KR101595600B1 - 인간 탯줄의 와튼 젤리에 기반한 신 생체재료 - Google Patents

인간 탯줄의 와튼 젤리에 기반한 신 생체재료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체재료, 구체적으로는 재생 의학에서 이것의 응용을 위해 탯줄의 세포외 매트릭스로부터 형성된 하이드로겔에 관한 것이다. 본 발명은 특히 선택적으로 세포를 포함할 수 있는 탯줄의 와튼 젤리로부터 독점적으로 분리된 글리코사미노글리칸으로 이루어진 생체재료, 그리고 그것의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

인간 탯줄의 와튼 젤리에 기반한 신 생체재료{NEW BIOMATERIAL BASED ON WHARTON'S JELLY FROM THE HUMAN UMBILICAL CORD}
본 발명은 재생 의학에 적용하기 위한 탯줄의 세포외 매트릭스로부터 형성된신 생체재료, 구체적으로는 하이드로겔에 관한 것이다. 본 발명은 특히 선택적으로 세포들을 함유할 수 있는 탯줄의 와튼 젤리로부터만 독점적으로 단리된 글리코사미노글리칸들로 이루어진 생체재료, 또한 이것의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
중합체에 의해 형성된 생체재료들은 재생 의학에 중추적 역할을 하는데 그 이유는 이들이 일시적으로 이식 세포의 접착, 증식 및 분화를 위한 3차원 고정장치(anchor)를 제공하기 때문이다. 이러한 3차원 성질은 세포 간 전달을 위한 적절한 플랫폼을 제공하고 세포와 생체재료의 성분들과의 유연관계(relationship)를 제공한다. 시간이 지나면서 매트릭스와 세포 간에 일어나는 생체상호작용(biointeraction)은 세포의 증식 능력, 새로운 조직 형성을 위한 이들의 조직화, 이들의 분열화 및 재생과정을 지휘하는 신호전달 분자의 분비를 결정한다.(Dawson et al., 2008).
이러한 현상들이 일어나도록 하기 위해서, 본 생체재료는 재흡수될 때까지 제한 시간 동안 적용된 지점에 머무르면서, 재생 효과를 비롯하여 적절한 세포 작용(cellular action)이 일어나기에 충분히 오랫동안 그 구조를 유지할 필요가 있다.
특정 유형의 생체재료인 하이드로겔은 조직공학에서의 그것의 적용을 적합하게 하는 수많은 특성을 갖고 있다.
하이드로겔은 자체 무게의 10~20%에서 수백 배에 이르기까지 그들의 구조 내부에 많은 양의 물을 함유하는 함수능력을 가진, 천연 또는 합성질의 서로 연결된 친수 중합체들로 형성된 구조이다. 이들 겔은 반-고체 형태를 보이는데, 이것의 3차원 격자는 지지체로서 역할을 할 수 있는 구조적 매트릭스를 형성하기에 이상적인 후보물질(candidate)로 제공된다. 이 3차원 구조는 물리적 가교화와 화학적 가교화 모두에 의해 형성될 수 있다. 물리적 가교화는 그것의 구조가 최종 적용에 따라 가역적일 수 있는 가역적 하이드로겔을 생성하는 반면, 화학적 가교화는 이것의 구조가 모든 적용에서 유지되는 영구적 하이드로겔을 형성한다(Coburn et al ., 2007). 따라서, 하이드로겔은 물과 접촉할 때 팽창하여 부드러운 탄성 물질을 형성하는 3차원 망상 형태로 가교화된 (천연 또는 합성질의) 중합체이고, 용해 없이 그것의 상당한 분획을 그것의 구조 중에 유지한다.
하이드로겔은 다음과 같이 일련의 특정한 특성이 있다:
1. 친수성: 이들의 구조에 수용성 작용기(-OH, -COOH, -CONH2, -CONH, SO3H)가 존재하기 때문. 이들은 살아 있는 조직의 수분함량과 유사한 높은 수분 함량을 갖는다(Elisseeff et al., 2005).
2. 불수용성: 이들의 구조에 3차원 중합체 그물망이 존재하기 때문.
3. 그들은 매끄럽고 탄력적인 경도를 갖고, 이 경도는 친수성 개시 단량체와 가교화 중인 저밀도의 중합체에 의해 결정된다.
하이드로겔은 물 또는 수성 용액의 존재 하에, 화학적-물리적 평형 상태에 도달할 때까지 부피를 상당히 증가시키지만, 이들의 형태를 잃지 않으면서 팽창하는 능력을 갖는다. 이러한 팽창 능력은 세포들이 연성 조직에서 겪는 환경과 비교되는 수성 미세환경(aqueous microenvironment)을 제공한다. 물과 다공성 구조의 존재 역시 저분자량 용질 및 세포 생존에 중요하고 필수적인 영양분의 흐름뿐만 아니라, 하이드로겔 밖으로 세포 배설물의 운반을 가능하게 한다(Torres et al., 2000).
탯줄은 중요한 세포 성분을 가진, 혈관이 과다분포된(highly vascularized) 구조물이다. 세포와 혈관 시스템은 와튼 젤리라고 불리는 젤라틴성 결합 조직에 통합된다. 와튼 젤리는 적은 양의 세포와 많은 양의 세포외 매트릭스를 함유하는데, 주로 콜라겐, 히알루론산 및 황산화 글리코사미노글리칸으로 이루어진다.
점질다당류(mucopolysaccharides)로도 불리는 글리코사미노글리칸들(GAGs)은 프로테오글리칸으로 불리는 거대분자를 형성하는 핵단백질(protein nucleus)에 결합된 유기체에서 발견되는 헤테로 다당류이다. 이들은 세포 표면 또는 세포외 매트릭스에서 발견될 수 있고, 세포-세포 및 세포-세포외 매트릭스의 상호작용에 중요한 역할을 수행한다. 이들은 황산화 및 비-황산화 형태로 존재하며, 이들 분자의 공통적인 특징은 두 가지 다른 당에 의해 형성된 이당류의 반복적 서열의 배치이다: 둘 중 하나는 일반적으로 헥수론산염인 반면, 나머지 하나는 헥소사민이다. 이당류의 결합 및 황산화의 위치의 배열상 변화는 이들 사슬의 물리적 및 화학적 특성에 있어서 다양성의 증가로 이어진다. 고황산염 함량 및 우론산의 존재는 GAGs에 큰 음전하를 제공하고, 그래서 와튼 젤리에서의 다량의 GAGs는 이 조직을 극도로 수화시킨다.
여러 유형의 GAGs가 있고, 이것은 그들의 구조 때문만이 아니라 분자에 신호를 보내는 여러 세포를 위한 고정장치 자리이기 때문에, 기본적인 세포 기능에 직접적으로 관여한다.
히알루론산은 와튼 젤리에서 가장 풍부한 GAGs이다. 이것은 생체 내에서 유리 탄수화물처럼 기능을 하는 GAGs 군의 유일한 비-황산화 요소로, 이것의 구조는 이당류: D-글루쿠론산 및 (1-β-3) N-아세틸-D-글루코사민의 반복으로 이루어진다(Goa et al., 1994; Laurent et al., 1992). 이것은 여러 세포 유형에 의해 합성되고, 세포 주변의 지지 및 보호 구조물을 생성하기 위해 세포외 매트릭스의 다른 구성요소들과 상호작용하는 세포외 공간으로 분비된다.(Collins et al., 2008). 이것은 거대 다가-음이온성(polyanionic) 선형 중합체이고, 단일 분자는 분자량이 100,000~5.106 Da일 수 있다(Toole et al., 2004; Bertolami et al., 1992). 이것은 큰 부피를 차지하는 코일형 구조를 갖기 때문에, 점도가 높은 용액을 만든다. 히알루론산의 개별 분자들은 서로 결합하여, 망상구조 또는 격자구조를 형성한다. 조직 발달에서, 히알루론산은 세포 증식 및 이동에 관여하는 주요한 구조적 거대분자로 여겨진다.
히알루론산은 세포외 매트릭스의 신혈관생성, 형태형성(morphogenesis), 일반 무결성 및 회복(repair)과 같은 여러 처리 과정에 관여하여 왔다. 양수에 히알루론산이 다량으로 함유된 것이 태아기 상처의 치료에 유리하다는 것이 알려져 있다(Longaker et al., 1989). 건강한 피부와 흉터 사이의 분자 특성의 변화들이 추가로 관찰된 바 있고, 일반 흉터의 히알루론산은 비대성 흉터(hypertrophic scars)의 그것과는 확실히 다르다(Ueno et al., 1992).
콘드로이틴 설페이트는 D-글루쿠론산 이합체와 N-아세틸갈락토스아민이 반복하여 형성되는 선형 중합체이다. 이것의 유용성은 연골성분 매트릭스의 퇴화(degradation)에 관련된 효소들의 활동을 억제하는 것에 의한 관절 질환에 대한 치료에서 시험된 바 있다. 이것은 또한 보체(complement)의 억제에 의해 항-염증제 역할을 하기도 하고, 혈전색전증 치료, 외과수술 및 안과 치료에서 유용하다.
콘드로이틴 설페이트 B로도 알려진 데르마탄 설페이트는 헤파린 보조인자 II를 통해 트롬빈에 선택적 방해 효과를 나타내기 때문에 강력한 항응고제이고, 출혈 위험이 낮기 때문에 생체 내에서 아주 효과적이다(Trowbridge et al ., 2002).
일반적으로 글리코사미노글리칸들, 특히 헤파린은 혈장 캐스케이드 활성(cascade activity)을 조절하는 능력이 있어서, 서로 다른 시점에서 내재성 응고 경로의 억제를 강화하고 전형적인 보체 활성 경로를 억제한다(Rabenstein, 2001). 헤파린의 알려진 다른 기능은 혈관신생의 억제, 체액성 성장 및 그것의 항바이러스 활성이다.
헤파란 설페이트는 헤파린과 밀접하게 관련된 구조를 갖는다. 이것은 동물 조직에 널리 분포되어 있고, 이것의 기능들 중에는 세포 접착 및 세포 증식 조절이 두드러진다. 이것은 단백질의 퇴화를 저해하는 보호 효과가 있어서, 기저막(basement membrane)을 통한 단백질의 운송을 조절하고 또한 이것들의 내면화(internalization)에 개입한다(Rabenstein, 2001).
인간 또는 동물 기원으로부터 얻은 점액다당류에 관한 여러 개의 특허 문건이 있다. 문서 US 3,887,703은 소 또는 양의 태아의 피부 표피와 탯줄에서 얻은 점액질 다당류에 관한 것이다. 탯줄을 사용하는 유일한 실시예는 1~9 월령의 소 태아를 사용한 것이고, 1차 작업은 10℃ 하에서 연마하는 것이므로 막 또는 혈관이 제거된다는 것은 언급되지 않았다. 혼합물 양은 형성하는 개개의 점액질 다당류 또는 존재하는 양은 언급되지 않았다; 활성 산물은 혼합물에 존재하는 헥소스아민의 양에 의해 동정된다. 오일성 두피와 머리카락의 치료를 위한 그리고 염증 치료를 위한 주입용 및 경구 섭취용 둘 다의 형태의 조성물이 추출물로 제조된다.
