CN117752856A - 一种植骨材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植骨材料，所述植骨材料包含骨颗粒和胆固醇修饰的透明质酸钠；还涉及该植骨材料的制备方法及其在制备治疗骨缺损的材料中的应用。本发明的植骨材料被生理盐水或血液浸润后能够稳定在植骨空间，不易发生流动，从而起到稳定血凝块，引导宿主细胞长入和血管爬伸的作用，实现骨重建，可适用于拔牙窝或缺乏骨壁的水平、垂直骨增量等各种适应症。

Description

一种植骨材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，更具体涉及一种植骨材料及其制备方法与应用。

背景技术

植骨材料应用于骨缺损修复已经有多年历史，其中自体骨被认为是植骨材料的“金标准”，具备骨传导和骨诱导性，且不存在免疫风险，是最为理想的植骨材料，但是自体骨需要从患者身体其他部位获取后移植，又会造成新的损伤，难以满足大量的使用；与自体骨类似，异体骨同样难以实现量产，并且由于捐赠者信息有限或不充分，可能会造成感染，包括免疫原性、传播病毒等；人工合成的复合材料、高分子材料对复杂的骨组织而言，植入后会存在生物活性不足、降解与组织再生修复速度难以匹配等问题，与宿主组织之间始终难以达到真正的“生物性融合”。

目前的植骨材料普遍以动物源性材料(牛骨、猪骨等)为主，将动物源性材料经不同工艺去除有机物后，粉碎成一定粒径范围的颗粒，使用时复水或复血液后填充至缺损位置，形成稳定的三维支架结构，引导细胞长入和血管爬伸，最终实现骨重建。然而颗粒状的植骨材料在临床使用中易被生理盐水或血液冲散，缺乏内聚性，操作不便，通过添加塑形剂将植骨材料聚合成团，能够稳定植入，是临床上亟待解决的问题，也是口腔植骨材料未来必然的发展趋势。

CN101496914B公开了一种含有胶原蛋白骨支架材料的制备方法，将松质骨经氯仿和甲醇的混合溶液、TritonX-100和氨水的混合溶液处理，去除脂肪和蛋白，保留胶原结构以提高骨材料的力学强度，此方法工艺过程中引入多种有毒试剂，如氯仿、甲醇、TritonX-100、氨水等，处理过程中易对操作人员的呼吸道、中枢神经等造成严重危害，后续清洗不彻底会带来试剂残留，影响产品的生物安全性。本申请人已开发了一种骨修复材料的制备方法(CN112618798A)，通过过氧化氢、乙二胺等化学试剂有效去除异种骨中的脂肪蛋白，并有效保持骨材料的力学性能和骨传导性，并与3％-8％浓度的透明质酸钠凝胶混合后冻干得到成品，临床使用中可完整夹起，填充至缺损区域，复水或复血液后即可根据缺损形状进行塑形，操作便捷。但是透明质酸钠有较高的粘弹性，当水溶液过多或血液大量渗出时，包裹在透明质酸凝胶中的骨颗粒也会随之滑动，造成骨颗粒流失，在一些水平、垂直骨增量手术中由于缺乏足够的骨壁支撑，骨颗粒的流动导致缺损区域植骨空间的不稳定，进而影响新骨的生成。

综上，还需开发更安全、力学强度更好且具有更好的骨修复效果的植骨材料。

发明内容

针对上述产品技术的不足，本发明提供了一种新型植骨材料。本发明的新型植骨材料采用胆固醇对透明质酸进行修饰，采用特定工艺交联并与骨颗粒混合后形成产品，显著地提高了植骨材料的力学强度，且具有更好的成骨效果。

