XLHA)；XL=交聯；HA=玻尿酸

當HA經化學改質以獲得聚合物時，其等之鏈在其等間連接，獲得交聯玻尿酸(本文亦稱為XLHA)。

XLHA為具有可使用大量試劑交聯之非晶形網路之水凝膠(親水性凝膠)。根據本發明之較佳交聯劑為1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)，此係由於其較低毒性本質。

本發明提供含有抗凝血劑、觸變性凝膠及交聯HA之容器，較佳管子。該等管子(醫學裝置)適用於製備用於治療關節疼痛症狀及關節運動性改善之注射劑，以及適用於製備注射至中層至深層真皮中之注射劑以用於修正及修飾創傷或術後來源之萎縮性疤痕及用於皮膚脫水及修正中度至重度臉部皺紋及諸如鼻唇褶之解剖結構溝。

製備如此醫學裝置之關鍵點為PRP與HA之間之混合物。凝膠必須具有合適黏度以在20次管子倒轉內獲得完美且均質之PRP及HA混合物，即使XLHA具有更高黏度亦如此。此外，XLHA亦應適用於製備用於主要領域及用於類似治療之注射器，適用於使凝膠通過27G針。

XLHA應具有長於非XL凝膠之30天之滯留時間，例如約3個月滯留時間，且XLHA在3個月時段中完全吸收，仍保留永久性治療作用。

藉由調整交聯%，始終記住黏度限制來改變滯留時間。實際上，交聯%愈高，滯留時間愈長，但黏度可能變得愈高。

已經由實驗證實，所獲得之玻尿酸組成物有利地呈現上文所提及之特徵。

用於合成XLHA之流線方法之開發。

該方法可在本文中以「一鍋」法稱之。「一鍋」合成定義為用以改善化學反應效率，由此使反應物在單一反應器中經受連續化學反應的策略。只要在同一反應器中進行特定序列之反應，其在本文即可被視作為「一鍋」。

本發明之第一方面為實施例部分中所描述之合成方法。根據本發明之方法可在無氧氛圍中進行。較佳地，該方法在低濕度水平下進行。較佳地，該方法在氣流，較佳連續氣流下進行。作為空氣之替代方案，可使用諸如氮氣或氬氣之任何惰性氣體。作為連續氣流之替代方案，該方法在真空或空氣抽吸下進行。該方法在單一反應容器中以連續方法執行。

本發明亦提供用於製備可注射水凝膠之方法，該方法包含以下步驟：使一或多種聚合物均質化，使聚合物水合，使聚合物交聯以形成凝膠，使凝膠中和，使凝膠均質化，向凝膠添加一或多種聚合物以產生水凝膠且純化水凝膠，且其中該方法在單一反應容器中以連續方法進行。較佳地，該方法在氣流下且使用錨式攪拌器容器進行。較佳地，交聯步驟少於4小時，較佳約2小時。較佳地，中和步驟在約12小時期間在pH 7下執行。較佳地，在中和步驟之後，使凝膠在約4℃下隔夜。較佳地，添加至凝膠中之一或多種聚合物在室溫下添加。較佳地，添加至凝膠中之一或多種聚合物具有與初始聚合物相同之分子量及濃度。

聚合物可具有選自羥基、羧基及胺基之一或多個反應基。聚合物可為多糖、蛋白質或選自由聚(丙烯酸)及聚(乙烯醇)組成之群之合成聚合物。多糖可在玻尿酸、聚葡萄胺糖、海藻酸、澱粉、聚葡萄糖或鹽或其水溶性衍生物中選擇。較佳地，該方法在中性pH下進行。較佳地，交聯反應在約50℃之溫度下進行約2小時。較佳地，交聯反應進行少於4小時、少於3個半小時、少於3小時或少於2個半小時之時間段。較佳地，反應容器中不使用葉輪。替代地，使用錨式攪拌容器。

本文對「約」之提及可替代性地意謂+-10%。動態黏度可在本文中稱作零剪切黏度。

起始交聯之起始係藉由添加一定量之交聯劑進行，該交聯劑為選自由環氧化物、表鹵代醇及二乙烯碸組成之群之化合物之雙官能或多官能分子。較佳環氧化物為選自由以下組成之群之化合物：1,4丁二醇二縮水甘油醚(亦稱為1,4-雙(2,3-環氧丙氧基)丁烷)、1-(2,3-環氧丙基)2,3-環氧基環己烷及1,2-乙二醇二縮水甘油醚。

於鹼性水溶液中之具有至少兩個環氧官能基之基於環氧化物之交聯劑可用於本發明之方法中。

具有至少兩個環氧官能基之基於環氧化物之交聯劑可選自由以下組成之群：1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)、乙二醇二縮水甘油醚(EGDGE)、1,6-己二醇二縮水甘油醚、丙二醇二縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚、聚伸丁二醇二縮水甘油醚、新戊二醇二縮水甘油醚、聚丙三醇聚縮水甘油醚、二甘油聚縮水甘油醚、甘油聚縮水甘油醚、三甲基丙烷聚縮水甘油醚、1,2-(雙(2,3-環氧丙氧基)乙烯、新戊四醇聚縮水甘油醚、山梨糖醇聚縮水甘油醚及其等之任何組合。

含有乙醇之鹼性水溶液可含有約5%w/w至約13%w/w乙醇。含有乙醇之鹼性水溶液可為含有約5%w/w至約13%w/w乙醇之約0.7%w/w至1.3%w/w氫氧化鈉水溶液。

根據本發明之特殊具體實例，起始交聯之步驟在鹼性介質中進行。在鹼性介質中進行之交聯反應之特徵在於極堅固的醚鍵之形成。藉由醚化進行之交聯允許更長之活體內保留。

交聯反應為確保各聚合物之鏈與彼此之橋接之反應。其可藉由測定交聯之量來定量。

交聯可在單一聚合物或在聚合物之混合物發生。

作為玻尿酸之替代方案，可使用其他聚合物。較佳地，聚合物具有天然來源。具有天然來源之聚合物之使用允許較佳的生物相容性，亦即此類使用產生較低的發炎性反應之風險。

較佳地，具有天然來源之聚合物為選自由以下組成之群之化合物：玻尿酸、硫酸軟骨素、角質素、硫酸角質素、肝素、硫酸肝素、纖維素及其衍生物、海藻酸鹽、三仙膠、鹿角菜膠、蛋白質或核酸。

甚至更所欲地，具有天然來源之至少一種聚合物為非天然地存在於人體中之聚合物，其選自由以下組成之群：纖維素及其衍生物、海藻酸鹽、三仙膠、鹿角菜膠；與天然地存在於人體中之至少一種聚合物交聯之聚合物，其選自由以下組成之群：玻尿酸、硫酸軟骨素、角質素、硫酸角質素、肝素、硫酸肝素、蛋白質或核酸。

參與交聯反應之聚合物可為合成的，但較佳具有天然來源。具有天然來源之聚合物之使用允許較佳的生物相容性，亦即此類使用產生較低的發炎性反應之風險。

較佳地，使用上文所提及之具有天然來源之聚合物。

然而，明顯地，本發明不限於上文所提及之聚合物，且可使用具有不同類型及尺寸之聚合物。

補充聚合物之添加可發生在初始交聯反應之任何進展程度中，較佳在75%初始交聯反應下。此步驟可藉由以連續或不連續方式添加聚合物來進行。

補充聚合物之分子量可大於500,000Da。其等亦可為合成的或天然的。其等可以聚合物混合物形式添加。其等可具有與初始交聯步驟中所使用者之本質或尺寸相同或不同之本質或尺寸。所欲地，所添加之補充聚合物由長於起初存在之聚合物之鏈構成。此給予凝膠以其外部機械結構改良，長鏈與短鏈相比更難降解。

玻尿酸可藉由利用微生物醱酵來獲得。玻尿酸包括玻尿酸、玻尿酸之鹽或其任何混合物。

玻尿酸之鹽選自由以下組成之群：玻尿酸鈉、玻尿酸鉀、玻尿酸鎂、玻尿酸鋅、玻尿酸鈷、玻尿酸四丁銨及其等之任何組合。

作為均質化/水合步驟之替代方案，將聚合物或玻尿酸基質溶解於為水溶液之第一液體介質中，且無任何交聯。

作為均質化/水合步驟之替代方案，沈澱聚合物或玻尿酸基質，此係藉由使其經受包含一定量之一或多種第一水溶性有機溶劑之第二液體介質且無任何交聯來進行，該一或多種第一水溶性有機溶劑給予玻尿酸沈澱條件。

有利地，本發明中不使用有機溶劑。

如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法或其部分係在惰性氛圍下在真空下執行。

本發明出於其目的已提出生物相容性交聯凝膠，其避免已知缺點，同時具有易於用於其臨床利用且具有使得此生物相容性交聯凝膠在不再需要其功能時消失但足以縮限藉由醫學或手術干預進行之投予之數目之壽命的優點。

停止交聯之步驟亦可藉由與根據本發明之停止交聯之步驟同時、在該步驟之前或隨後進行滲析來進行。

此方法允許獲得同時具有為雙相、聚密化(polydensified)、內聚、可注射之特徵且具有長保留(remainance)之生物相容性交聯凝膠。

內聚意謂凝膠重組且不鋪展或分離之傾向。因此，內聚特徵促成獲得凝膠之活體內高相容性及長保留。

聚密化意謂存在有交聯度變化，甚至在凝膠自身內。凝膠之聚密化特徵允許組成物獲得凝膠之通過細徑針之可注射性及所有活體內保留之優點。

凝膠之長保留之功效允許隔開醫學干預且因此改善患者生活品質。

根據本發明之實現獲得之此類內聚聚密化單相凝膠之特徵在於經促進之可注射性及長於具有相同組成之單相凝膠之活體內保留之活體內保留，該具有相同組成之單相凝膠之交聯量在凝膠內均勻。

本發明亦出於其目的具有藉由上文所提及之方法製備之凝膠。

在一個具體實例中，凝膠構成包含至少一種經分散之活性成分之基質。隨後，凝膠可用作為載體，該載體允許該活性成分自該液體或其中注射有該載體之生物學組織的逐步釋放。活性成分為可例如為抗氧化劑之藥理活性劑。活性成分亦可具有不同本質。具有不同本質之活性成分之混合物亦可分散於凝膠中。

較佳注射此凝膠。

此外，本發明出於其目的具有此凝膠之用途，其(例如在治療性應用之例子中)出於皺紋填充、疤痕遮蔽或唇體積增加之美容目的用於分離、置換或填充生物學組織或用於增加該組織之體積(增加聲帶、食道、括約肌、尿道或其他器官之體積)，或用於補充或置換生物流體。其亦可補充或置換例如天然滑液之生物流體。

本發明亦提供根據本發明之交聯玻尿酸之組合。

本發明之組成物可與例如聚葡萄胺糖微珠或未經改質之大孔聚葡萄胺糖微珠之聚葡萄胺糖組合。該等聚葡萄胺糖微珠可均勻地分散於本發明之玻尿酸組成物或交聯及非交聯玻尿酸之組合中。

本發明之交聯玻尿酸組成物可與非交聯組成物組合。此外，該等組成物可與血小板濃縮物或骨髓濃縮物組合。

本發明之組成物可包括額外組分，其等選自用於控制注射疼痛之醯胺類型之局部麻醉劑，包括利多卡因(lidocaine)、丙胺卡因(prilocaine)、布比卡因(bupivacaine)、甲哌卡因(mepivacaine)及阿替卡因(articaine)。

在另一方面，本發明提供：

i)用於修正臉部不完美之方法，此係藉由使用27G或30G細針向深層真皮中或皮下地注射本發明之組成物來進行。目標為軟化諸如鼻唇褶及木偶紋(marionette line)之臉部褶痕及皺紋之外觀以增強淺輪廓，以使薄唇飽滿，或以改善凹陷疤痕之外觀。

ii)用於治療導因於諸如脂萎縮之消瘦狀況所致之面部體積損失以改善患者之外觀之方法，此係藉由例如在面頰中皮下注射足量的本發明之組成物(本文亦稱為填充劑)來進行。

如所提及，本發明亦關於使得能夠(較佳以大體積)製備單獨血小板濃縮物(PC)或骨髓濃縮物(BMC)或與諸如本發明之玻尿酸之生物材料組合之PC或BMC的新穎方法及醫學裝置。其亦關於尤其適用於與PC及BMC組合之玻尿酸之新穎調配物：可如下表徵該HA：

- 約最大值5Pa.s(帕斯卡秒)之動態黏度。

- 1500kDa(介於500kDa與2000kDa之間)，

- 2%濃度(介於1%與2.5%之間)，

- 約3%之交聯度

此外，適用於其中HA之流動具有重要性之注射器及類似裝置之HA之特徵在於至多60Pa的彈性，以便HA恰當地在27G針中流動。

動態黏度及彈性視濃度%、交聯度及分子量而定。為得到合適黏度，吾人可調整此等兩個因子。

管子在本文中之特徵在於遠端及近端，且近端具有用於收集例如全血、骨髓之材料、物質或組成物之孔徑。

在另一方面，本發明提供包含或預填充有細胞選擇凝膠(例如觸變性凝膠)及抗凝血劑之組成物或裝置，較佳管子或注射器。較佳地，觸變性凝膠在管子遠端處在抗凝血劑下方成層。管子之特徵可在於為觸變性凝膠之第一層，接著為抗凝血劑之第二層，繼而有用於收集物質(例如全血、骨髓或其他物質)之開放空間。尤其適於製備PRP或BMC之該裝置：可在收集物質(例如全血、骨髓或其他物質)之前或之後在管子中收集凝血酶(例如自體凝血酶血清)。添加凝血酶使得物質(例如PRP或BMC)能夠膠凝。觸變性凝膠(本文亦稱為細胞選擇凝膠(cell selector gel)或CSG)之密度介於1.04g/cm3與1.09g/cm3之間、較佳介於1.045g/cm3與1.075g/cm3之間。凝膠之密度可為1.075g/cm3、1.07g/cm3、1.065g/cm3、1.06g/cm3、1.055g/cm3、1.05g/cm3、1.045g/cm3或1.04g/cm3。

在另一個方面，本發明提供包含或預填充有生物材料及抗凝血劑之組成物或裝置，較佳管子或注射器。較佳地，生物材料在管子遠端處在抗凝血劑下方成層。管子之特徵可在於為生物材料之第一層，接著為抗凝血劑之第二層，繼而有用於收集物質(例如全血、骨髓或其他物質)之開放空間。生物材料之密度低於紅血球之密度(1.09g/cm3至1.1g/cm3)，亦即低於1.09g/cm3、低於1.085g/cm3、低於1.08g/cm3、低於1.075g/cm3、低於1.07g/cm3、低於1.065g/cm3、低於1.06g/cm3、低於1.055g/cm3、低於1.05g/cm3、低於1.045g/cm3或低於1.04g/cm3。有利地，該配置使得能夠使用具有重要密度範圍之生物材料，該範圍為約1g/cm3至低於紅血球密度之密度(亦即低於1.09g/cm3及>=1g/cm3)。該裝置適用於製備與生物材料組合之PRP或BMC。為避免抗凝血劑與生物材料之混合，可使用具有惰性或疏水性之合適生物材料。可替代地，在抗凝血劑與生物材料之間加入物質或障壁之層或放置物質或障壁。可在收集物質(例如全血、骨髓或其他物質)之前或之後在管子中收集凝血酶(例如自體凝血酶血清)。

在一個方面，本發明提供包含或預填充有玻尿酸(較佳本發明之HA組成物)、聚葡萄胺糖及抗凝血劑之組成物或裝置，較佳管子或注射器。較佳地，HA及聚葡萄胺糖在管子遠端處在抗凝血劑下方成層。管子之特徵可在於為HA或聚葡萄胺糖之第一層，接著為HA或聚葡萄胺糖之第二層，及為抗凝血劑之第三層，繼而有用於收集物質(例如全血、骨髓或其他物質)之開放空間。

因此，本發明係關於無菌及非致熱容器，較佳允許使PC(例如富血小板血漿(PRP))或BMC與例如玻尿酸(HA)之生物材料有利地以相同比例(例如4mL的PRP，4mL HA)、有利地視情況以大體積混合的管子。在一個具體實例中，本發明係關於由以下組成或包含以下之醫學裝置：一個用於製備PC或BMC之管子，及一個預填充有玻尿酸之管子，其較佳經由使得能夠將PC或BMC轉移至預填充有生物材料之管子中之裝置連接。較佳地，該轉移自動地發生，例如歸因於含有生物材料之管子中之真空。本發明之各方面及具體實例使得能夠以至少3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml或更多之體積製備血小板濃縮物(PC)或骨髓濃縮物(BMC)與生物材料或細胞萃取物之組合。

PC/BMC管子(允許製備PC及/或BMC之管子)可允許製備4mL的PRP/BMC且可含有惰性聚酯細胞選擇凝膠及液體抗凝血劑。HA管子專用於引導PRP/BMC自PRP/BMC管子之轉移及其與玻尿酸之混合。HA管子可僅含有約4mL玻尿酸凝膠。兩個管子均較佳僅供單次使用且設計成與於同一套組中提供之無菌且單次使用之靜脈切開術材料一起使用。

在另一方面，本發明提供用於製備骨髓濃縮物(BMC)及/或血漿濃縮物(PC)之容器，其特徵在於：a)該容器包含或預填充有：i)至少一種抗凝血劑，及/或ii)至少一種過濾器及/或允許分離紅血球(RBC)之組成物，較佳或視情況為細胞選擇凝膠(CSG)，較佳或視情況為觸變性凝膠，較佳或視情況為惰性聚酯CSG，及 iii)視情況選用之至少一種生物材料，其較佳或視情況選自玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白或其等之任何組合，及iv)視情況選用之至少一種血液、骨髓、細胞及/或血小板保存及/或刺激溶液，較佳或視情況為勃脈力-A(plasmalyte-A)，及b)視情況選用之收集裝置，其視情況或較佳包含具有附件(較佳或視情況安全鎖及蝶形針)之收集固持器或由其等組成，可固定至該容器以用於將血液及/或骨髓收集至該容器中且其中該收集較佳或視情況在閉路中發生，較佳或視情況自動地發生，較佳或視情況藉由真空而發生，及c)視情況選用之收集裝置，其可固定至該容器以用於將凝血酶血清(較佳或視情況自體凝血酶血清)收集至該容器中，且其中該收集較佳或視情況在閉路中發生，較佳或視情況自動地發生，及d)視情況選用之轉移裝置，其可固定至該容器以用於將該PC及/或該BMC轉移至另一容器中，其中該容器較佳或視情況為管子或注射器，較佳或視情況於真空下，其中該轉移較佳或視情況在閉路中發生，較佳或視情況自動地發生，較佳或視情況藉由真空而發生，較佳或視情況藉由在兩個容器之間的直接接觸或經由一裝置發生，及e)視情況進一步包含至少一種用於分離其他血液組分及/或骨髓組分(視情況或較佳用於分離淋巴球)之過濾器或物質，f)該容器視情況處於真空下，且可適用於：i)將骨髓及/或全血收集至該容器中，及ii)離心，及iii)視情況該容器之抽真空及/或混合及/或倒轉，且可適用於以下中之任一者或兩者： iv)自該容器收集該PC及/或BMC，及/或v)將該PC及/或BMC轉移至另一容器中。

「適用於」可在本文中(在本發明之任何方面或具體實例中)以「當用於......時」取代。

根據本發明之此方面，容器可含有以下中之任一者：i)至少一種抗凝血劑，或ii)至少一種過濾器及/或允許分離紅血球(RBC)之組成物，較佳或視情況細胞選擇凝膠(CSG)，或iii)至少一種抗凝血劑與以下之組合：a.至少一種過濾器，或b.允許分離紅血球(RBC)之組成物，較佳或視情況細胞選擇凝膠(CSG)，或c.至少一種過濾器及允許分離紅血球(RBC)之組成物之組合，該組成物較佳或視情況為細胞選擇凝膠(CSG)。

在另一方面，本發明提供用於製備與至少一種生物材料組合之PC及/或BMC之容器，該至少一種生物材料較佳或視情況選自玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白、細胞萃取物或其等之任何組合，該容器之特徵在於：a)該容器包含或預填充有較佳或視情況選自玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白、細胞萃取物或其等之任何組合之生物材料，及b)視情況選用之收集裝置，其較佳或視情況包含收集固持器，可固定至該容器以用於將PC及/或BMC收集至該容器中，及c)視情況，與至少一種生物材料組合之該PC及/或BMC可被收集，較佳或視情況在閉路中，及d)該容器視情況進一步包含或預填充有凝血活化劑，其較佳或視情況選自凝血酶血清、葡萄糖酸鈣及/或氯化鈣，及 e)該容器視情況處於真空下，f)該容器視情況含有兩個或更多個腔室，其中各腔室可含有選自物質、生物材料、細胞萃取物、PC或BMC及/或凝血活化劑之組成物，其中該等組成物在其各別腔室中彼此分離，且其中該等組成物可視情況在該容器內部及或外部彼此接觸或混合在一起，其中該等腔室係藉由化學或生物學物質、膜或任何其他分離手段分離，其中該等分離手段可視情況隨時間推移崩解或可生物降解，且可適用於：i)自PC及/或BMC容器(較佳或視情況自第一方面之容器)收集PC及/或BMC，其中該轉移視情況在閉路中發生，較佳或視情況自動地發生，較佳或視情況藉由真空而發生，較佳或視情況藉由在兩個容器之間的直接接觸或經由收集裝置發生，及ii)視情況離心，及iii)將與至少一種生物材料組合之該PC及/或BMC收集或轉移至另一裝置(較佳或視情況注射器)中，較佳或視情況在閉路中發生，較佳或視情況自動地發生，及iv)視情況混合及/或倒轉。

在另一方面，本發明提供用於製備與至少一種生物材料組合之PC及/或BMC之注射器，該至少一種生物材料較佳或視情況選自玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白、細胞萃取物或其等之任何組合，該注射器之特徵在於：a)該注射器包含或預填充有較佳或視情況選自玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白、細胞萃取物或其等之任何組合之生物材料，b)視情況選用之收集裝置(較佳或視情況收集固持器)，其可固定至該注射器以用於將PC及/或BMC收集至該注射器中， c)視情況，該注射器包含或預填充有較佳或視情況選自凝血酶血清、葡萄糖酸鈣及/或氯化鈣之凝血活化劑，d)該注射器視情況含有兩個或更多個腔室，其中各腔室可含有選自物質、生物材料、細胞萃取物、PC或BMC及/或凝血活化劑之組成物，其中該等組成物在其各別腔室中彼此分離，且其中該等組成物可視情況在該注射器內部及或外部彼此接觸或混合在一起，其中該腔室係藉由化學或生物學物質、膜或任何其他分離手段分離，其中該等分離手段可視情況隨時間推移崩解或可生物降解，且可適用於：i)自PC及/或BMC容器(較佳或視情況自本發明之第一方面之容器)收集PC及/或BMC，其中該收集較佳或視情況在閉路中發生，此係藉由在該注射器與該容器之間的直接接觸或經由收集裝置發生，較佳或視情況自動地發生，及ii)視情況倒轉，及iii)視情況將與至少一種生物材料組合之該PC及/或BMC施用或注射至人類或動物上或中，較佳或視情況在閉路中發生，較佳或視情況自動地發生。

在另外的具體實例中，本發明提供如前述方面中任一個所述之容器或注射器，其進一步預填充有或包含：i)至少一種抗凝血劑，及/或ii)至少一種過濾器及/或允許分離紅血球(RBC)之組成物，較佳或視情況為細胞選擇凝膠(CSG)，較佳或視情況為觸變性凝膠，較佳或視情況為惰性聚酯CSG，及/或iii)視情況選用之至少一種生物材料，其較佳或視情況選自玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白或其等之任何組合，及/或iv)視情況選用之至少一種PC或BMC保存液，其視情況或較佳為勃脈力-A，及/或 v)視情況選用之至少一種凝血活化劑、凝血酶血清、磷酸三鈣(TCP)、骨替代物、玻尿酸組成物、葡萄糖酸鈣、葡萄糖二酸鈣、聚葡萄胺糖、絲蛋白、絲蛋白-蠶絲蛋白或絲蛋白、生長因子、甘露糖醇、膠原蛋白、白蛋白、抗壞血酸、乳脂、脂肪細胞、脂肪組織、骨髓濃縮物、潤滑素(lubricin)、cd-明膠、肉毒桿菌毒素及/或一或多種細胞萃取物，該一或多種細胞萃取物較佳為自體細胞萃取物，其選自角質細胞、骨髓、纖維母細胞、骨膜細胞或角膜細胞、黑色素細胞及蘭格漢氏細胞、脂肪細胞、諸如肌母細胞及衛星細胞之肌肉細胞、成骨細胞、軟骨細胞、臍帶細胞、幹細胞、間葉幹細胞(MSC)、前脂肪細胞、脂肪細胞、前內皮細胞、許旺氏細胞或跟腱細胞之萃取物。

在另外的具體實例中，本發明提供如前述方面或具體實例中任一個所述之容器或注射器，其特徵進一步在於：a)至少兩個容器，至少一個容器及一個注射器或至少兩個注射器可經由連接裝置連接在一起，該連接裝置使得能夠將任何物質、材料、PC、BMC、細胞萃取物或組成物自一個容器或注射器轉移至其他容器或注射器，b)該容器為管子，及/或c)該管子或注射器允許抽取約1ml至約20ml全血、骨髓、PC或BMC，較佳或視情況約2ml至約10ml，較佳或視情況約4ml，d)該容器及/或注射器為無菌及/或非致熱的，及/或e)該容器適用於製備PRP、自體PRP、PC、自體PC及/或自體BMC，及/或f)該容器適用於製備約2ml至約10ml、較佳或視情況約3ml至約6ml、較佳或視情況約4ml的PRP、自體PRP、自體PC及/或自體BMC，及/或g)該注射器預填充有或包含約0.5ml至約5ml的生物材料，較佳或視情況約2ml的生物材料，及/或h)該容器預填充有或包含約1ml至約4ml的細胞選擇凝膠，較佳或視情況約1.5 ml至約3.5ml、較佳或視情況約1.5ml、約2ml、約2.5ml或約3ml的細胞選擇凝膠，及/或i)該容器包含或預填充有約0.2ml至約1ml的抗凝血劑，較佳或視情況約0.6ml的抗凝血劑，較佳或視情況約2%至約6%、較佳或視情況約4%的檸檬酸鈉，及/或j)該容器或注射器含有約1ml至約5ml的玻尿酸，較佳或視情況約2ml的玻尿酸，及/或k)該玻尿酸呈凝膠形式，及/或l)該玻尿酸存在緩衝液中，該緩衝液較佳或視情況為磷酸鹽緩衝液，其較佳或視情況包含以下或由以下組成：氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀及水，及/或m)該玻尿酸適用於注射、美塑療法及/或施用，及/或n)每個容器存在約40mg至約200mg該玻尿酸，較佳或視情況每個容器存在約80mg該玻尿酸，及/或o)該玻尿酸之分子量為約1000kDa至約2000kDa，較佳或視情況約1550kDa，及/或p)該玻尿酸係約0.1%至約3%、較佳約1%至約2%，及/或q)該玻尿酸係藉由醱酵獲得，及/或r)該容器經預填充：1.此係在製造過程期間進行，及/或2.此係在離心之前、在將血液或骨髓收集至該容器中之前及/或之後進行，及/或3.有至少一種物質、生物材料、凝膠及/或抗凝血劑或其等之任何組合，且含於套組或醫學裝置中。