특허 문서 US 5,814,621은 본질적으로 물에서보다 유기 용제-물 혼합물에서 용해도가 더 큰 약물과 약물의 일부를 형성하는 점액질 다당 물질로 이루어진 조성물에 관한 것으로, 여기서 약물의 결정 또는 입자는 점액질 다당 물질 입자의 표면에 분산되고, 상기 약물은 단독으로 있을 때보다 물에서 더 빨리 분해된다. 상기 조성물은 과립 형태로 존재할 수 있다.
특허 출원 WO 2008/021391 A1은 탯줄막을 포함하는 생체재료를 기술한다. 더욱이, 이 생체재료는 부가적으로 한 가지 이상의 탯줄 혈관 및/또는 와튼 젤리를 포함할 수 있다. 본 생체재료는 바람직하기는 건조하고, 납작하거나 튜브형이거나 특정 구조에 알맞은 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 탯줄막의 한 층 이상을 포함하는 생체재료의 제조방법뿐만 아니라, 상기 생체재료를 얻는 방법 그리고 조직 또는 장기를 회복하기 위한 생체재료의 용도를 제공한다.
본 명세서는 탯줄로 만든 생체재료를 특징으로 한다. 본 명세서는 상기 재료의 조성물이 콜라겐(타입 I, III 및 IV, 이들은 생체재료 매트릭스의 75~80%를 차지한다), 피브로넥틴 및 글리코사미노글리칸을 포함함을 기술한다.
본 생체재료는 또한 탯줄에서 유래되지 않고 상업적 출처를 갖는 콜라겐을 포함할 수 있고, 또는 이것은 종래 기술에 알려진 다른 조직 및 방법으로부터 분리된 바 있음이 또한 언급되었다. 저자들은 또한 본 생체재료가 성장인자, 호르몬, 항생제, 면역조절 인자 등과 같은 비-구조적 화합물을 포함할 수 있다는 것을 덧붙인다.
스페인 특허 ES 8600613은 생체 조직을 처리하고, 세포막과 핵산, 지질 및 세포질 성분을 분리하며, 콜라겐을 주성분으로 하는 세포외 매트릭스를 형성하고, 그리고 콜라겐을 생체이식편(body graft)으로 사용하기에 적합한 생체 조직으로 만드는 과정을 기술하고, 이 과정은 상기 조직을, 생체 내에서 그것의 조직 이식에 적합한 크기와 형태를 유지하면서 동시에 하나 이상의 세제(detergent)로 추출하는 것을 포함한다.
특허 문헌 ES 2 180 653 T3은 생물학적 소재들을 세포의 70% 이상을 제거하기 위한 자기분해된 물질로 변환시키는 방법과 인간 또는 동물에 이식수술 후 무기물화를 억제하기 위한 상기 재료의 처리 방법을 기술한다. 본 문헌은 출발 생물학적 재료는 비록 구체적으로 돼지의 대동맥 판막에 관한 것이지만, 다른 것들 중에서 탯줄일 수 있음을 주장한다. 그럼에도 불구하고, 본문에는 탯줄로 이것을 실행하는 것에 관한 어떤 상세한 내용도 포함되지 않았다. 생성된 생체재료는 생체인공심장판막을 생성하는 데 사용된다.
특허 문헌 US 4,240,794는 혈관 대체물로 사용하기 위한 인간 또는 동물 탯줄의 제조에 관한 것이다. 본 문헌은 구체적으로 알코올에서 탯줄을 탈수시키는 기법을, 이어서 이 탯줄을 원하는 형태로 고정시키는 방법을 기술한다. 일단 탯줄에서 남아 있을 수 있는 다른 조직들을 없애고 나면, 이 탯줄은 굴대(mandrel)에 놓여 탈수에 필요한 시간 동안 특정 에틸알코올에 담궈진다. 탈수 후, 탯줄은 고정을 위해 1% 알데하이드 용액에 담궈진다.
특허 문헌 FR 2,563,727은 와튼 젤리를 함침시키고 동결 온도에서 보관된 탈프로그램(deprogrammed) 연결 조직으로부터 피부 이식편을 생산하는 방법을 기술한다. 저자들은 탯줄에 고정된 장치를 기술하고, 이것은 압축 공기를 주입하는 캐뉼라에 의해 팽창된다. 탯줄은 그 후 절단되고 분리되지만, 이 과정에서 얻은 생성물은 와튼 젤리 독점적으로 구성되지 않는다고 기재되어 있다.
관심의 세포를 얻기 위해 탯줄을 사용하는 특허 문헌이 있다. 이러한 목적을 위해, 와튼 젤리를 분리하고 제거한 뒤, 상기 세포를 얻는 과정을 실행한다. 예를 들어, PCT 문서 98/17791은 탯줄에서 연골세포 전구체(pre-chondrocytes)의 분리를 기술한다. 이들 전구체는 추후에 치료를 위해 연골을 생성하는 데 사용된다. 이와 유사하게, WO 2004/072273 A1 문서에서, 전구세포(progenitor cells)는 탯줄 주위에 있는 와튼 젤리로부터 추출되고, 인간 조직의 회복에 사용된다.
그러나 인간 탯줄의 와튼 젤리에 위치한 GAGs에 의해 형성되고, 인간 탯줄 막과 혈관이 없으며, 여러 인간 질병에서 사용되도록, 필요한 점성 특성 등에 적합된 하이드로겔을 형성할 수 있는 생체재료를 언급한 문서는 없다.
따라서, 본 발명의 생체재료는 와튼 젤리로 불리는 탯줄의 세포외 매트릭스를 형성하는 GAGs만으로 독점적으로 구성된다. 세포외 매트릭스는 조직의 복잡하고 특이적인 생물학적 물질이다. 방광의 혈관에서 유래된 세포외 매트릭스는 피부에서 유래된 것과는 완전히 다르다(Hiles & Hodde, 2006). 그렇기 때문에, 세포외 매트릭스를 합성하려는 여러 시도가 문헌에 알려져 있지만, 특정 조직의 자연 상태를 모방하는 정밀한 조성물은 아직까지 생성된 바 없다.
본 발명에서 개발된 생체재료는 조직 공학의 기본 매트릭스로서의 사용을 허용하는 3차원 구조를 제공하고, 더 나아가 질병에 직접 적용되었거나 또는 세포와 함께 적용되었을 때, 본 생체재료는 재생 과정에 개입하여 조직 자체의 세포들에 콜 효과(call effect)를 행사하고 세포 활성화 과정에 유리한 환경을 제공한다.
와튼 젤리는 아주 적은 수의 세포를 함유하지만, 그럼에도 다량의 세포외 매트릭스(콜라겐과 GAGs)를 함유하는 것을 특징으로 한다. 달리 표현하면, 와튼 젤리에서 발견되는 세포들은 상당히 활성화되어 높은 수준의 매트릭스를 생성할 수 있다. 이것은 변형 성장인자 베타(TGF-β), 인슐린-유사 성장인자 I형(IGF-I), 섬유모세포(fibroblast) 성장인자(FGF), 상피 성장인자(EGF) 및 혈소판-유래 성장인자(PDGF)를 포함해, 다량의 성장인자가 와튼 젤리에 축적되기 때문이다. 이러한 성장인자들은 특이 수용체와 결합함에 의해 각자의 세포 활성 조절 역할을 수행하는데, 이들 특이 수용체 중 몇몇은 와튼 젤리를 구성하는 다양한 GAGs에 있다. 이들 성장인자들은 세포 증식, 분화 및 와튼 젤리를 형성하는 세포외 매트릭스의 합성 및 리모델링을 조절한다. 다량의 합성된 매트릭스는 높은 기계적 내성, 탄력성 그리고 자궁 수축 또는 태아 이동에 의해 초래되는 혈관의 폐색을 막기 위해 사용되는 높은 수화능을 제공한다(Sobolewski et al ., 2005).
다른 생체재료와 달리, 본 발명의 생체재료는 탯줄의 와튼 젤리로부터 얻은 다양한 GAGs의 조합물로 구성된다. 이것은 대체로 히알루론산으로 구성되나, 더 나아가 다른 GAGs 화합물과 달리, 데르마탄 설페이트, 헤파란 설페이트, 헤파린, 케라탄 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트 및 콘드로이틴-6-설페이트을 함유한다. 이러한 GAGs의 조합물은, 각자가 세포 행동 조절 기능을 실행하기 때문에, 본 생체재료의 생체활성(bioactivity)을 개선시킨다. 예를 들어, 헤파란 설페이트와 헤파린은 FGF 및 EGF의 주요 결합부위이고(Kanematsu et al ., 2003; Ishihara et al ., 2002), 이들 성장인자들을 단백질 분해로부터 보호하고 세포 환경에서 이들 인자들의 국지적 농축을 허용하여, 다량의 세포 활성에 적합한 분자 미세환경을 생성한다(Malkowski et al ., 2007).
본 생체재료에 존재하는 GAGs의 조합물은 다수의 특이적 신호전달 분자 결합지점을 제공하는데, 이것은 적용 지점에서 치료받은 결함을 재생하고 회복시킬 세포외 매트릭스를 다량 합성하기 위한 조직 자체의 세포의 높은 활성을 허용한다.
아울러, 본 발명의 생체재료의 기원은 비-면역원성 영역의 인간 기원의 천연 구조를 제공하고, 이것의 제거는 정상적인 생리적 주기에 통합되고, 이것은 동물 기원의 생체재료의 반응 또는 일부 합성 생체재료가 일으킬 수 있는, 예를 들어 염증, 경결(induration)(장기 조직의 경화), 육아종 발발, 점막에서 괴사 및 그것의 생성에 사용된 독성 물질로 인한 조직 합병증과 같은 부작용을 막는다.
탯줄에서 GAGs의 가장 중요한 기능 중 하나는 외부 침략으로부터 내부에 위치한 혈관계를 보호하기 위한 내구성과 탄력성 그리고 저항성을 제공하는 것이다. 사실, 이러한 분자들의 합성에서의 결함은 임신 기간 중의 심각한 질병과 관련된다(Gogiel et al ., 2005). 탯줄의 일부분을 형성하는, 7가지 서로 다른 유형의 GAGs로 이루어진 생체재료를 얻는 것은 그들의 섬유들 사이에 가교화를 형성하고, 유기체에서 일어나는 것을 시뮬레이션하고, 그러고 나서 탯줄에 부여된 것과 유사한 내구성, 저항성 및 압축성을 제공할 수 있다.
도 1: 본 발명의 생체재료에 존재하는 GAGs의 특성 및 정량화.
막대 그래프는 본 발명의 생체재료에 존재하는 서로 다른 유형의 GAGs 및 그들 각각의 백분율을 나타낸다. HA: 히알루론산, KS: 케라탄 설페이트, C6S: 콘드로이틴-6-설페이트, HS: 헤파란 설페이트, C4S: 콘드로이틴-4-설페이트, DS: 데르마탄 설페이트, H: 헤파린.
도 2: 조직 염색에 의한, 샘플에서의 GAGs의 존재 및 세포 및 DNA/RNA의 부재의 검증.
좌측 영상은 세포를 갖는 샘플을 나타내고 우측 영상은 생체재료만의 염색을 나타낸다. A, B: 헤마톡실린-에오신 염색; C, D: 메틸 그린-피로닌 염색; E, F: 알시안 블루 염색.
도 3: 주사 전자 현미경에 의한 본 발명의 생체재료의 내부 3차원 구조 영상.