本发明的一方面提供了一种植骨材料，其特征在于，所述植骨材料包含骨颗粒和胆固醇修饰的透明质酸钠；优选地，所述胆固醇修饰的透明质酸钠中透明质酸钠与胆固醇的质量比范围为100:1～20:1。发明人出乎意料地发现，采用胆固醇修饰的透明质酸钠作为交联的原料，可以显著改善交联透明质酸钠与骨颗粒复合之后产物的力学性质。采用胆固醇类似物替换胆固醇进行修饰则无法达到这种优异的技术效果。同时发明人也意外发现胆固醇修饰的透明质酸钠中透明质酸钠与胆固醇的质量比范围为100:1～20:1时产物的力学性能最佳，在该范围之外则产物力学强度会减弱。此外，胆固醇作为人体的细胞的重要组成成分，在人体内发挥重要的生物学功能，在血液中可通过一系列酶和代谢途径进行转化，参与机体内各种物质的代谢，安全性好，无免疫风险。

可选地，所述骨颗粒为动物骨颗粒；优选地，所述动物骨为牛松质骨；优选地，所述骨颗粒为经脱脂和脱细胞的动物骨颗粒。牛松质骨颗粒完整保留了天然的孔隙结构，植入后在缺损区域形成稳定的支架结构，引导宿主细胞的长入和血管爬伸，新骨的生成伴随着植骨材料的降解，在缺损区域实现动态平衡，最终实现骨重建。

可选地，所述胆固醇修饰的透明质酸钠通过使胆固醇和透明质酸钠的混合物与催化剂反应得到；优选地，所述催化剂选自碳二亚胺(例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，简称EDC)或对甲基苯磺酸；优选地，所述胆固醇和透明质酸钠的混合物与所述催化剂的质量比范围为100:1～50:1。

可选地，所述胆固醇修饰的透明质酸钠通过包括以下步骤的制备方法得到：(1)将透明质酸钠和胆固醇的混合物和催化剂溶于溶剂中进行活化；所述溶剂优选选自DMF(二甲基甲酰胺)或DMSO(二甲基亚砜)；所述活化时间优选为20-30h；(2)将步骤(1)获得的溶液进行透析，透析时间优选为20-24h；(3)透析后的溶液干燥后获得所述胆固醇修饰的透明质酸钠。

另一方面，本发明提供了上述植骨材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括将所述胆固醇修饰的透明质酸钠与交联剂反应后与骨颗粒混合的步骤；优选地，所述交联剂选自碳二亚胺(例如EDC)、1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)或酰肼化合物(例如己二酸二酰肼，简称ADH)中的一种或多种。更优选地，交联剂可以是己二酸二酰肼和EDC、己二酸二酰肼和BDDE或己二酸二酰肼与EDC和BDDE。进一步优选地，交联剂是己二酸二酰肼和BDDE。发明人出乎预料地发现，采用己二酸二酰肼和BDDE作为交联剂对修饰有胆固醇的透明质酸进行交联，相较于单独采用EDC、BDDE或己二酸二酰肼进行交联，可以更好地形成适合与骨颗粒混合的网状结构，能够更好地将骨颗粒包裹起来，使整个体系具有更好的力学强度，植入缺损区域后可有效提高植骨空间的稳定性，减少骨颗粒流失造成难以有效成骨的风险。己二酸二酰肼与EDC或BDDE可以混合添加或者先后添加。

可选地，所述制备方法包括以下步骤：(1)将所述胆固醇修饰的透明质酸钠配成凝胶，凝胶浓度为3％～8％，溶胀后加入交联剂，所述交联剂为碳二亚胺和/或BDDE，所述凝胶与交联剂的质量比优选为100:1～50:1；优选还加入己二酸二酰肼，所述凝胶与己二酸二酰肼的质量比优选为100:1～50:1；(2)称取骨颗粒，和步骤(1)获得的交联产物混合，骨颗粒与交联产物的混合质量比范围优选为1:1～1:2，混合均匀后进行干燥；(3)将步骤(2)的产物浸泡于纯化水中进行交联剂置换，置换时间不低于10h；(4)将步骤(3)的产物经干燥和终端灭菌形成最终产品，干燥方式选自真空冷冻干燥或真空烘干方式，灭菌方式选自环氧乙烷灭菌或者辐照灭菌。