在另一方面，本發明提供由以下中之任一者組成或包含以下中之任一者之醫學裝置或套組：

a)至少一個如該等方面或具體實例中任一個所述之容器及/或至少一個如該等方面或具體實例中任一個所述之注射器。

b)至少一個本發明之第一方面之容器、至少一個本發明之第二方面之容器及/或至少一個本發明之第三方面之注射器或其等之任何組合，

c)至少一個本發明之第一方面之容器及至少一個本發明之第二方面之容器，

d)至少一個本發明之第一方面之容器及至少一個本發明之第三方面之注射器，

e)至少一個本發明之第一方面之容器、至少一個本發明之第二方面之容器及至少一個本發明之第三方面之注射器，

f)至少一個本發明之第二方面之容器及至少一個本發明之第三方面之注射器，

g)至少一個用於製備PC之本發明之第一方面之容器及至少一個用於製備BMC之本發明之第一方面之容器，

h)至少一個用於製備PC之本發明之第一方面之容器及/或至少一個用於製備BMC之本發明之第一方面之容器，及至少一個包含或預填充有細胞萃取物之本發明之第二方面之容器，及至少一個包含或預填充有玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白或其等之任何組合之本發明之第二方面之容器，

i)至少一個用於製備PC之本發明之第一方面之容器及/或至少一個用於製備BMC之本發明之第一方面之容器，及至少一個包含或預填充有細胞萃取物之本發明之第二方面之容器，及至少一個包含或預填充有玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白或其等之任何組合之本發明之第三方面之注射器，

j)至少一個用於製備PC之本發明之第一方面之容器及/或至少一個用於製備BMC之本發明之第一方面之容器，及至少一個包含或預填充有細胞萃取物之本發明之第三方面之注射器，及至少一個包含或預填充有玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白或其等之任何組合之本發明之第二方面之容器，其中該醫學裝置或套組視情況進一步包含：

k)至少一個本發明之第一方面之容器、本發明之第二方面之容器及/或本發明之第三方面之注射器或其等之任何組合，及/或

l)至少一個用於製備凝血酶血清(較佳自體凝血酶血清)之容器，及/或

m)使得能夠將任何物質、材料、PC、BMC、細胞萃取物或組成物自一個容器或注射器轉移至另一容器或注射器之連接裝置。

在另外的具體實例中，本發明提供醫學裝置或套組，其包含：a)根據本發明之第一方面之容器，及b)本發明之第一方面之容器、本發明之第二方面之容器或本發明之第三方面之注射器，及c)視情況選用之用於收集血液或骨髓之收集裝置，其較佳或視情況包含較佳或視情況具有安全鎖及蝶形針之收集固持器或由其組成，及d)視情況選用之較佳或視情況包含收集固持器及轉移裝置或由其等組成之收集裝置，其用於將PC及/或BMC收集至本發明之第一方面之該容器、本發明之第二方面之該容器及/或本發明之第三方面之該注射器中，及e)視情況選用之附件及/或單次使用之靜脈切開術材料。

在另外的具體實例中，本發明提供醫學裝置或套組，其包含：a)在真空下允許抽取約4mL的血液或骨髓之用於製備PRP或BMC之管子，其含有：ii.約2.5mL的惰性細胞選擇凝膠iii.約0.6mL的抗凝血劑，較佳或視情況為約4%之檸檬酸鈉，b)在真空下允許自該管子a)抽取約4mL的PRP或BMC之管子，其含有約2mL於磷酸鹽緩衝液中之玻尿酸凝膠，該磷酸鹽緩衝液較佳或視情況為注射用氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀及水，c)用於收集血液及/或骨髓之收集裝置，其由具有安全鎖及蝶形針之收集固持器組成，d)較佳或視情況由收集固持器及轉移裝置組成之收集裝置，其用於將PC及/或BMC自該管子a)收集至該管子b)中。

在另外的具體實例中，本發明提供醫學裝置或套組，其包含：a)在真空下允許抽取約4mL的血液或骨髓之用於製備PRP或BMC之管子，其含有：i.約2.5mL的惰性細胞選擇凝膠ii.約0.6mL的抗凝血劑，較佳或視情況為約4%之檸檬酸鈉，b)允許自該管子a)抽取約4mL的PRP或BMC之注射器，其含有約2mL於磷酸鹽緩衝液中之玻尿酸凝膠，該磷酸鹽緩衝液較佳或視情況為注射用氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀及水，c)用於收集血液及/或骨髓之收集裝置，其由具有安全鎖及蝶形針之收集固持器組成，d)較佳或視情況由收集固持器及轉移裝置組成之收集裝置，其用於將PC及/或BMC自該管子a)收集至該注射器b)中。

在另外的具體實例中，本發明提供如前述方面或具體實例中任一個所述之醫學裝置或套組，其進一步包含組織收獲套管(較佳或視情況脂肪組織收獲套管)、較佳或視情況筆直或凹形之注射用套管、活塞塞子、至少一個自黏著盤、呂埃(luer)連接器、麻醉溶液、諸如針及/或注射器之注射附件、組織收獲及混合用注射器(較佳或視情況呂埃鎖注射器)、至少一個轉移套管、夾具裝置、具有用於分配PC及/或BMC之分配器之容器、套管針、諸如氯化鈣或葡糖酸鈣之凝血活化劑的安瓿、紙口罩、用於同時釋放PC及凝血酶血清或PC、BMC、物質、生物材料或凝血活化劑之任何其他組合的裝置，其中該裝置包含至少一個注射器、噴霧施用用噴嘴、二重活塞塞子、施用器注射器固持器及/或連接器、或其等之任何組合。

在另一方面，本發明提供至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個如前述方面或具體實例中任一個所述之容器及/或注射器，其用於療法、皮膚病學、牙科學、矯形學、運動醫學、化妝品、美學、手術、眼科學、美塑療法、注射、滲入、皮下施用、創傷護理、體積增強、體積修正、機械支撐及/或黏性補充。

在另一方面，本發明提供組成物，較佳為視情況與至少一種生物材料組合之PC及/或BMC，該至少一種生物材料較佳選自玻尿酸、聚葡萄胺糖、蠶絲蛋白或絲蛋白或其等之任何組合，該組成物係使用至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個如前述方面或具體實例中任一個所述之容器及/或注射器獲得，或藉由使用如前述方面或具體實例中任一個所述之方法獲得，該組成物視情況進一步與凝血活化劑、凝血酶血清、磷酸三鈣(TCP)、骨替代物、玻尿酸組成物、葡萄糖酸鈣、葡萄糖二酸鈣、聚葡萄胺糖、絲蛋白、絲蛋白-蠶絲蛋白或絲蛋白、生長因子、甘露糖醇、膠原蛋白、白蛋白、抗壞血酸、乳脂、脂肪細胞、脂肪組織、骨髓濃縮物、潤滑素、cd-明膠、肉毒桿菌毒素及/或一或多種細胞萃取物組合，該一或多種細胞萃取物視情況或較佳為自體細胞萃取物，其選自角質細胞、骨髓、纖維母細胞、骨膜細胞或角膜細胞、黑色素細胞及蘭格漢氏細胞、脂肪細胞、諸如肌母細胞及衛星細胞之肌肉細胞、成骨細胞、軟骨細胞、臍帶細胞、幹細胞、間葉幹細胞(MSC)、前脂肪細胞、前內皮細胞、許旺氏細胞或跟腱細胞之萃取物，其中該組成物較佳或視情況用於療法、皮膚病學、牙科學、矯形學、運動醫學、化妝品、美學、手術、眼科學、美塑療法、注射、滲入、皮下施用、創傷護理、體積增強、體積修正、機械支撐及/或黏性補充。

在另一方面，本發明提供用於使創傷或組織癒合或用於促進骨或牙周生長及/或骨及/或組織(諸如皮膚、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、脂肪組織、角膜、末梢神經、脊柱或骨)再生之治療方法，此係使用至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個如前述方面或具體實例中任一個所述之容器及/或注射器來進行。

在另一方面，本發明提供如前述方面或具體實例中任一項所述之組成物、方法、醫學裝置、套組、容器或注射器在療法、皮膚病學、牙科學、矯形學、運動醫學、化妝品、美學、手術、眼科學、美塑療法、注射、滲入、皮下施用、創傷護理、體積增強、體積修正、機械支撐及/或黏性補充中之用途，其係在創傷、受損組織、受損骨或牙周缺陷或腔上/針對創傷、受損組織、受損骨或牙周缺陷或腔，用於細胞再生，用於組織黏著，用於促進創傷癒合或組織癒合及/或人類或動物之創傷或組織中之組織及/或軟骨及/或骨及/或神經之封閉及/或再生，或用於誘導患有牙周疾病或需要牙周再生之其他病況之哺乳動物之創傷或牙周缺陷中的牙周再生，或用於韌帶及/或軟骨復原，或用於促進疤痕或皺紋中之皮膚再生，或用於增加具有真皮脂肪移植物或需要脂肪組織再生之其他病況之哺乳動物中之脂肪組織體積，或用於誘導患有心肌缺陷或需要心肌再生組織再生之其他病況之哺乳動物中之心肌再生，或用於誘導患有角膜缺陷或需要角膜再生之其他病況之哺乳動物中之角膜再生，或用於誘導患有關節或軟骨缺陷或需要關節或軟骨組織再生之其他病況之哺乳動物中之關節或軟骨再生，或用於促進人類或低級動物之疤痕、皺紋或脂肪缺陷中之皮膚再生，或用於誘導患有末梢神經損傷、神經縫合或脊髓損傷或需要末梢神經再生之其他病況之哺乳動物中之末梢神經再生，或用於誘導患有骨損傷、骨缺陷或需要骨再生之其他病況之哺乳動物中之骨再生，或用於供矯形外科之用的注射及美學注射，或用於皮膚組織之再生及/或回春，尤其在促進及/或引發皮膚再生(諸如減少皮膚皺紋、深度皺紋、痤瘡、燒傷、風疹或天花疤痕、白斑病及脂萎縮)、鼻唇紋之改善及皮膚損傷或諸如皮膚燒傷、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、皮膚瘢痕瘤或杜普征氏手掌纖維瘤病(Dupuytren's palmar fibromatosis)之病症之治療中，及在減少與皮膚及組織再生相關的疼痛中，或用於創傷或組織癒合或再生治療，尤其在原生或輔助移植物之安裝及/或固持及/或封閉中之該等創傷性或手術創傷之治療；血管炎之治療；諸如糖尿病神經病性潰瘍或褥瘡、糖尿病潰瘍、穿孔潰瘍或糖尿病穿孔潰瘍之潰瘍、關節炎、骨關節炎、偽關節炎、放射性皮炎及封閉瘺管、瘺管，或用於諸如在心臟衰竭、慢性心臟衰竭、缺血性及非缺血性心臟衰竭及心肌病之治療中之心臟病症、心臟再生，或用於諸如軟骨損傷、軟骨及/或骨損傷(諸如深度軟骨損傷及/或糜爛及/或關節鏡檢查)、肌腱撕裂及肩部肩回旋肌之骨、軟骨及關節病症，或用於諸如乾眼症候群之角膜病症；諸如由化學燒傷導致之角膜混濁之角膜混濁、史蒂芬強森症候群(Steven's Johnson syndrome)病痛；角膜之結疤及角膜潰瘍，或用於末梢神經損傷、神經縫合及脊髓損傷、糖尿病創傷、大血管創傷、深度注射、內真皮注射、關節內滲入、眼藥水、洗眼劑，用於關節、肌肉損傷，在雷射之後、在脫皮之後作為遮罩，單一療法，用於閃光度、光澤度、亮度或明度。

在一個具體實例中，本發明係關於醫學裝置，其包含以下或由以下組成：a.與收集固持器組裝在一起之安全鎖蝶形針，b.預組裝轉移裝置c.在真空下允許抽取血液之管子，其含有：i)約2.5mL的惰性細胞選擇凝膠，ii)約0.6mL的抗凝血劑(例如檸檬酸鈉4%)， d.在真空下允許抽取PRP之管子，其含有約2mL於磷酸鹽緩衝液(注射用氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀及水)中之玻尿酸凝膠，且玻尿酸較佳約80mg每管子、約1550kDa且較佳由醱酵獲得。

本文所提及之所有玻尿酸均可關於由根據本發明之任何方法獲得之玻尿酸或關於根據本發明之任何玻尿酸組成物。

本發明之容器及注射器可施用於大或深度創傷上，或作為生物膠施用。

本發明之含有生物材料之容器及注射器較佳藉由潮濕蒸汽滅菌且較佳在低微生物氛圍下包裝。本發明之其他容器、注射器或組件(例如用於製備PC之管子、基礎靜脈切開術材料)較佳藉由在較佳雙重泡殼包裝之後暴露於約25kGy之最小劑量之γ照射來滅菌。

細胞選擇凝膠可在本文中稱為聚合物或觸變性凝膠。

本文所描述之其他物質可在本發明之製造方法之步驟之一或多者期間組合。

在另一方面，本發明提供藉助於填充機器自動地製造容器或血液管之方法，其包含容器或血液管之受控真空及堵塞。

在一個具體實例中，本發明之任何方面或具體實例之容器或注射器預填充有選自瓊脂、洋菜糖、膠原蛋白、聚葡萄胺糖、生長因子、抗壞血酸、白蛋白、絲蛋白、蠶絲蛋白或絲蛋白-絲蛋白或玻尿酸之物質。

瓊脂、洋菜糖、膠原蛋白、抗壞血酸、白蛋白、蠶絲蛋白或絲蛋白-絲蛋白可全部呈現適用於本發明之組成物之穩定化及/或黏度特性。在一個具體實例中，玻尿酸或聚葡萄胺糖可經以下取代或與以下組合：瓊脂、洋菜糖、膠原蛋白、抗壞血酸、白蛋白、絲蛋白及/或蠶絲蛋白或絲蛋白-絲蛋白。較佳地，玻尿酸或聚葡萄胺糖可經以下取代或與以下組合：絲蛋白或蠶絲蛋白或絲蛋白- 絲蛋白。在一個具體實例中，絲蛋白或蠶絲蛋白或絲蛋白-絲蛋白可與PC及/或BMC組合。在另一具體實例中，絲蛋白或蠶絲蛋白或絲蛋白-絲蛋白可與與PC及/或BMC組合之聚葡萄胺糖及/或HA組合。在另一具體實例中，白蛋白可與PC及/或BMC組合。在另一具體實例中，白蛋白可與與PC及/或BMC組合之聚葡萄胺糖及/或HA組合。在另一具體實例中，白蛋白可與聚葡萄胺糖及/或HA、蠶絲蛋白或絲蛋白-絲蛋白組合，且進一步與PC及/或BMC組合。

在一個具體實例中，可在本發明之任何方面或具體實例之容器或注射器中預填充選自瓊脂、洋菜糖、膠原蛋白、聚葡萄胺糖、生長因子、抗壞血酸、白蛋白、絲蛋白、蠶絲蛋白或絲蛋白-絲蛋白或玻尿酸及/或其等之任何組合之物質。

在一個具體實例中，代替玻尿酸或與玻尿酸組合，可使用或組合類似物質，例如洋菜糖、瓊脂、膠原蛋白聚葡萄胺糖、白蛋白及/或蠶絲蛋白或絲蛋白-絲蛋白及/或其等之任何組合。

較佳地，抗凝血劑為檸檬酸鹽或檸檬酸鈉。

較佳地，聚合物為觸變性凝膠。

較佳地，容器、管子、注射器、套組或裝置係用於人類使用或人類治療。在一個具體實例中，容器、管子、注射器、套組或裝置可用於動物，或適於獸醫學使用或動物治療。

較佳地，如前述方面中任一個所述之製造方法係在受控層流及/或生物負荷下執行。

容器、管子或注射器可具有不同形狀且由晶體、玻璃、塑膠或金屬製成。較佳地，容器、管子或注射器較佳由塑膠(較佳COP或COC)製成，較佳無鄰苯二甲酸酯。

在另一具體實例中，本發明提供約1000kDa至約2000kDa在約 1.5%至約2.5%濃度下、約1400kDa至約1600kDa在約1.8%至約2.2%濃度下、約1550kDa在約1.8%至約2.2%濃度、更佳約1.7%至約2%濃度下之玻尿酸(HA)。該HA尤其適於注射或滲入、內真皮注射、皮下施用、關節內滲入、瘺管及/或作為生物膠。

該等玻尿酸之組成物亦適於與血小板濃縮物、較佳富血小板血漿(PRP)之組合。HA組成物之另外的合適特徵在本文中針對與PC及BMC組合來描述。

在一個具體實例中，本發明涵蓋分子量及濃度不同之至少兩種玻尿酸之組合。

在另一方面，本發明提供包含具有不同觸變性凝膠之管子之醫學裝置，該等不同觸變性凝膠具有不同密度。

在另一方面，本發明提供具有有新穎密度之觸變性凝膠之管子，該密度適用於以靶向方式分離血液組分以用於新穎用途及應用。

在另一方面，本發明提供尤其適於細胞培養之醫學裝置。

定義及化學式：如本說明書及/或本發明中使用/就本說明書及/或本發明而言之一些定義

D-葡萄糖醛酸 N-乙醯基-D-葡萄糖胺

結構1A1(上文)：玻尿酸(HA)單體(N=1)及/或HA聚合物(N>1)之典型結構(轉載自Ahmet Tezel及Glenn H.Fredrickson,Journal of Cosmetic and Laser Therapy,2008；10：35-42)。除非上下文另外清晰地指示，否則如本文所定義之「聚合物」在其範圍內包括「寡聚物」；且單獨「聚」在其範圍內包括「寡聚」。HA聚合物為較佳的(N>1，較佳N=2至25000或更多)；HA單體為較不佳的。在上文所示之化學結構中，HA以HA之去質子化羧酸根或聚羧酸根形式之鈉鹽之形式顯示，但此不為由術語「HA」涵蓋之唯一結構。

如本文所定義之「玻尿酸」(「HA」)包括上文所示結構1A1之一種或該(等)羧酸形式及/或聚羧酸形式，且獨立地包括上文所示結構1A1之任何鹽形式，特別是任何陰離子(較佳聚陰離子)鹽形式(特別是上文所示結構1A1之任何醫藥學上可接受之金屬鹽及/或銨鹽及/或有機銨鹽，較佳上文所示結構1A1之任何醫藥學上可接受之鹼金屬鹽及/或鹼土金屬鹽，更佳上文所示結構1A1之任何鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及/或鎂鹽)。

較佳地，如本文所定義之「玻尿酸」(「HA」)包括上文所示結構1A1之一種或該(等)羧酸形式及/或聚羧酸形式，且獨立地包括上文所示結構1A1之一種或該(等)羧酸根形式及/或聚羧酸根形式及/或聚陰離子形式之任何鹽(例如上文所列之彼等鹽中之任一者，更佳任何鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及/或鎂鹽)。

類似地，如本文所定義之「交聯玻尿酸」(「XLHA」或「XL HA」)包括例如如本文概括定義之XLHA結構(例如參見上文及/或下文結構1A4(A)及/或1A4(B))之一種或該(等)羧酸形式及/或聚羧酸形式，且獨立地包括例如如本文概括定義之XLHA結構(例如參見本文結構1A4(A)及/或1A4(B))之任何任何鹽形式，特別是任何陰離子(較佳聚陰離子)鹽形式(例如上文針對HA所列之彼等鹽中之任一者)。

較佳地，如本文所定義之「XLHA」包括例如如本文概括定義之XLHA結構之一種或該(等)羧酸形式及/或聚羧酸形式，且獨立地包括例如如本文概括定義之XLHA結構(例如參見本文結構1A4(A)及/或1A4(B))之一種或該(等)羧酸根形式及/或聚羧酸根形式及/或聚陰離子形式之任何鹽(特別是任何醫藥學上可接受之金屬鹽及/或銨鹽及/或有機銨鹽，較佳任何醫藥學上可接受之鹼金屬鹽及/或鹼土金屬鹽，更佳任何鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及/或鎂鹽)。

HA可使用大量交聯劑，較佳用二環氧化物交聯劑進行交聯以形成XLHA。最常用於生物醫學應用之交聯劑為1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)，此係由於其較低毒性本質(參見例如Jeon,O.，等人，Carbohydrate Polymers,70,(2007),251257)。BDDE結構示於以下；最重要地，其結構含有兩個環氧基團，該線性有機分子之兩端各有一個：

1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)結構(上文)

較佳適用於使HA交聯之二環氧化物交聯劑(crosslinking agent/crosslinker)之較佳總括的結構示於以下：

在上文總括的二環氧化物交聯劑[結構1A3]中，顯示為「[連接基團]」之所說明之連接基團較佳為有機連接部分及/或較佳具有適用於使HA聚合物交聯，例如適用於使HA聚合物在其等之-OH基團處交聯之長度及/或結構。較佳地，[連接基團]包含長度為2至20個原子(較佳3至12個原子，例如4至8個原子，例如6個原子)之鏈。(鏈較佳為線性的，但視情況其可為分支鏈的。)更佳地，[連接基團]包含長度為2至20個(或3至12個或4至8個，例如6個)原子之鏈(較佳直鏈)，其中鏈原子包含鏈碳原子(例如作為-CH₂-或-CHMe-或-CMe₂-基團(Me=甲基))；且其中視情況，鏈原子亦包含1、2、3或4個鏈氧原子、鏈硫原子及/或鏈氮原子(較佳鏈原子亦包含1、2、3或4個、較佳1或2個鏈氧原子)。

結構1A4(A)及1A4(B)(上文)：交聯HA(XLHA)之較佳總括的結構。

左側之部分結構1A4(A)概括說明總括的交聯鏈(A)，其係藉由使總括的二環氧化物交聯劑(結構1A3)與兩個HA聚合物鏈之-OH基團反應來形成。

右側之部分結構1A4(B)概括說明總括的側鏈或基團(B)，其僅與一個HA或XLHA聚合物鏈連接，其係藉由以下形成：i)使一或該總括的二環氧化物交聯劑(結構1A3)之一個環氧基團與一個HA聚合物鏈之-OH基團反應，加上ii)使與單一HA連接之連接基團之第二環氧基團水解(例如藉由水或氫氧化物)。

為方便起見，部分結構1A4(A)及1A4(B)被顯示為均存在於兩個交聯HA鏈上之鄰接位置處-然而，此僅出於說明之目的，且XLHA結構可包括僅1A4(A)或僅1A4(B)或兩者，且A型及B型連接基團/基團之間之相對距離及A型及B型連接基團/基團之相對比例以及交聯%及側基%全部為可變化的。

在上文總括的交聯HA之結構1A4(A)及1A4(B)中，顯示為「[連接基團]」之所說明之連接基團較佳為有機連接部分及/或較佳具有適用於使HA聚合物交聯，例如適用於使HA聚合物在其等之-OH基團處交聯之長度及/或結構。較佳地，[連接基團]包含長度為2至20個原子(較佳3至12個原子，例如4至8個原子，例如6個原子)之鏈。(鏈較佳為線性的，但視情況其可為分支鏈的。)更佳地，[連接基團]包含長度為2至20個(或3至12個或4至8個，例如6個)原子之鏈(較佳直鏈)，其中鏈原子包含鏈碳原子(例如作為-CH₂-或-CHMe-或-CMe₂-基團(Me=甲基))；且其中視情況，鏈原子亦包含1、2、3或4個鏈氧原子、鏈硫原子及/或鏈氮原子(較佳鏈原子亦包含1、2、3或4個、較佳1或2個鏈氧原子)。

附註：XLHA之確切形式及/或XLHA之鹽形式(若存在)及/或任何交聯鏈(例如在上文結構1A4(A)中)及視情況選用之任何側鏈(例如在上文結構1A4(B)中)的位置(在XLHA聚合物內)及/或比例或百分比可相對於上文結構中之所示內容大大變化，該上文結構中之所示內容僅出於說明目的而作為實例結構。側鏈(例如具有上文結構1A4(B)中所示之類型)為視情況選用的-其可或可不存在於XLHA中。交聯鏈(較佳具有上文結構1A4(A)中所示之類型)存在於交聯玻尿酸(XLHA)中。XLHA在上文以聚陰離子(聚羧酸根)形式且以鈉鹽形式顯示；然而，在本發明中，XLHA之任何形式(例如聚陰離子或酸性或其他)及/或XLHA之任何鹽形式均為有可能的。

在本發明及本說明書中，「滯留時間」較佳係根據ISO_10993-6_2016中所揭示之方法來定義及/或量測(亦即或較佳地，線性HA在1個月之後完全降解)。特別地，在本發明中，例如由於XLHA之交聯網路，凝膠及/或XLHA較佳具有長於非交聯(非XL)HA凝膠(例如對應及/或典型及/或習知非XL HA凝膠)之滯留時間(通常約30天滯留時間)之滯留時間。

數目平均分子量M _n：為樣本中之所有聚合物鏈之統計平均分子量，且由

定義，其中M_i為鏈之分子量且N_i為具有彼分子量之鏈之數目。若引用M_n用於分子量分佈，則在呈該分佈之M_n之任一側上存在相等數目之分子。

重量平均分子量M _w：由

定義。與M_n相比，M_w在決定對分子量平均值之貢獻考慮鏈之分子量。鏈愈大，鏈對Mw貢獻愈多。若引用M_w用於分子量分佈，則在呈該分佈之M_w之任一側上存在相等重量之分子。