본 영상은 서로 다른 두 개의 배율(A: 10mm 및 B: 5mm)에서의 본 발명의 생체재료의 내부 구조를 나타내고, 여기서 서로 결합된 GAG 단위들을 볼 수 있고, 상당히 균일한 다공성 구조를 제공한다.
도 4: 본 발명의 생체재료에 존재하는 세포의 독성 연구의 결과.
본 그래프는 AMSC 세포(지방-유래 간엽 줄기세포)(도 A), 마우스 섬유 아세포(도 B9), L929(도 C), 조골세포(도 D), 연골세포(도 E) 및 각질형성세포(도 F)의 세포독성 곡선을 나타낸다. 이러한 결과들은 대조군(생체재료에 없는 세포들)과 양성 대조군(ISO-10993 표준에 따라 결정된 독성 생체재료(PVC)에 존재하는 세포들)에 대해 제공된다.
그래프에서 관찰되는 바와 같이, 생체재료는 생체재료에 배열된 세포들의 미토콘드리아 활성이 대조군 세포들(표준 배양 조건에서)과 관련해 차이점을 보이지 않으므로, 검사된 어떤 유형의 세포에서도 독성을 일으키지 않는다. 는다.
도 5: 3차원 생체재료의 현미경 영상
본 영상은 표준 24-웰 배양 접시를 틀로 사용하여 동결건조된 후 본 발명의 고체 생체재료를 현미경으로 관찰한 3차원 구조를 나타낸다. 본 영상은 하나의 웰에서 고체화된 생체재료의 양에 해당한다.
탯줄은 와튼 젤리라고 불리는 연성 연결 조직 부분을 형성하는 (황산화 및 비-황산화) GAGs를 다량 함유한다. 이들 GAGs 중에서, 주요 비-황산화 GAG는 히알루론산이지만(Hadidian et al., 1948; Jeanloz et al., 1950), 소량의 황산화 GAGs도 검출된다(Danishefsky et al., 1966). 게다가, 탯줄의 조직학적 연구는 헤파린의 존재를 암시해왔다(Moore et al., 1957). 또한 탯줄에 아직 확인되지 않은 더 많은 소수(minor)의 황산화 GAGs가 있을 가능성이 크다.
본 명세서에서 기술된 발명은 탯줄의 와튼 젤리로부터만 독점적으로 얻은 GAGs로 제조된 하이드로겔이다. 이 하이드로겔은, 본 생체재료를 얻는 인간 탯줄의 와튼 젤리에 존재하는 세포가 전혀 없고, 따라서 면역성 성분을 갖지 않는다.
이 생체재료는 히알루론산, 케라탄 설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 데르마탄 설페이트 및 헤파린을 포함하는 군으로부터 선택되는 글리코사미노글리칸들의 혼합물에 의해 형성된다.
이 생체재료는 바람직하기는 다음 조합 및 배율로 GAGs의 혼합물을 형성하는 것으로 알려졌다: 히알루론산(65~75%), 케라탄 설페이트(5~15%), 콘드로이틴-6-설페이트(6~8%), 헤파란 설페이트(3~7%), 콘드로이틴-4-설페이트(2~6%), 데르마탄 설페이트(1~5%) 및 헤파린(0.1~2%). 더욱 바람직하기는 GAGs의 조합은 다음과 같다: 히알루론산(70%), 케라탄 설페이트(10%), 콘드로이틴-6-설페이트(7%), 헤파란 설페이트(5%), 콘드로이틴-4-설페이트(4%), 데르마탄 설페이트(3%) 및 헤파린(1%).
본 발명은 또한 앞서 기술된 하이드로겔로 제조된 생체재료에 관한 것이고, 이것은 선택적으로 세포를 함유한다. 따라서 이 하이드로겔의 작용은 심각하게 손상된 조직에서 또는 환자에 의한 인 시츄 ( in situ ) 세포 인공주입의 가능성이 없는 조직에서 재생 및 조직 회복 과정에서 증진되는데, 이것은 생체재료가 손상된 조직과 동일한 유형의 건강한 세포를 가지고 있다는 사실에 의한 결과이다. 생체재료에 함유된 세포는 다른 무엇보다: 미분화된 간엽 줄기세포 또는 또 다른 세포주로 분화된 간엽 줄기세포, 미분화된 조혈 줄기세포 또는 또 다른 세포주로 분화된 조혈 줄기 세포, 연골세포 및 연골모세포, 조골세포 및 골세포, 각질형성세포, 섬유 아세포, 근육세포, 지방세포, 뉴런 또는 신경계로부터의 다른 세포들, 백혈 세포계로부터의 세포들, 각막세포, 내피세포 또는 상피세포일 수 있다.
본 발명은 다음 단계들로 나뉜다: (i) 탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs의 추출물을 얻는 단계, (ii) 탯줄의 와튼 젤리로부터 단리된 GAGs로부터 하이드로겔을 생산하는 단계, (iii) 얻은 하이드로겔을 특징짓는 단계 및 (iv) 생체재료를 사용하는 단계.
탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs 의 추출물을 얻는 단계
본 생체재료를 얻기 위한 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 인간 탯줄을 얻는 단계;
b. 인간 탯줄을 생리 식염수와 항생제로 처리하는 단계;
c. 인간 탯줄 표면으로부터 혈액을 모두 제거하는 단계;
d. 인간 탯줄을 1~2cm의 부분으로 조각내는 단계;
e. 내부에 잔존하는 혈액을 깨끗이 씻어내는 단계;
f. 탯줄 막과 혈관을 제거하는 단계;
g. 와튼 젤리를 포함한 젤라틴성 재료를 분리하는 단계;
h. 얻은 젤라틴성 재료를 효소적으로 소화시키는 단계; 그리고
i. GAGs를 침전시켜 단리하는 단계.
구체적으로, 탯줄의 와튼 젤리로부터 글리코사미노글리칸들을 분리하기 위해 다음과 같은 방법이 실시된다:
와튼 젤리를 얻는 단계
분만 직후 탯줄을 집하하고, 처리되어 취급될 때까지 4℃에서 유지하고, 이런 상태에서 24시간 이상 시간이 경과돼서는 안 된다.
처리하는 동안, 탯줄은 바람직하기는 바이오안전 수준 II 무균 후드(laminar flow hood)에서 멸균 상태로 유지된다. 탯줄은 잔존 혈액을 완전히 제거하기 위해, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 용액 또는 항생제(페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신-B) 및/또는 적혈구 라이시스 완충액 혼합물을 포함하는 인산염 완충용액 1X(1X PBS)로 적어도 연속 3회 세척한다.
일단 탯줄의 표면에서 혈액을 깨끗이 씻어내고, 탯줄을 페트리 접시에 옮기고, 1~2cm 크기의 부분으로 조각낸다. 탯줄을 조각으로 자를 때, 탯줄의 혈관에 잔존하던 혈액이 흘러나올 수 있고, 그래서 이 경우에 탯줄 조각을 철저하게 씻는 것이 필요하다.
탯줄은 구조적 측면에서 탯줄 동맥 2개와 탯줄 정맥 1개를 가지며, 이들은 균일한 매트릭스 와튼 젤리에 의해 지지되고 얇은 막에 의해 덮힌다. 와튼 젤리를 독점적으로 얻기 위해서 이 막과 혈관을 기계적으로 제거한다. 이렇기 하기 위해서, 탯줄 조각을 세로로 길게 절개하고, 메스와 핀셋을 사용하여 탯줄 막과 혈관을 모두 조심스럽게 제거한다. 이러한 기계적 분리의 결과로 얻게 되는 젤라틴성 재료가 와튼 젤리다. 일반적으로 탯줄 25~200g에서 와튼 젤리 20~160g이 얻어진다.
와튼 젤리로부터 GAGs 를 추출하는 단계
파파인 효소를 사용하는 효소적 소화에 의해 인간 연골로부터 GAGs를 얻기 위해(SIGMA, Ref: P-4762) 문헌(Rogers et al ., 2006)에 기술된 절차를 일부 수정하여 사용해 탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs를 얻었다.
전 단계에서 얻은 와튼 젤리의 완전 소화를 위해 60℃에서 24~48 시간 동안 추출 완충용액(L-시스테인 5mM, Na2HPO4완충액 100mM, EDTA 5mM, 파파인 10mg(14 U/mg), pH 7.5) 10㎖에 담근다.
와튼 젤리가 완전히 소화되고 나면, 필요없는 소화 잔류물을 제거하기 위해 원심분리시킨다. 이때, 소화된 부피가 출발 부피보다 큰 것이 관찰된다. 이러한 증가는 와튼 젤리에 존재하는 GAGs의 용해 그리고 이로써 그들이 축적했던 물의 방출 때문이다.
일단 샘플이 원심분리되면, 상청액은 다른 용기에 옮겨 담아지고, 이어서 샘플에 있는 GAGs는 침전된다.
탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs 를 침전시키고 단리하는 단계
와튼 젤리의 GAGs를 100% 에탄올 5 부피로 침전시킨다. 이 단계에 의해, 샘플의 GAGs뿐만 아니라 샘플에 존재하는 염들도 침전된다. 이러한 침전은 샘플에 존재하는 물 분자들이 에탄올 분자와 상호작용하고, 그러면서 물 분자가 샘플의 GAGs와 상호작용할 수 없게 되어, GAGs가 물에서 불용성이 되고, 그 결과로 침전이 일어난다. 따라서, 에탄올을 첨가하고 시험관을 흔들어준 직후, 흰색 침전물이 관찰된다. GAGs가 침전되도록 -20℃에서 12시간 동안 방치된다. 침전되면, 원심분리하여 100% 에탄올을 제거하고, 침전물을 75% 에탄올 5 부피로 세척하여 샘플에 침전되었을지 모를 잔류염들을 제거한다. 샘플을 다시 한 번 원심분리하여 상청액을 완전히 제거한다.
GAGs를 포함한 샘플이 침전되면, 고체 잔류물은 에탄올이 모두 증발될 때까지 실온에서 30분 이상 건조되도록 방치된다. 에탄올이 증발되면, GAGs를 포함한 샘플은 Milli-Q H2O에서 재현탁되고 4℃에서 무기한 방치된다.
이런 유형의 물질의 기계적 내성은 낮다; 재료들이 또 다른 유형의 합성물 또는 인산칼슘-유형 물질과 결합되지 않는 한, 부하를 받지 않는 것으로 여겨지고, 오히려 손상된 부위에서 재생 생체활성 작용을 수행하는 것으로 여겨진다. 그러나 이 하이드로겔을 구성하는 다당류 분자들 사이의 최대의 친화도는 이들이 서로에 대해 높은 응집력을 유지하게 하고, 그럼으로써 주입 부위에 남고 접착 성질을 갖도록 한다.
가교화 : 하이드로겔을 얻는 단계
적용 부위의 주변 조직의 세포들 또는 이식 이전에 본 생체재료에 배열된 세포들에 의한 군집화(colonization)를 허용하는 내부 구조를 갖는, 좀 더 내성이 있고 영구적인 생체재료를 요구하는 다른 치료적 적용들이 있다. 이 경우, 본 발명의 생체재료는 손상된 조직의 치유와 회복을 유도하는 생체활성 3차원 매트릭스처럼 행동한다.