另一方面，本发明提供了上述植骨材料在制备治疗骨缺损的材料中的应用；优选地，所述骨缺损为颅骨缺损、口腔骨缺损或四肢非承重部位骨缺损。与之相对应地，本发明还提供了上述植骨材料用于治疗骨缺损的用途。

总而言之，本发明如上所述的可塑形的植骨材料，便于临床操作的同时，被生理盐水或血液浸润后能够稳定在植骨空间，不易发生流动，从而起到稳定血凝块，引导宿主细胞长入和血管爬伸的作用，实现骨重建，可适用于拔牙窝或缺乏骨壁的水平、垂直骨增量等各种适应症；使用经胆固醇改性修饰后的透明质酸钠作为原料，使本发明的产品拥有良好的生物相容性和力学性质，有利于伤口愈合和早期成骨。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1、实施例6、实施例9、对比例1、对比例6、对比例9中各样品的细胞毒性测试图及细胞形态。

图2为实施例1、实施例7、实施例8、对比例1、对比例2、对比例3、对比例7、对比例8、对比例10、对比例11、对比例12中各样品复血后骨块散落情况评价柱状图。

图3为实施例4中实施例1、对比例1样品不同时间点组织学结果对比。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术术语和科学术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中的定义为准。另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

本发明实施例中所采用的试验方法、检测方法和常规实验试剂配制方法，如无特别说明，均按照本领域常规操作。

透明质酸钠干粉：购自华熙生物科技股份有限公司，特性黏数为1.7m³/kg-2.7m³/kg。

实施例1植骨材料制备

步骤一：脱细胞牛股骨松质骨颗粒制备

按照CN112618798A公开的方法进行脱细胞牛股骨松质骨颗粒制备，取牛股骨进行前处理、脱脂、病毒灭活、脱细胞及清洁处理。

步骤二：胆固醇修饰的透明质酸钠制备

2.1将透明质酸钠干粉和胆固醇(CAS号：57-88-5，分析纯)按质量比50:1混合，混合后和EDC按质量比50:1(混合物：EDC)溶于适量DMSO中，活化24h。

2.2将步骤2.1获得的溶液置于纯化水中进行透析，每隔2h更换一次溶剂，透析24h。

2.3将透析后的溶液进行真空冷冻干燥，获得胆固醇修饰的透明质酸钠，呈海绵状。

步骤三：经修饰的透明质酸钠凝胶混合骨颗粒

3.1将步骤二得到的经修饰的透明质酸钠与纯化水配成凝胶，凝胶浓度为5％，充分溶胀后加入交联剂BDDE，凝胶与交联剂BDDE的质量比为50:1，加入己二酸二酰肼(ADH)，凝胶与ADH的质量比为50:1。

3.2称取步骤一获得的牛松质骨颗粒，和步骤3.1获得的交联的凝胶按3:5的质量比混合，混合均匀后填充至相应尺寸的冻干模具中，置于干燥器中静置12h。

3.3步骤3.2结束后将产物从干燥器中取出，浸泡于注射用水中，利用水凝胶与水达成平衡，置换出交联剂残留，每隔1h更换一次注射用水，置换时间为12h。通过真空冷冻干燥及包装盒终端灭菌形成最终产品。

实施例2

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.1中透明质酸钠干粉和胆固醇的质量比为100:1，其他制备方式保持一致。

实施例3

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.1中透明质酸钠干粉和胆固醇的质量比为20:1，其他制备方式保持一致。

实施例4

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.1中将透明质酸钠干粉和胆固醇混合后，和EDC按质量比100:1溶于DMSO中，其他制备方式保持一致。