對於所有合成之多分散聚合物：M _n <M _w。

多分散性指數用作聚合物之分子量分佈之寬度之量度，且由以下定義：

多分散性指數愈大，分子量愈寬。其中所有鏈長均相等之單分散聚合物(諸如蛋白質)之M_w/M_n=1。最佳受控合成聚合物(用於校正之窄聚合物)之M_w/M_n為1.02至1.10。步驟聚合反應典型地產生約2.0之M_w/M_n值，然而鏈反應產生介於1.5與20之間之M_w/M_n值。

附註：當於本文提及「分子量」及/或就本發明而言提及「分子量」時，則除非另外說明，否則其係指重量平均分子量M _w及/或數目平均分子量M _n；且較佳指重量平均分子量M _w。

固有黏度：反映於溶液中之聚合物增強溶液黏度之能力。

折射率增量dn/dc：折射率增量應用於在特定條件下之樣本。舉例而言，溫度、雷射波長、分子構形或添加劑影響dn/dc之絕對值。因此，對於完美靜態光散射實驗，應確定在考慮中的條件下之準確dn/dc。在許多切實可行之實例中，值可得自在類似條件下得出之先前數據組(或自文獻參考文獻)。

流體動力半徑R _h ：如藉由動態光散射所量測，定義為與被觀測之分子以相同之速率擴散之等效硬球體之半徑。實際上，蛋白質及其複合物之溶液不以硬球體之形式存在，且因此所測定之流體動力半徑更緊密地反映溶合翻滾分子所採用之視尺寸。

馬克-霍溫克-櫻田(Mark-Houwink-Sakurada)關係MHS：在連結經分成數部分之樣本之固有黏度及分子量方面作用良好之實驗關係。其係用於完成給定聚合物之構形分析。

複數黏度：複數剪切模數。對材料之變形的總抗性，不論該變形為可恢復的(彈性)或非可恢復的(黏性)。符號G*複數黏度=黏度-i ^x 彈性

共享模數：(由改變應變產生)為剪應力與剪應變之比。其係由與上文關係類似之複數關係推斷出：G*=G'+iG"

其中G*為複數剪切模數，G'為同相儲存模數，且G"為異相類似定向損耗模數；

。

交越頻率：其中此等參數交越之頻率，對應於特異於材料之鬆弛時間(t)。

Tan δ：tan(δ)=G"/G'定量能量損耗與儲存之間之平衡。當tan(45°)=1時，大於整體之tan(δ)之值表明更「液體」之特性，然而低於整體之值意謂更「固體」之特性，無論黏度為何。

溶脹度：可經由線性尺寸變化或經由體積變化測定之聚合物中之溶脹程度。大部分聚合物係藉由溶劑(包括水)吸收(水合)而溶脹。

II.細胞培養

此外，本發明提供高度創新、有效、快速且可再現性GMP醫學裝置，以由患者自身之血液或骨髓產生富血小板血漿、血清或單核細胞的標準化製劑，該標準化製劑待用作胎牛血清(FBS)之替代物以用於培養患者自身之細胞以用於再生目的(細胞療法、免疫療法、神經退化治療...)。

本發明提供醫學裝置，其用於製備自體富血小板血漿(PRP)或血清，該血漿或血清待取代FBS用作細胞培養基補充物以在不含異源成分之條件中用於細胞療法應用。

用於治療應用之細胞培養應在GLP實驗室中使用以GMP條件製造之經認證裝置進行。本發明之醫學裝置實現此等條件。其等允許藉由在閉路系統中之單一步驟離心來快速製備自體富血小板血漿或血清。約5.5ml的PRP或4ml的血清係自10ml的靜脈血液獲得，因此所收集之血液管之數目可適於達到最終產物之所欲體積。

有利地，由本發明之醫學裝置獲得之PRP或BMC可用於免疫療法中。免疫療法為使用患者之免疫系統之細胞對抗諸如癌症之疾病之治療。免疫療法包括以不同方式起作用之治療。一些免疫療法以極一般方式加強身體之免疫系統。其他免疫療法幫助訓練免疫系統特異性地攻擊癌細胞。快速浮現的免疫療法方法稱為授受性細胞轉移(adoptive cell transfer；ACT)：收集且使用患者自身之免疫細胞以治療其癌症。存在數種類型之ACT，但最接近產生經食品藥物管理局(FDA)批准之治療者稱為CART-細胞療法，且在白血病及淋巴瘤療法中帶來希望。關於其方法，自患者收集T細胞且隨後在實驗室中經工程改造。

傳統地，對於自患者之血液分離單核細胞，實驗室使用菲科爾-帕克密度梯度培養基(Ficoll-Paque density gradient media)。此方法為耗時的，需要數個長離心且因此意味著大量步驟，於該等步驟中細胞可能受損。

本發明之特定醫學裝置允許自患者血液或骨髓特異且快速地分離血液單核細胞。

此系統允許製備PRP以及患者之單核白血球(MNC)。

幹細胞及神經退化性疾病為吾等創新之另一應用領域。

在此上背景中，在再生醫學中作了大量努力以在將神經元幹細胞移植至患者中之前使其等擴增。限定培養基為可獲得的，但在其活體內命運及其分化上仍存在大量問題。此等細胞之試管內培養係以神經球形式或以單層形式達成。神經球呈現壞死及自發分化問題，但與單層培養不同，其不需要供細胞黏著之基質。對於此等兩個缺點，本發明之用於細胞培養的裝置可充當用於單層培養之置換基質或充當用於神經球三維培養之營養支持。

本發明包含意欲用於由患者血液或骨髓快速、有效、可靠且標準化地製備PRP、血清或MNC之方法及套組。

此等裝置亦適用於動物研究及療法。

尤其適用於細胞培養(但仍可用於PC或BMC製備)之裝置具有以下共同特點：

i)容器，例如管子或注射器。較佳地，管子由硼矽酸鹽製成。較佳地，管子含有聚矽氧，且經去熱源。較佳地，管子處於真空下且具有塞子。

ii)複合牛頓聚合物(complex Newtonian polymer)，作為用於藉由重力進行之細胞分離之添加劑。較佳地，複合牛頓聚合物為觸變性凝膠。較佳地，觸變性凝膠為具有視黏度及密度而定之作用模式之大聚合物複合物。較佳地，觸變性凝膠為寡聚物，較佳聚烯烴寡聚物或丙烯酸樹脂混合物。觸變性凝膠可為PEG-矽膠。

觸變性凝膠可含有額外物質或其等效物作為參(2-乙基己基)苯 -1,2,4-三甲酸酯、二氧化矽、矽烷、二氯二甲基反應產物及/或二氧化矽。觸變性凝膠之特徵可進一步在於：不溶於水中，部分可溶於丙酮中，及可輕易地溶於己烷中。此外，觸變性凝膠之特徵可在於在15℃下約400Pa.s至700Pa.s、在25℃下約100Pa.s至250Pa.s、在45℃下30Pa.s至100Pa.s及在65℃下10Pa.s至80Pa.s之黏度。

出於細胞培養之目的，已經由實驗確定，以下裝置尤其適用且提供出人意料且有效之結果。

i)含有作為添加劑之密度為約1.03g/cm3至約1.05g/cm3之觸變性凝膠之裝置在本文中稱為CC-PRP。此類裝置使得能夠收集「純」PRP。較佳地，密度為約1.04g/cm3至約1.05g/cm3。該裝置進一步含有作為添加劑之抗凝血劑，較佳檸檬酸鈉，較佳濃度0.1M。較佳地，該裝置僅含有此等兩種添加劑，亦即觸變性凝膠及抗凝血劑。觸變性凝膠較佳作為例如自管子之封閉末端開始之第一層存在於裝置中，接著為由抗凝血劑組成之第二層。有利地，該裝置使得能夠快速製備除RBC及多核細胞以外之PC或BMC、不具有單核白血球(MNC)之PC或BMC、白血球耗乏之PRP、PC或BMC。

ii)含有作為添加劑之密度為約1.05g/cm3至約1.095g/cm3之觸變性凝膠之裝置，在本文中稱為MC-PRP。有利地，該裝置使得能夠自患者血液或骨髓特定且快速地分離血液單核細胞。有利地，該裝置允許製備PRP、PC或BMC以及患者單核白血球(MNC)、富白血球PC、BMC或PRP。較佳地，密度為約1.08g/cm3至約1.09g/cm3或1.075g/cm3至約1.09g/cm3。最佳地，密度為約1.075g/cm3至約1.08g/cm3。該裝置進一步含有作為添加劑之抗凝血劑，較佳檸檬酸鈉，較佳濃度0.1M。較佳地，裝置僅含有此等兩種添加劑，亦即觸變性凝膠及抗凝血劑。觸變性凝膠較佳作為例如自管子之封閉末端開始之第一層存在於裝置中，接著為由抗凝血劑組成之第二層。

iii)僅含有作為添加劑之密度為約1.3g/cm3至約1.05g/cm3之觸變性凝膠之裝置，在本文中稱為CC-S。有利地，該裝置使得能夠快速製備凝血酶血清。

iv)在本文中稱為CC-HA的含有以下作為添加劑之裝置：a.觸變性凝膠，其密度為約1.03g/cm3至約1.05g/cm3或如上文在點i)下所提及，b.抗凝血劑，較佳檸檬酸鈉，較佳濃度0.1M，及c.玻尿酸。玻尿酸可為非交聯或交聯的。較佳地，玻尿酸具有約1500kDa之分子量且為約1.5%至約2%、較佳約2%。玻尿酸可為由本文所描述之方法獲得之交聯玻尿酸。分子量可在500kDa至9000kDa範圍內。較佳地，該裝置僅含有此等三種添加劑，亦即玻尿酸、觸變性凝膠及抗凝血劑。玻尿酸較佳作為例如自管子之封閉末端開始之第一層存在於裝置中，接著為由觸變性凝膠組成之第二層，接著為由抗凝血劑組成之第三層。有利地，該裝置使得能夠快速製備與HA組合之PC或BMC。HA可經另一生物材料取代。

v)在本文中稱為MC-HA的含有以下作為添加劑之裝置：d.觸變性凝膠，其密度為約1.05g/cm3至約1.09g/cm3 cm3或如上文在點ii)下所提及，e.抗凝血劑，較佳檸檬酸鈉，較佳濃度0.1M，及f.玻尿酸。玻尿酸可為非交聯或交聯的。較佳地，玻尿酸具有約1500kDa之分子量且為約1.5%至約2%、較佳約2%。玻尿酸可為由本文所描述之方法獲得之交聯玻尿酸。分子量可在500kDa至9000kDa範圍內。較佳地，該裝置僅含有此等三種添加劑，亦即玻尿酸、觸變性凝膠及抗凝血劑。玻尿酸較佳作為例如自管子之封閉末端開始之第一層存在於裝置中，接著為由觸變性凝膠組成之第二層，接著為由抗凝血劑組成之第三層。有利地，該裝置使得能夠快速製備與HA組合之PC或BMC。HA可經另一生物材料取代。

抗凝血劑之濃度可不同於0.1M，範圍為0.05至0.15M，或較佳 0.08M至0.14M，或大於0.08M，較佳大於0.09M。

已在約25℃之溫度下量測所提供之密度(可稱為重力)。

由此等裝置生產之血液製劑可單獨或以組合形式使用：此等產物、組成物可用於細胞療法研究/療法中。

細胞培養中之上文裝置之組合已提供人意料之結果及特定優點：CC-S+CC-PRP：存在於CC-S中之自體凝血酶會再活化PRP製劑中之凝血且允許形成血小板被捕捉在其中之纖維蛋白基質。

CC-S+MC-PRP：PRP：存在於CC-S中之自體凝血酶會再活化PRP製劑中之凝血且允許形成單核細胞及血小板被捕捉在其中之纖維蛋白基質。

CC-PRP+MC-PRP：為組合來自兩個不同製劑之PRP且為使其與透過MC-PRP裝置特定分離之單核細胞一起之生長作用達到最大。

CC-HA：允許PRP及玻尿酸在同一製劑中以適合於細胞培養之給定密度組合的單一裝置。

本發明涵蓋由任何裝置或其組合獲得之血小板溶胞產物。

自由CC-PRP產生之製劑，血小板溶胞產物可藉由遵循此實驗指引來生成：緊接在製備之後，將PRP製劑冷凍至至少-20℃且無進一步操作。為利用，在37℃(水浴)下解凍在本文中稱為HPL之人類血小板溶胞產物直至冰凝塊消失為止。不使HPL升溫。

本發明涵蓋自血液或骨髓獲得之CC-PRP、MC-PRP、CC-S、CC-HA或其等之任何組合。

技術組合

本發明涵蓋但不限於以下組合：

- 來自血液之CC-PRP+MC-PRP

- 來自骨髓之CC-PRP+MC-PRP

- CC-PRP+來自同一患者之經分離之細胞(來自不同來源之角質細胞、纖維母細胞、骨髓、骨膜細胞或角膜細胞、黑色素細胞及蘭格漢氏細胞、脂肪細胞、肌肉細胞(肌母細胞、衛星細胞)、成骨細胞、軟骨細胞、臍帶細胞、許旺氏細胞、肌腱細胞、間葉幹細胞)

- 自來自血液之CC-PRP+MC-PRP獲得之HPL

- 自來自骨髓之CC-PRP+MC-PRP獲得之HPL

- 自CC-PRP+來自同一患者之經分離之細胞(來自不同來源之角質細胞、纖維母細胞、骨髓、骨膜細胞或角膜細胞、黑色素細胞及蘭格漢氏細胞、脂肪細胞、肌肉細胞(肌母細胞、衛星細胞)、成骨細胞、軟骨細胞、臍帶細胞、許旺氏細胞、肌腱細胞、間葉幹細胞)獲得之HPL

- 來自血液之CC-S+MC-PRP

- 來自骨髓之CC-S+MC-PRP

- CC-S+來自同一患者之經分離之細胞(來自不同來源之角質細胞、纖維母細胞、骨髓、骨膜細胞或角膜細胞、黑色素細胞及蘭格漢氏細胞、脂肪細胞、肌肉細胞(肌母細胞、衛星細胞)、成骨細胞、軟骨細胞、臍帶細胞、許旺氏細胞、肌腱細胞、間葉幹細胞)

- 來自血液之CC-S+CC-PRP+MC-PRP

- 來自骨髓之CC-S+CC-PRP+MC-PRP

- CC-S+CC-PRP+來自同一患者之經分離之細胞(來自不同來源之角質細胞、纖維母細胞、骨髓、骨膜細胞或角膜細胞、黑色素細胞及蘭格漢氏細胞、脂肪細胞、肌肉細胞(肌母細胞、衛星細胞)、成骨細胞、軟骨細胞、臍帶細胞、許旺氏細胞、肌腱細胞、間葉幹細胞)

- 來自血液之CC-HA+MC-PRP

- 來自骨髓之CC-HA+MC-PRP

- CC-HA+來自同一患者之經分離之細胞(來自不同來源之角質細胞、纖維母細胞、骨髓、骨膜細胞或角膜細胞、黑色素細胞及蘭格漢氏細胞、脂肪細胞、肌肉細胞(肌母細胞、衛星細胞)、成骨細胞、軟骨細胞、臍帶細胞、許旺氏細胞、肌腱細胞、間葉幹細胞)

- 來自血液之MC-HA+MC-PRP

- 來自骨髓之MC-HA+MC-PRP

- MC-HA+來自同一患者之經分離之細胞(來自不同來源之角質細胞、纖維母細胞、骨髓、骨膜細胞或角膜細胞、黑色素細胞及蘭格漢氏細胞、脂肪細胞、肌肉細胞(肌母細胞、衛星細胞)、成骨細胞、軟骨細胞、臍帶細胞、許旺氏細胞、肌腱細胞、間葉幹細胞)

自體或同種異體PRP可用於細胞培養。

此外，白蛋白凝膠可以用作用於細胞培養之撐體或基質。白蛋白凝膠可以單層使用或以中間具有細胞培養基之雙層(類似三明治)使用。

其中可單獨或組合使用此等製劑之治療領域概述：

- 細胞療法：幹細胞、多潛能細胞或再程式化成體細胞在用於治療疾病之細胞療法中之使用需要在活體外生長細胞。CC-PRP及CC-S為用於在自體細胞療法中置換FBS之有效產物。治療領域包括但不限於再生醫藥、皮膚、創傷癒合、創傷護理、組織再生、作為美學及整形手術程序中之皮膚填充劑、皮膚護理、肌肉骨胳(MusculoSkeletal；MSK)、肝臟再生、婦科泌尿學及血管生成。

- 組織工程改造：受損組織再生需要創建骨架，在該骨架中患者自身之細胞可增殖且維持各組織類型之生物功能。細胞培養產物(與CC-S組合之CC-PRP)形成富含支持細胞增殖及組織再生之生長因子之三維纖維蛋白骨架。

- 免疫療法：對抗癌症之淋巴球之使用需要自患者自身之身體取得其等。隨後，在再注射至患者中之前，活體外活化淋巴球。MC-PRP允許快速且容易地分離待用於免疫療法中之淋巴球。

有利地，本發明之細胞培養裝置允許自患者之血液或骨髓特定且快速地分離血液單核細胞：細胞培養管技術。

本發明亦提供可以包含以下組分之醫學裝置(可稱為套組)：

i)對於CC-PRP：套組為6×CC-PRP管子(10ml)

管子內容物

- 分離凝膠

- 檸檬酸鈉(抗凝血劑)

ii)對於MC-PRP：6×MC-PRP管子(10ml)

iii)對於CC-S：套組包含6×CC-S管子(10ml)

套組可包含以下額外材料：

- 血液收集附件組

- 水平頭(旋翼式)或固定45°角度轉子離心機。

有利地，以下結果係利用本發明之裝置獲得：CC-PRP：血小板回收率：80%，血小板濃度因數：1.6×

MC-PRP：血小板回收率：95%，血小板濃度因數：在單核細胞回收之情況下1.7×。

有利地，本發明之裝置不誘發發炎反應。

使用CC-S，有利地，其帶來營養因子且亦帶來自體凝血酶以製造血小板凝膠。與CC-S之組合出乎意料地使得基質能夠用於細胞之3D培養或使得基質能夠用於塗佈2D培養用盤，且改善細胞接附及細胞類型分化。

本發明之裝置尤其適用於3D培養及例如用於培養物或骨架材料之基質、載體之形成。

裝置可係取代及/或與以下組合：合成共聚物、陶瓷及玻璃-陶瓷、天然材料及合成材料之生物人工共混物。

圖1及圖2顯示可例如用於使HA交聯以形成XLHA之方法容器。

圖3顯示允許促炎性顆粒球(Granulo)之優先耗乏(87%)之MC-PRP裝置。與PRP一起濃縮之剩下的白血球大多為淋巴球(Lympho)及單核球(Mono)。

圖4顯示由於血小板存在呈現於充當用於營養素及生長因子持續釋放之儲集器之血漿中而允許持續MNC生存力的MC-PRP裝置。

圖5顯示由患者自身之血液製備之AT-MSC培養補充物相較於利用10% FBS製備之典型培養基而言大幅度增強試管內增殖。

圖6顯示對來自同一患者之NHDF之PRP增殖功效，如圖6(A)中所示。NHDF藉由酶消化與新鮮皮膚樣本分離且以相同密度經接種以用於試管內培養。在5天培養之後，漸增濃度的PRP顯著增強細胞增殖(光學顯微鏡術圖片)，如圖6(B)中所示。在併入紫色染料之後，進行細胞增殖之流動式細胞量測術分析。結果以誘導倍數表示，如圖6(C)中所示。在B圖中繪製數據之代表性密度曲線圖。

圖7為通用線性HA樣本(綠色及黑色)及樣本04D18-D AS(a)、10D18-D AS(b)、26C18-D(c)及ARV-HA-40-3 18D04(d)之可溶性級分之馬克-霍金(Mark-Howking)曲線。參見下文實施例1B。

圖8(G'及G"對頻率)顯示示出呈不同頻率(Hz)之函數之G'及G"值的圖。細節參見下文實施例1B。

圖9為呈不同頻率(Hz)之函數之複數黏度值之圖。細節參見下文實施例1B。

圖10顯示在與樣本21K17-D AS(□)及線性HA(□)之BTH 0.5U/ml一起培養後記錄之Mw。細節參見下文實施例1B。

圖11顯示數種具有Mw>500kDa(a)及MW<200kDa(b)之樣本級分(wt%)變化。細節參見下文實施例1B。

圖12顯示根據文獻中所報導之評分發現之值/參數。細節參見下文實施例1B。

圖13顯示血液及PRP細胞計數。與利用CC-PRP裝置製備之富血小板血漿(PRP)相比之全血中之血小板(PLT×105)、白血球(WBC×103)及紅血球(RBC×106)數目之分析。(****p<0.0001)。N=10名患者。

圖14顯示在7天培養之後在存在FBS 10%或PRP(5-20%)之情況下NHDF之亮視野光學攝影。放大10×。圖片為一個供體之代表。使用CellTrace紫(活體染料)藉由流動式細胞量測術評估PRP增殖功效。達7天對NHDF的增加PRP濃度之增殖功效(1-50%)，相較於FBS 10%(n=10名不同患者)在完整自體系統(來自同一患者之細胞及PRP)中無培養基更換。

圖15顯示NHDF中之PRP依賴型細胞週期調節，如圖15(A)中所示。在利用PRP 50%進行之治療之48h培養之後之NHDF的描述性細胞週期數據。直方圖指明'G2/M'階段遏制中之細胞數目增加及'G1'階段中之細胞數目降低。在48h處理之後之G1/G0、S及G2/M階段中之細胞數目圖示，如圖15(B)中所示，及7天處理，如圖15(C)中所示。

圖16 圖16(A)顯示描繪在不同培養基中培養48h之NHDF中之MTT甲臢之細胞定位的代表性亮視野顯微鏡術影像。經FBS處理之NHDF顯示細胞質內深色顆粒而經PRP處理之NHDF顯示經擠出之甲臢晶體。經溶解之甲臢定量(吸光度量測(570nm))，如圖16(B)中所示。數據係以平均值+/- SD呈現。**p<0.01，****p<0.0001。

圖17顯示長期PRP處理(7天)促進NHDF細胞形狀改變，使纖維母細胞緊密地模擬肌纖維母細胞分化，如圖17(A)中所示。評估F-肌動蛋白細胞骨架重組。明顯的肌動蛋白微絲束在經PRP處理之細胞中沿細胞質出現，如圖17(B)中所示。

圖18 圖18(A)顯示與FBS 10%相比之4天經PRP刺激之NHDF之α-SMA陽性細胞之流動式細胞量測術直方圖重疊。圖18(B)顯示在於培養基中存在FBS 10%或PRP(20-50%)之情況下在7天培養之後NHDF上之波形蛋白(vimentin)(上行)及α-SMA(下行)免疫螢光。細胞核經DAPI對比染色。

圖19顯示NHDF至層連結蛋白及膠原蛋白I之黏著之短期PRP作用。NHDF經FBS 10%或PRP 10%刺激15min、30min或4h。移除未接附之細胞，且已黏著細胞經甲醇固定且染色有0.1%結晶紫，如圖19(A)中所示。隨後，溶解細胞，且使用微定量盤讀取器(在590nm下之光密度)定量所釋放之染料，如圖19(B)中所示。槓指示標準差。複本數目：介於10與20孔/實驗條件之間。*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。

圖20顯示在NHDF培養中PRP 10%處理對細胞遷移之比較細胞功效。圖20(A)顯示如在8h之後以利用毒傘素(phalloidin)免疫螢光染色證明，遷移纖維母細胞使刮痕區之寬度變窄。細胞遷移前端在經FBS 10%處理之細胞中沿同等分佈，而其在經PRP 10%處理之細胞中不太均勻。圖20(B)為顯示FBS 10%培養中之經分離之細胞遷移及PRP 10%培養中之總體細胞遷移的放大圖片。圖20(C)顯示在創傷癒合分析中8h利用漸增濃度之PRP進行之處理對NHDF遷移的作用。

圖21顯示用含有FBS 10%或PRP 10%之培養基處理4天之NHDF之陣列CGH 特徵。圖21(A)為g13.2區中之染色體4上之可比較同型組合刪除之實例，且圖21(B)為q29區中之染色體3上之可比較良性異型組合刪除。

提出實施例以便說明本發明但決非限制本發明。

實施例 實施例1-玻尿酸

使用本文所描述之方法，已以細菌醱酵之HA為起始物合成交聯玻尿酸(本文亦稱為XLHA)以獲得具有以下規格之產物：

1. 2%最大HA含量

2. 20%最大交聯度

3. 60Pa.s作為最高複數黏度值

4. 2ppm最大殘餘BDDE濃度

5.可用套管22G1/2或27G1/2輕易注射

已進行數個實驗以便得到具有極少BDDE方染之玻尿酸。出乎意料地，本發明之方法提供極少BDDE方染，即使其相比於先前已知方法涉及較少步驟、更快且具成本效益。

有利地，亦獲得具有以下規格之交聯HA：

- 藉由醱酵獲得之來自HA之交聯玻尿酸。

- 交聯百分比：10-50%

- 交聯劑：在鹼性條件中之BDDE

- 交聯HA再吸收時間：3-4個月(可吸收產物範圍=3-6個月)

- HA濃度：2%

- BDDE殘餘物：<2ppm

- 均質凝膠

- 黏彈性凝膠

- 可用套管22G1/2或27G1/2輕易地注射

- 複數黏度：對於注射器，最大值60Pa.s

- 彈性：最大值50%

- 不含局部過度交聯之「閃斑」

- 交聯HA之密度應低於分離凝膠之密度以便在離心之後在後者內遷移

- 可於管子中使用以製備PRP+HA或BMC+HA(HA應易於與PRP或BMC混合)且可於注射器2ml及35ml中使用。

- 根據ISO 10993，生物相容性

- 藉由蒸汽滅菌

- 非致熱

- 製造過程可再現且穩定

HA纖維及粉末兩者均已用於非XLHA之生產及其等之不同水合品質。

對於所產生之各批次，當已要求用於計算交聯百分比之分析時，已測定殘餘BDDE之量。

已執行包含兩種不同量之BDDE、從而包含兩種不同最終交聯%之兩種不同合成。旋轉/回轉混合以及袋被用於製備XL產物。

本文揭示用於產生XLHA之適用於過程自動化之連續一鍋法。有利地，該方法使可調諧黏度成為可能。有利地，根據最終應用在方法開始時選擇分子量，對於需要達到某一最終值之濃度亦如此，以預先規劃所有過程以便達到所想要之值。