히알루론산, 콘드로이틴-6- 및 -4-설페이트, 케라탄 설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파란 설페이트 및 헤파린은 세포 활성을 조절하고 새로운 세포외 매트릭스의 합성을 활성화시킨다. 생체재료에 존재하는 GAGs의 다양성은 세포 확산 및 분화 과정을 조절하는 성장인자에 특이적인 수많은 결합 부위가 존재할 수 있게 할 뿐만 아니라 세포가 새로운 세포외 매트릭스 및 성장인자를 합성할 수 있는 능력을 갖도록 한다. 이런 효과는 손상된 조직에 대한 더 큰 반응 능력을 가져오고 재생을 가속화시키며, 심지어 만성 궤양의 경우처럼 심하게 손상된 부위의 경우에 치유를 가능하게 한다.
생체재료가 3차원 매트릭스로 사용될 수 있도록 하기 위해, GAGs의 추출물은 안정화되어, 그것의 기계적 속성을 향상시키고 3차원 구조의 형성을 허용해야 한다. 이러한 목표를 달성하기 위해서, GAGs는 생체재료를 고체 하이드로겔의 형태로 형성하기 위해 화학적으로 변형되거나 또는 가교화될 수 있다. 이러한 화학적 변형은 통상적으로 알코올 또는 카르복실기를 필요로 한다.
안정한 고체 하이드로겔을 얻기 위해서, 샘플에 가교화 반응(가교화, 중합반응)을 실시하는 것이 필요하다. 이 과정은 수용성 중합체의 사슬들이 불용성화 되는 것을 필요로 한다(Elisseeff et al ., 2005).
가교화에 의해 얻은 하이드로겔은 그것을 조직 공학에 유용하게 쓰일 수 있도록 만드는 독특한 특성이 있다: 영양분 또는 노폐물을 운반하기 위한 높은 물 함량, 탄력성 및 3차원 미세환경에서 세포들을 캡슐화하거나 또는 제자리에 고정시키는 능력. 가교 밀도는 하이드로겔의 구멍 크기에 직접적인 영향을 미치고, 그렇기 때문에 예를 들어 물 함량 또는 기계적 저항성과 같은 물리적 특성에 영향을 미친다. 그렇기 때문에 가교 밀도가 높고 따라서 구멍 크기가 아주 작은 하이드로겔은 가교도가 낮고 구멍 크기가 큰 하이드로겔보다 더 적은 양의 물을 흡수하고 더 큰 기계 저항성을 갖는다.
가교화에 의한 하이드로겔 형성은 여러 반응: 온도변화, 화학 반응 및 광중합에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서, 가교 반응은 다음과 같이 수행된다: 가교화될 중합체의 수성 용액(이 경우, GAGs의 수성 용액)을 얻고 가교화를 일으킬 화학약품을 첨가한다. 이 경우에, 하이드로겔을 발전시키기 위해 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드 하이드로클로라이드)가 사용되는데, 그 이유는 EDC가 수용액 중의 카르복실 기를 활성화하기 때문이다. 이들 활성화된 카르복실기는 1차 아민 또는 하이드록실기와 반응하여, 결과적으로 아마이드 또는 에스테르 결합을 생성한다. 하이드로겔이 형성되면, 남아있을 수 있는 EDC 잔류물을 제거하기 위해 PBS로 여러 차례 세척한다. 이렇게 하여 GAG 분자들은 다량의 물을 흡수할 수 있도록 제조되고, 그 결과 고체 다공성 구조의 하이드로겔을 형성한다(Pieper et al ., 1999; Wissink et al ., 2001).
특정 형태 및 크기를 갖는 하이드로겔은 이런 목적을 위한 주형에서 가교화 과정 동안 고형화되고, 이와 같이하여 하이드로겔은 사용되는 주형에 따라 원하는 형태와 크기를 갖는다.
고체 하이드로겔은 동결건조법으로 불리는 공정에 의해 건조되고 하이드로겔에 존재하는 GAG 분자들 사이에 위치하는 물 분자의 제거 덕분에 다공성 구조를 얻을 수 있다(도 5). 더구나, 일단 생체재료가 동결건조되면, 하이드로겔의 3차원 구조는 주사 전자 현미경(SEM)에 의해 특징화될 수 있다(도 3). 얻은 고체 하이드로겔은 동결건조법에 의해 동결되고, 일단 동결되고 나면 승화라고 불리는 공정으로 물을 제거하기 위해 진공실에 유입된다. 사실상 원래의 하이드로겔에 함유되었던 모든 유리 수(free water)는 여러 동결 사이클에 의해 제거된다.
일단 하이드로겔이 최종 형태로 얻어지면, 40분 동안 자외선에 노출시키는 방법에 의해 멸균된다. 하이드로겔에 대해 실시된 무균 검사는 생체재료가 최적으로 멸균되었음을 입증해주었다.
일단 멸균되고 나면, 하이드로겔은 즉시 적용되거나 또는 세포에 부착(association)될 수 있는 최종 생성물 형태가 된다.
본 발명의 하이드로겔에 대한 세포 부착 분석은 이 생체재료가 세포에 해로운 영향을 미치지 않는다는 점과 생체재료의 증식 능력이 표준 배양 조건에서 발생할 수 있는 능력과 유사함을 입증했다(도 4).
바이오겔의 용도
본 발명의 생체재료는 세포와 결합된 형태로 또는 단독으로, 관절계 질환 및 미적 치료에 주입가능 형태로 적용될 수 있다. 사용될 수 있는 세포들은 다른 세포들 중에서: 미분화된 간엽 줄기세포 또는 또 다른 세포주로 분화된 간엽 줄기세포, 미분화된 조혈 줄기세포 또는 또 다른 세포주로 분화된 조혈 줄기세포, 연골세포 및 연골모세포, 조골세포 및 골세포, 각질형성세포, 섬유 아세포, 근육세포, 지방세포, 뉴런, 신경계로부터의 다른 세포들, 백혈세포계로부터의 세포들, 각막세포, 내피세포 또는 상피세포이다.
하이드로겔은 의도된 적용에 따라 주입 기법이 달라지고, 하이드로겔의 점도는 주입 시스템의 능력에 맞게 조절된다. 주입 가능한 하이드로겔의 점도는 10~15,000cS이고, 바람직하기는 10~2,000cS이다. 가교화된 하이드로겔은 15,000cS보다 큰 점도를 가질 수 있다. 하이드로겔의 점도는 필요에 따라 가교화에 의해 변형될 수 있고, 15,000cS보다 큰 점도를 가질 수 있다.
본 발명에서 개발된 생체재료는 바람직하기는 주입 가능한 형태로 다음 질병에 적용될 수 있다: 연조직의 리모델링, 충전, 또는 재건, 잔주름, 주름 및 흉터, 화상, 궤양, 연조직 확장, 얼굴 지방위축증, 추간판 탈출증의 치료, 연골, 근골격계 부상, 골관절염 및 주위관절염의 회복; 종양, 질 질환, 뇌 손상의 치료, 골수 회복(repair), 퇴행성 뇌신경질환, 심혈관질환 및 진통제 및 소염제와 같은 윤활 작용.
고체 형태인 본 발명의 생체재료는 실질적으로 다공성 구조를 갖는다. 상기 구조에서, 구멍 직경은 0.5~1,000㎛, 바람직하기는 0.5~500㎛이고, 15,000cS보다 큰 점도를 가질 수 있다. 고체 형태의 상기 생체재료는 바람직하기는 다음 질병에 적용될 수 있다: 화상, 궤양 및 진피-표피 결함의 치료, 각막 손상, 망막 손상 또는 백내장과 같은 안과 질환의 치료; 연골 회복, 골연골 결손, 골관절염 또는 골 결손의 경우와 같은 골관절계의 치료, 그리고 질 질환의 해결에서 애쥬번트, 치은염 및 치주염의 치료; 세포 배양 시스템의 발생(development)에서의 사용.
연골 질환은 전 세계적으로 중요한 사회적-경제적 문제이다. 이런 점에서, 발병율을 기록하기는 어렵지만, 5억 명이 관절 손상을 앓고 있는 것으로 추산된다.
연골 질병은 부상 또는 질환의 결과로 발생하고, 만약 치료되지 않을 경우, 골관절염(OA)과 같은 퇴행성 질환에 이를 수 있다.
OA는 가장 일반적인 관절염의 유형 중 하나로, 미국과 유럽에서 3500~4000만 명이 이 질환을 앓고 있다. 이것은 뼈의 무기력이 수반되는 연골의 분해를 일으키는 퇴행성 질환이다. 이 질환은 일반적으로 손과 무릎, 엉덩이, 발 그리고 목에 영향을 미치고, 성인의 경우, 육체적 거동을 못하게 하는 가장 일반적인 원인들 중 하나이다.
관절 연골은 상당히 분화된 관다발 조직으로, 관절 표면들 사이에 마찰을 일으키는 중량 및 충격과 연계된 힘으로부터 가동관절의 뼈를 보호한다. 이 조직은 단일 세포 유형인 연골세포에 의해, 그리고 중요하고 풍부한 세포외 매트릭스에 의해 형성된다. 상기 매트릭스는 II형 콜라겐 섬유(주요 분자)의 고밀도 네트워크 및 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 히알루론산 및 어그리칸(aggrecan)과 같은 GAGs를 포함하는 이 내트워크 내의 프로테오글리칸의 매크로-응집물들(macro-aggregates)로 이루어진다.
연골의 특수한 구조 및 그것의 제한적인 회복 능력은 이런 유형의 손상의 치료를 아주 복잡하게 만든다. 혈관생성의 부재가 그것의 재성 능력을 아주 제한적으로 만드는데, 그 이유는 줄기 세포들이 손상된 부위에 접근해 재성 과정에 기여할 수 없기 때문이다.
최근 몇 년 사이, 생분해성 생체재료가 연골 손상의 치료에 쓰여왔다. 이런 점에서, 거시적인 합성 중합체들(젖산, 글리콜산, 카프로락톤)은 가장 중요하고 가장 많은 생체재료들이 되고 있다. 그러나, 이들 고체 거시재료들은 종래의 외과수술과 같은 적극적인 외과적 시술의 사용을 요구한다. 이러한 한계들을 극복하기 위해서, 주사 주입 또는 관절경과 같은 최소한의 침습적(invasive) 기법으로 이식될 수 있는 새로운 생체 매트릭스가 현재 개발 중이다.
따라서, 본 발명의 주입 가능한 생체재료의 적용방법 중 한 가지는 골관절염의 퇴행성 과정에 의해 손상된 관절 연골의 재생이다. 상기 생체재료는 관절경과 같은 경피 기법에 의해 또는 어느 주입 장치에 의해 재생될 부위에 손쉽게 투여될 수 있다. 이와 같은 용이한 투여에 더하여, 주입 가능한 하이드로겔은 악화된 조직의 크기 및 기하학적 형태에 맞춰진 안정된 임플란트를 형성하는 속성을 갖는다.
생체재료의 또 다른 적용은 상처 치료용 3차원 생체재료의 사용이다.
만성 당뇨, 욕창 및 정맥궤양은 미국에서 3~6백만 명이 앓고 있는 중대한 질환이다. 이 질환들은 선진국 인구의 1~3%가 앓고 있고, 병원에 입원한 환자의 15%가 이 질환으로 고통받고 있다. 이런 부상들로 고통받는 다수의 환자들이 상당한 사회적-경제적 그리고 의료 상의 반향을 일으키고 있으며, 그래서 높은 치료비가 정립되고, 환자의 삶의 질이 상당히 바뀌고 있다.