实施例5

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.1中活化时间为20h，其他制备方式保持一致。

实施例6

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.2中透析时间为20h，其他制备方式保持一致。

实施例7

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤3.1中凝胶与交联剂BDDE的质量比为100:1，其他制备方式保持一致。

实施例8

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤3.1中凝胶与ADH的质量比为100:1，其他制备方式保持一致。

实施例9

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤3.3中将产物浸泡于注射用水中以去除交联剂残留，每隔2h更换一次注射用水，置换时间为10h，其他制备方式保持一致。

对比例1

按照实施例1的制备方法，区别在于透明质酸钠不做胆固醇修饰处理，用纯化水直接配制成凝胶，凝胶浓度为5％，充分溶胀后和骨颗粒按3:5的比例混合。

对比例2

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.1中透明质酸钠干粉和胆固醇的质量比为100:0.5，其他制备方式保持一致。

对比例3

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.1中透明质酸钠干粉和胆固醇的质量比为10:1，其他制备方式保持一致。

对比例4

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.1中将透明质酸钠干粉和胆固醇混合后，和EDC按质量比100:0.5溶于DMSO中，其他制备方式保持一致。

对比例5

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.1中将透明质酸钠干粉和胆固醇混合后，和EDC按质量比20:1溶于DMSO中，其他制备方式保持一致。

对比例6

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤2.2中透析时间为16h，其他制备方式保持一致。

对比例7

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤3.1中凝胶与交联剂BDDE的质量比为25:1，不加入ADH，其他制备方式保持一致。

对比例8

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤3.1中凝胶与ADH的质量比为25:1，不加入交联剂BDDE，其他制备方式保持一致。

对比例9

按照实施例1的制备方法，区别在于步骤3.3中将产物浸泡于注射用水中以去除交联剂残留，每隔2h更换一次注射用水，置换时间为8h，其他制备方式保持一致。

对比例10

按照实施例1的制备方法，区别在于使用豆甾醇(CAS号83-48-7，分析纯)代替胆固醇，其他制备方式保持一致。

对比例11

按照实施例1的制备方法，区别在于使用巯基胆固醇(CAS号1249-81-6，分析纯)代替胆固醇，其他制备方式保持一致。

对比例12

按照实施例1的制备方法，区别在于使用黄体酮(CAS号57-83-0，分析纯)代替胆固醇，其他制备方式保持一致。

实验例1细胞毒性检测

取实施例1、实施例6、实施例9、对比例1、对比例6、对比例9的样品进行细胞毒性检测。

细胞准备：将小鼠成纤维细胞使用含10％FBS的MEM培养基复苏后于37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养，传代2-3次至细胞成对数生长期，用胰蛋白酶消化细胞，收集并调整细胞浓度为1×10⁵个细胞/mL进行下述实验。

实验样品制备：取上述各样品进行处理，按照浸提比例：0.1g/mL；浸提介质：MEM培养基；浸提条件：37℃、120rpm震荡浸提72h。

阴性样品制备：含10％FBS的MEM培养基。

阳性样品制备：制备含10％的DMSO的MEM培养基。

实验方法：将细胞悬液加入96孔板中，每孔100μL，共计1×10⁴个细胞/孔，37℃，5％CO₂培养24h。培养结束后弃去板内培养基，分别加入各样品浸提液，阴性样品和阳性样品，每组6孔，放入37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内。空白样品组只加入含10％FBS的MEM培养基，不含细胞。24小时培养结束后镜检拍照记录，弃去板内培养基，每孔加入MTT染色剂50μL(1mg/mL)，放入37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内培养2h。培养结束后、弃去培养板内液体，每孔加入100μL异丙醇，避光震荡混匀30min，放入酶标仪中570nm为检测波长，650nm为参考波长进行吸光度检测。