已使用此方法產生數個批次。

如圖1中所示，第一階段為纖維/粉末之水合：

(1)在反應器中轉移聚合物纖維/粉末，隨後封閉反應器。隨後，在攪拌下經由進料容器添加溶劑，同時過濾(220μm)。作為替代方案，在已封閉反應器之情況下，使用固體埠添加粉末，隨後添加如上文所描述之溶劑。

(2)在使混合物均質化之後，添加含有交聯劑之鹼性溶液，量測pH

(3)隨後，使溫度升高至50℃。在2小時之後，使混合物返回至室溫。

(4)藉由添加酸來執行中和步驟。經由進料容器添加於PBS中之HCl溶液，同時過濾。檢查pH以確認已達到生理條件。中性pH會已降低HA反應性，此係因為羥基較不質子化，因此反應性較低。

(5)將混合物在4℃下保持攪拌隔夜且在此階段結束時再次檢查pH。低溫亦會降低系統反應性且允許在無進一步交聯之情況下完全均質化。

(6)最後，使混合物返回至室溫，且添加某量之未交聯HA以獲得支撐分離凝膠所需且允許與PRP混合之黏度。經由進料容器添加聚合物且將其攪拌直至完全均質化為止。

(7)在此時收集凝膠，同時過濾(280μm)

參見圖1。

於此方式，會在封閉環境中在不使凝膠暴露於可能之污染之情況下執行整個合成方法，此連續方法會在整個方法期間允許合成混合物更佳均質化，操作會降低至零，因此時間始終較短。

該方法之最終階段為藉由滲析進行之純化。很大程度上因為以下者所以使用此方法：允許分離具有不同尺寸且兩者均可溶於同一溶劑中之分子。在純化期間，未反應BDDE藉由通過滲析膜來排除，同時水進入使聚合物進一步溶脹。達到最終濃度，且殘餘BDDE已以痕量存在且在滅菌之後進一步減少。

實際上，已測試所產生且在不同溫度下經不同膜純化且經進一步滅菌或脫氣之所有批次之殘餘BDDE之量。

所獲得之XLHA可有利地用於產生用於製備與玻尿酸組合之A-PRP之醫學裝置。

以下為製備本發明之交聯HA之方法之一個具體實例：

用於製備本發明之交聯HA之材料示於圖2中，概述如下：

在較佳具體實例中，本發明使用「一鍋」系統代替Turbula。此外，較佳使用錨式攪拌器裝置或容器代替葉輪。錨式攪拌器容器產生改善之HA組成物特性。已意外地發現，「一鍋」方案在用於製備玻尿酸時提供以下諸多優點：

附註：所考慮之時間及操作係指方法本身，不包括為簡單起見視為相等之溶液製備及加熱及冷卻時間

實施例1A-合成交聯(XL)玻尿酸(HA)，以非交聯HA及BDDE作為交聯劑為起始

主題：合成及開發Regen Matrix^TM產品，作為Cellular Matrix^TM(HA+PRP)產品之後繼產品。開發含有在一鍋反應中合成之XLHA之Regen Matrix^TM管子(及/或注射器)，以用於製備[PRP+XLHA]混合物(例如溶液)，以用於皮膚護理及關節保護。

實施例1A：概述

已以經細菌醱酵之玻尿酸(HA)為起始物合成交聯玻尿酸(XLHA)(在此特定合成中，HA呈聚陰離子形式且以鈉鹽形式存在)，以獲得具有如下特定規格之產物：2%最大含量之HA(參見例如WO 2004/014399 A1，“Process for preparing a sterile high molecular weight hyaluronic acid formulation”)；20%最大交聯度(參見例如Jeon,O.，等人，Carbohydrate Polymers,70,(2007),251-257)；60 Pa.s作為最高複數黏度值(參見例如http：//www.rheosense.com/applications/viscosity/drug-injectability，及/或參見例如Nicholls,M.等人，Clinical Medicine Insights：Arthritis and Musculoskeletal Disorders,(2018),11,1-5)；2ppm最大殘餘BDDE濃度(參見例如De Boulle,K.，等人，Dermatol.Surg.,2013；39：1758-1766)；可用類型/規格22G1/2或27G1/2之套管(針)輕易地注射。

針對調配選擇之參數係基於已由RegenLab^TM生產之Cellular Matrix^TM管子，基於已在文獻中報導之數據且基於已在Regenlab^TM內執行之非XLHA之生產。

在此實施例1A中，吾等報導在研究及開發期間執行之關於所查詢之文獻、所提出之合成器具及所規劃及執行之合成實驗及/或測試的活動。

HA纖維及HA粉末兩者均已用作起始材料，此係因為其等已由Regen Lab^TM選擇用於產生非XL HA及其等之不同水合品質。在合成視角下，咸信在HA纖維與HA粉末之間不存在或存在極少差異(除了HA粉末較佳需要更長水合時間以外)，此係因為咸信若M.W.實質上在相同範圍內，則試劑之間之反應性及比率不改變。

當繼續進行開發時，HA纖維已由於其可獲得性而更頻繁地用於合成。出於合成之目的，已確定一旦分子量實質上落入相同範圍(較佳地，約1500kDa)內且水合階段完成時，所用HA不影響結果。

對於所產生之各個批次XL HA，可測定或已測定XL HA產物中之殘餘BDDE之量(濃度)。此外，可進行或已進行使得能夠計算XL HA產物中之交聯百分比之分析。

實施例1A：前言

玻尿酸(「HA」，亦稱為玻尿酸)為包含重複(1、2、3個或更多個)雙糖單元(D-葡萄糖醛酸及N-乙醯基-D-葡萄糖胺)之糖(特定言之葡萄糖胺聚糖)(參見例如下文結構1A1)。

於生理pH，HA通常以聚陰離子聚合物(例如寡聚物)形式存在，其中在D-葡萄糖醛酸部分內，一些或所有(典型地大部分或所有，更典型地實質上所有)羧酸(-COOH)基團經去質子化(亦即以羧酸根基形式存在)。較佳地及/或通常，例如在生理pH及/或生理條件下，HA至少部分地(典型地大部分)以鈉鹽(典型地HA之一種或該羧酸鹽/聚羧酸鹽形式之一種或該鈉鹽)形式存在。此較佳及/或常見之HA及其鈉鹽之陰離子/聚陰離子(例如羧酸鹽/聚羧酸鹽)形式以下文結構1A1中所示之雙糖結構表示(轉載自Ahmet Tezel及Glenn H.Fredrickson,Journal of Cosmetic and Laser Therapy,2008；10：35-42)。

D-葡萄糖醛酸 N-乙醯基-D-葡萄糖胺

結構1A1：玻尿酸(HA)單體(N=1)及/或HA聚合物(N>1)之典型結構(轉載自Ahmet Tezel及Glenn H.Fredrickson,Journal of Cosmetic and Laser Therapy,2008；10：35-42)。除非上下文另外清晰地指示，否則如本文所定義之「聚合物」在其範圍內包括「寡聚物」；且單獨「聚」在其範圍內包括「寡聚」。HA聚合物為較佳的(N>1，較佳N=2至25000或更多)；HA單體為較不佳的。在上文所示之化學結構中，HA以HA之去質子化羧酸根或聚羧酸根形式之鈉鹽之形式顯示，但此不為由術語「HA」涵蓋之唯一結構。

類似地，如本文所定義之「交聯玻尿酸」(「XLHA」或「XL HA」)包括例如如本文概括定義之XLHA結構(在上文及/或下文中，例如參見本文結構1A4(A)及/或1A4(B))之一種或該(等)羧酸形式及/或聚羧酸形式，且獨立地包括例如如本文概括定義之XLHA結構之任何任何鹽形式，特別是任何陰離子(較佳聚陰離子)鹽形式(例如上文針對HA所列之彼等鹽中之任一者)。

較佳地，如本文所定義之「XLHA」包括例如如本文概括定義之XLHA結構(例如參見本文結構1A4(A)及/或1A4(B))之一種或該(等)羧酸形式及/或聚羧酸形式，且獨立地包括例如如本文概括定義之XLHA結構(例如參見本文結構1A4(A)及/或1A4(B))之一種或該(等)羧酸根形式及/或聚羧酸根形式及/或聚陰離子形式之任何鹽(特別是任何醫藥學上可接受之金屬鹽及/或銨鹽及/或有機銨鹽，較佳任何醫藥學上可接受之鹼金屬鹽及/或鹼土金屬鹽，更佳任何鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及/或鎂鹽)。

活體內，HA係於諸如皮膚、關節滑液、眼睛玻璃質液及軟骨內骨架之各種人體部分中製造且因此存在於該等人體部分。

HA於生理pH下為聚陰離子聚合物且因此高度帶電。正是出於此原因，其極為可溶且其可大規模地結合水(參見例如Kablik,J.，等人，Dermatol.Surg.,2009；35：302-312)。於70kg體重之人類中，存在之HA之平均量為約15g，其三分之一每天降解及/或合成。降解程序極為重要且由一類稱為玻尿酸水合酶(Hyalurohydrase)之酶(特別是HYAL 1及/或HYAL 2，其等分別連接至細胞膜及連接至溶酶體)執行。首先，HYAL 2破壞通常超過1MDa至20kDa片段之聚合物，隨後HYAL 1將該(等)片段裂解成四糖，其等在被排除之前被進一步水解成單體(參見例如Jeon,O.，等人，Carbohydrate Polymers,70,(2007),251-257)。

當化學改質HA以獲得聚合物時，其鏈自身之間連接(互連)，故此經化學改質之聚合物被稱為「交聯玻尿酸」(XLHA)(參見例如Ahmed,E.M.,Journal of Advanced Research,(2015),6,105-121)。ⁱ

XLHA為具有可使用大量試劑交聯之非晶形網路之水凝膠(親水性凝膠)。最常用於生物醫學應用的為1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)，此係由於其較低毒性本質(參見例如Jeon,O.，等人，Carbohydrate Polymers,70,(2007),251-257)。BDDE結構示於以下；最重要地，其結構含有兩個環氧基團，該線性有機分子之兩端各有一個：

1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)結構

較佳適用於使HA交聯之二環氧化物交聯劑之較佳總括的結構示於以下：

在上文總括的二環氧化物交聯劑[結構1A3]中，顯示為「[連接基團]」之所說明之連接基團較佳為有機連接部分及/或較佳具有適用於使HA聚合物交聯，例如適用於使HA聚合物在其等之-OH基團處交聯之長度及/或結構。較佳地，[連接基團]包含長度為2至20個原子(較佳3至12個原子，例如4至8個原子，例如6個原子)之鏈。(鏈較佳為線性的，但視情況其可為分支的。)更佳地，[連接基團]包含長度為2至20個(或3至12個或4至8個，例如6個)原子之鏈(較佳直鏈)，其中鏈原子包含鏈碳原子(例如作為-CH₂-或-CHMe-或-CMe₂-基團(Me=甲基))；且其中視情況，鏈原子亦包含1、2、3或4個鏈氧原子、鏈硫原子及/或鏈氮原子(較佳鏈原子亦包含1、2、3或4個、較佳1或2個鏈氧原子)。

一般而言，環氧化物為可與諸如羥基(-OH，醇)之親核性基團反應(尤其在合適的烷化條件下)之烷基化劑(且為親電子劑)。

視pH條件而定，HA分子呈現不同行為。一般而言，視pH而定，BDDE優先與HA之醇基而非與HA之羧酸基反應(參見例如L.Kenne等人，Carbohydrate Polymers,91,(2013),410-418)，如下：

‧當HA經受高pH值，特別是高於(較佳高1或更大或2或更大或2.5或更大或3或更大，上文pH單位)HA羥基之pKa值(其pKa值為約10)之pH值(較佳約pH>13)時，後者幾乎全部經去質子化且因此比亦以該等pH存在之HA之去質子化羧酸根基更具親核性。因此，在該等高pH值下，交聯劑(較佳BDDE之環氧基團)優先與HA之羥基反應以形成醚鍵。

‧當pH低於羥基之pKa值時，較小量或百分比之HA之羥基經去質子化，且HA之陰離子羧酸根基為HA上之更主要陰離子。此等條件促進酯鍵形成，此係藉由交聯劑之環氧基團與(大部分)HA之陰離子羧酸根基之反應進行。

在交聯反應之後，BDDE可以不同化學狀態存在。如下文結構流程1A2中所說明，尤其在高pH下，交聯劑(此處，BDDE)偏好與HA主鏈中之一級醇基團(亦即-CH₂-OH)反應。其中BDDE可存在於最終交聯HA產物中之不同狀態概括於下(亦參見例如Jeon,O.，等人，Carbohydrate Polymers,70,(2007),251-257)：

‧完全反應之交聯劑：已在兩端上與HA反應，產生二取代BDPE之BDDE分子(結構流程1A2中之結構A)(參見例如Jeon,O.，等人，Carbohydrate Polymers,70,(2007),251-257及/或Kablik,J.，等人，Dermatol.Surg.,2009；35：302-312)。

‧側懸交聯劑：已在單單一端上與HA反應之BDDE分子，亦即僅一個環氧基團已與一個HA鏈反應(烷基化)。在BDDE之另一端處，第二環氧基團一般與水或氫氧化物反應。以此方式，形成單連接BDPE(結構流程1A2中之結構B)(參見例如Jeon,O.，等人，Carbohydrate Polymers,70,(2007),251-257及/或Kablik,J.，等人，Dermatol.Surg.,2009；35：302-312)。

‧去活化交聯劑：已在兩端處與水或氫氧化物反應，形成自由BDPE(完全水解之BDDE)之BDDE分子(結構流程1A2中之結構C)(參見例如Jeon,O.，等人，Carbohydrate Polymers,70,(2007),251-257及/或Kablik,J.，等人，Dermatol.Surg.,2009；35：302-312)。

‧殘餘交聯劑：尚未與HA或水或氫氧化物反應之BDDE分子(結構流程1A2中之結構D)。與殘餘交聯劑存在有關之風險幾乎經由純化交聯產物完全消除(參見例如Kablik,J.，等人，Dermatol.Surg.,2009；35：302-312)。

如此獲得之XLHA之純化為整個製程中之重點，此係因為在最終(例如經純化)XLHA產物中未反應交聯劑(例如未反應BDDE)之殘餘量低於2ppm(亦即或例如低於2mg每L含水介質，例如每L含水凝膠)為強烈較佳的。

結構流程1A2：示意顯示玻尿酸(HA)鏈與交聯劑BDDE之交聯反應。在上文結構流程1A2中，HA起始材料以HA之一種或該(等)聚羧酸根(去質子化及/或聚陰離子)形式之一種或該(等)鈉鹽形式顯示；然而，可使用例如如本文所定義之HA之任何形式；且因此可形成任何形式之交聯HA。此外，可使用不同(非BDDE)二環氧化物交聯劑代替BDDE及/或加上BDDE。關於在HA與二環氧化物交聯劑(較佳BDDE)之交聯反應期間形成之產物A、B、C及D，因為衍生自二環氧化物(較佳BDDE)之所有四種產物(A至D)之總和為<5mg/mL，或<5,000ppm，二環氧化物(較佳BDDE)之原生形式D之痕量水平(痕量水平<2ppm；亦即或例如<2mg每L例如含水凝膠之含水介質)代表交聯反應產物(A至D)之總和之極小部分。

一個較佳之交聯HA之總括的結構(其能夠在其中使用總括的二環氧化物交聯劑[

](其為結構1A3，其中「[連接基團]」較佳如本文所定義)以使HA聚合物交聯以產生交聯HA之總括結構(下文)之反應中製備)如下：

結構1A4(A)及1A4(B)：交聯HA之較佳總括的結構。左側之部分結構1A4(A)概括說明總括的交聯鏈(A)，其係藉由使總括的二環氧化物交聯劑(結構1A3)與兩個HA聚合物鏈之-OH基團反應來形成。右側之部分結構1A4(B)概括說明總括的側鏈或基團(B)，其僅與一個HA或XLHA聚合物鏈連接，其係藉由以下形成：i)使一或該總括的二環氧化物交聯劑(結構1A3)之一個環氧基團與一個HA聚合物鏈之-OH基團反應，加上ii)使與單一HA連接之連接基團之第二環氧基團水解(例如藉由水或氫氧化物)。

在上文總括的交聯HA之結構1A4(A)及1A4(B)中，顯示為「[連接基團]」之所說明之連接基團較佳為有機連接部分及/或較佳具有適用於使HA聚合物交聯，例如適用於使HA聚合物在其等之-OH基團處交聯之長度及/或結構。較佳地，[連接基團]包含長度為2至20個原子(較佳3至12個原子，例如4至8個原子，例如6個原子)之鏈。(鏈較佳為線性的，但視情況其可為分支的。)更佳地，[連接基團]包含長度為2至20個(或3至12個或4至8個，例如6個)原子之鏈(較佳直鏈)，其中鏈原子包含鏈碳原子(例如作為-CH₂-或-CHMe-或-CMe₂-基團(Me=甲基))；且其中視情況，鏈原子亦包含1、2、3或4個鏈氧原子、鏈硫原子及/或鏈氮原子(較佳鏈原子亦包含1、2、3或4個、較佳1或2個鏈氧原子)。

(附註：XLHA之確切形式及/或XLHA之鹽形式(若存在)及/或任何交聯鏈(例如在上文結構1A4(A)中)及視情況選用之任何側鏈(例如在上文結構1A4(B)中)的位置(在XLHA聚合物內)及/或比例或百分比可相對於上文結構中之所示內容大大變化，該上文結構中之所示內容僅出於說明目的而作為實例結構。側鏈(例如具有上文結構1A4(B)中所示之類型)為視情況選用的-其可或可不存在於XLHA中。交聯鏈(較佳具有上文結構1A4(A)中所示之類型)存在於交聯玻尿酸(XLHA)中。XLHA在上文以聚陰離子(聚羧酸根)形式且以鈉鹽形式顯示；然而，在本發明中，XLHA之任何形式(例如聚陰離子或酸性或其他)及/或XLHA之任何鹽形式均為有可能的。

實施例1A：工業生產

XLHA已由多家公司利用不同方法生產。所獲得之XLHA凝膠大部分用於製備注射器，以用於皮膚治療。一般而言，視用於合成之所用交聯劑(較佳BDDE)之量及/或所採用之物理參數而定，可調整交聯百分比且可產生具有各種黏彈特性及滯留時間之凝膠。

描述用於合成XLHA之不同方法之數篇論文及專利申請案已被公開。首次使用環氧化物交聯劑進行之XLHA之合成由Laurent、Hellsing及Gelotte在1964年報導(Laurent,T.,Hellsing,K.，及Gelotte,B.,“Cross-linked gels of hyaluronic acid”,Acta Chemica Scandinavia,(1964),18(1),274-275)。以Malson及Lindqvist之名申請揭示BDDE作為交聯劑之用途之首個專利申請案係在1986年公開(WO 86/00079，Malson,T.，及Lindqvist,B.,“Gels of crosslinked hyaluronic acid for use as a vitreous humor substitute”)。此後，XLHA合成已由其他人根據其需要改動，且隨著技術及設備的開發已開發出新穎合成方法。

舉例而言，Merz-Anteis基於藉由2005專利申請案中所揭示之方法合成之內聚XLHA生產一系列產品，其中交聯係在無氧氛圍中進行(WO 2005/085329，Hermitte,L.及Benoit,O.,“Biocompatible crosslinked gel”)。

之後，以Teoxan之名申請的以下三個專利申請案已被公開：a)描述其中包含擠出步驟之XLHA合成之專利申請案(WO 2012/077054 A1；Meunier,S.及Bourdon,F.；“Process of preparing a cross linked gel”)；b)介紹麻醉劑在調配中之用途之第二個專利申請案(WO 2015/015407 A1；Meunier,S.及Bourdon,F.；“Composition comprising hyaluronic acid and mepivacaine”)；及c)揭示使用可變形袋以用於使凝膠均質化之新穎方法之第三個專利申請案(WO 2010/131175 A1；Bourdon,F.；“Process for preparing a crosslinked gel”)。

最後，Shiseido揭示其中使用旋轉/回轉混合器之方法(US 2011/0034684 A1,Yokokawa,Y.,Oka,T.,Mori,Y.及Ueno,N.；“Process For Preparing Crosslinked Hyaluronic Acid Gel”)。

總體而言，大部分或所有先前所揭示之合成一種或該交聯聚合物(特別是XLHA)之方法具有一些共同步驟，諸如：1.初始水合步驟，在此期間將呈粉末或纖維之物理形式之聚合物(特別是HA)溶解至緩衝液介質，典型地經緩衝之含水介質中；2.交聯步驟，其中添加交聯劑且反應在某種溫度下在特定pH條件下進行某段時間；3.中和階段，其在最終XLHA產物之施用(使用)環境為人體之典型情況下為必需的；及4.最後純化階段，其用於排除及/或用於減少(較佳用於排除及/或用於減少50%或更大或70%或更大或90%或更大或95%或更大或99%或更大)未反應交聯劑之量(亦即分子之莫耳數或數目)。

在先前所揭示之用於製造XLHA之方法中之一些中，包括一些中間階段，諸如溶脹及/或添加另一聚合物或麻醉劑，此係例如視所需之最終調配物及所欲之特性而定(就黏度、滯留時間及/或預期用途等而言)。

實施例1A：用於開發新穎產品之XLHA合成

在醫學裝置及/或醫藥組成物領域中已知將Regen Lab^TM用於產生含有玻尿酸(HA)之產品(醫藥組成物)，尤其是用於皮膚病學及/或矯形學領域中之較佳人體內之治療及/或預防者。特別地，Cellular Matrix^TM(對於其，參見例如WO 2013/061309 A2，Turzi,A.,“New a-prp medical device & tissue engineering composition,manufacturing machines and process”)為已由於其內所含有之兩種活性產物(亦即PRP(富血小板血漿)及玻尿酸(HA))所給予之對皮膚回春之貢獻而被廣泛使用的產品(例如參見Lana JFSD，等人，J.Stem Cells Regen Med.,2016；12(2)；及/或Ulusal,B.G.,Journal of Cosmetic Dermatology,2017；16(1)：112-119)。

自此產生嘗試開發其中非交聯(非XL)HA經XL HA取代的Cellular Matrix^TM產品之變體(Regen Matrix^TM)的根據及/或通向本發明的想法。

任何含有該XLHA及/或XLHA之新穎產品(特別是根據本發明者)較佳：(a)用於製備可注射醫藥組成物，該醫藥組成物用於較佳藉由施用來治療及/或預防關節疼痛症狀及/或關節運動性改善及/或另一關節相關病症(較佳人體內)，該施用係藉由注射，更佳藉由注射至需要該治療及/或預防之關節中來進行；及/或(b)用於製備可注射醫藥組成物，該醫藥組成物用於藉由注射至(較佳人類之)中層真皮至深層真皮中來施用；較佳：(b1)用於修正及/或修飾較佳人體內之萎縮性疤痕(較佳創傷性及/或術後來源之萎縮性疤痕)；及/或(b2)用於治療及/或預防較佳人體內之皮膚脫水；及/或(b3)用於修正及/或修飾較佳人體內之臉部皺紋(較佳中度至重度臉部皺紋)及/或解剖結構溝，諸如鼻唇褶。

此類醫藥組成物(及/或醫學裝置)(特別是根據本發明者)之特性及/或製備之一個重點為(i)PRP與(ii)HA(對於已知的Cellular Matrix^TM產品)或更佳XLHA(對於本發明)之間之混合。

特別地，根據本發明，凝膠(較佳XLHA-凝膠及/或含有XLHA之凝膠)具有允許待獲得之(i)PRP與(ii)凝膠及/或XLHA之有效及/或均質混合物(較佳在50次管子倒轉內或更佳在20次管子倒轉內)之黏度為強烈較佳的。

明顯地，XLHA具有高或更高黏度，特別是與非交聯(例如線性)HA聚合物及/或凝膠相比更如此。然而，特別是根據本發明，XLHA(典型地含有XLHA之凝膠)之黏度在允許待獲得之與PRP之有效及/或均質混合物的範圍內為強烈較佳的(即使例如需要增加次數(>50次或>20次)之管子倒轉以獲得與PRP之有效及/或均質混合物)。

XLHA(特別是本發明之XLHA)，較佳在實質上不(例如不)與PRP混合時，亦可用於製備注射器，以用於主要治療領域中(較佳用於皮膚病學及/或矯形學領域中之治療及/或預防中，較佳在人體內)及用於其他類似及/或相似治療。在此情況下，因為典型地包含或使用或混合實質上無PRP(例如無PRP)，故XLHA(特別是本發明之XLHA)之黏度可高於意欲用於XLHA-PRP混合物中之XLHA之黏度。

因此，XLHA(特別是本發明之XLHA)較佳包含於含有XLHA及PRP之醫藥組成物及/或管子(例如Regen Matrix^TM管子)生產中。XLHA(特別是本發明之XLHA)包含於含有XLHA凝膠但實質上不含有PRP(例如不含有PRP)之注射器生產中亦為有可能且較佳的。

特別地，在本發明中，例如由於XLHA之交聯網路，故凝膠及/或XLHA之滯留時間較佳長於非交聯(非XL)HA凝膠(例如典型及/或習知非XL HA凝膠)之30天滯留時間。

在本發明及本說明書中，「滯留時間」較佳係根據ISO_10993-6_2016中所揭示之方法來定義及/或量測(亦即或較佳地，線性HA在1個月之後完全降解)。

特別地，在本發明中，藉由調整交聯及/或改質%(百分比)，較佳在根據本發明之XLHA凝膠及/或如本發明中所使用之XLHA凝膠中，滯留時間通常改變。牢記可藉由最終使用/應用例如XLHA而設定之黏度限制(較佳黏度範圍)係所欲的。

實際上，咸信交聯及/或改質%愈高，滯留時間愈長(其常常為所欲的)，且黏度亦可能變得愈高(例如視XLHA之預期用途而定，若黏度過高，則其可能為非所欲的)。

考慮到所有上文事實及因素，在本發明中，特別是對於在管子中之使用，較佳者係使用在施用之後在6個月時段內(較佳在3個月內)在活體內被實質上完全吸收(較佳由已投予有XLHA之人類身體實質上完全吸收)且更佳保留永久性及/或長效性治療效果(較佳地，治療效果持續長於3個月或長於6個月)的XLHA。