궤양은 상당히 복잡한 병태 생리학을 갖는 유기체에 큰 영향을 미치는 외상이다. 섬유 아세포(진피 세포들), 각질형성세포(표피 세포들), 세포외 매트릭스 그리고 혈장-유래 단백질 사이에서 발생하는 복잡한 상승적 상호작용이 상처 기저부에서 발생하여, 서로 다른 상처 치료 단계들, 지혈, 염증, 회복 및 리모델링이 발생할 수 있다.
그러나, 만성적 특징 및 재발은 임상 진행에서 가장 의미 있는 빈도이다. 오늘날 사용가능한 치료법과 외과적 드레싱(dressing)은 매우 다양하지만, 치유율과 치유 속도가 여전히 매우 낮기 때문에, 따라서 빠른 상처 치료를 달성하는 좀 더 효과적인 치료법이 요구된다. 최근 만성 궤양의 병태 생리학에 대해 획득된 진보적인 지식은 이 질병의 치료에 중요한 진보를 가져온 새로운 외과적 처치법의 개발을 야기한 바 있다. 비록 지금까지, 피부를 덮기 위한 이상적인 드레싱이 존재하지 않지만, 이상적 드레싱은 반드시 상처에 대한 빠른 부착과 같은 일련의 기본적인 특성들을 준수하고, 액체 손실에 대한 효과적인 방어막을 제공하며, 기계적 압력에 내성을 갖고 장기적 안정성을 제공해야 한다. 이들 드레싱은 멸균이 손쉽고, 취급 및 운송이 쉬워야하며, 무해해야 한다.
본 발명의 생체재료는 만성 궤양 치료에 효과적일 드레싱에 필요한 특징들의 대부분을 가지고 있다. 이런 점에서, 만성 궤양에 대한 치료 효과를 평가하려는 목적으로, 마우스를 사용하여 생체 내(in vivo ) 실험 연구를 수행하였다.
실시예
실시예 1. 와튼 젤리 획득
탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs를 단리하기 위해 다음 단계를 수행하였다:
분만 직후 탯줄 50g을 농도 1X(H2O 1L에 대해: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g, H2O 1L에서 pH=7.4)의 PBS 300㎖와, 1X 농도의 페니실린(30,000 유닛), 스트렙토마이신(30,000㎍), 암포테리신-B(75㎍)항생제들의 혼합물 3㎖(LONZA, Ref: 17-745 E)를 사전에 넣어 둔 살균된 병에 수집하였다. 탯줄은 처리할 때까지 4℃에서 24시간 이하의 시간 동안 보관할 수 있지만, 본 실시예에서는 탯줄을 수집 후 즉시 처리하였다.
처리를 위해, 탯줄을 바이오안전 수준 II 무균 후드에서 멸균 상태로 보존하였고, 탯줄에 함유된 혈액 잔류물을 완전히 제거하기 위해 일련의 연속적인 세척을 실시하였다. 이를 위하여, 탯줄을 용기에 넣고, 페니실린(30,000 유닛), 스트렙토마이신(30,000㎍), 암포테리신-B(75㎍) 항생제들의 혼합물 3㎖를 함유하는 1X PBS(H2O 1L에 대해: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g, H2O 1L에서 pH=7.4) 300㎖(LONZA, Ref: 17-745 E)를 첨가하였다. 병을 수직으로 기울여서 10초 동안 5회 손으로 흔든 뒤 용액을 버렸다. 이런 작업을 혈액의 대부분이 제거될 때까지 적어도 3회 이상 반복하였다. 그런 다음, 탯줄을 1X 농도(H2O 1L에 대해 NH4Cl 8.99g, KHCO3 1g, EDTA 37mg, pH 7.3)의 혈구 용해 용액 500㎖로 혈액 잔류물이 완전히 제거될 때까지 세척하였다.
탯줄 표면에서 혈액을 깨끗이 씻어낸 뒤, 10cm 페트리 접시에 옮겨 담아 살균 가위로 1~2cm의 조각들로 잘랐다. 혈관에 남아 있는 혈액이 탯줄을 조각으로 자르는 동안 방출되었기 때문에, 항생제(10,000 유닛), 스트렙토마이신(10,000㎍)과 암포테리신-B(25㎍)의 혼합물 1㎖를 함유하는 1X PBS 10㎖를 첨가하여 상기 조각들을 철저히 씻은 뒤, 조각의 표면을 받침대(support surface)에 대고 눌러, 멸균 메스를 조각의 길이를 따라 수평으로 이동시켰다. 내부로부터 혈액 잔류물이 모두 제거될 때까지 이 과정을 반복하였다. 완전히 깨끗해진 탯줄 조각을 멸균 시험관에 옮겨 담고, 그 즉시 처리하였다. 그러나 필요한 경우, -80℃에서 무한정 저온보존할 수 있다.
그런 다음 탯줄을 둘러싼 막과 그 안에 위치한 혈관들을 기계적으로 제거하였다. 그러기 위해서, 탯줄 조각들을 세로로 가르고 메스와 핀셋을 사용하여 탯줄 막과 혈관을 모두 조심스럽게 제거하였다. 이런 기계적 분리의 결과로 얻어진 젤라틴성 재료가 와튼 젤리다. 와튼 젤리 40g을 얻었다.
실시예 2. 와튼 젤리로부터 GAGs 의 추출
인간 연골로부터 GAGs를 얻기 위해 기술된 절차를, 몇 군데 수정하여, 탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs를 얻는 데 사용하였다(Rogers et al ., 2006).
실시예 1에서 얻은 와튼 젤리를 추출 완충 용액(200mM L-시스테인 242㎕, 704mM Na2HPO4 완충용액 1.42㎖, 0.5M EDTA 100㎕, pH 7.5인 파파인 10mg(14 U/mg))(SIGMA, Ref: P-4762) 10㎖에 담그고, 와튼 젤리를 완전히 소화시키기 위해 24시간 동안 60℃로 유지시켰고, 일단 소화된 후, 샘플을 5분 동안 800rpm에서 원심분리하여 소화 잔류물을 제거하였다. 소화 후 부피는 시작 부피인 10㎖보다 약 20㎖ 많은 양인 30㎖인 것이 관찰되었고, 이것은 와튼 젤리에 존재하는 GAGs의 용해 때문이고, 그에 따라 이들이 축적했던 물의 방출 때문이다.
샘플을 원심분리한 후, 상청액을 다른 시험관에 옮겨 담았고, 샘플에 존재하는 GAGs를 침전시켰다.
실시예 3. 탯줄의 와튼 젤리로부터 GAGs 의 침전 및 단리
상청액에 존재하는 와튼 젤리의 GAGs를 100% 에탄올 5부피로 침전시켰다. 이 단계에 의해, 이 샘플의 GAGs는 물론이고 샘플에 존재했던 염들이 침전되었다. 이것은 샘플에 존재하는 물 분자들이 에탄올 분자들과 상호작용하고, 따라서 물 분자들이 샘플의 GAGs와 상호작용할 수 없다는 점에서 기인한다. 침전을 위해 GAGs를 -20℃에서 12시간 방치하였다. 침전 후, 샘플을 5분 동안 2500rpm에서 원심분리하였다. 이렇게 하여, 100% 에탄올을 모두 제거하였다. 침전물을 75% 에탄올 5 부피로 세척하여 샘플에 침전되었을 수 있는 잔류성 염을 제거하였다. 이어서 2500rpm으로 5분간 원심분리하여, 상청액을 완전히 제거하였다.
샘플이 침전된 뒤, 고체 잔류물을 건조시키기 위해 에탄올이 모두 증발할 때까지 실온에서 30분 동안 방치하였다. 와튼 젤리 약 40g을 함유한 샘플로부터 시작해 침전된 GAGs의 양은 시작 물질에 따라, 50~300mg 사이다. 이 특정의 경우에, GAG 침전물 200mg을 얻었고, 이것을 Milli-Q H2O 2㎖에 재현탁시켜, 하이드로겔이 생성될 때까지 4℃에서 계속 보관하였다.
실시예 4. 탯줄의 와튼 젤리의 GAGs 를 함유하는 주입 가능성 하이드로겔의 생성
하이드로겔의 수분 함량은 이것의 적용에 필요한 점도에 따라, 하이드로겔 중량의 10%부터 100배까지 이를 수 있다.
침전된 GAGs를 H2O 2㎖에 재현탁시킨 후 얻은 하이드로겔을 1000cS의 점도를 제공하기 위해 주입 가능한 생리학적 혈청 용액에 재현탁시켰다. 이 하이드로겔을 추후에 200cS의 점도를 제공하기 위해 주입 가능한 생리학적 혈청 용액 8㎖에 재현탁시켰고, 하이드로겔 구조의 붕괴를 막기 위해, 완전한 용해 및 균질화가 될 때까지 보텍스(vortex)에서 부드럽게 교반시켰다.
일단 하이드로겔이 용해되면, 4℃에서 보관하였고, 이 상태로 무한정 보관할 수 있다.
실시예 5. 탯줄의 와튼 젤리로부터의 GAGs 를 함유하는 고체 하이드로겔의 생성
문헌(Cui et al ., 2006)에 기술된 고체 하이드로겔 생성 방법은 다음과 같다. 실시예 3에 따라 와튼 젤리로부터 얻은 GAGs 추출물로부터 수용액을 제조하였다. 구체적으로 농도 1%인 H2O 중의 GAGs 용액을 생성했다. 이를 위해, H2O 10㎖를 침전 및 단리 후 얻은 GAGs (실시예 3) 200mg에 첨가하였다. 아디프산 디하이드라지드(ADH) 1.2g을 용액에 첨가하고, 용액의 pH를 0.1N HCl을 사용하여 pH=3.5로 조절하였다. pH가 조절되고 나면, 고정액 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드 하이드로클로라이드)(SIGMA, Ref: E6383) 0.6g을 용액에 첨가했다. 이 혼합물을, 고체 하이드로겔을 얻을 때까지, 실온에서 지속적인 교반 하에 30분~1시간 동안 보관하였다.
고체 하이드로겔이 형성되면, 1X PBS (H2O 1L에 대해: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g, H2O 1L에서 pH=7.4)로 1회 5분씩 3회 세척하여 EDC 초과량을 제거하였다. 하이드로겔의 물리적 형태와 관련하여, 하이드로겔은 자신이 굳어진 주형의 형태를 갖는데, 그렇기 때문에 표준 96, 48, 24, 12 및 6-웰 배양판, 페트리 접시 또는 그 밖의 다른 원하는 형태의 용기를 사용할 수 있다. 부가적으로, 하이드로겔은 비이커와 같은 큰 용기에서 고체화될 수 있고, 그래서 하이드로겔은 고체화된 후 특징적인 형태와 두께로 자를 수 있다. 구체적으로, 본 실시예에서, 본 하이드로겔은 24-웰 배양판의 웰에서 고체화시켰고, 일단 고체화된 후에 1X PBS 500㎖로 5분 동안 3회 세척하였다.