实验结果分析：根据各组的吸光度均值按照如下公式计算细胞的相对增殖率。

存活率(％)＝100*OD570_e/OD_b

式中：OD_e—试验样品100％浸提液光密度平均值；

OD_b—空白光密度平均值；

对实验原始数据进行处理,按照表1和表2评定材料的毒性程度。

表1细胞毒性反应分级标准

细胞相对增殖率(RGR)	反应分级	反应程度
			≥100	0级	无
80-99	1级	轻微
			50-79	2级	轻度
30-49	3级	中度
			0-29	4级	重度

表2细胞毒性反应分级标准

表3相对增殖率及毒性等级

由表3和图1的细胞毒性实验结果可知，其中对比例6、对比例9有明显的细胞毒性，其他实验组未出现细胞毒性反应。证明本发明特定透析时间与产物交联剂去除步骤参数可以保证终产物安全性，在此范围之外则无法达到合格安全性标准。

实验例2抗压强度检测

取实施例1、实施例7、实施例8、对比例1、对比例2、对比例3、对比例7、对比例8的样品进行抗压强度检测。

所有分组均使用相同规格的填模模具，确保成品尺寸一致，每组取15个样品进行检测，检测结果取平均值。将样品置于力学强度仪上，所有样品测定时摆放方向一致，接触面积相同，测量并记录开始破裂瞬间的加载力并计算各样品的抗压强度。

表4抗压强度检测

分组	实施例1	实施例7	实施例8
				抗压强度(MPa)	4.57±0.25	4.62±0.41	4.71±0.53
分组	对比例1	对比例2	对比例3
				抗压强度(MPa)	0.43±0.16	3.25±0.57	4.06±0.21
分组	对比例7	对比例8
				抗压强度(MPa)	3.11±0.13	2.98±0.46

由以上结果可知，对比例1中透明质酸钠未做胆固醇修饰和交联处理，力学强度较低，通过修饰和交联处理，可有效提高产品的抗压强度，力学性能更加优异。其中对比例2中用于修饰的胆固醇量较少，修饰程度低，抗压强度相对较低；相较于实施例1，对比例3中胆固醇的用量更多，但是抗压强度有所降低，其主要原因可能在于过多的胆固醇会影响交联透明质酸钠的空间结构，进而会影响透明质酸钠凝胶混合骨颗粒的效果，所以影响了终产品的抗压强度；对比例7、对比例8中由于无交联剂BDDE与ADH的协同作用促进交联，也会影响产品的抗压强度。

实验例3流动性评价

取实施例1、实施例7、实施例8、对比例1、对比例2、对比例3、对比例7、对比例8、对比例10、对比例11、对比例12的样品进行复血后流动性评价。

取新鲜兔血，每组取5个样品置于过量的血液中，于37℃培养箱中孵育，分别在1h、6h和24h观察骨块形态，并通过测量骨块的底面积来评价在血液中是否容易散开(成品底面积为10mm*5mm＝50mm²)。数据示于表5与图2中。

表5复血后流动性评价

由以上结果可知，对比例1中透明质酸钠未做胆固醇修饰和交联处理，在血液中浸泡1h后即发生明显的形变和塌陷，用手按压有明显的滑动感；对比例2中用于修饰的胆固醇量较少，修饰程度低，随着浸泡时间的延长，会有一定的散落和塌陷情况；相较于实施例1，对比例3中胆固醇的用量更多，复血后的流动性与实施例1无明显差异；对比例7、对比例8中由于无交联剂BDDE与ADH的协同作用促进交联，随着浸泡时间的延长，6h-24h有轻微的散落和塌陷情况。对比例10、对比例11和对比例12使用胆固醇类似物替代胆固醇来制备产品，产品复血后短时间会发生形变和塌陷，不利于产品的临床使用。