在本發明中，凝膠(典型地XLHA凝膠及/或含有XLHA之凝膠)能夠通過27G針/套管及/或通過22G針/套管(較佳在0℃-40℃下，較佳在10℃-30℃下，諸如在15℃-25℃下)為較佳的。此係為允許藉由經由27G針及/或22G針/套管注射將含有XLHA之凝膠及/或含有XLHA之醫藥組成物輕易施用，例如施用至人類。更佳地，凝膠(典型地XLHA凝膠及/或含有XLHA之凝膠)能夠較佳在上文所陳述之溫度下通過22G1/2針/套管及/或通過27G1/2針/套管。

實施例1A：用於合成XLHA之「一鍋」法之開發

在本發明中，已執行使用兩種不同量(濃度及/或莫耳百分比)之BDDE進行之兩種不同合成，其因此產生兩種不同最終交聯百分比。

如先前已提出且如本文(例如上文)所討論，旋轉/回轉混合以及袋被用於合成XL產物(XLHA)。分析此等方法，明顯地涉及大量操作。首先，使用該等方法，以給出程序及所獲得之例如XLHA凝膠之凝膠之一些基線證據。

在合成方法中，存在5個可在不同步驟中執行之基本階段。

根據本發明，考慮到使用先前所公開之製造XL HA之方法進行之操作之數目、使用此等方法進行之合成程序之長度及產物之爆發(所形成之產物之數目)，現提供製造(合成)交聯HA之替代性方法。

反應器已常用於實驗室中以用於開發合成方法。反應器有時用於製備聚合物及/或API(活性醫藥成分)，特別是在例如化學及/或醫藥工業之試驗工場。

根據本發明之一個方面，已開發出根據本發明之生產XLHA之連續一鍋法。該方法為方便的、有效的、工作良好的及/或一般適用於過程自動化。較佳地，在化學反應器容器內，特別是在試驗工場型化學反應器容器內產生XLHA。

已使用此連續一鍋法/本發明之方法產生數個批次。

如下文/本文之流程1A5中所示，連續一鍋法之第一階段為HA纖維或HA粉末之水合：

步驟1.將HA聚合物纖維或粉末轉移至反應器中，隨後將反應器封閉。隨後，在攪拌下經由進料容器添加溶劑，同時過濾(較佳使用220μm篩孔過濾器過濾)，或在已過濾後添加。作為替代方案，在已封閉反應器之情況下，使用固體輸入埠添加HA聚合物粉末，且隨後例如如上文所描述地添加溶劑。此時之溫度較佳為室溫(典型地10℃-40℃，較佳15℃-30℃，更佳17℃-25℃)。

步驟2.在藉由攪拌使混合物均質化之後，添加含有交聯劑之鹼性(basic/alkaline)水溶液，且量測pH。

步驟3.使溫度升高至50℃，且攪拌混合物。在於50℃下在攪拌下2小時之後，冷卻反應混合物或使其冷卻至室溫(典型地10℃-40℃，較佳15℃-30℃，更佳17℃-25℃)。

步驟4.隨後，藉由添加酸(較佳酸水溶液)使反應混合物中和。較佳地，例如經由進料容器將於PBS(磷酸鹽緩衝鹽水溶液)中之HCl水溶液添加至反應混合物中，較佳同時進行過濾。檢查pH以確認已達到生理條件(亦即中性pH，約7之pH)。中性pH會降低HA及/或XLHA對任何剩餘交聯劑的反應性，此係因為HA及/或XLHA之羥基相比於在高pH下去質子化遠較低，且因此羥基反應性會較低。

步驟5.冷卻混合物或使其冷卻至4℃，且在約4℃至5℃下保持攪拌隔夜(亦即達約8-20小時，較佳達約10-16小時)。在此階段結束時再次檢查混合物之pH。低溫亦應降低系統(例如HA及/或XLHA)之反應性，及/或應允許完全均質化，及/或實質程度的均質化，且無進一步交聯。

步驟6.最後，使混合物升溫或使其升溫回室溫(典型地10℃-40℃，較佳15℃-30℃，更佳17℃-25℃)。添加特定量之非交聯HA(典型為用於Cellular Matrix^TM管子中之類型/等級)(約相同分子量，M.W.)，以便獲得所欲黏度。所欲黏度可較佳為需要保持一種或該分離凝膠所需及/或允許形成[XLHA且亦較佳HA]與PRP之混合物，較佳有效及/或均質混合物的所需的黏度。較佳經由進料容器將非交聯HA聚合物添加至混合物中，且攪拌混合物直至已達成反應混合物之完全及/或實質性均質化為止。

步驟7.在此時，自反應器收集凝膠且過濾(較佳使用280μm篩孔過濾器)。

流程1A5：用於HA與交聯劑(BDDE)之間之反應的反應器。編號項目為合成方法之步驟1至7，如圖1中所揭示。

以此方式，大部分或所有合成程序(較佳實質上整個合成程序)係(較佳)在封閉環境中執行，較佳實質上不使凝膠暴露於可能的污染。

此外，與先前所公開之方法相比，用於製備交聯XLHA(較佳與在之後所添加之非XL HA)之連續方法及/或「一鍋」法一般允許該方法期間之合成混合物之更佳均質化及該方法期間之操作減少，且因此執行合成之時間一般始終較短。

該方法之最終階段為XLHA之純化，較佳藉由滲析進行之純化。較佳使用此滲析方法，此係因為其使得能夠分離均可溶於同一溶劑中之不同尺寸之分子。在藉由滲析進行之純化期間，一般藉由通過一種或該滲析膜來排除(或減少，典型地大大減少，在其濃度中)可能存在於含有XLHA之混合物或凝膠中之任何未反應BDDE，同時(較佳)使水進入含有XLHA之混合物或凝膠中，使聚合物進一步溶脹。隨後，達到例如XLHA之聚合物之最終濃度，且隨後，殘餘BDDE應僅以痕量存在，且若所欲可在另一滅菌過程之後進一步減少。

實際上，已測試大部分或所有批次之所產生且經不同滲析膜純化及/或處於不同溫度下及/或經進一步滅菌或脫氣之XLHA凝膠的殘餘BDDE的量(濃度)。

隨後，如此獲得之XLHA凝膠可用於產生醫學裝置(例如管子或注射器)，其自身可用於製備A-PRP。

WO 2011/110948(A.Turzi)及/或WO 2013/061309 A2(A.Turzi；“New a-prp medical device & tissue engineering composition,manufacturing machines and process”)揭示含有[非交聯HA、觸變性凝膠及抗凝血劑]之管子用於製備PRP與HA混合物之用途。

當製備XLHA與PRP混合物(根據本發明之XLHA與PRP混合物)時，可由讀者使用WO 2011/110948及/或WO 2013/061309 A2中之一般揭示內容作為技術指引。

實施例1B：玻尿酸(HA)及/或交聯玻尿酸(XLHA)樣本之物理化學表徵 1.前言/報導範圍

例如如上文實施例1A及/或下文中實施例1C中所揭示，已使用一鍋法及不同量之交聯劑(BDDE)執行交聯玻尿酸(XLHA)合成。

已送出十種樣本以用於樣本可溶性部分之利用SEC-TDA(與光散射、折射測定法及黏度測定法之三偵測器陣列組合之粒徑排阻層析法)進行之定性及定量流體動力學表徵。

之後已再送出自三個驗證批次收集之六種樣本(滅菌前及滅菌後)。該等批次全部皆已使用與BDDE交聯之1500kDa HA纖維在鹼性條件中且利用先前所描述之一鍋法合成。

此外，已送出由Regen Lab產生之線性HA樣本作為參考物。在此等新樣本上執行樣本可溶性部分之利用SEC-TDA進行之定性及定量流體動力學表徵。

此外，已在物理化學視角下藉由執行流變性研究、酶降解、內聚性測試及溶脹來表徵所選樣本。

根據DMS所送出之報告書寫關於此研究之方法及結果。

2.表徵目標

此等樣本之表徵對於瞭解用於合成XLHA之合成方法是否可產生相同類型之凝膠且因此其是否是可再現的或是否所用參數之間存在任何相關性而言是必要的。

所執行之分析再次聚焦於三個驗證批次之可溶性部分之定性-定量表徵，且聚焦於一組代表性樣本之物理化學表徵。特別地，已在無菌樣本上執行研究以理解在不同生理學相關頻率下之凝膠之流變性行為。

3.樣本描述

本文報導具有所分析之樣本清單之表。以灰色報導其可溶性分率先前已經表徵且討論之樣本，且以黑色報導其分析會在下文報導之驗證批次。對於流變性視角下，僅已對一些所選批料之滅菌樣品作研究。該清單按製造順序並參考用於分析線性HA之注射器報導該等批次。

藉由將過量BDDE添加至HA溶液中(1：453莫耳比)來執行批次6、7及8之合成。

對於批次6、7及8之可溶性分率之分析，已收集(表示為BS及AS)且分析滅菌(在121℃下達至少15分鐘)前及滅菌後之凝膠樣本。流變性研究僅已在被視為較具代表性之批次2、3、4、6、7、8及9之滅菌樣本上執行。排除樣本5，因為其未發生交聯。

4.材料及方法 4.1 萃取可溶性部分

已在樣本26C18-D BS、26C18-D AS、04D18-D BS、04D18-D AS、10D18-D BS、10D18-D AS、ARV-HA-40-3 18D04及ARV-HA40-3 18D04(其為含有線性HA之最終滅菌產物上執行分析。已在具有7.4之pH之磷酸鹽緩衝液(PBS)中稀釋樣本5次(1.5-2ml最終體積)。已在37℃下搖晃懸浮液達18小時，隨後在10000×g下離心5分鐘。

僅樣本04D18-D BS及ARV-HA40-3 18D04顯示為均質的，而所有其他樣本在離心之後分離，顯示具有不同黏度之兩個相存在但不論如何不可分開。隨後，已再稀釋樣本2次，隨後用0.22μm過濾器過濾。已分析含有可溶性HA之上清液。

4.2 HA之可溶性部分之定量分析。

已使用兩種技術(比色測試及SEC-TDA分析)來量測HA含量(mg/ml)ⁱⁱⁱⁱⁱ。考慮到針對各樣本執行之稀釋，已計算可溶性HA之含量。

已分析各樣本至少兩次，且對於各分析，已執行兩個定量計算。因此，已在至少4次量測之後獲得對於各樣本獲得之可溶性分率的值。

4.3 使用SEC-TDA進行之HA(線性及交聯)之可溶性部分之流體動力學表徵

所分析之樣本中之每一者中所含有之HA之可溶性部分之流體動力學參數已藉由配備有三重偵測器(TDA光散射、折射測定法及黏度測定法)之粒徑排阻層析法(SEC)測定。已在利用上一段中所描述之方法製備之樣本上執行分析。

SEC設備(Viscotek,Malvern,UK)由兩個模數構成：1)GPCmax VE 2001，由用於凝膠滲透層析法(GPC)之特定泵、在管線中連接之用於使溶劑脫氣之系統及自動取樣器構成之整合系統；2)TDA305模數(三重偵測器陣列)，其包括用於管柱之恆溫烘箱及用於折射率(RI，具有4個毛細管橋接器(VS及光散射(Light scattering；LS))之黏度計) 之三重偵測器。後者係由兩個部件形成：具有極佳信號-雜訊比之直角光散射(Right-Angle Light Scattering；RALS)，及創新的低角散射(Low Angle Scattering；LALS)

用於HA之Dn/dc值(在分析物濃度變化後之信號強度之無限小變化，由折射率偵測器量測)為0.155ml/g。

已製備各樣本之至少兩種溶液，且對於各溶液，已執行至少兩次層析分析(層析曲線報導於附件1中)。平均分子量(M_w)、平均數值分子量(M_n)、多分散性指數(M_w/M_n)、固有黏度([η])及流體動力半徑(R_h)報導於表2中。

4.4 流變性表徵

使用配備有由50mm且間隙為0.9mm之不鏽鋼盤-盤構成之量測系統之流變儀Anton Paar Physica 301使用La Gatta等人ⁱⁱ所報導之方法執行流變行為研究。已在兩個頻率下量測值：0.159Hz及15.90Hz。

4.5 耐酶性/酶降解

已執行聚焦於樣本中之一者之酶降解之初步動力學研究。實驗旨在理解HA在暴露於酶活性時之行為。遵循文獻中所描述之實驗指引，已將樣本30A18-D與BTH(牛睾丸玻尿酸酶)一起培養。ⁱⁱⁱ

特別地，已在PBS中在pH7.4下將濃度為22.4mg/ml之樣本30A18-D稀釋至4mg/ml且與BTH 0.5U/ml一起培養。在不同培養時間(2、3、6及24h)之後，樣本已被加熱至100℃達10分鐘以使酶失活且隨後藉由SEC-TDA表徵。已藉由量測培養期間之流體動力學參數遞減且特別是MW降低來監測降解。

已將該降解與具有類似MW之實驗室中可獲得之線性HA之參考物相比。對於各時間點，已執行分析三次。

4.6 內聚性測試

已使用由Sundaram及co描述之方法評估各樣本之內聚性。^iv使1ml之各樣本經10ml之1%甲苯胺藍溶液著色，隨後置放於1ml注射器中且擠出至含有700ml MilliQ水之Becker中。以當凝膠接觸Becker底部時為起始磁力攪拌溶液。利用視訊及距擠出15"、70" e 95"下拍攝之照片記錄測試。

4.7 溶脹

已在於所有樣本之間選擇之具有明顯不可溶HA部分之樣本上執行測試，該等樣本已經送出及分析，其等為12B18-D BS及AS、26C18-D BS及10D18-D AS。

已將2ml之各凝膠在PBS中稀釋至1ml且在37℃及800rpm下培養16h。已在於PBS中將各凝膠之0.2ml等分試樣培養至1ml最終體積下量測吸水度。隨後，已在13000g下離心樣本達5min且使上清液與水合凝膠分離。一旦凝膠已達到溶脹平衡(水合凝膠8g)/初始凝膠(g)，以凝膠之體積擴增來量測吸水度。

5.結果及討論 5.1 可溶性部分

所有樣本均呈現可溶性部分。批次10D18-D AS及26C18-BS顯示與其他批次相比較小之可溶性分率。考慮到所有批次均具有相當的總HA濃度(可溶性+不可溶)，此等批次具有較高百分比之不可溶HA(經化學改質)。在另一方面，樣本04D18-D BS及ARV-HA-40-3 18D04含有較高百分比之可溶性 HA，顯示較低改質度。此結果與以下事實一致：ARV-HA-40-3 18D04為線性HA，而04D18-D BS之相同結果表明未發生或發生極低的化學改質。

以下表1顯示對於所送出之各樣本獲得之值：

批次26C18-D顯示在M_w降低內所變之滅菌之後之可溶性分率增加。

如已針對報告n° HARET_CHARAC_2018_06 of 05.06.2018中所討論之樣本02J17所觀測，批次04D18-D相反地顯示可溶性分率減少及M_w增加。

作出以下假設：在滲析之後較高BDDE殘餘存在於批次中，因此交聯反應可能在滅菌期間繼續。

在其中觀測到經滅菌樣本之可溶性分率重要減少但Mw略微地降低之批次10D18-D之情況下出現不同情形。

給予樣本04D18-D及02J17之說明可相同。

實際上，除其中Mw降低½之樣本以外，所觀測到之所有變化均極小，使得其落在對各值發現之誤差內部，換言之，未出現顯著變化。

5.2 流體動力學參數

所有樣本均具有Mw高於700kDa之可溶性部分。特別地，樣本26C18-D BS及10D18-D BS及AS之Mw為1100-1200kDa。多分散性指數一般在1.4與1.8之間。實際上，已觀測到樣本BS之值降低，此可能係由於交聯期間之溫度(2小時期間50℃)之作用。

對於各樣本，SEC-TDA分析允許亦衍生馬克-霍金曲線(MHS曲線-log固有黏度相對於log M_w)。已將此等曲線(圖7顯示樣本04D18-D AS(a)、10D18-D AS(b)及26C18-D(c)之重疊)與在Naples之實驗藥品部門處可獲得之線性HA(非經改質)中之一者相比。所有樣本均呈現可溶性部分，其若與線性HA相比，則呈現在相等分子量下之較低固有黏度值。此表明HA鏈之更緊密構形，亦意謂構形分析與可溶性部分中之交聯HA鏈(或至少經改質)之存在相容。圖7d係關於樣本ARV-HA-40-3 18D04，其可與在DMS處可獲得且被用作為參考物之線性HA完美地重疊。此重疊一般係對非經改質之HA之對具有不造成任何利用此技術可見之構形變化之極低改質度之HA觀測到。

吾等所作出之此考慮可表明，所分析之樣本為全部經化學改質的。

5.3 流變性表徵

已在於0.159Hz與15.9Hz之間之不同頻率下執行流變性研究。

此處，在圖8中，顯示呈不同頻率(Hz)之函數之G'及G"值的圖。在圖9中，顯示呈不同頻率(Hz)之函數之複數黏度值之圖。兩個圖均給出圖中所列舉之相同批次之結果。在下表2中，吾等報導在0.5Hz及2.5Hz下之G'、複數黏度及tan δ值。

圖8：G'及G"對頻率。顯示呈不同頻率(Hz)之函數之G'及G"值的圖。

圖9：G'及G"對頻率。在圖9中，顯示呈不同頻率(Hz)之函數之複數黏度值之圖。

圖7中所報導之數據顯示樣本12B18-D AS及10D18-D AS具有基本上彈性之行為。此與為此等兩個樣本最小值之可溶性分率值一致，且與共價網路之存在相容。根據更能代表纏結網路之所量測之值，其他樣本相反地為黏性的(如藉由MHS曲線所確認，仍經化學改質)。對於此等後者樣本，在高於15.9Hz之頻率下量測交越。在黏性調配物之間，樣本26C18 AS及04D18-D AS具有類似的Tan δ值，且低於對21K17 AS、30A18-D AS及ARV-HA-40-3 18D04所量測之值。

根據機械光譜，對於樣本12B18-D AS及10D18-D AS，在所有所考慮之範圍內，複數黏度不斷地隨頻率降低。樣本21K17 AS、30A18-D AS及 ARV-HA-40-3 18D04起初呈現恆定行為，接著為稀化行為。基於對樣本21K17 AS及30A18-D AS所收集之數據，黏度特徵與含有可溶性HA且具有不同的聚合鏈構形之凝膠相容。對於樣本26C18-D AS及04D18-D，觀測到中間行為，有2區有於複數黏度與頻率之間具有不同關係。

5.4 酶降解

已研究牛睾丸玻尿酸酶之作用以得到關於XLHA之耐玻尿酸酶性之初步資訊並得到關於活體內可能性滯留時間之建議。

以下，(圖10)報導相較於線性HA(^□)之樣本21K17-DAS(^■)在與BTH一起培育後記錄的Mw之變化的圖。

圖10.樣本21K17-D AS(^■)及線性HA(^□)之在與BTH 0.5U/ml一起培養後記錄之Mw。

在圖11中，亦為顯示具有MW>500kDa及MW<200kDa之樣本分率(wt%)之變化的圖。

數據證實兩個樣本均可經歷由BHT催化之解聚合。報導M_w對比培養時間之圖對於具有類似初始M_w之兩個樣本顯示類似的解聚合動力學。僅在2小時培養時，樣本21K17-D AS具有較高Mw。圖11a顯示當在各時間點時，在500kDa下各樣本存在相當的分率減少。圖11b中之結果表明，如可推測的，在與酶一起培養之時間後，兩個樣本之伴以較低M_w之分率增加。更詳細地，雖然在最大培養時間，兩個樣本在200kDa下之分率相當地增加，在3小時及6小時培養時，樣本21K17-D AS之相同分率較高。然而，極重要地，應考慮到此等結果獨立於已經分析之部分中之MW之總體分配。總之，此等結果不顯示在酶降解下之樣本之間有顯著差異。

此等結果亦可考慮樣本21K17-D AS之可溶性部分來解釋。實際上，所報導之值極接近樣本中之HA之總濃度，暗示了極低的化學改質度，此可解釋對於酶降解的類似之行為。

圖11：具有Mw>500kDa(a)及MW<200kDa(b)之樣本部分(wt%)變化。

5.5 內聚性測試

以下吾等在圖12中報導內聚性評分(由三個不同操作者給出的值之平均值，其係基於文獻(Sundaram等人，Plast Reconstr Surg.2015)中針對驗證方法所報導之內聚性等級，其評分為：

1 完全分散的

2 大部分分散的

3 部分分散的，部分內聚的

4 大部分內聚的

5 完全內聚的。

總體而言，除樣本n° 10之外，凝膠自大部分展現內聚至完全內聚。

圖12：根據文獻中所報導之評分發現之值。

5.6 溶脹

測試已僅對具有較高不可溶部分且因此為12B18-D BS、12B18-D AS、10D18-D-AS及26C18-D-BS之樣本執行。

此處，所獲得之結果：

結果表明當使樣本12B18-D BS於生理介質中平衡時其增加體積3倍。對於已全部經滅菌之其他樣本，已報導小溶脹值，具有在小丸與上清液之間之分離為極困難的。更精確地，已觀測到兩個具有不同流動速度且無法完全分離的相：當嘗試分離時，黏性較小的部分在更黏性時傾向於混合。溶脹值在三個樣本之間相當。

6 結論

分析SEC-TDA確認，所分析之所有樣本均含有可溶性HA，且除ARV-HA40-3 18D04以外之所有樣本均含有經化學改質之HA且MW相對高(

1000kDa)。

在Bioteknet執行之分析證實在所分析之所有樣本中存在可溶性HA。特別地，考慮到所有樣本之總濃度均為約20mg/ml(可溶性+不可溶)，表中所報導之數據表明對於在此研究中分析之批次，大多數HA仍可溶於含水介質中。儘管與先前的報導中所討論之樣本相比，某些批次顯示表明較高化學改質度之較小可溶性分率。

所有批次皆顯示較高的M_w，其在相同實驗室中利用相同技術分析且主要用作皮內填充劑之所有其他商業HA(參見表1中針對瑞藍(Restylane)所報導之數據)。此為關於耐滅菌性及可能儲架期之重要數據。實際上，HA隨溫度及時間解聚合而形成可能具促炎性之較小片段(<50Da)。此結果告訴吾等，吾等之凝膠符合要求AS且可能儲存與已商售凝膠相同之所考慮量之時間 (12-24個月)。

構形分析表明所有樣本均含有經化學改質之HA，且固有黏度與交聯HA之存在相容。

分析機械特性，已觀測到，12B18-D AS及10D18-D-AS展現彈性行為，其亦可與不可溶分率之較高值連結，因此證實較高改質度，且後者在所考慮之頻率下甚至更具剛性且黏性。在具有黏性行為之樣本之間，線性樣本ARV-HA40-3 18D04在所分析之範圍內具有較高黏度。

已針對耐酶降解性作測試之唯一樣本並未顯示可區分其與線性HA的改質度(在所用實驗條件中)。

此等結果被可溶性分率值(其對於更具黏性/彈性之樣本而言較高)確認。

如段落5.5中所報導，大部分樣本具有高內聚性，且此外根據文獻，均勻地分佈於組織且特別是真皮內(Sundaram等人，Plast Reconstr Surg.2015；僅在用於皮膚護理之凝膠上執行之研究)

最後，測試溶脹之凝膠呈現表明高內部擷取水能力之良好的體積擴增。

三個批次26C18-D-AS、04D18_D_AS及10D18-D-AS已使用相同方法合成，然而可溶性分率及流變性行為顯示存在一些差異。藉由深度分析關於三個合成之報告，觀查到由達到50℃(交聯溫度)所耗費之時間及在50℃下所耗費之時間給予之總交聯時間中之差異。

考慮對於此三個樣本迄今為止所獲得之結果，尤其是參考不可溶分率，在26C18-D-AS模型上合成新批次，因此將凝膠保持在50℃下達最大70分鐘。

為更佳理解吾等凝膠之活體內可能行為，在批次21K17-D AS、10D18-D-AS、26C18-D-AS及ARV-HA40-3 18D04上執行更多耐酶降解性測試，該等批次被選擇作為利用類似合成獲得之具有所有範圍之改質度之代表性樣本(表4)。

在使用固定劑量之BHT之時間後及在添加不同劑量之酶後執行測試且在2小時消化之後進行量測。

7 定義及公式

重量平均分子量M _w：由

對於所有合成之多分散聚合物：M _n <M _w。

多分散性指數用作聚合物之分子量分佈之寬度之量度，且由以下定義：

固有黏度：反映於溶液中之聚合物增強溶液黏度之能力。

折射率增量dn/dc：折射率增量應用於在特定條件下之樣本。舉例而言，溫度、雷射波長、分子構形或添加劑影響dn/dc之絕對值。因此，對於完美靜態光散射實驗，應確定在考慮中的條件下之準確dn/dc。在許多切實可行之實例中，值可得自在類似條件下得出之先前數據組(或自參考文獻)。

流體動力半徑R _h：如藉由動態光散射所量測，定義為與被觀測之分子以相同之速率擴散之等效硬球體之半徑。實際上，蛋白質及其複合物之溶液不以硬球體之形式存在，且因此所測定之流體動力半徑更緊密地反映溶合翻滾分子所採用之視尺寸。

馬克-霍溫克-櫻田(Mark-Houwink-Sakurada)關係MHS：在連結經分成數部分之樣本之固有黏度及分子量方面作用良好之實驗關係。其係用於完成給定聚合物之構形分析。

複數黏度：複數剪切模數。對材料之變形的總抗性，不論該變形為可恢復的(彈性)或非可恢復的(黏性)。符號G*複數黏度=黏度-i ^x 彈性

共享切模數：(由改變應變產生)為剪應力與剪應變之比。其係由與上文關係類似之複數關係推斷出：G*=G'+iG"

。

交越頻率：其中此等參數交越之頻率，對應於特異於材料之鬆弛時間(t)。

實施例1C：交聯玻尿酸(XLHA)合成概述 6.前言/報導範圍

以下報導概述針對交聯玻尿酸(XLHA)生產執行之不同合成。

7.材料及方法

所有試劑已不經無進一步純化即使用。使用MW為1550kDa之HTL HA纖維。BDDE(14-丁二醇二縮水甘油醚)及呈小丸之NaOH購自Sigma Aldrich。HCl 1N購自Carl Roth International。所有混合物及溶液均使用同樣用於純化製程之PBS來製備。