이 경우, 24-웰 배양판에서 가교화된 고체 하이드로겔에 다음 단계들로 이루어진 저온살균 처리를 실시하였다: -80℃에서 하이드로겔을 동결하였다. 동결된 하이드로겔 샘플을 동결건조기의 진공실에 도입하였다. 온도를 -40℃까지 분당 0.1℃씩 올렸고, 온도를 20분 동안 -40℃로 유지하면서 하이드로겔을 진공 상태에 두었다. 이후, 온도를 -20℃까지 분당 0.1℃씩 올리고 -20℃의 온도를 15분 동안 유지하였다. 그런 후, 온도를 0℃까지 분당 0.1℃씩 올리고 0℃의 온도를 15분 동안 유지하였다. 이후, 온도를 25℃까지 순차적으로 분당 0.1℃씩 올리고, 진공실의 외부 압력과 내부 압력이 동일해지는 데 필요한 시간 동안 이 온도를 유지하였다.
이 실시예에서, 주사 전자 현미경(SEM)으로 이 하이드로겔의 3차원 구조의 특징을 묘사하기 위해, 하이드로겔을 저온살균한 후, 다음 단계를 수행하였다: 저온살균된 하이드로겔의 일부분을 잘라낸 후, 이 부분을 AUTOSAMDRI-814 건조기에서 CO2로 임계점까지 건조시켰다. 그런 다음 스퍼터(SPUTTER)에서 금으로 도금했다. 생성물들은 전압 20 KV의 JEUL 주사 전자 현미경(JSM35)에서 관찰하였다.
하이드로겔의 SEM 분석(도 3)은 하이드로겔이 균일한 다공성 구조를 갖고, 구멍들의 상호연결된 망상구조를 함유한다는 점을 보여주었다. 현미경 사진은 구멍 직경이 0.5~500㎛인 고다공성 3-차원 구조의 존재를 나타내고, 이 범위의 구멍들은 마이크로다공성 및 매크로다공성의 존재를 포함한다. 적절한 세포 군집화가 발생하기 위해서는 매크로다공(300~500㎛)이 필요하고, 그럴 때 많은 수의 세포들이 한 곳에 모이고, 그럴 때 서로 다른 유형의 세포들이 공존한다. 이것은 예를 들어 구조화된 조직의 형성에 유리하므로, 유관 망상조직이 형성될 수 있다. 중간 크기의 구멍들은 세포 통합을 가능하게 한다. 마이크로다공(0.5-50㎛)은 세포 생존을 위해서는 필요하고, 그 이유는 이들이 가스, 영양분의 올바른 확산과 세포 대사의 결과로 생성된 폐기물의 제거의 수행을 책임지기 때문이다. 구멍 크기는 주사 전자 현미경에 의해 얻은 도량 규정에 기반하여 측정된다.
이 경우, 이전 실시예의 주입 가능한 생체재료와 달리, 고체 하이드로겔은 3차원 구조를 제공하고, 이것은 구조 전체, 내부 및 외부 모두에서의 세포 성장 및 군집화를 위한 매트릭스이다. 이 생체재료는 좀 더 높은 구조적 민감성을 나타내는데, 이것은 생체활성 성질과 영양 작용을 추구할 뿐만 아니라, 다른 무엇보다 궤양 및 기타 진피-표피 질환의 치료, 연골 회복 및 안과 질환 치료와 같은 조직 회복이 수행될 때까지 임시로 세포들을 수용할 수 있는 구조 또한 추구하는 적용들을 나타낸다. 생체재료에 함유된 세포들은 굼집화를 다룰 수 있는 이식 부위 근처의 조직들의 세포들일 수 있고 또는 임상 적용에 앞서 생체재료의 생체 외(ex vivo )에 배열된 세포들일 수 있는데, 그러면 생체재료의 재생 작용은 증진된다.
이 생체재료는 0.01~500㎛ 범위의 크기를 갖는 구멍들이 균질하게 분포되어 있고, 이것은 주사 전자 현미경 기법에 의해 확인된다. 이 다공성 범위는 구조 전체에 걸친 가스 및 영양분의 확산, 그리고 세포가 이 생체재료에 들어가는 것 모두에 적합하다.
실시예 6. 본 발명의 생체재료 중에 존재하는 GAGs 의 특징 규명 및 정량화
본 발명의 생체재료에 존재하는 서로 다른 GAGs를 질량 분석(ESI/MS) 기법으로 분석 및 정량화하였다. 이 기법에 의해 분자량이 200~2000 돌턴인 분자만 측정될 수 있고, GAG 분자들은 대부분이 이 범위를 초과한다는 점을 감안하여, 우선 분자량이 200~2000 Da인 GAG 사슬들을 얻기 위해 샘플을 효소적으로 소화시켰다.
GAGs의 동정 및 정량화를 위한 표준으로, 농도를 알고 있는 각각의 GAG의 표준 상업 화합물을 사용하였다. 구체적으로 GAGs의 정량화를 수행하기 위해 사용한 표준은 다음과 같았다: 히알루론산의 경우 히알루론산 칼륨염(SIGMA, Ref: 53750); 콘드로이틴 설페이트의 경우 콘드로이틴 설페이트 나트륨염(SIGMA, Ref: C4384); 데르마탄 설페이트의 경우 데르마탄 설페이트 나트륨염(SIGMA, Ref: C3788); 케라탄 설페이트의 경우 케라탄 설페이트(CHEMOS, Ref: 7295); 헤파린의 경우 헤파린 나트륨염(SIGMA, Ref: H8537); 그리고 헤파란 설페이트의 경우 헤파란 설페이트 나트륨염(SIGMA, Ref 51541).
사용된 각 GAG 표준에 대해 얻은 결과를 기반으로 본 샘플에 존재하는 GAGs의 정량화의 값을 얻었다.
GAGs의 효소적 소화를 수행하기 위해, 문헌에 기술된 방법은 다음과 같았다(Mahoney et al ., 2001). 이러한 취지로, 각각의 GAG의 소화에 특이적인 효소들을 사용하였다.
히알루론산의 경우, 히알루로니다아제(SIGMA, Ref: H3506)를 사용하였고; 콘드로이틴 설페이트의 경우, 콘드로이티나제(SIGMA, Ref: C2780)를 사용하였고; 데르마탄 설페이트의 경우, 콘드로이티나제 B(SIGMA, Ref: C8058)를 사용하였고; 헤파린의 경우, 헤파리나제 I(SIGMA, Ref: H2519)를 사용하였고; 헤파란 설페이트의 경우, 헤파리나제 I(SIGMA, Ref: H2519)를 사용하였고; 케라탄 설페이트의 경우, 케라타나제(K2876)를 사용하였다.
이들 효소들은 다음의 완충용액 10㎖에 상응하는 효소 440U를 재현탁시켜서 제조하였다: 100mM 인산염 완충용액(pH=7.77) 2㎖, 1M NaCl 770㎕, BSA 1mg 및 H2O 7.23㎖.
효소 농도가 160 U/㎖ 인 효소적 소화 완충 용액을 다음과 같이 제조하였다: 효소(2000 U) 4.5㎖을 소화 완충용액 7.5㎖, 1M NaCl 1.5㎖, 3M 아세테이트산 나트륨(pH= 5.2) 0.333㎖ 및 H2O 5.67㎖에 첨가하였다. 효소적 소화를 실시할 샘플과 표준을 다음과 같이 제조하였다: 소화 완충용액 500㎕(효소 80U)를 각각의 GAG에 대한 표준 500㎕에 농도 2mg/㎖로 첨가하였고, 그 결과 표준의 최종용액의 농도는 1 mg/㎖였다. 동일한 과정을 GAGs 샘플에 실시하였다: 소화 완충용액(효소 80U) 500㎕를 GAGs의 샘플 500㎕에 첨가하였다.
샘플을 37℃에서 1시간 동안 소화시켰고, 그런 다음 60℃에서 5분 동안 열 변성(thermal denaturation)에 의해 효소를 불활성시켰다.
소화를 실시한 다음, 샘플과 표준을 질량분석기로 분석하였다. 질량 분석기는 분석 대상 샘플에 존재하는 특정 이온의 질량-대-전하의 비율을 측정하는 실험적 방법이다. 이 질량분석기는 다음의 세 가지 기본 구성으로 이루어진다: 이온 소스(ion source), 질량 분석기(mass analyzer) 및 검출기. 분석 대상 샘플은 이온 소스에 의해 이온화되고, 이것은 질량 분석기에서 분리되어 질량 스펙트럼을 생성하도록 검출된다. 질량 스펙트럼에서 질량-대-전하 값이 특정 이온의 상대적 풍부함과 비교해 나타난다.
구체적으로, 본 실시예에서는, 다음과 같이 샘플을 질량 분석기에 주입하였다: 샘플 20㎕를 분당 0.2㎖의 흐름 속도로 질량/질량 검출기로 직접 주입하였다(Thermo LCQ 모델). 네거티브(음) 전기분사이온화법(ESI-) 방법을 사용하였고, 크로마토그램의 시간을 10분으로 설정하였다. 문헌(Mahoney et al ., 2001)에 따라, GAG 각각의 유형에 대해 인식된 사슬의 분자량에 해당하는 ±6 Da의 범위를 갖는 분자 이온들을 선택했다. 상기 이온들은 표준 GAGs의 샘플 및 분석 대상 샘플 모두에 여전히 존재했고, 그래서 샘플에서의 각 GAG의 존재를 정성적으로 입증하였다. 결과의 재현성을 보장하기 위해, 샘플과 표준을 각각 이중으로 중복하여(duplicate) 주입하였다.
다양한 GAGs의 정량화를 위해, 1mg/㎖에서 각각의 GAG에 대한 표준에 대하여 표준 선을 그렸다. 표준 선들을 만드는 데 사용된 표준 GAGs(히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트 및 케라탄 설페이트) 각각의 다음과 같은 농도에서 표준 선을 그렸다: 750㎍/㎖, 500㎍/㎖, 250㎍/㎖, 100㎍/㎖, 0㎍/㎖. H2O로 표준 선의 희석을 실시하였고, 효소적 소화 완충용액과 H2O를 동일한 비율로 함유하는 혼합물을 선의 0점으로 사용하였다.
본 발명의 생체재료에서 정량화의 결과들과 각각의 GAG의 비율은 다음과 같고, 생체재료의 기원이 자연발생적임을 감안할 때, 이것은 GAGs의 조성에 적은 변수들이 존재함을 암시한다(도 1):
히알루론산 70%
케라탄 설페이트 10%
콘드로이틴-6-설페이트 7%
헤파란 설페이트 5%
콘드로이틴-4-설페이트 4%
데르마탄 설페이트 3%
헤파린 1%
실시예 7. 생체재료에서 세포 잔존물( cell rests )의 존재를 결정하기 위한 조직학적 연구
본 발명의 생체재료는 자연발생적 GAGs의 조합물을 함유한다. 이 자연발생은 이들의 재생 효과 및 세포 활성에 대한 효과를 증진시킨다. GAGs의 구조와 그들간의 상호작용이 생리학적 조건에서 세포외 매트릭스에서 발견되는 방식과 유사하기 때문이다.
탯줄은 면역성이 높은 조직 유형이 아니다. 사실, 와튼 젤리에 함유된 줄기 세포의 이종 기원의 사용은 수많은 연구에서 치료법을 위해 고려된다. 또한 동맥과 정맥 시스템이 탯줄의 맥관구조로부터 발생된 연구들도 있는데, 이것 또한 이종 기원의 사용을 위한 것이다.