实验例4兔颅骨缺损试验

取实施例1、对比例1的样品进行新西兰兔颅骨缺损试验，观察缺损区域新骨的长入情况。

取雄性新西兰兔(2.0-2.3kg)24只，使用1.5％浓度的戊巴比妥钠按5μL/g的剂量静脉注射麻醉动物，8％硫化钠头顶部脱毛，清洗后固定于手术台上，常规消毒。在顶骨前端，弧形切开皮肤至骨膜下，暴露顶骨，用颅钻去骨，在左右两边分别造出直径8mm的圆形全层骨缺损区，保留硬脑膜，生理盐水冲洗后分别在左右两边植入实施例1、对比例1的样品，覆盖可吸收生物膜后缝合皮肤，术后即刻注射青霉素。术后2、4、8、12周处死动物，取颅骨标本，固定、脱钙后做HE染色，显微镜下观察，采用图像分析软件ImageJ通过计算面积分析新骨生成率，每个时间点各6只。

表6实施例1、对比例1样品不同时间点新骨生成率

由图3组织学染色结果可知，术后2周时，尚未看到有明显的新骨生成，4周时可以看到骨颗粒周围开始出现新生骨，8周时骨改建持续进行，骨颗粒周围形成越来越多的新生骨，12周时新生骨也逐渐成熟，完成新生骨和植骨材料的整合，整个过程中实施例1中的新骨生成率显著高于对比例1。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (8)

1.一种植骨材料，其特征在于，所述植骨材料包含骨颗粒和胆固醇修饰的透明质酸钠；优选地，所述胆固醇修饰的透明质酸钠中透明质酸钠与胆固醇的质量比范围为100:1～20:1。

2.权利要求1所述的植骨材料，其特征在于，所述骨颗粒为动物骨颗粒；优选地，所述动物骨为牛松质骨；优选地，所述骨颗粒为经脱脂和脱细胞的动物骨颗粒。

3.权利要求1所述的植骨材料，其特征在于，所述胆固醇修饰的透明质酸钠通过使胆固醇和透明质酸钠的混合物与催化剂反应得到；优选地，所述催化剂选自碳二亚胺或对甲基苯磺酸；优选地，所述胆固醇和透明质酸钠的混合物与所述催化剂的质量比范围为100:1～50:1。

4.权利要求3所述的植骨材料，其特征在于，所述胆固醇修饰的透明质酸钠通过包括以下步骤的制备方法得到：(1)将透明质酸钠和胆固醇的混合物和催化剂溶于溶剂中进行活化；所述溶剂优选选自DMF或DMSO；所述活化时间优选为20-30h；(2)将步骤(1)获得的溶液进行透析，透析时间优选为20-24h；(3)透析后的溶液干燥后获得所述胆固醇修饰的透明质酸钠。

5.权利要求1-4任一项所述的植骨材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括将所述胆固醇修饰的透明质酸钠与交联剂反应后与骨颗粒混合的步骤；优选地，所述交联剂选自碳二亚胺、BDDE或酰肼化合物中的一种或多种；更优选地，所述碳二亚胺为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，所述酰肼化合物为己二酸二酰肼。

6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将所述胆固醇修饰的透明质酸钠配成凝胶，凝胶浓度为3％～8％，溶胀后加入交联剂，所述交联剂为碳二亚胺和/或BDDE，所述凝胶与交联剂的质量比优选为100:1～50:1；优选还加入己二酸二酰肼，所述凝胶与己二酸二酰肼的质量比优选为100:1～50:1；(2)称取骨颗粒，和步骤(1)获得的交联产物混合，骨颗粒与交联产物的混合质量比范围优选为1:1～1:2，混合均匀后进行干燥；(3)将步骤(2)的产物浸泡于纯化水中进行交联剂置换，置换时间不低于10h；(4)将步骤(3)的产物经干燥和终端灭菌形成最终产品，干燥方式选自真空冷冻干燥或真空烘干方式，灭菌方式选自环氧乙烷灭菌或者辐照灭菌。

7.权利要求1-4任一项所述的植骨材料在制备治疗骨缺损的材料中的应用。

8.权利要求7所述的应用，其中所述骨缺损为颅骨缺损、口腔骨缺损或四肢非承重部位骨缺损。