使用配備有與機械攪拌器連接之鐵氟龍攪拌葉片之三頸圓底燒瓶(或用於三公升合成之兩頸圓底燒瓶)來執行合成(參見下文中之燒瓶圖式)。藉由將燒瓶浸入置放在加熱板上方之水浴中來控制溫度。水及凝膠溫度均已在加熱步驟期間受到控制，且保證空氣流動直至交聯步驟結束為止。

作為用於所有批次之通用程序，在容器/燒瓶內部引入纖維/粉末，接著引入於PBS中之NaOH溶液(0.25M)。將混合物在室溫下攪拌約2小時直至完成均質化為止。隨後，引入於PBS中之BDDE溶液(比率HA：BDDE 1：453)，且將反應混合物在50℃下攪拌2小時以允許較快交聯(已執行此步驟，確保向合成中的連續流動空氣)。隨後，添加HCl(0.08M)以中和pH，且停止交聯，同時在4℃之溫度下攪拌隔夜。添加非交聯凝膠，且將混合物攪拌3小時直至完全均質化為止。

將如此獲得之混合物在真空下過濾(280μm篩孔)且通過使用分子量截止值為12-14kDa之膜滲析24小時來純化(除非另外具體指出)。

所有批次之pH、容積滲透濃度及黏度均受控。不存在用於計算BDDE之殘餘量之分析，此係因為已評估到，滅菌後之值低於0.82ppm(5A-DIR 011 PV 26.01.2018)，無論滅菌前之值為何。

8.合成 3.1 批次12B18-D

已將60g HA(MW 2800kDa)溶解於576.18g的NaOH 0.25M(PBS溶液)中且混合2小時45分鐘直至形成均質凝膠為止。同時，已將5.45g BDDE稀釋於1.17g的NaOH 0.25M中，隨後添加至HA凝膠中。已將凝膠在室溫下混合30分鐘。隨後，保持在48℃下達1小時34分鐘。隨後，藉由添加1764.86g HCl溶液1N降低溫度且開始中和。在5℃下混合凝膠17小時47分鐘。同時，將6.23g的HA溶解於300g的NaOH 0.25M(PBS溶液)中，隨後將269.07g的所形成之凝膠添加至經中和之XLHA中。攪拌混合物2小時。在24小時期間藉由滲析(膜MW截止值為12-14kDa)純化所獲得之凝膠。

3.2 批次26C18-D

已將20g的HA(MW 1550kDa)溶解於192.27g的NaOH 0.25M(PBS溶液)中且混合2小時20分鐘直至形成均質凝膠為止。同時，已將1.11g的BDDE稀釋於3.71g的NaOH 0.25M中，隨後添加至HA凝膠中。已將凝膠在室溫下混合40分鐘。隨後保持在41℃與50℃之間達70分鐘。隨後，藉由添加588.39g的HCl溶液1N降低溫度且開始中和。在5℃下混合凝膠16小時45分鐘。同時，將3.39g的HA溶解於150g的NaOH 0.25M(PBS溶液)中，隨後將89.64g的所形成之凝膠添加至經中和之XLHA中。攪拌混合物3小時40分鐘。在24小時期間藉由滲析(膜MW截止值為25kDa)純化所獲得之凝膠。

3.3 批次10D18-D

已將20g的HA(MW 1550kDa)溶解於192.45g的NaOH 0.25M(PBS溶液)中且混合2小時直至形成均質凝膠為止。同時，已將1.13g的BDDE稀釋於3.70g的NaOH 0.25M中，隨後添加至HA凝膠中。已將凝膠在室溫下混合20分鐘。隨後保持在50℃下達55分鐘。隨後，藉由添加588.18g的HCl溶液1N降低溫度且開始中和。在5℃下混合凝膠16小時45分鐘。同時，將3.39g的HA溶解於150g的NaOH 0.25M(PBS溶液)中，隨後將89.55g的所形成之凝膠添加至經中和之XLHA中。攪拌混合物4小時。在24小時期間藉由滲析(膜MW截止值為25kDa)純化所獲得之凝膠。

實施例2-細胞培養

使用醫學裝置(容器)以製備PRP/BMC以用於根據本發明之細胞培養，已獲得以下結果。

參見圖3。

此裝置之主要優點係由其維持MNC(單核細胞)生長之能力來證實(在保持在室溫下的MC-PRP進行之試管內評估)。保持在此等條件中之血小板具有與全血中所描述之半衰期類似之半衰期(7天)。

圖4。

實施例3-細胞培養-CC-S 用於使用CC-S之細胞培養之實驗指引階段1：收集全血

1.打開管子泡殼包裝。

執行靜脈穿刺且用全血填充所欲數目之CC-S管子。管子內之真空使得能夠自動收集必需體積之血液(約10ml)。

階段2：離心

2.在離心機啟動之前必須總使其正確地平衡。

一旦血液被收集在CC-S管子中，則必要時用水填充平衡管(分開地提供，ref.SF-82-CB-110)直至其達到與其將平衡的CC-S管子中之血液體積相同之體積為止。

將經填充之管子彼此相對地插入離心機中以使機器平衡。如下調整離心值：

- 時間：10至20分鐘

- 離心力(RCF)：1500g(根據離心機製造商說明書設定對應RPM速度)

階段3：離心結果

3.在離心之後，血液分離成數部分；且紅血球及白血球被捕捉在凝膠下方，且纖維蛋白凝塊在細胞選擇凝膠上方。凝塊之液體部分為自體凝血酶血清。藉由延長離心時間或藉由用裝配於收集注射器上之套管在凝塊上按壓來自凝塊抽取血清。自各管子獲得約4.5ml的血清。

階段4：利用

4.將CC-S用作為濃度在5% v/v至20% v/v之間之自體培養補充物，該濃度係待針對各細胞系確定。

實施例4-細胞培養-CC-PRP 用於使用CC-PRP之細胞培養之實驗指引階段1：收集全血

1a.打開管子泡殼包裝。

執行靜脈全血、臍帶血或髓質血穿刺。

穿刺且填充所欲數目之CC-PRP管子。管子內之真空使得能夠自動收集必需體積之血液(約10ml)。

1b.小心地倒轉管子數次以混合血液與抗凝血劑。

階段2：離心

2.在離心機啟動之前必須總使其正確地平衡。

一旦血液被收集在CC-PRP管子中，則必要時用水填充平衡管(分開地提供，ref.SF-82-CB-110)直至其達到與其將平衡的CC-PRP管子中之血液體積相同之體積為止。

將經填充之管子彼此相對地插入離心機中以使機器平衡。

如下調整離心值：

- 時間：5分鐘

階段3：離心結果

3.在離心之後，血液分離成數部分；紅血球及白血球被捕捉在凝膠下方捉，且血小板沈降在凝膠表面上。

階段4：均質化

4.藉由輕輕地倒轉CC-PRP管子數次，繼續使血小板沈積物再懸浮於血漿上清液中。自各管子獲得約5ml的PRP。

確認血小板完全自凝膠脫離。清澈且透明的血漿應變得混濁。若存在血小板聚集物，則應將其與血漿一起收集。

階段5：利用

5.將CC-PRP用作為濃度在5% v/v至20% v/v之間之自體培養補充物，該濃度係待針對各細胞系確定。為避免纖維蛋白凝塊形成，應使培養基補充有2個單位/ml肝素。

實施例5-細胞培養-MC-PRP 用於使用MC-PRP之細胞培養之實驗指引階段1：收集全血

1a.打開管子泡殼包裝。執行靜脈穿刺且用全血填充所欲數目之MC-PRP管。管子內之真空使得能夠自動收集必需體積之血液(約10ml)。

1b.小心地倒轉管子數次以混合血液與抗凝血劑。

階段2：離心

2.在離心機啟動之前必須總使其正確地平衡。

一旦血液被收集在MC-PRP管子中，則必要時用水填充平衡管(分開地提供)直至其達到與其將平衡的CC-PRP管子中之血液體積相同之體積為止。

將經填充之管子彼此相對地插入離心機中以使機器平衡。

如下調整離心值：

- 時間：8分鐘

階段3：離心結果

3.在離心之後，血液分成數部分：紅血球在凝膠下方被捕捉，且單核細胞及血小板在凝膠表面上沈降。

階段4：均質化

4a-方法1：藉由輕輕地倒轉MC-PRP管子數次，繼續使細胞沈積物再懸浮於上清液中。各管子獲得約5ml細胞懸浮液。

4b-方法2：為獲得較高細胞濃度：在繼續使細胞再懸浮之前，用長套管(不提供)小心地移除2ml非細胞血漿上清液上部層。隨後，藉由輕輕地倒轉管子使細胞沈積物再懸浮於剩下的2ml中。

確認細胞完全自凝膠脫離。清澈且透明的血漿應變得混濁。若存在聚集物，則應將其與血漿一起收集。

階段5：利用

5. MC-PRP典型地以70 +/- 10%原始樣本中所存在之單核細胞之回收率產生於富血小板血漿中之細胞懸浮液。

實施例6-使用CC-HA之細胞培養 用於使用CC-HA之細胞培養之實驗指引 階段1：收集全血

1a.打開第一泡殼包裝，隨後小心地打放第二泡殼包裝。

1b.使用來自附件組之必需的靜脈切開術材料執行靜脈穿刺且用全血填充CC-HA管子。管子內之真空使得能夠自動收集必需體積之血液(約6ml)。

1c.小心地倒轉管子數次。

1d.使用用於排除受污染之血液產物之適當方法丟棄抽取針。

階段2：離心

在離心機啟動之前必須總使其正確地平衡。必要時，用水填充平衡管(分開地提供)直至其達到與CC-HA管子中之血液之水平相同之水平為止。隨後，將經填充之管子彼此相對地插入離心機中以使機器平衡。

如下調整離心值：

‧時間：5分鐘

‧離心力(RCF)：1500g(根據離心機製造商說明書設定RPM速度)

階段3：離心結果

在離心之後，血液分離成數部分：紅血球被捕捉在凝膠下方，且細胞成分沈降在凝膠表面上。玻尿酸位於血漿上方。

階段4：均質化

4a.在垂直位置上將管子倒置，且將其維持在此位置直至HA自管壁脫離且浮至血漿層頂部為止。

4b.小心地倒轉管子至少20次直至血小板再懸浮為止。

4c.在水平位置上在手指之間滾動管子直至已自管壁移除所有HA且製劑均質為止。各管子獲得約5ml混合物HA/PRP。

4d.使用來自附件組之轉移裝置以自CC-HA管子收集混合物HA/PRP。

階段5：利用

5. CC-HA可用作為濃度在10% v/v至40% v/v之間之自體培養補充物，該濃度係待針對各細胞系確定。為避免纖維蛋白凝塊形成，應使培養基補充有2個單位/ml肝素。在此製劑中，血小板被捕捉在玻尿酸基質中。此製劑可用作用於待針對各細胞系確定之單層培養物之塗層基質。

實施例7-CC-PRP裝置效能

吾等在此實施例中證實，相較於用於脂肪組織衍生型間葉幹細胞(AT-MSC)及正常人類真皮纖維母細胞(NHDF)之典型培養條件而言，在使用本發明之裝置進行之細胞培養中使用PRP具有大有效性(圖5及6)。

1. AT-MSC AT-MSC分離

在37℃下用0.01%第I型膠原酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)消化純脂肪達45min且輕輕地攪動。在於1400rpm下離心10min之後移除非消化脂肪組織。將稱為基質血管部分(SVF)之剩餘小丸懸浮於紅血球溶解緩衝液中達5min(Qiagen，Hilden，德國)。隨後，將其用基礎培養基洗滌：含有1g/L葡萄糖、L-麩醯胺酸、25mM HEPES(Invitrogen,Carlsbad,CA)之達爾伯克氏改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium；DMEM)-低葡萄糖，其補充有10,000mg/mL青黴素及鏈黴素(Bioconcept,Salem,NH)及2個單位/mL肝素(Liquemin 5000；Roche,Basel,Switzerland)。

在於1200rpm下離心5min之後，隨後將SVF再懸浮於DMEM及補充物中，且經由100mm耐綸細胞過濾器(BD Biosciences)過濾。經分離之SVF中之平均細胞密度為30×10⁴個細胞/毫升。

AT-MSC培養

將SVF細胞以5000個細胞/cm2塗鋪在48孔盤(BD Biosciences) 中且在不同培養基培養條件中培養：作為對照組之10% FBS(Gibco,Carlsbad,CA)，或添加至基礎DMEM及補充物(對於各條件，1mL培養基)中之1%、5%、10%、20%、40%及60% nPRP或tPRP。在24-48h培養之後之所得黏附塑膠的細胞群作為AT-MSC進行測定。將細胞在37℃下在具有5% CO2之標準培養箱中培養10天且不更換用於FBS及PRP條件之培養基。

對AT-MSC之PRP增殖功效

在所有條件中，AT-MSC在培養期期間保持其典型紡錘體纖維母細胞形狀。在10天培養之後，當與含有FBS之培養基相比時，補充有不同nPRP濃度之所有培養基均呈現較高AT-MSC數目(圖3)。此nPRP正向作用遵循劑量依賴性鐘狀曲線。補充有20% nPRP之培養基提供最佳條件，且在10天培養之後，AT-MSC數目比10% FBS中之AT-MSC數目高13.9倍(n=14，p<0.001)。相比而言，其他條件較不有效[例如當與10% FBS相比時，10%及40% nPRP培養基分別使AT-MSC數目增加5.6及10.9倍(n=14，p<0.001)](圖3)。

圖5。

2. NHDF NHDF分離

簡言之，使在腹壁成形術期間收獲之組織經歷14個單位/mL Liberase DL研究級(Roche)消化，該消化係用於分離分別經處理之表皮層與真皮層。經由絞碎及於0.3%胰蛋白酶/PBS膠原酶(Gibco)及1%胎牛血清(FBS，Gibco)以及1%抗生素/抗黴劑(AB/AM，Gibco)中之後續消化分離NHDF。隨後，過濾、離心且塗鋪NHDF。NHDF分別展現預期卵石及紡錘體形態，且無污染跡象。將第1至5代之NHDF細胞於37℃下在補充有5% CO2之含有10% FBS及 1% P/S之達爾伯克改良之基礎培養基(DMEM；Dulbecco modified Essential Media，Gibco)中培養。使所有細胞均生長至80%匯合度且使用TrypleX溶液(Gibco)繼代。

NHDF培養

將NHDF以1000個細胞/cm²塗鋪在12-孔盤(BD Biosciences)中且在不同培養基培養條件中培養：作為對照組之10% FBS(Gibco,Carlsbad,CA)或1%、5%、10%、20%非活化PRP。將細胞在37℃下在具有5% CO2之標準培養箱中培養5或7天且不更換用於FBS及PRP條件之培養基。

對NHDF之PRP增殖功效

在所有條件中，NHDF在培養期期間保持其典型紡錘體纖維母細胞形狀。在5天培養之後，當與含有FBS之培養基相比時，補充有不同nPRP濃度之所有培養基均呈現較高NHDF數目(圖4)。補充有20% nPRP之培養基提供最佳條件，且在5天培養之後，NHDF數目比10% FBS中之NHDF數目高幾乎4倍(n=3，p<0.001)。在7天之後，在20%下之PRP增殖性作用甚至更有效地將總細胞數目增加至5-6倍，且一半細胞顯示如由流動式細胞量測術分析描繪之高增殖性表現型。

圖6。

實施例8-CC裝置產物之細胞表徵及其等用於培養PBMC、MSC及軟骨細胞之潛能研究 I.前言

測試三個根據本發明之裝置：

‧MC-PRP：允許從周邊血液、臍帶血及骨髓抽吸分離單核細胞

‧CC-PRP：允許製備富血小板血漿(PRP)，其可在合成培養基中以其本身使用或用作為添加劑，置換動物來源血清以促進試管內細胞生長

‧CC-S：允許獲得血清，其可在合成培養基中用作為添加劑以促進試管內細胞培養來置換動物來源血清

對應於由此等裝置產生之製劑之產物分別稱為「MC-PRP製劑」、「CC-PRP製劑」及「CC-S製劑」。

此等製劑係以液體或凝膠形式產生以用於生物塗層，且應用於矯形學及皮膚病學中。應注意，合成培養基中之CC-PRP及MC-PRP之使用可能需要添加抗凝血劑，例如肝素(2個單位/ml)以防止血漿凝血。

此研究在一方面旨在表徵3個製劑內所存在之細胞群且在另一方面旨在評估CC-PRP及CC-S製劑在細胞培養中對數種類型之細胞之潛能。

II.目標及服務 II.1.表現型表徵及細胞存活

此研究旨在：

藉由流動式細胞量測術進行MC-PRP製劑中所存在之細胞亞群之細表現型表徵(Fortessa LSRII，BD Biosciences)

對於CC-PRP及CC-S裝置，藉由6色流動式細胞量測術執行B細胞、T細胞、NK細胞及顆粒球計數

研究來自MC-PRP、CC-PRP及CC-S裝置之細胞在其等已經培養之後之存活

II.1. MC-PRP製劑中所存在之細胞群之細表現型表徵

免疫亞群之細表現型分型包括：

‧CD3+T淋巴球計數、CD19+B淋巴球、CD3-CD16+CD56+NK淋巴球

‧血液中所存在之3個單核球性亞群之計數及頻率分析：發炎性單核球CD14+、中間單核球CD14+CD16+及非典型單核球CD16+

‧血液中所存在之3個樹突狀細胞亞群之計數：DC骨髓：mDC1 CD1c+；mDC2 CD141+以及漿細胞樣DC CD123+

‧NK淋巴球(CD56-、CD56暗及CD56亮)之記數及亞群頻率分析

‧TCD4及CD8淋巴球亞群(初始，中央記憶、CD45RA-效應及CD45RA+記憶效應)之枚舉及頻率分析

‧T輔助淋巴球(Th1 CXCR3+、Th2 CCR4+、Th17/Th22 CCR6+CCR4+及TFH亞群CXCR5+)之計數及亞群頻率分析

‧T調節細胞亞群(初始CD45RA+、記憶CD45RA-FoxP3低、效應CD45RA-FoxP3高及活化HLA-DR+)之計數及頻率分析

‧B淋巴球亞群(初始CD27-IgD+、非轉換CD27+IgD+記憶、CD27+IgD-、CD27-IgD-、CD27-IgD-、雙重陰性CD24高CD38高未成熟/過渡CD27、CD27漿母細胞+CD38+CD138-及CD27+CD38+CD138+血漿細胞)之計數及頻率分析

將藉由MC-PRP裝置獲得之細胞之表現型與在同一供體上於Ficoll梯度離心之後分離之周邊血液單核細胞(PBMC)者相比較。因此，在Ficoll之後存在2個條件：條件「MC-PRP」及「CC-PBMC」。對於此等兩個條件而言，在表現型分型之前繼續進行至解包裝及計數PBMC之先前步驟為必須的。

對於兩個條件中之每一者，將表現型表徵分解至6至15個抗體之8個管子中：

‧管子1：編號充當參考物之細胞系LB、LT及NK

‧管子2：表徵3個單核球亞群：典型、中間及非常規。

‧管子3：分析LT分化，此允許使用標記CD45RA及CCR7之差分表現來表徵初始CD4及CD8群、中央記憶、記憶效應及EMRA。

‧管子4：分析樹突狀細胞(DC骨髓CD141+及CD1c+)及DC漿細胞樣亞群。藉由HLA-DR分子及共刺激分子之表現水平分析DC活化水平。

‧管子5：輔助T細胞分析，此使得有可能測定Th1(CXCR3+)、Th2(CCR4+)、Th17/22(CCR6+、CCR4+)、Th1/Th17(CXCR3+、CCR6+)及濾泡性T細胞(CXCR5+)之頻率。

‧管子6：基於CD16及CD56標記之差分表現表徵NK亞群。

‧管子7：基於CD45RA及FoxP3標記之表現分析調節性LT亞群。活化藉由在於HLA-DR、CD39、CD62L及CTLA-4分子之表現表徵。

‧管子8：基於CD27及IgD之相對表現分析LB亞群以表徵初始B細胞、非轉換記憶、轉換記憶。亦表徵漿細胞及過渡B。

此研究需要最少10ml至12ml供體血液。

II.1.b CC-PRP及CC-S製劑中之細胞之表現型表徵

對於CC-PRP及CC-S裝置：藉由6色流動式細胞量測術的B細胞、T細胞及NK細胞計數。

對於兩個條件(MC-PRP及CC-S)而言，在表型分型之前繼續進行至解包裝及計數此等樣本中所存在之單核細胞之初步步驟為必須的。對於兩個條件中之每一者，表現型表徵包括管子：LB、LT及NK(6個抗體+生存力標記+計數珠粒)。

此研究需要最少10ml供體血液以用於約1%之細胞污染假設。

選項：測定使用CC-S裝置獲得之血清對比在乾燥管子上獲得之自體血清中之生長因子。

以下生長因子之ELISA分析：CC-S對比在乾燥管子上獲得之自體血清中之TGF-β1、TGF-β2、PDGF-BB、PDGF-AB、VEGF、FGF鹼性、IGF-I及人類EGF。使用一組10個供體以進行統計研究。

II.1.c 在由製劑MC-PRP、CC-PRP及CC-S培養細胞之後之細胞存活

在培養之前執行單核細胞、血小板及顆粒球計數。此計數界定此研究所需之血液之量。此外，在24小時及48小時培養之後，執行計數、細胞生存力評估及藉由流動式細胞量測術進行之表徵(3個管子用於計數B淋巴球、T淋巴球、骨髓細胞及顆粒球)。

若在48h培養之後細胞存活大於70%，則吾等在72h及96h時達成兩個額外點，亦包括計數、細胞生存力評估及6色流動式細胞量測術表徵。

初步結果顯示在室溫下保持在PRP中之MNC之6天倍增時間。

II.2. CC-PRP及CC-S製劑之細胞存活評估

此研究之目標為評估PRP製劑對數種類型之細胞培養之作用：

- 人類周邊血液單核細胞(PBMC)

- 人類間葉幹細胞(MSC)

- 人類軟骨細胞

II.2.a. PBMC

在48h時藉由完全免疫表現型分型評估CC-PRP及CC-S製劑對PBMC培養之作用以證實某些細胞亞群之較佳存活。此由以下組成：

在培養之前(J0)在流動式細胞量測術中表現型表徵所有淋巴及骨髓群，允許分析骨髓細胞、NK細胞、調節T細胞、輔助T淋巴球、記憶T細胞及B淋巴球；

在48h培養之後在流動式細胞量測術中表現型表徵所有淋巴及骨髓群，允許分析骨髓細胞、NK細胞、調節T細胞、輔助T淋巴球、記憶T細胞及淋巴球B。

此工作係自體進行。測試四個條件：

‧自在乾燥管子上收集之血液獲得之自體血清(在培養基中以10%使用)

‧CC-S(在培養基中以10%使用)

‧自在乾燥管子上收集之血液獲得之自體血清(以10%+肝素2U/ml使用)(對照組，以克服肝素對細胞表現型之作用)

‧CC-PRP(以10%+肝素2U/ml使用)

在培養之前(J0-1點)藉由流動式細胞量測術進行之所有淋巴及骨髓群之細表現型表徵包含8個管子：

‧管子1：計數LB、LT及NK(6個抗體+生存力標記+計數珠粒)。標記0.5 10⁶個PBMC/管子

‧管子2：分析單核球亞群(13個抗體+生存力標記+計數珠粒)。標記2 10⁶個PBMC/管子

‧管子3：分析LT分化(11個抗體+生存力標記)。標記1 10⁶個PBMC/管子

‧管子4：分析樹突狀細胞亞群(17個抗體+生存力標記+珠粒編號)。標記2 10⁶個PBMC/管子

‧管子5：T輔助細胞分析(12個抗體+生存力標記)。標記2 10⁶個PBMC/管子

‧管子6：分析NK亞群(14個抗體+生存力標記)。標記1 10⁶個PBMC/管子

‧管子7：分析調節性LT(抗體+生存力標記)。標記1 10⁶個PBMC/管子

‧管子8：分析LB亞群(13個抗體+DAPI)。標記2 10⁶個PBMC/管子

在培養之後(48h，4點)藉由流動式細胞量測術進行之所有淋巴及骨髓群之細表現型表徵包括4×8個管子：

‧管子1-4：LB、LT及NK計數(6個抗體+生存力標記+計數珠粒)。標記0.5 10⁶ 個PBMC/管子

‧管子5-8：分析單核球亞群(13個抗體+生存力標記+計數珠粒)。標記2 10⁶個PBMC/管子

‧管子9-12：分析LT分化(11個抗體+生存力標記)。標記1 10⁶個PBMC/管子

‧管子13-16：分析樹突狀細胞亞群(17個抗體+生存力標記+珠粒編號)。標記2 10⁶個PBMC/管子

‧管子17-20：T輔助細胞分析(12個抗體+生存力標記)。標記2 10⁶個PBMC/管子

‧管子21-24：分析NK亞群(14個抗體+生存力標記)。標記1 10⁶個PBMC/管子

‧管子25-28：分析調節性LT(15個抗體+生存力標記)。標記1 10⁶個PBMC/管子

‧管子29-32：分析LB亞群(13個抗體+DAPI)。標記係在2×10⁶個PBMC/管子(輔助T淋巴球、記憶T淋巴球、B淋巴球)上進行。

代替48小時或另外，可進行在較後期之測試。

II.2.b.人類CSM

研究-可使用新鮮血液：

以評估與胎牛血清(陽性對照組)相比，CC-PRP及CC-S製劑在培養中對間葉幹細胞(MSC)之存活及增殖之作用；

以研究MSC對三個細胞系之分化特性：軟骨細胞、脂肪細胞及成骨細胞。

研究中之第一步為確定待用於培養中之CC-PRP及CC-S之有效劑量(0%、5%、10%、15%、20%或25%)以用於3代之MSC的最佳存活及增殖。一旦確定此等劑量，則比較MSC存活及增殖研究在習用之含有胎牛血清之陽性對照組培養基與含有最佳劑量之CC-PRP或CC-S之培養基之間進行。在至少2個不同之CSM及4代樣本上進行此研究。在各代藉由錐蟲藍計數測定MSC之存活及增殖。

藉由在21天在相較於參考培養基而言之特定分化培養基中培養細胞來進行三個細胞系(軟骨細胞、脂肪細胞及成骨細胞)中之MSC之分化特性研究。

在軟骨細胞分化之例子，在一方面藉由比較相較於在第0天未分化細胞而言之在第21天經分化細胞且在另一方面藉由在存在或不存在MSC之軟骨細胞分化之誘導因子TGFB3之情況下比較所培養之細胞來評估分化效率。因此，需要7個條件以評估CC-PRP及CC-S對軟骨細胞分化之作用：