그러나, 본 발명의 생체재료에, 염증 반응을 일으키거나 또는 거부 반응을 일으킬 수 있는 세포와 세포 잔존물이 없다는 것을 보증하기 위해서, 헤마톡실린-에오신, 알시안 블루 및 메틸 그린-피로닌 조직학적 염색을 수행하였다(도 2).
헤마톡실린-에오신: 이것은 조직학적 차원에서 가장 널리 사용되는 조직화학적 염색제다. 이것은 세포와 세포의 구성물들을 관찰할 수 있게 해준다. 헤마톡실린은 세포의 산 성분, 특히 핵산에 대한 친화성을 나타내고, 에오신은 염기성 부위에 대한 친화성을 나타내어, 세포질을 관찰할 수 있게 해준다. GAGs 샘플의 제제(도 2B)를 염색하였고, 세포의 확장물(extensions)을 양성 대조군으로 사용하였다(도 2A).
다음과 같은 방법으로 헤마톡실린-에오신 염색을 수행하였다: GAG의 샘플을 멸균 면봉을 사용하여 슬라이드 위에 확장시켰다. 그리고 확장물을 적어도 24시간 동안 건조시키기 위해 방치하였다. 슬라이드가 건조된 후, 확장물들을 70% 메탄올로 5분 동안 고정시켰다. 5분 후, H2O로 세척하여 고정액을 제거하였다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 3분 동안 염색하였다(PANREAC, DC Harris 헤마톡실린 용액). 그런 다음, H2O로 세척하여 과량의 염색제를 제거하였다. 모든 슬라이드를 0.5% HCl을 함유하는 H2O에 통과시켜 염색제의 비특이적 결합을 제거하였다. 슬라이드를 H2O로 세척하였다. 이 슬라이드들은 30초 동안 에오신(H2O에 0.5%)으로 염색하였다. 슬라이드를 H2O로 세척하여 에오신 초과량을 제거하였다. 플루오로마운트-G 장착 배지(Fluoromount-G mounting medium)(SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01) 여러 방울을 슬라이드에 떨어트린 후, 슬라이드 덮개를 씌워 현미경 아래서 관찰하였다.
헤마톡실린-에오신 염색 결과(도 2, 영상 A 및 B)는 분석한 GSGs의 샘플에 세포들의 부재함을 나타낸다.
알시안 블루: 알시안 블루는 주요 양이온성 염색제 중 하나이고(분자상태에서 양전하를 띈다), 프로테오글리칸의 일부를 형성하는 설페이트, 포스페이트 또는 카보네이트라디칼을 함유하는 다당류의 음전하를 갖는 부위에 결합된다. 이러한 정전기적 결합은 배지의 pH에 좌우된다; 중성 pH에서, 알시안 블루 염색제는 중성 라디칼을 가진 프로테오글리칸에 결합되고; 산성 pH에서, 염색제는 설페이티드 프로테오글리칸에 결합되고; 그리고 염기성 pH에서, 염색제는 포스페이트 프로테오글리칸에 결합된다. pH가 1일 때, 알시안 블루는 와튼 젤리의 GAG의 일부를 형성하는 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 헤파란 설페이트 및 케라탄 설페이트를 함유하는 약하거나 강하게 설페이티드화된 프로테오글리칸에 결합된다. GAGs 샘플의 제제(도 2F)를 염색하였고, 세포의 확장물을 대조군으로 사용하였다(도 G2 E).
본 실시예에서 다음과 같은 방법으로 알시안 블루 염색을 수행하였다:
GAG의 샘플을 멸균 면봉을 사용하여 슬라이드 위에 확장시켰다. 그리고 확장물을 적어도 24시간 동안 건조시키기 위해 방치하였다. 슬라이드가 건조된 후, 확장물을 70% 메탄올로 5분 동안 고정시켰다. 5분 후, 1X PBS로 세척하여 고정액을 제거하였다. 슬라이드를 0.1N HCl(pH=1)에 5분간 담가 두었다. 그런 다음 0.1N HCl(pH=1)에서 2시간 동안 1% 알시안 블루로 염색시켰다. 이 슬라이드들을 0.1N HCl에 5분간 담갔다가, 그 직후 H2O로 세척하여 과량의 염색제를 제거하였다. 플루오로마운트-G 장착 배지(SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01) 여러 방울을 슬라이드에 떨어트린 후, 슬라이드 덮개를 씌워 현미경 아래서 관찰하였다.
알시안 블루를 이용한 염색의 결과들(도 2, 영상 E 및 F)은 생체재료의 분석 샘플에서 GAGs가 존재함을 나타낸다.
메틸 그린- 피로닌: 이 염색은 조직에 포함된 핵산의 조직학적 조사를 위해 사용되고 뿐만 아니라 림프 세포 및 원형질 세포의 존재를 입증하기 위해 사용된다. 또한 조직 단면과 세포학적 제제에서 원형질 세포 및 RNA의 동정에 유용하다. 피로닌은 원형질 세포의 세포질과 핵소체를 빨갛게 염색시킨다. 메틸 그린은 DNA를 파란빛 도는 초록(자주색)으로 염색시킨다. GAGs 샘플의 제조물들을 염색하고(도 2D) 세포의 확장물을 대조군으로 사용하였다(도 2C).
본 실시예에서 다음과 같은 방법으로 메틸 그린-피로닌 염색을 수행하였다:
각각의 GAG 샘플을 멸균 면봉을 사용하여 슬라이드 위에 확장시켰다. 그리고 확장물을 적어도 24시간 동안 건조시키기 위해 방치하였다. 슬라이드가 건조된 후, 확장물은 70% 메탄올로 5분 동안 고정시켰다. 5분 후, H2O로 세척하여 고정액을 제거하였다. 슬라이드를 0.1N HCl(pH=1)에 5분간 담가 두었다. 그런 다음 메틸 그린-피로닌(H2O에 0.012% 메틸 그린, H2O에 0.01% 피로닌, 0.75% 메탄올)으로 5분간 염색하고, H2O로 세척하여 과량의 염색제를 제거하였다. 플루오로마운트-G 장착 배지(SOUTHERN BIOTECH, Ref: 0100-01) 여러 방울을 슬라이드에 떨어트린 후, 슬라이드 덮개를 씌워 현미경 아래서 관찰하였다.
메틸 그린-피로닌으로 염색한 결과(도 2, 영상 C 및 D)는 분석된 GAGs 샘플에 핵산의 부재함을 나타낸다.
도 4의 영상에서 볼 수 있듯이, 세포 또는 핵산 잔유물 모두 본 발명의 생체재료에서 볼 수 있다. 그러나 GAGs의 존재는 개발된 생체조직에서 알시안 블루 염색에 의해 관찰될 수 있다.
실시예 8. 본 발명의 생체재료에서 여러 세포 유형의 독성
이식에 사용될 수 있는 생체재료 또는 조직 공학용 매트릭스로서 사용될 수 있는 생체재료에 대한 주요 필수조건은 세포 내 독성의 완전한 부재이다.
본 발명의 생체재료가 독성 작용을 일으키지 않음을 검증하기 위해, 세포독성은 본 발명의 생체재료에 배열된 세포들에 대해 MTT 방법(Roche Diagnostics)으로 결정하고, ECVAM(유럽 대안적 방법의 유효성 인증 센터)에 의해 유효성을 입증하였다. 피부 각질형성세포와 섬유 아세포, 골 조골세포, 연골 연골세포 및 지방 세포-유래 간엽 줄기 세포뿐만 아니라 ISO 10993에서 L929 독성 분석을 위해 지목된 세포주(cell line)와 같은, 사용된 세포 유형들은 생체재료가 표적으로 삼는 질병과 연관되어 있다.
MTT 분석은 특정 기질을 다른 2차 대사 산물로 변형시키는, 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소의 능력에 기반을 둔 것이다. 형성된 화합물의 양은 미토콘드리아 탈수소효소의 활성에 의해좌우되고, 이 화합물의 양은 배양조직에 존재하는 생균(viable cell)의 수를 명확히 나타내는 지표이다.
구체적으로, 이 미토콘드리아 검사, 세포 확산 키트 I (MTT) Cat. No. 1 465 007 Roche는 세포 미토콘드리아 디하이드로게나제 숙시네이트에 의해 수행되는 (노란색) 테트라졸리움 염의 불용성 (파란색) 포르마잔 결정으로의 변형을 결정한다. 세포들은 추후에 투과가능해졌고, 형성된 결정들은 용해되었고, 이로써 파장이 550nm일 때 ELISA 마이크로플레이트 리더기(ELISA microplate reader)로 흡광도를 측정함으로써 정량화될 수 있는 유색 용액이 생성되었다. 얻은 결과들은 도 4에 나타내었다.
순차적 과정은 다음과 같다:
1. 세포를 부착-방지 96-웰 플레이트에 생체재료 50㎕와 함께 시드하였고, 각각의 웰의 밀도는 세포 유형에 따라 웰 1개당 2000~5000 개였다. 각각의 세포 유형과 관련해 적절한 세포 농도는 사전에 결정된 바 있다. 섬유 아세포, 조골세포, 연골세포 및 지방세포-유래 간엽 줄기세포 및 인간 기원의 제1차 배양조직으로부터의 모든 세포를 웰 1개 당 세포 4000개의 농도로 시드하였다. L929 마우스 섬유 아세포주를 웰 1개당 세포 200개의 농도로 시드하였고, 제1차 배양조직의 인간 피부로부터 얻은 각질형성세포를 웰 1개 당 세포 5000개의 농도로 시드하였다.
2. 세포 독성 분석을 시작하기에 앞서 배양조직을 37℃에서 24시간 방치하여 5% CO2로 안정화시켰다. 이 분석에는 양성 대조군(세포+배지+세포독성을 일으키는 공지의 물질, 이 경우에는, 폴리비닐 폴리클로라이드, 즉 PVC를 사용하였다)과 대조군(세포+표준 배양 배지), 그리고 본 발명의 생체재료와 접촉하는 세포들을 포함시켰다.
3. 이들의 측정을 수행할 때까지 절차에 표시된 시간 동안 인큐베이터에서 37℃로 인큐베이션하도록 방치하였다. 이 경우 방치 시간은 접촉 후 24시간, 48시간 및 72시간이었다.
4. 인큐베이션이 끝난 후, MTT 용액(0.5 mg/ml) 10㎕를 각각 배지 100㎕가 든 각각의 웰의 배양조직에 첨가하였다. 그리고 이것을 인큐베이터 안에서 4시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다.
5. 인큐베이션이 끝난 후, 세포 내에 존재하는 포르마잔 결정을 관찰할 수 있다. 각각의 배양조직 또는 각각의 웰에 가용성 용액 100㎕를 첨가하였다. 그리고 인큐베이터에서 37℃로 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이에 따라 세포는 투과성이 되고, 결정들은 이와 같이 지시 대로 가용화제 100㎕로 가용화시켜, 쉽게 정량화할 수 있는 유색 용액으로 만들었다.
6. 결정이 가용화 된 후, 550nm에서 ELISA 리더기로 플레이트를 읽었다. 검침 전, 플레이트의 아래 표면을 에탄올로 씻는 것이 바람직하다.
도 4에서 관찰할 수 있듯이, 본 발명의 생체재료는 검사 대상인 세포주 어느 것에도 독성효과(toxic effect)를 일으키지 않았고, 대조군과 관련해 별다른 차이가 없었다.