‧CSM J0

‧CSM+陽性對照組J21

‧CSM+陽性對照組+TGFb3 J21

‧CSM+CC-PRP J21

‧CSM+CC-PRP+TGFb3 J21

‧CSM+CC-S J21

‧CSM+CC-S+TGFb3 J21

可能在培養結束時需要纖維母細胞標記以確認細胞尚未轉分化。

對於朝向脂肪細胞之分化，藉由比較在分化培養基中或在增殖培養基中培養21天之細胞評估分化效率。因此，需要6個條件以評估CC-PRP及血清對脂肪細胞分化之作用：

‧CSM+陽性對照組J21，增殖培養基

‧CSM+陽性對照組J21，分化培養基

‧CSM+CC-PRP J21，增殖培養基

‧CSM+CC-PRP J21，分化培養基

‧CSM+CC-S J21，增殖培養基

‧CSM+CC-S J21，分化中間

藉由評估特異於各細胞系之標記之誘導來測定分化，該評估係藉由RT-qPCR(3個標記/分化細胞之組)以及藉由用於朝向脂肪細胞之分化之紅油染色來進行。

最後，將相同實驗流程應用於朝向骨母細胞之分化：藉由比較在分化培養基中或在增殖培養基中培養21天之細胞來評估分化效率。需要六個條件來評估CC-PRP及血清對朝向骨母細胞之分化的作用：

‧CSM+陽性對照組J21，增殖培養基

‧CSM+陽性對照組J21，分化培養基

‧CSM+CC-PRP J21，增殖培養基

‧CSM+CC-PRP J21，分化培養基

‧CSM+CC-S J21，增殖培養基

‧CSM+CC-S J21，分化中間

藉由評估各細胞系之特定標記之誘導來測定分化，該評估係藉由RT-qPCR(5個標記/分化細胞之組)以及藉由用於朝向骨母細胞之分化之組織學染色來進行。

II.2.c.人類軟骨細胞

利用在人類軟骨細胞之存活、增殖及表現型上的CC-PRP及CC-S管子獲得製劑。

第一步為確定待用於培養中之CC-PRP及CC-S之有效劑量(0%、5%、10%、15%、20%或25%)以獲得2代之人類軟骨細胞之最佳存活及增殖。在各代藉由錐蟲藍計數測定MSC之存活及增殖。藉由RT-qPCR測定CC-PRP及CC-S對在培養中維持軟骨細胞表現型之作用且與在於含有FCS之陽性對照組培養基中培養細胞之後獲得的結果相比較。在第1代及第2代評估軟骨細胞特定標記(聚集蛋白聚糖(aggrecan)、膠原蛋白IIB、Sox9、膠原蛋白X、MMP13)之表現。在最終表徵中可能需要纖維母細胞標記以評估軟骨細胞之去分化。

II.2.d.人類肝細胞

CC-PRP及/或CC-S製劑對人類肝細胞之增殖及分化狀態之維持的作用，使用兩個細胞模型：HepG2人類肝腫瘤細胞系-C3A及HuH7及成人肝細胞之原代培養物。重要地，應注意實驗以同種異體執行。

1-研究PRP對肝腫瘤系之存活及增殖之影響

在第一系列實驗中，在HepG2-C3A及HuH7細胞系上評估CC-PRP及CC-S溶液之毒性。測試大劑量作用(5%至25%)。隨後，評估此等溶液對增殖之作用。隨後，選定小數目劑量以分析在數代之細胞增殖。

實驗指引

毒性評估

在96孔盤中在補充有10%胎牛血清(FCS)之培養基中培養細胞。

- 在16小時培養之後，培養基以補充有以下之基礎培養基置換：

‧5%、10%、15%、20%或25%補充有2U/ml肝素之CC-PRP

‧5%、10%、15%、20%或25%補充有2U/ml肝素之經照射之CC-PRP

‧5%、10%、15%、20%或25% CC-S

‧2U/ml肝素

‧10% FCS

‧10%補充有2U/ml肝素之FCS

在48小時培養之後，使用Cell Titer-Glo發光生存力分析套組(Promega)來量測細胞生存力。

評估在一代之增殖

在96孔盤中在補充有10%胎牛血清(FCS)之培養基中培養細胞。

‧5%、10%、15%、20%或25%補充有2U/ml肝素之CC-PRP或經照射之CC-PRP

‧5%、10%、15%、20%或25% CC-S

‧2U/ml肝素

‧10% FCS

‧10%補充有2U/ml肝素之FCS

- 在24、48及72h培養之後，藉由量測BrdU之併入(細胞增殖ELISA，BrdU-Sigma)來評估增殖。

評估在3代之增殖

在24孔盤中在補充有10%胎牛血清(FCS)之培養基中培養細胞。

-在16小時培養之後，培養基以補充有以下之基礎培養基置換：

‧x%、y%補充有2U/ml肝素之CC-PRP或經照射之CC-PRP

‧x%、y% CC-S

‧10% FCS

‧10%補充有2U/ml肝素之FCS

- 在各代計數細胞且在錐蟲藍中量測生存力。

重複三次(對於在3代之計數，重複兩次)測試各實驗點。基於3 個獨立實驗(因此具有3批不同CC-PRP、CC-S)分析結果。

2-研究PRP對原代人類肝細胞之增殖及分化狀態之維持之影響

在明確界定之補充有或不補充有CC-PRP之培養基中培養原代人類肝細胞(Pichard L,Raulet E,Fabre G,Ferrini JB,Ourlin JC,Maurel Moleth P.Molods 2006,320：283-93)。在其後所指示之時間，分析毒性、增殖及分化狀態之維持。應注意，應在3個原代肝細胞製劑上以CC-PRP之3個不同批次執行實驗。

注意：應考慮在肝腫瘤系上獲得之結果以調整所用CC-PRP之百分比且決定是否度活此經照射之溶液。

實驗指引

毒性評估

在塗佈有膠原蛋白I之96孔盤中在所界定之補充有2%胎牛血清(FCS)之培養基中培養肝細胞(Pichard等人，2006)。

‧2U/ml肝素

在24h及96h培養之後，使用Cell Titer-Glo發光生存力分析套組(Promega)來量測細胞生存力。

藉由量測BrdU併入進行之增殖評估。

- 在塗佈有膠原蛋白I之96孔盤中在所界定之補充有2% FCS之培養基中培養肝細胞(Pichard等人，2006)。

在16小時培養之後，培養基以補充有以下之基礎培養基置換：

‧2U/ml肝素

‧10ng/ml EGF及HGF以及2U/ml肝素

藉由量測BrdU併入(細胞增殖ELISA，BrdU-Sigma)來每24小時評估增殖，持續72小時。

評估肝細胞之分化狀態之維持

- 在塗佈有膠原蛋白I之24孔盤中在所界定之補充有2% FCS之培養基中培養肝細胞(Pichard等人，2006)。

‧x%及y%補充有2U/ml肝素之CC-PRP或經照射之CC-PRP

‧2U/ml肝素此係在約48小時期間進行。

隨後，將細胞與10μM利福平(rifampicin)或10nM TCDD(異生物質代謝中所涉及之兩個主要信號傳導路徑之原型活化劑)一起培養24小時。

隨後，藉由透過RT-qPCR量測此等信號傳導路徑之一連串目標基因之表現(PXR、AhR、CYP3A4、CYP1A2白蛋白、HNF4)來評估異生物質代謝酶之表現之維持及可誘導性。

選項1 ：在將肝細胞與兩個劑量之CC-PRP或經照射之CC-PRP一起培養之後藉由西方墨點法評估ERK1/2及Akt信號傳導路徑。EGF用於陽性對照組中。

選項2 ：量測CYP3A4及CYP1A2活性(KitsP450-Glo)。

選項3 ：在補充有CC-HA(富含玻尿酸)之培養基中培養原代肝細胞以促進肝細胞組織成球體。亦有意測試CC-PRP或CC-S對球體形成之影響。實際上，其等之形成係視血清存在而定。另外，球體形成不對所有批次之肝細胞有效。

實驗指引

在96孔盤GravityTRAP® ULA盤中在所界定之補充有以下之培養基(Pichard等人，2006)中培養肝細胞：

‧10% SFV：

‧10% CC-HA

‧10% CC-PRP

‧10% CC-S

- 在7天時段內在顯微鏡下觀測球體形成。

藉由鈣黃綠素-碘化丙錠標記評估球體中之肝細胞之生存力。

實現在所界定之培養基(Pichard等人2006)2% FCS中之細胞與膠原蛋白I連接之控制。

在6孔上測試各實驗點。基於5項獨立實驗(因此以5批不同CC-HA、CC-PRP、CC-S)分析結果。

注意：待在測試溶液中直接培養之肝細胞，出於邏輯原因，應在冷凍保存之肝細胞上產行實驗。

之後，可評估不同溶液對肝細胞分化成球體之影響。此研究之關聯性視以下而定：在一方面，利用CC-PRP、CC-S溶液獲得之關於肝細胞於2D之分化之結果，及在另一方面其等對球體形成之影響。

實施例9-針對阿茲海默症、卡羅爾克羅澤(Carole Crozet)、幹細胞及神經退化性疾病之神經及神經幹細胞應用

第一目標為測定本發明之PRP製劑及不同細胞培養裝置對人類神經幹細胞(NSC)之增殖及分化之作用。吾等提出使用兩個神經幹細胞系：來源於人類胚胎幹細胞之H9NSC(Gibco)系或來源於非病理學iPSC之iPSC/NSC系。

第二目標為評估在健康小鼠及AD實驗模型中經移植且經PRP預處理之NSC細胞之命運。

最後，最終目標為研究PRP對NSC及來自由患有阿茲海默症(AD)之患者之纖維母細胞再程式化之iPSC獲得之神經網路的作用。

PRP及神經模型

有許多關於神經幹細胞及其神經元衍生物在移植以及等知其分化之後之命運之問題。此外，此等細胞可以神經球形式或以單層形式生長。在神經球中遇到難以主控之壞死及自發分化之問題；在另一方面，與在單層培養中者一樣，此類型之培養不需要基質以用於細胞黏著。實際上，對於單層培養，NSC擴增需要使用先前已塗佈有基質膠(matrigel)、聚鳥胺酸+層黏連蛋白或聚鳥胺酸+纖網蛋白之培養皿，而此由於其等之來源而造成問題。隨後，可考慮使用PRP作為用於單層培養之基質置換物或用於懸浮培養之營養支撐物。

細胞模型

使用來自由GIBCO販售之人類胚胎幹細胞之H9NSC系及自已利用用於分化此等細胞之不同實驗指引生成之健康iPSC獲得之NSC：單層之神經元分化(在30天內)、使得有可能獲得成熟神經元之3D之神經元分化(在6至12週內)。已使用由患有阿茲海默症之患者之纖維母細胞產生之iPSC進行針對阿茲海默症的2年建模。細胞表徵顯示來自患者之細胞相對於健康對照組具有不同表現型：較慢增殖、較高細胞凋亡、活性含氧物(ROS)生成及較高Aβ42/40比，此與阿茲海默症標記一致。目標為對來自患有阿茲海默症之患者之iPSC測試PRP，及測試與阿茲海默症之先前所培養之健康細胞之移植。阿茲海默症實驗模型中之PRP或與PRP一起之共注射。

實驗計劃 1-確定PRP劑量

實驗計畫之第一步為測定待針對NSC培養使用之PRP之適當劑量，亦即，不導致細胞死亡之劑量。關於此，吾等提出測試不同PRP之不同劑量且相較於對照組中使用之吾等培養基之使用評估在1代之細胞之存活及增殖。

評估毒性/細胞凋亡：藉由量測LDH釋放(CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析-Promega)評估PRP溶液之毒性，且使用凋亡蛋白酶-3/7套組(Caspase-Glo® 3/7分析-Promega)評估細胞凋亡。

增殖評估：藉由量測BrdU併入(細胞增殖ELISA，BrdU-Sigma)來評估增殖。基於3個獨立實驗分析結果。

2-研究PRP對健康H9NSC或iPSC/NSC之存活、增殖及分化之影響

在4代在存在PRP之情況下培養H9NSC或iPSC/NSC細胞達24h、48h及72h，此時分析毒性、增殖及細胞凋亡。在對照組中使用在StemProNSC增殖培養基中生長之細胞。

評估分化：在第30天評估單層形式之分化或在第6週及第12週評估3D形式之分化。藉由q-RT-PCR及9個細胞系及細胞功能性之標記(NSC、神經元、星狀神經膠細胞、血清素激導性、GABA激導性、乙醯膽鹼激導性、多巴胺激導性、麩胺酸激導性、突觸活性)之免疫螢光法評估分化。

3-研究PRP對健康H9NSC或維持呈神經球之iPSC/NSC之存活、增殖及分化之影響

在4次繼代在存在PRP之情況下以神經球生長H9NSC、iPSC或NSC細胞達24h、48h及72h，此時分析毒性、增殖及細胞凋亡。在對照組中使用在StemProNSC增殖培養基中生長之細胞。

增殖評估：藉由量測BrdU之併入(細胞增殖ELISA，BrdU-Sigma)來評估增殖。基於3個獨立實驗分析結果。

評估分化：在第30天評估單層形式之分化或在第6週及第12週評估3D形式之分化。藉由q-RT-PCR及9個細胞系及細胞功能性之標記(NSC、神經元、星狀神經膠細胞、血清素激導性、GABA激導性、乙醯膽鹼激導性、多巴胺、麩胺酸激導性、突觸活性)之免疫螢光法評估分化。

4-研究置換習知培養基之PRP對H9NSC或健康iPSC/NSC之存活、增殖及分化之影響

在先前已塗佈有PRP製劑之盤上以單層形式培養H9NSC、iPSC 或NSCf細胞(達24h、48h及72h，此時在4代分析毒性、增殖及細胞凋亡)。在對照組中使用在StemProNSC增殖培養基中生長之細胞。

5-研究PRP對整合至整合性腦系統中之影響

可利用1種細胞類型H9NSC或健康20週之iPSC/NSC進行分析。

器官型培養中之腦切片上之細胞移植及細胞命運分析。

向C57BI/6J小鼠中之細胞移植及細胞命運分析。

器官型培養中之建模神經退化性病變(阿茲海默症)之腦切片上之細胞移植及細胞命運分析。

6-研究PRP對來自患有阿茲海默症之患者之iPSC/NSC細胞表現型之影響

吾等自3名患有阿茲海默症之患者生成3個iPSC系。兩名患者為基因形式(APP基因中之D694N突變或PSEN1基因中之G217D突變)之攜帶者及一名患者具有單發形式。此等細胞具有已不同於健康細胞之表現型。吾等評估PRP影響，特別是PRP防止細胞死亡或經分化之細胞表現型改變之能力。吾等亦評估 AD之兩個主要標準特徵：Aβ水平及Tau磷酸化。

研究相較於健康iPSC/NSC對照組PRP對iPSC/NSC MA存活、增殖及分化之影響

‧評估毒性/細胞凋亡：藉由量測LDH釋放(CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析-Promega)評估PRP溶液之毒性，且使用凋亡蛋白酶-3/7套組(Caspase-Glo® 3/7分析-Promega)評估細胞凋亡。

‧增殖評估：藉由量測BrdU之併入(細胞增殖ELISA，BrdU-Sigma)來評估增殖。基於3個獨立實驗分析結果。

‧評估分化：在第30天評估單層形式之分化或在第6週及第12週評估3D形式之分化。藉由q-RT-PCR及9個細胞系及細胞功能性之標記(NSC、神經元、星狀神經膠細胞、血清素激導性、GABA激導性、乙醯膽鹼激導性、多巴胺激導性、麩胺酸激導性、突觸活性)之免疫螢光法評估分化。

‧評估在經分化之細胞上之PRP之添加。藉由q-RT-PCR及9個細胞系及細胞功能性之標記(NSC、神經元、星狀神經膠細胞、血清素激導性、GABA激導性、乙醯膽鹼激導性、多巴胺激導性、麩胺酸激導性、突觸活性)之免疫螢光法評估分化。

研究PRP對所分泌之Aβ水平及對增殖性細胞上、經分化之細胞上之Tau磷酸化之影響

‧藉由多重ELISA的分析Aβ40及Aβ42且評估Aβ40/Aβ42比率

‧Tau/磷酸化Tau劑量

實施例10-自體富血小板血漿(CC-PRP)安全地增強人類試管內纖維母細胞擴增 摘要

如今，用於皮膚修復之自體纖維母細胞應用呈現重要臨床關注。在大多數情況下，試管內皮膚細胞培養為必須的。然而，使用異種或同種異體培養基進行之細胞擴增呈現一些缺點，諸如感染傳播之風險或緩慢的細胞擴增。在此研究中，吾等研究自體培養系統以利用患者自身之富血小板血漿(PRP)試管內擴增人類皮膚纖維母細胞。自經歷腹壁成形術之患者分離人類真皮纖維母細胞，且收集血液以使用CC-PRP醫學裝置製備新鮮PRP。隨後使用補充有胎牛血清(FBS)或PRP之培養基培養至多7天。相較於FBS而言，在補充有PRP之培養基中培養之纖維母細胞顯示劑量依賴性、顯著較高之增殖速率(在20% PRP之情況下至多7.7倍)及在試管內創傷癒合中起始較快遷移，同時維持染色體穩定性。在高濃度下，PRP改變纖維母細胞形態，誘導細胞骨架重排及α-SMA及波形蛋白表現增加。吾等之發現顯示，自體PRP為用於纖維母細胞培養之有效且具成本效益之補充物，且應被視為用於試管內細胞擴增之異種/同種異體血液衍生物之安全替代方案。

影響陳述

自體真皮纖維母細胞移植為皮膚缺陷修復中之重要療法，但試管內皮膚細胞培養在大多數情況下為必須的。然而，使用異種或同種異體培養基進行之細胞擴增呈現一些缺點，諸如感染傳播之風險。吾等證實利用患者自身之富血小板血漿之自體培養系統為用於纖維母細胞培養之有效、具成本效益且安全的補充物。當其重視優良製造規範及管制機構標準時，其應被視為用於驗證使用試管內細胞擴增的未來臨床方案之異種或同種異體血液衍生物之強力替代方案及代替物。

前言

再生藥品具有治癒或置換因年齡、疾病或外傷而受損之組織及器官以及修正先天性缺陷之潛能。臨床前及臨床數據顯示用於治療慢性疾病及急性損傷或甚至一些癌症之前景。1 在再生藥品之「工具箱」中，細胞療法旨在向患者傳遞自體或同種異體細胞組分以用於修復或再生受損組織以便恢復生理功能。2 細胞療法中可使用廣泛範圍之細胞，包括血液及骨髓細胞、成熟及未成熟固體組織細胞、成體幹細胞及(最有爭議的)胚胎幹細胞。皮膚為含有基礎幹細胞群及對於更新及維持其結構完整性及功能至關重要之各種細胞類型之人體內之多功能及保護性障壁。2 治療性創傷癒合及皮膚結構及功能之恢復視許多因素而定，包括先驅細胞、胞外基質(ECM)組分、用於血管生成及細胞-基質及細胞-細胞相互作用之調節之生長因子及細胞介素之可得性。為真皮之主要細胞類型之纖維母細胞在真皮中生產關鍵ECM蛋白，包括層黏連蛋白、纖網蛋白、膠原蛋白、彈性纖維、非膠原蛋白分子及在正常皮膚體內恆定及創傷癒合中調節細胞功能、遷移以及細胞-基質及細胞-細胞相互作用之生長因子。3 已證實真皮纖維母細胞作為皮膚創傷癒合4、組織再生5中之治療裝置或作為美學及整形手術程序中之皮膚填充劑之臨床潛能。6 一些作者甚至暗示，相比於間葉幹細胞，在再生藥品方面纖維母細胞可用作更可行且潛在地更有效之細胞療法。7

自體細胞療法旨在降低有害免疫反應或感染傳播之風險。在大多數情況下，細胞在治療前必須進行試管內擴增以獲得均質細胞群及足夠數目。最近，美國食品藥物管理局(FDA)觀察到，在製造過程期間超過80%用於細胞療法產品之試驗用新藥應用使用胎牛血清(FBS)。8 然而，此異種添加劑呈現感染及免疫反應之潛在風險且提供緩慢的細胞增殖。因此，針對安全且有效之血清代替物之尋找為基本的。一些作者已提出用自體人類血清置換培養基中之FBS以用於細胞擴增，但由於細胞增殖慢，仍需要長培養時間(3週)及移植之前之數個細胞繼代。9，10在先前的研究中，吾等證實自體富血小板血漿(PRP)可用作用於脂肪衍生型間葉細胞幹細胞增殖之安全、有效且具成本效益之培養基。11供應有20%自體PRP之培養基增加細胞增殖超過13倍而不改變細胞表現型。目前，自患者自身之血液獲得之PRP已有效用於臨床使用情況中以用於創傷癒合、骨再生或皮膚回春。12 血小板為自體生長因子之天然供應者、細胞增殖、分化及組織再生之關鍵控制者。在生理條件下，血小板可被活化且其等之α顆粒可逐漸分泌生長因子及細胞介素，諸如血小板衍生型生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、轉形生長因子-P(TGF-P)及血管內皮生長因子(VEGF)。因此，吾等假定自體PRP可充當當前非自體產品之安全且有效之生物補充替代方案以用於皮膚纖維母細胞擴增。在此研究中，吾等評估與典型FBS補充培養基相比使用CC-PRP裝置獲得之自體PRP之功效以界定用於人類真皮纖維母細胞(NHDF)增殖之自體系統。吾等研究最佳PRP濃度，且評估補充有PRP之培養基對NHDF之遷移、黏著、分化及基因組穩定性之生物作用。

材料及方法 細胞分離

在日內瓦大學醫院(Geneva University Hospital，Geneva，Switzerland)在吾等整形、重建且美觀手術部自10名經歷腹壁成形術之健康女性分離NHDF。程序符合赫爾辛基聲明(Declaration of Helsinki)之原則且經當地機構倫理學委員會批准(協定#3126)。自所有供體獲得知情書面同意書。將NHDF如其他地方所描述地分離13，且在補充有10% FBS、1% HEPES 1M緩衝溶液(Life Technologies)、1%非必需胺基酸混合物100×(Life Technologies)、1% L-麩醯胺酸100×(Life Technologies)、1%青黴素/鏈黴素100×(Life Technologies)、 1%丙酮酸鈉100×(Life Technologies)之完整生長培養基(達爾伯克氏改良之伊格爾氏培養基[DMEM]；Life Technologies，Paisley，UK)中培養，且在4℃下儲存至多1個月。視程序而定，在第1或2代使用其。

製備人類自體PRP

藉由使用CC-PRP醫學裝置由相同NHDF供體之血液製備PRP。此等含有作為抗凝血劑之檸檬酸鈉之特別管子透過特別的分離凝膠分離血小板及血漿與其他血液組分(例如紅血球及白血球)。簡言之，將30mL人類周邊血液收集至三個CC-PRP管子中(10毫升/管子)。將所收集之血液在標準實驗室離心機中在1500g下離心5min。隨後，紅血球及白血球聚積在分離凝膠下方在試管底部，而血漿及血小板保留在凝膠層上方。藉由返回管子五次使含血小板血漿均質化以獲得6.0mL的PRP，其係收集在聚丙烯管(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)中直至使用為止。在離心之前且在添加至培養基之前之所製備之PRP中計數全血中之血小板、紅血球及白血球以及平均血小板體積(KX-21N；Sysmex，Lincolnshire，IL，USA)。

細胞增殖分析

藉由CellTraceTM紫(Molecular Probes，ThermoFischer Scientific，Waltham，MA，USA)染色評估細胞增殖。在第2代，在24孔盤中以8×10³個細胞/孔之密度接種NHDF，且在10% FBS中培養或用一系列PRP濃縮物(1-50%)處理7天。根據製造商之實驗指引，藉由流動式細胞量測術使用Attune聲聚焦細胞計數器(Life Technologies)執行細胞增殖之定量。為執行細胞週期分析，吾等量測DNA含量。簡言之，在12孔盤中以4×10⁵個細胞/孔之密度接種NHDF，且在10% FBS中培養或用一系列PRP濃縮物(1-50%)處理2天及7天。使用Tryple X胰蛋白酶處理細胞且隨後用70%乙醇固定。隨後，使細胞預滲透，且在室溫下用FxCycle PI溶液(Molecular Probes)染色核DNA內容物。使用Attune聲聚焦細胞計數器(Thermofisher Scientific)運作樣本。使用FlowJo軟體執行細胞週期分析。

細胞形態、α-SMA及波形蛋白表現

為研究細胞骨架重排，在黑暗中在底部透明的96孔盤(pCIear，Greiner，Kremsmünster，Austria)以105個細胞/毫升之濃度在補充有0.5% FBS之DMEM中接種細胞達24h，且隨後用一系列PRP濃縮物(1-50%)處理7天。將NHDF在室溫下用4%三聚甲醛固定10min且用0.1% Triton X-100預滲透5min。隨後，使其經50μL 5U/mL毒傘素(Life技術)染色，用PBS洗滌兩次，且經50μL 1μg/mL DAPI標記5min。為評估波形蛋白表現，在室溫下以2.5μg/ml使用小鼠單株抗波形蛋白抗體FITC(V9，eBiosciences，ThermoFischer Scientific)達1h。為描繪α-SMA表現，在室溫下以2μg/ml使用兔子多株抗αSMA(Abcam，ab 5694)達1h，接著在室溫下以2μg/ml使用次級山羊抗兔子多株Alexa fluor 594(Abcam，ab 150080)達1h。使用Cytation 3細胞成像多模式讀取器(BioTek)以觀測免疫螢光染色。為量測α-SMA蛋白表現，在6孔盤中以5×10⁵個細胞/孔之密度接種NHDF，且在10% FBS中培養或用一系列PRP濃縮物(1-50%)處理4天。使用Tryple X使細胞脫離且隨後用於PBS中之2%三聚甲醛固定10min。在於PBS中洗滌之後，使細胞經0.1% Triton X-100預滲透細胞5min。在室溫下將106/ml單細胞懸浮液與在2μg/ml下之最佳濃度之抗α SMA抗體(Abeam，ab5694)在洗滌緩衝液(於PBS中之2%正常山羊血清)中一起培養1h，洗滌三次，接著與山羊抗兔子IgG H&L(Alexa Fluor®594，Abcam)一起培養1-h。在Attune Nxt流式細胞儀(Life Technologies)上執行流動式細胞量測術。對照組樣本由無初級抗體結合之細胞組成。

藉由MTT分析進行之細胞胞洩及代謝活性評估

四唑鎓鹽溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)之還原為細胞氧化還原狀態之指標。甲臢產生之量表明細胞質之還原性潛能且因此表明細胞生存力。其為最常用於量測細胞增殖及細胞毒性之方法中之一者。MTT係藉由胞吞作用由細胞吸收且在胞內體/溶酶體區室中還原成甲臢。甲臢胞內沈積為藍色顆粒。14 在特殊情況下，15其可經胞洩且形成類針甲臢晶體。在96孔盤中以104個細胞/孔之密度接種NHDF且在含有0.5% FBS之DMEM中培養隔夜。第二天，使細胞培養物經一系列PRP濃縮物(5-20%)處理48h，且隨後在37℃下添加10μL MTT(500μg/mL最終濃度)達4h。利用倒置顯微鏡(Nikon)拍攝照片(100×放大)。隨後，抽吸培養基，且將不可溶甲臢晶體以100μL DMSO/孔溶解。隨後，將盤置放於振盪器上達5min(150rpm)。在微定量盤讀取器(Biotek)上在595nm下讀取吸光度。

細胞黏著分析

對於層黏連蛋白及第I型膠原蛋白上之細胞黏著之評估，在96孔盤上重複三次執行實驗。將NHDF以1×10⁴個細胞/孔之密度塗鋪在預塗佈有層黏連蛋白(10μg/mL)及第I型膠原蛋白(50μg/mL)之96孔盤上。使細胞在37℃下在10% FBS中或與10% PRP一起黏著30min、1h或4h。將盤用PBS洗滌三次，用4%三聚甲醛固定10min，用0.1%結晶紫染色，且將樣本用流動的水洗滌且空氣乾燥；在倒置顯微鏡下拍攝影像。以冰乙酸溶解樣本，且藉由使用自動微定量盤讀取器測定在570nm下之光密度。

創傷癒合分析

將NHDF在96孔盤中以4×10⁴個細胞/孔之密度接種且生長達24h至匯合。在NHDF單層中使用10-μL吸移管尖端製造刮痕。用PBS洗滌孔兩次以移除已脫離之細胞，且在各孔中央中拍攝照片。隨後，將NHDF在10% FBS中或與一系列PRP濃縮物(1-50%)一起培養8h。在培養之後，將NHDF用PBS洗滌且在4%三聚甲醛中固定。在高通量Cytation 3細胞成像多模式讀取器(BioTek)上每孔獲得一個影像(中央位置，與時間0相同)。使用ImageJ軟體藉由量測在時間0h及8h時的受傷面積來執行定量。

比較性基因組雜交陣列

藉由比較性基因組雜交陣列測定基因組穩定性。藉由使用比較性基因組雜交(CGH)比較經FBS 10%或PRP 10%處理6天之NHDF。根據製造商之實驗指引，使用QIAGEN QIAamp DNA Mini套組(Qiagen，Hilden，德國)萃取DNA。使用具有43kb總體中值探針間距之Agilent SurePrint G3人類CGH微陣列套組4_180K(設計ID 022060)(Agilent Technologies)執行陣列CGH。實際解析度為約129Kb。混集自所培養之NHDF萃取之DNA及對照組DNA(Promega男性DNA，參考G1471)。分別將供體DNA及性別相符的對照組之DNA(各1μg)以Cy3-dUTP及Cy5-dUTP(Sure Tag標記套組，Agilent Technologies)標記。藉由Amicon Ultra 30 K過濾器(Millipore，Burlington，MA，USA)來純化所標記之產物。根據由Agilent提供之實驗指引執行雜交。混集供體及對照組DNA且在65℃下與2mg人類Cot-I DNA雜交且旋轉24h。使用Agilent SureScan微陣列掃描儀及Agilent Feature Extract軟體(v11.5)分析陣列，且結果由Agilent Genomic Workbench(7.0版)呈現。

統計分析

對於各細胞培養實驗，重複三次或重複四次執行處理。除非另外說明，否則各實驗重複三次。數據係以平均值±SEM呈現。將單向ANOVA用於具有一個自變量之實驗中之多重比較。將Dunnet測試用於顯著性ANOVA之事後分析。當p

0.05時，組之間之平均值中之差異是顯著的。

結果 全血及PRP中之血球及血小板計數

在離心之後，大部分血小板於血漿底部聚積在凝膠分離器上。將凝膠上之血小板懸浮於完整血漿(平均體積6ml)中且將此懸浮液用作為PRP。PRP之最終平均血小板濃度為2.5×10⁵ +/- 1.21個血小板/μL。此濃度比離心之前之全血濃度(1.64×10⁵ +/- 0.64個血小板/μL)大1.53倍。來自全血之PRP中之血小板回收率為96%。全血與PRP之間之平均血小板體積相當(全血中之8.7fL +/- 0.87相對於PRP中之8.2fL +/- 0.82)。相較於全血，平均白血球濃度在PRP中顯著較低(分別為0.75×10³ +/- 0.7個細胞/μL相對於6.75×10³ +/- 2.88個細胞/mL；p<0.05)。平均紅細胞濃度亦顯著降低(分別為0.03×10⁶ +/- 0.001個細胞/mL相對於4.17×10⁶ +/- 0.49個細胞/mL；p<0.05)(n=10)(圖13A)。

PRP促進增殖之劑量依賴型增加以及細胞週期改變

在7天培養且不更換培養基之後，與含有FBS之培養基相比，補充有不同PRP濃縮物之培養物顯示較高存活NHDF數目(圖14)。此PRP之增殖功效遵循劑量依賴性鐘狀曲線。最佳培養條件為PRP 20%，其中NHDF數目比FBS 10%高7.7倍(n=10；p<0.001)。觀測到在48h之後與對照組經FBS處理之細胞相比，經PRP處理之樣本展現顯著的細胞週期改變。在「G0/G1」期的細胞之平均百分比自FBS 10%組中之74.5%變為20% PRP組中之62%；在「S」期者自FBS 10%組中之9.5%變為PRP 20%組中之13%；在「G2/M」期者自FBS 10%組中之14%變為PRP 20%組中之23%(圖15A及B)。使用補充有PRP之培養基，在7天處理之後，細胞匯合，停止DNA合成及有絲分裂，且細胞進入G0/G1期呈靜態狀態(圖15C)。

MTT甲臢胞洩以及代謝活性之增加由PRP處理誘導

當將細胞與四唑鎓鹽MTT一起培養時，其等將鹽還原成紫色水不可溶甲臢。此胞質內鹽還原被認為係「細胞氧化還原活性」之指示符且因此與粒線體酶相關。在顯微鏡檢查經FBS處理之培養物下(圖16A)，甲臢顆粒處於胞內細胞器中。然而，當使細胞經PRP(5-20%)處理48h時，類針晶體出現在細胞表面上，代表經胞洩之MTT甲臢(圖16A)。此外，當吾等藉由光學密度測定法定量所溶解之甲臢之量時，吾等證明在經PRP處理之細胞中之增加，此直接反映在48h處理之後，與經FBS 10%處理之細胞相比，在經PRP 20%處理之細胞中細胞代謝活性增加(圖16B)以3.12倍達到峰值。

評估PRP對細胞形狀、細胞骨架、波形蛋白及α-SMA表現之作用

在典型FBS補充培養基中培養之NHDF顯示正常之扁平化細胞形狀，而經PRP(10-50%)處理之NHDF成紡錘體形狀，該紡錘體形狀為更接近3D基質培養或活體內使用情況之形態(圖2)。吾等試圖研究在7天PRP處理下發生之形態學變化(圖17A)是否與表現型變化相關。吾等首先證實，由皮層肌動蛋白定位(FBS 10%)至厚跨細胞絲狀構造(PRP 20%)之明顯F-肌動蛋白重組(圖17B)。吾等進一步藉由流動式細胞量測術及免疫螢光分析評估在PRP處理後之α-SMA表現之變化(圖18A)。在高PRP濃度(40-50%)之情況下α-SMA表現顯著地增加，而經FBS及PRP 5-10%處理之細胞顯示基礎核周染色(圖18B)。免疫螢光分析顯示在存在PRP 20%之情況下波形蛋白染色之增加，但其在高PRP濃度(PRP 50%)下完全消除。

PRP處理影響對胞外基質之細胞黏著且促進纖維母細胞集體遷移

為進一步表徵PRP對NHDF生物學之生物作用，吾等評估PRP處理對層黏連蛋白及第I型膠原蛋白上之細胞黏著之作用。如圖19A中所示，在接種之後4h，PRP減少NHDF對層黏連蛋白之總體接附。此作用在15min之後已出現，且總體細胞黏著減少21%。對於NHDF對膠原蛋白I基質之接附，獲得相同結果(圖19B)(在15min之後41%總細胞黏著)。為研究暴露於PRP之NHDF之遷移性特性，吾等執行試管內刮痕分析(圖20)。與利用FBS進行之細胞培養相比，八小時20% PRP處理誘導自刮痕邊界遷移至刮痕區中之細胞數目增加10%。此遷移前端為集體細胞遷移。相對而言，暴露於FBS 10%之NHDF顯示經分離之細胞遷移之特點。

PRP不改變細胞基因組穩定性

將在第2代之NHDF與補充有FBS 10%或PRP 10%之培養基一起培養4天以記錄增殖期間之基因穩定性。經兩種不同培養基處理之細胞之陣列CGH分析並未顯示不平衡染色體重排。響應於PRP處理之增加之增殖率並未引發基因組不穩定性。為例證數據，在染色體4(區q13.2)上所描繪之良性同型合子刪除在於FBS 10%或PRP 10%中培養之NHDF中可重疊，且q29區中chr3上之良性異型組合刪除亦如此(圖21)。

討論

自體纖維母細胞治療在美學及整形手術程序範圍內具有潛在開發。16 在動物研究之後開發自體纖維母細胞療法中之此臨床關注，其中顯示自成熟皮膚分離之纖維母細胞在皮內注射之後保持活體內存活5個月且改善真皮厚度。17 自2011年，LAVIV(Azficel-T，Fibrocell technologies，Exton，PA，USA)，第一個個人化自體纖維母細胞細胞療法經FDA批准用於增強成人鼻唇褶。18此技術之主要缺點為注射之前之細胞培養之成本及長時間(11-22週)，以及用於試管內擴增細胞之FBS所供應之生長因子之異種來源。由於所有利用纖維母細胞之細胞療法均依賴於試管內細胞擴增，已嘗試移除非人類來源之任何因素，例如使用FBS作為細胞培養基中之生長及營養素供給源。8 此前，極少研究旨在用PRP代替FBS以用於試管內擴增源自真皮或齒齦組織之纖維母細胞。19-23 然而，在使用異源溶胞產物PRP或經活化之PRP之此等實驗設置中，細胞增殖效率受限。Kakudo等人顯示在與5%經活化之PRP一起培養7天之後之2.5×人類真皮纖維母細胞增殖增強，而20%經活化之PRP並未促進增殖。19 利用NHDF之另一研究藉由添加5%經活化之PRP顯示在5天之後僅僅1.5×增殖增強。20 最近，顯示由一個49名患者之混集製備之非經活化之PRP在7天培養之後具有溫和增殖功效(1.3倍)。23 然而，在此研究中，Noh等人未用PRP置換FBS。其向含有FBS之培養基中添加未知濃度之PRP。就吾等所知，吾等之研究首次證實用不同濃度之自體非經活化之PRP代替FBS對於NHDF擴增之優點。如在其他研究中所執行，藉由凝血酶、鈣或膠原蛋白之PRP之活化刺激立即且重要之之生長因子釋放僅15min至24h。因此，吾等相信血小板活化對於作為細胞培養之應用而言係非所欲的，在該應用中需要來自逐步血小板去顆粒之生長因子緩慢釋放。平均血小板體積(MPV)被認為是血小板活性的潛在標記：含有更緻密顆粒之較大血小板相比於其較小對應物而言在酶及代謝上更具活性。24 在吾等之研究中，全血與PRP之間之MPV相當(全血中之8.7fL相對於PRP中之8.2fL)。因為 PRP製劑並未改變MVP，此意味著處理並未引起血小板活化。在利用含有非經活化之PRP之培養基進行之脂肪衍生型幹細胞擴增之先前的研究中，吾等證實PDGF-AB及FGF濃縮物在第5天達到峰值且保持穩定超過10天，而TGF-B1及VEGF自第0天至第10天持續地分泌。25 此與10天培養之後之50%血小板生存力直接相關。11 此外，在數天期間非經活化之PRP之連續且精密安排之GF分泌為僅在7至10天之後改變培養基(而非不含有血小板之其他培養基補充物(例如FBS、PRP溶胞產物)所需的每3天)提供可能性。

PRP之血小板濃度為可能影響其功效之關鍵因素。儘管PRP歷史上界定為含有比全血多4-5倍血小板之血漿，26但現咸已承認，高血小板濃度不比中度數值更佳且甚至可能有害。舉例而言，在3D前部十字形韌帶纖維母細胞培養中，含有與全血相同之血小板濃度之PRP與較高血小板濃度相比呈現最高細胞代謝及最低細胞凋亡速率。27 利用口腔纖維母細胞進行之另一研究顯示PRP中之血小板濃度增加(>2.5×)導致增殖減少。28 在吾等之研究中，利用CC-PRP裝置製備之PRP含有比全血多1.53倍之血小板。即使來自全血之PRP中之血小板回收率為96，此相對低血小板濃度係因為血小板懸浮於凝膠上之完整血漿中。此外，PRP之作用為劑量依賴性的。補充有20% PRP之培養基提供最高NHDF增殖率(比FBS培養基大7.7倍)，而具有超過40% PRP之培養基顯示較低增殖能力。此與證實補充有高PRP濃縮物之培養基效果比中度濃縮物差之其他研究一致。Atashi等人11亦得出以下結論：用於試管內脂肪衍生型性間葉幹細胞擴增之最佳PRP濃縮物為補充有20% PRP之培養基。高PRP濃縮物之有害作用可能係由於可能藉由負反饋環引起細胞受體下調之較高生長因子濃度。此機制亦可解釋分泌更多生長因子之經活化之PRP為何在一些應用效果較差。需要進一步研究以闡明此假定。藉由使用自體非經活化之PRP，吾等證實PRP可為用於NHDF試管內擴增之其他細胞培養基補充物之有效且安全之代替物。雖然PRP中所存在之生長因子觸發細胞分裂，其等亦對纖維母細胞發揮其他多效性活性。在吾等之培養設置中評估影響早期創傷癒合之細胞功能。吾等證實PRP處理加速細胞代謝活性及纖維母細胞胞洩能力。其係與細胞形狀改變及細胞骨架重組以及集體細胞遷移相關聯。儘管波形蛋白被認為是由纖維母細胞表現之間葉細胞標記，但其亦被新識別為創傷癒合中之增殖協調者。29 在20% PRP處理下，波形蛋白表現增強，此與在此濃度下觀測到之增殖加強直接相關。α-SMA(肌纖維母細胞標記)表現僅由高PRP濃度(>40%)觸發。此與Chellini等人證實單獨PRP不能夠刺激肌纖維母細胞表現型獲得之最新研究一致。30 在科學社群中存在一些關於長期PRP處理之潛在促贅生作用之辨論。31 此外，一些研究引起關於大量細胞擴增期間之基因穩定性之問題。32 因此，吾等使用CGH來檢查在FBS中相對於在PRP中生長之細胞之基因變化，且證實在PRP處理之情況下無不平衡染色體重排。

此證據對於將PRP培養之NHDF應用轉換至臨床使用情況而言在滿足法律法規要求方面是主要關注點。

吾等包括作為培養基補充物之自體PRP之細胞培養方案可用於其他細胞類型之擴增。此外，使用此新穎培養設置，吾等應能夠縮短培養時間且能夠生長更多細胞(無細胞繼代至多7天)以用於較大規模之應用，諸如大型組織損傷。在一組初步實驗(數據未示出)中，吾等亦證實PRP對人類表皮角質細胞之相同強效增殖功效，其中PRP 20%促進角質細胞增殖增加10倍。

結論

在此研究中，吾等已首次展示用於在培養基中使用PRP作為安全生物補充物進行NHDF擴增之完全自體模型。PRP之各種作用之範圍包含在加速細胞增殖至調節細胞黏著及遷移而不改變染色體穩定性，此係視濃度及處理持續時間而定。因為此自體技術重視優良製造規範準則及管制機構標準，PRP應被認為是有效、具成本效益且安全之纖維母細胞培養補充物，以及用於供試管內細胞擴增之未來臨床方案之驗證之用之異種或同種異體血液衍生物之代替物。

另外之研究已顯示於其他治療領域之功效：

參考文獻

1. Mao, A.S.及Mooney, D.J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, 14452, 2015。

2. Li, Z.及Maitz, P. Cell therapy for severe burn wound healing. Burns & trauma 6, 13, 2018。

3. Stunova, A.及Vistejnova, L. Dermal fibroblasts-A heterogeneous population with regulatory function in wound healing. Cytokine & growth factor reviews 39, 137, 2018。

4. Thangapazham, R.L., Darling, T.N.及Meyerle, J. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts. International journal of molecular sciences 15, 8407, 2014。

5. Costa-Almeida, R., Soares, R.及Granja, P.L. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration. Journal of tissue engineering and regenerative medicine 12, 240, 2018。

6. Weiss, R.A. Autologous cell therapy: will it replace dermal fillers？ Facial plastic surgery clinics of North America 21, 299, 2013。

7. Ichim, T.E., O'Heeron, P.及Kesari, S. Fibroblasts as a practical alternative to mesenchymal stem cells. Journal of translational medicine 16, 212, 2018。

8. Karnieli, O., Friedner, O.M., Allickson, J.G., Zhang, N., Jung, S., Fiorentini, D., Abraham, E., Eaker, S.S., Yong, T.K., Chan, A., Griffiths, S., Wehn, A.K., Oh, S.及Karnieli, O. A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies. Cytotherapy 19, 155, 2017。

9. Eca, L.P., Pinto, D.G., de Pinho, A.M., Mazzetti, M.P.及Odo, M.E. Autologous fibroblast culture in the repair of aging skin. Dermatologic surgery : official publication for American Society for Dermatologic Surgery [等] 38, 180, 2012。

10. Nilforoushzadeh, M.A., Jaffary, F., Siavash, M., Ansari, N., Siadat, A.H.及Heidari, A. Autologous fibroblast suspension for the treatment of refractory diabetic foot ulcer. Indian journal of dermatology, venereology and leprology 82, 105, 2016。

11. Atashi, F., Jaconi, M.E., Pittet-Cuenod, B.及Modarressi, A. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion. Tissue engineering Part C, Methods 21, 253, 2015。

12. Alves, R.及Grimalt, R. A Review of Platelet-Rich Plasma: History, Biology, Mechanism of Action, and Classification. Skin appendage disorders 4, 18, 2018。

13. Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current protocols in cell biology第2章，第2 1單元，2001。

14. Berridge, M.V., Herst, P.M.及Tan, A.S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology annual review 11, 127, 2005。

15. Molinari, B.L., Tasat, D.R., Palmieri, M.A.及Cabrini, R.L. Kinetics of MTT-formazan exocytosis in phagocytic and non-phagocytic cells. Micron 36, 177, 2005。

16. Mehrabani, D.及Manafi, N. Role of cultured skin fibroblasts in aesthetic and plastic surgery. World journal of plastic surgery 2, 2, 2013。

17. Zhao, Y., Wang, J., Yan, X., Li, D.及Xu, J. Preliminary survival studies on autologous cultured skin fibroblasts transplantation by injection. Cell transplantation 17, 775, 2008。

18. Smith, S.R., Munavalli, G., Weiss, R., Maslowski, J.M., Hennegan, K.P.及Novak, J.M. A multicenter, double-blind, placebo-controlled trial of autologous fibroblast therapy for the treatment of nasolabial fold wrinkles. Dermatologic surgery : official publication for American Society for Dermatologic Surgery [等] 38, 1234, 2012。

19. Kakudo, N., Minakata, T., Mitsui, T., Kushida, S., Notodihardjo, F.Z.及Kusumoto, K. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plastic and reconstructive surgery 122, 1352, 2008。

20. Kim, D.H., Je, Y.J., Kim, C.D., Lee, Y.H., Seo, Y.J., Lee, J.H.及Lee, Y. Can Platelet-rich Plasma Be Used for Skin Rejuvenation？ Evaluation of Effects of Platelet-rich Plasma on Human Dermal Fibroblast. Annals of dermatology 23, 424, 2011。

21. Liu, Y., Kalen, A., Risto, O.及Wahlstrom, O. Fibroblast proliferation due to exposure to a platelet concentrate in vitro is pH dependent. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [及] the European Tissue Repair Society 10, 336, 2002。

22. Nguyen, P.A.及Pham, T.A.V. Effects of platelet-rich plasma on human gingival fibroblast proliferation and migration in vitro. Journal of applied oral science : revista FOB 26, e20180077, 2018。

23. Noh, K.C., Liu, X.N., Zhuan, Z., Yang, C.J., Kim, Y.T., Lee, G.W., Choi, K.H.及Kim, K.O. Leukocyte- Poor Platelet-Rich Plasma-Derived Growth Factors Enhance Human Fibroblast Proliferation In Vitro. Clinics in orthopedic surgery 10, 240, 2018。

24. Ozer, K., Kankaya, Y.及Colak, O. An important and overlooked parameter in platelet rich plasma preparation: The mean platelet volume. J urnal of cosmetic dermatology 2018。

25. Atashi, F.S.-B., V.; Nayernia, Z.; Pittet-Cuénod, B.及Modarressi, A. Platelet Rich Plasma Promotes Proliferation of Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells via Activation of AKT and Smad2 Signaling Pathways Stem Cell Res Ther 52015。

26. Marx, R.E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP？ Implant dentistry 10, 225, 2001。

27. Yoshida, R., Cheng, M.及Murray, M.M. Increasing platelet concentration in platelet-rich plasma inhibits anterior cruciate ligament cell function in three-dimensional culture. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society 32, 291, 2014。

28. Graziani, F., Ivanovski, S., Cei, S., Ducci, F., Tonetti, M.及Gabriele, M. The in vitro effect of different PRP concentrations on osteoblasts and fibroblasts. Clinical oral implants research 17, 212, 2006。

29. Cheng, F., Shen, Y., Mohanasundaram, P., Lindstrom, M., Ivaska, J., Ny, T.及Eriksson, J.E. Vimentin coordinates fibroblast proliferation and keratinocyte differentiation in wound healing via TGF-beta-Slug signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113, E4320, 2016。

30. Chellini, F., Tani, A., Vallone, L., Nosi, D., Pavan, P., Bambi, F., Zecchi Orlandini, S.及Sassoli, C. Platelet-Rich Plasma Prevents In Vitro Transforming Growth Factor-beta1-Induced Fibroblast to Myofibroblast Transition: Involvement of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)-A/VEGF Receptor-1-Mediated Signaling (dagger). Cells 72018。

31. Omar, N.N., El-Tawdi, A.H., Tash, R.F., Shoukry, Y., Mahmoud, N.A.及El Bakly, W. Tumor potential in rat wounds after short- and long-term administration of platelet-rich plasma. Journal of biological regulators and homeostatic agents 31, 889, 2017。

32. Rajamani, K., Li, Y.S., Hsieh, D.K., Lin, S.Z., Harn, H.J.及Chiou, T.W. Genetic and epigenetic instability of stem cells. Cell transplantation 23, 417, 2014。

Claims

一種交聯玻尿酸，其動態黏度為約1Pa.s至約5.2Pa.s或<=6Pa.s.、<=5.5Pa.s.、<=5.2Pa.s.、<=5Pa.s.、<=4.5Pa.s.或<=4Pa.s.，其中所述交聯玻尿酸與血小板濃縮物、富血小板血漿及/或骨髓濃縮物組合，且其中用語「約」意謂±10%。
如請求項1所述之交聯玻尿酸，其中其彈性為<=100Pa、<=70Pa、<=60Pa、<=50Pa、<=40Pa、<=30Pa、<=20Pa或<=10Pa。
如請求項1或2所述之交聯玻尿酸，其分子量介於100kDa與6000kDa之間、介於500kDa與2000kDa之間，或為約1300kDa、約1400kDa、約1500kDa、約1600kDa或約1700kDa，且其中用語「約」意謂±10%。
如請求項1或2所述之交聯玻尿酸，其濃度介於約0.5%至約10%之間、介於約1%至約2.5%之間，為約1.5%或約2%，且其中用語「約」意謂±10%。
如請求項1或2所述之交聯玻尿酸，其交聯度介於約0.5%至約10%之間、介於約1%至約5%之間、介於約2%至約4%之間，為約2.5%、約3%或約3.5%，且其中用語「約」意謂±10%。
如請求項1或2所述之交聯玻尿酸，其BDDE含量為<=2.5ppm、<=2ppm、<=1.5ppm或<=1ppm。
如請求項1或2所述之交聯玻尿酸，其密度低於觸變性凝膠之密度。
如請求項1或2所述之交聯玻尿酸，其動態黏度為<=5.2Pa.s.且分子量為約1500kDa，且其中用語「約」意謂±10%。
如請求項1或2所述之交聯玻尿酸，其動態黏度為<=5.2Pa.s.且濃度為約2%，且其中用語「約」意謂±10%。
如請求項1或2所述之交聯玻尿酸，其動態黏度為<=5.2Pa.s.，分子量為約1500kDa，濃度為約2%且交聯度為約3%，且其中用語「約」意謂±10%。
如請求項1或2所述之交聯玻尿酸，其彈性為<=60Pa以用於注射器。
如請求項1所述之交聯玻尿酸，其中所述交聯玻尿酸具有：- 約最大5Pa.s的動態黏度；- 介於500kDa與2000kDa之間的分子量，諸如1500kDa；- 介於1%與2.5%之間的濃度，諸如2%的濃度；- 約3%的交聯度；且其中所述交聯玻尿酸與血小板濃縮物、富血小板血漿及/或骨髓濃縮物組合，且其中用語「約」意謂±10%。
一種容器，其含有如請求項1-12中任一項所述之交聯玻尿酸。
如請求項13所述之容器，其中該容器為管子或注射器。
如請求項13至14中任一項所述之容器，其進一步包含至少一種抗凝血劑及/或至少一種觸變性凝膠。