실시예 9. 골관절염 치료를 위한 주입 가능한 형태의 본 발명의 생체재료의 용도
골관절염에서 본 발명의 생체재료의 치료 효과의 생체 내 평가를 위하여, 실시예 3에서 얻은 하이드로겔을 사용하였다. 200cS의 점도를 제공하기 위해 이 하이드로겔을 주입 가능한 생리학적 혈청 용액 8㎖에 재현탁시켰다. 실험 모델로 무릎 중 하나에 전방 십자 인대를 절제한 토끼를 사용하였다. 이 인대 절제는 측면 관절 절개술로 실시했다. 그런 다음, 그 무릎을 불안정하게 만들기 위해, 몇 달에서 몇 주에 이르는 기간을 기다렸고, 그 기간 동안 골관절염과 유사한 연골의 미란(erosions)이 발생했다. 아울러, 무릎에 관절 절개를 하지 않은 동물들을 대조군으로 사용하였다.
부상당한 관절 표면을 세척 및 관절경 수술에 의한 괴사 조직 제거로 처치하고 상처부위를 본 발명의 주입 가능한 생체재료로 덮었다. 생체재료를 바르고 4주 후, 실험 동물을 희생시켜 연골을 추출하였다. 얻은 연골을 추후의 조직학적 처리를 위해 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 조직학적 단면을 얻기 위해, 샘플을 파라핀에 포함시켰고, 이러한 목적을 위해 5분 동안 50, 70, 90 및 100% 알코올에서 유지시켰다. 이어서 샘플들을 5분 동안 시트로솔에 놓아두었고, 그 후 고체 덩어리를 얻을 때까지 파라핀에 넣어 두었다. 마이크로톰을 사용해 조직학적 단면 5㎛를 얻었고, 이 단면들을 사용하여 조직학적 염색 및 면역라벨링(immunolabeling)을 수행하였다.
면역조직화학적 기법에 의해 조직학적 단면에서 연골의 세포외 매트릭스의 서로 다른 표식들을 분석하였다. 연골의 세포외 매트릭스의 특이적 분자들과 연구 대상 분자 표식들은 타입 II 콜라겐, 케라탄 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트 및 콘드로이틴-6-설페이트였다. 모노클로날 항체를 사용하여 면역라벨링을 수행하였다. 조직 단면의 라벨링에 사용된 기법은 직접적인 면역라벨링으로, 플루오로크롬으로 표지된 단클론 항체를 사용하였다. 공초점 현미경 검사를 사용하여 라벨링을 관찰하였다.
얻은 결과들은 생체재료가 다음과 같은 이유로 상처 입은 연골의 재생을 일으킴을 입증하였다:
-주입 가능한 생체재료는 이식된 후 독성을 일으키지 않았다. 예를 들면, 조직학적 단면에서 육안 또는 현미경으로 염증 현상이 관찰되지 않았다.
-생체재료는 이식 부위 중 회복되고 저지되어야 할 상처의 기하학적 형태 및 크기에 알맞았다.
- 이식 부위 옆의 건강한 조직의 세포들의 표현형(phenotype)의 변화가 관찰되지 않았다.
- 이식 부위에서 II형 콜라겐과 같이 연골 특이성 세포외 매트릭스 분자의 존재는 원조직의 세포외 매트릭스와 동일한 수준의 새로운 세포외 매트릭스의 형성으로 재생 과정의 시작을 보여준다.
- 이식 부위에서 연골세포의 존재가 관찰되었다. 이것은 세포 이동, 부착 및 증식의 자극을 나타낸다.
- 이러한 사실들은 본 발명의 생체재료가, 연골 회복의 어떤 조짐도 보이지 않은 대조동물군에서와 달리, 연골 결손의 재생을 촉진함을 입증하였다.
실시예 10. 3차원 생체재료의 용도
실시예 5에서 얻은 본 발명의 고체 생체재료는 만성 궤양 치료에 효과적인 드레싱에 필요한 특징들을 대부분 갖고 있다. 이런 점에서, 만성 궤양에서의 치료 효과를 평가하기 위해, 스위스 알비노 마우스를 사용하여 생체내 실험 연구를 실시하였다. 이 마우스의 등 부위의 약 3cm2에 열 마찰을 일으켰다. 동일한 유형의 상처를 입었으나 시판 중인 히알루론산겔로 치료를 받은 동물을 대조군으로 사용하였다.
본 발명의 생체재료의 적용을 위해, 유도된 상처의 표면을 세척, 소독, 외과적 괴사조직 제거에 의해 준비하였고, 그러고 나서 성형가능한 본 발명의 고체 생체재료로 깊게 그리고 얇게 상처 부위를 덮고 채웠다. 생체재료를 놓고 15일 후, 실험 동물을 희생시켜 상처 부위를 적출하고 추후 조직학적 검사를 위해 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 이런 처리과정을 위해, 샘플을 파라핀에 넣어두었고, 이를 위해 50, 70, 90 및 100% 알코올에 5분 동안 유지시켰다. 이어서 샘플을 시트로솔에 5분간 넣어두었고, 고체 덩어리를 얻을 때까지 파라핀에 넣어두었다. 마이크로톰을 사용하여 조직학적 단면 5㎛를 얻었고, 이 단면들을 사용하여 조직학적 염색 및 면역라벨링을 수행하였다.
5 및 10 케라틴과 같은 다양한 표피 표현형 표지자(epidermal phenotype markers), 인볼루크린 및 로리크린과 같은 분화 표지자(differentiation markers), 비멘틴과 같은 진피 표지자, 그리고 라미닌과 같은 매트릭스의 구성성분들을 면역조직화학적 기법에 의해 조직학적 단면에서 분석하였다. 조직 단면을 라벨링하는 데 사용되는 이 기법은 직접적인 면역라벨링으로, 플루오로크롬으로 표지된 모노클로날 항체를 사용한다. 이 라벨링은 공초점 현미경 검사에서 관찰하였다.
얻은 결과들은 본 생체재료가 다음과 같은 이유로 궤양의 재생에 효과적이었다고 입증하였다:
-상처에 적용된 생체재료는 면역학적으로 불활성이고 독성의 조짐이 전혀 나타나지 않았다.
-생체재료는 회복되어야 할 상처의 기하학적 형태 및 크기에 알맞았고, 상처 부위를 깊고 그리고 얇게 완전히 덮었다.
- 생체재료는 지혈 현상을 촉진하였고, 이것은 치유 과정의 시작을 알리는 신호이다.
- 치유 과정이 진행됨에 따라, 생체재료는 분해되었고, 진피-표피 구성성분들로 대체되었다.
- 조직학적 단면들은 생체재료가 섬유 아세포와 각질형성세포의 이동 및 증식을 유도했고, 이것이 단면 내에서 지속됨을 입증하였다.
- 본 발명의 생체재료는 대조군 동물과 관련하여 효과가 두 배 더 뛰어난 상처 치유를 유도했고, 게다가 흉터의 새 조직은 본 발명의 생체재료를 적용하지 않은 동물에서의 흉터 조직보다 품질이 훨씬 뛰어났다.
Figure 112011027155231-pct00001
Figure 112011027155231-pct00002
Figure 112011027155231-pct00003

Claims (27)

  1. 인간 탯줄(human umbilical cord)의 와튼 젤리의 추출물을 포함하는 하이드로겔 형태의 생체재료로서, 상기 추출물은 히알루론산, 케라탄 설페이트, 콘드로이틴-6-황산, 헤파란 설페이트, 콘트로이틴-4-설페이트, 데르마탄 설페이트 및 헤파린으로 구성되는 글리코사미노글리칸들(GAGs)의 혼합물로 이루어지고, 그리고 상기 추출물은 와튼 젤리에 원래 존재하는, 인간 탯줄 막, 혈관 및 세포가 없는 것인 생체재료.
  2. 제1항에 있어서, 생체재료가 히알루론산을 GAGs의 총 혼합물의 65~75 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  3. 제1항에 있어서, 생체재료가 케라탄 설페이트를 GAGs의 총 혼합물의 5~15 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  4. 제1항에 있어서, 생체재료가 콘드로이틴-6-설페이트를 GAGs의 총 혼합물의 6~8 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  5. 제1항에 있어서, 생체재료가 헤파란 설페이트를 GAGs의 총 혼합물의 3~7 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  6. 제1항에 있어서, 생체재료가 콘드로이틴-4-설페이트를 GAGs의 총 혼합물의 2~6 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 생체재료.
  7. 제1항에 있어서, 생체재료가 데르마탄 설페이트를 GAGs의 총 혼합물의 1~5 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  8. 제1항에 있어서, 생체재료가 헤파린을 GAGs의 총 혼합물의 0.1~2 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  9. 제1항에 있어서, 히알루론산 70 중량%, 케라탄 설페이트 10 중량%, 콘드로이틴-6-설페이트 7 중량%, 헤파란 설페이트 5 중량%, 콘드로이틴-4-설페이트 4 중량%, 데르마탄 설페이트 3 중량% 및 헤파린 1 중량%을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  10. 제1항에 있어서, 하이드로겔은 10~15,000 cS의 점도를 갖는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  11. 제10항에 있어서, 10~2,000 cS의 점도를 갖는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  12. 가교된, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 생체재료를 포함하는 3차원 구조 생체재료.
  13. 제12항에 있어서, 15,000 cS보다 더 큰 점도를 갖는 것을 특징으로 하는 3차원 구조 생체재료.
  14. 제12항에 있어서, 구멍 직경이 0.5~1000㎛인 다공성 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 3차원 구조 생체재료.
  15. 제14항에 있어서, 구멍 직경이 0.5~500㎛인 것을 특징으로 하는 3차원 구조 생체재료.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 와튼 젤리에 원래 존재하는 것이 아닌 세포를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생체재료.
  17. 제12항에 있어서, 와튼 젤리에 원래 존재하는 것이 아닌 세포를 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 구조 생체재료.
  18. 제16항에 있어서, 상기 세포가 미분화된 간엽 줄기세포 또는 다른 세포주로 분화된 간엽세포; 미분화된 조혈 줄기세포 또는 다른 세포주로 분화된 조혈 줄기세포; 연골세포, 연골모세포, 조골세포, 골세포, 각질형성세포, 섬유 아세포, 근육세포, 지방세포, 뉴런, 신경계로부터의 다른 세포, 백혈세포계로부터의 세포, 각막세포, 내피세포 및 상피세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체재료.
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  20. 삭제
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  22. 연조직의 리모델링, 충전 또는 재건, 잔주름, 주름과 흉터, 화상, 궤양, 연조직 확대, 얼굴 지방위축증, 추간판 탈출증의 치료 그리고 연골, 근골격계 부상, 골관절염 및 주위관절염의 회복; 종양, 질 질환, 뇌 손상의 치료, 골수 회복(repair), 퇴행성 뇌신경질환, 심혈관질환 및 윤활 작용; 화상, 궤양 및 진피-표피 결함의 치료, 안과 질환의 치료; 골관절계의 치료, 그리고 질 질환의 해결에서 애쥬번트, 치은염 및 치주염의 치료를 위한, 또는 세포 배양 시스템의 발생(development)에서의 사용을 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 생체재료.
  23. 제22항에 있어서, 상기 안과 질환은 각막 손상, 망막 손상 또는 백내장인 생체재료.
  24. 제22항에 있어서, 상기 골관절계는 연골 회복, 골연골 결손, 골관절염 또는 골 결손인 생체재료.
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