CN102176881A - 来自人脐带的脐带胶质的新生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种由脐带的细胞外基质形成的生物材料(尤其是水凝胶)在再生医学中的应用。本发明尤其涉及一种由糖胺聚糖组成的生物材料及其制备方法和用途，所述糖胺聚糖专有地从脐带的脐带胶质(其任选的包含细胞)分离。

Description

来自人脐带的脐带胶质的新生物材料

发明技术领域

本发明涉及一种由脐带的细胞外基质形成的生物材料(尤其是水凝胶)在再生医学中的应用。本发明尤其涉及一种由糖胺聚糖组成的生物材料及其制备方法和用途，所述糖胺聚糖仅从脐带的脐带胶质(Wharton′s jelly)(其任选的包含细胞)分离。

发明背景

由多聚体形成的生物材料在再生医学中起着重要作用，因为它们为移植细胞的粘附、增殖和分化提供暂时的三维锚定。这种三维性质为细胞间的联系以及细胞与生物材料组分之间的关系提供合适的平台。基质和细胞之间随时间的生物相互作用决定了细胞的增殖能力，它们组构起来形成新的组织，它们的分化以及分泌指导再生过程的信号(Dawson等，2008)。

为了产生这些现象，需要将生物材料在应用部位保持有限的时间直至其重吸收，维持其结构足够长的时间以便得到具有再生效果的合适细胞作用。

生物材料的特定类型，水凝胶，具有许多使其适用于组织工程的特性。

水凝胶是由具有天然或合成性质的交联亲水聚合物形成的结构，具有在其结构内包含大量水的能力，是其自身重量的10-20％直至数百倍。这些凝胶显示半固体形态，其三维点阵使其成为形成充当支持物的结构基质的理想候选物。这些三维结构可以通过物理交联和化学交联形成。物理交联产生可逆的水凝胶，其结构根据最后的应用可以逆转，而化学交联产生固定的水凝胶，其结构在整个应用过程中都被维持(Coburn等，2007)。因此，水凝胶是采用三维网络形式交联的聚合材料(具有天然或合成的性质)，其在接触水时膨胀，形成软的弹性材料，并且在它们的结构中保留其大部分组分而无溶解。

水凝胶具有一系列特性，诸如：

1.亲水性：归因于它们的结构中存在水溶性基团(-OH，-COOH，-CONH₂，-CONH，SO₃H)。它们具有类似于活组织的高含水量(Elisseeff等，2005)。

2.不溶于水：归因于它们结构中三维聚合物网络的存在。

3.它们具有光滑和弹性的稠度，这是由亲水起始单体和多聚体的低交联密度决定的。

它们有能力在存在水或水溶液时膨胀，显著增加它们的体积直至达到化学-物理平衡，但不失去它们的形状。这种膨胀能力提供与细胞在软组织中遇到的基本相当的水性微环境。水和多孔结构的存在还允许低分子量溶质和营养物(毒鱼细胞活性是重要和必要的)的流动，以及将细胞废料输送到水凝胶外(Torres等，2000)。

脐带是含有重要细胞组分的高度血管化结构。细胞和血管系统被整合到称为脐带胶质(WJ)的凝胶状结缔组织中。WJ包含少量的细胞和高水平的细胞外基质，其主要由胶原，透明质酸和硫酸化的糖胺聚糖组成。

糖胺聚糖(GAG)，也称为粘多糖，是杂多糖，发现其在生物体中结合称为蛋白多糖的蛋白细胞核形成大分子。这些可以发现于细胞表面或细胞外基质中，并行使细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用的重要功能。它们采取硫酸化和非硫酸化的形式，这些分子的常见特性是由两种不同的糖形成的二糖重复序列的组成；其中一种通常是己糖醛(hexuronato)，而另一种是己糖胺。二糖键合以及硫酸化位置的结构变化导致这些链物理和化学性质多样性的增加。高硫酸化的含量和糖醛酸的存在给GAG提供大的负电荷，所以WJ中的大量GAG使得该组织被极度水化。

存在数种类型的GAG，其直接参与基本细胞功能，不仅归因于它们的结构，还因为它们是数个细胞信号转导分子的锚定位点。

透明质酸是WJ中最丰富的GAG。它是GAG家族中唯一非硫酸化的成员，其在体内的功能就像游离的碳水化合物，其结构由二糖：D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-葡糖胺的重复组成(Goa等，1994；Laurent等，1992)。它由数种细胞类型合成，并被分泌入细胞间隙，在那里它与细胞外基质的其他组分相互作用来产生围绕细胞的支持和保护结构(Collins等，2008)。它是大的多聚阴离子线性聚合物，单个分子可以具有100,000到5.106Da的分子量(Toole等，2004；Bertolami等，1992)。它具有吸收大体积的螺旋结构，产生高粘度溶液。透明质酸的单个分子彼此结合，形成网络或点阵。在形成组织时，透明质酸被认为是参与细胞增殖和迁移的主要结构大分子。

透明质酸已经参与数个过程，诸如血管化，形态发生，细胞外基质的整体完整性和修复。已知羊水中包含的大量透明质酸有利于胎儿伤口的修复(Longaker等，1989)。还可以观察到在健康皮肤和疤痕之前其分子性质的变化，正常疤痕的透明质酸当然不同于肥大性疤痕的透明质酸(Ueno等，1992)。

硫酸软骨素是由D-葡糖醛酸二聚体和N-乙酰半乳糖胺重复形成的线性聚合物。已经在针对关节疾病的疗法中检测了其有效性，通过抑制导致软骨组分的基质降解的酶的活性。它还作为抗炎药，通过抑制补体，并可用于在手术和眼科诊所中治疗血栓栓子的病症。

硫酸皮肤素，也称为硫酸软骨素B，是一种有效的抗凝剂，归因于其通过肝素辅因子II对凝血酶的选择性抑制作用，在体内非常有效，因为其更低的出血风险(Trowbridge等，2002)。

通常糖胺聚糖，尤其是肝素，具有调节血浆级联活性的能力，增强内在凝结途径的抑制并在不同点抑制典型的补体激活途径(Rabenstein，2001)。肝素的其他已知功能是血管发生的抑制，体液生长及其抗病毒活性。

硫酸类肝素具有与肝素密切相关的结构。它在动物组织中广泛分布，在其功能中，细胞粘附和细胞增殖的调节是最显著的。它具有抗蛋白降解的保护作用，调节它们输送通过基底膜以及干涉其内化(Rabenstein，2001)。

存在数篇涉及获自人或动物来源的粘多糖的专利文献。文献US3,887,703涉及获自牛或绵羊的胎畜的皮肤皮层和脐带的粘多糖混合物。使用脐带的唯一实例是1-9个月大的牛的胎畜，它没有提及膜或血管被去除，因为第一步操作是在10℃研磨。形成混合物的单独粘多糖或存在的量没有被提及；通过混合物中存在的己糖胺的量鉴定活性产物。利用提取物制备用于治疗油性头皮和毛发以及炎症的注射用和口服摄入形式的组合物。

专利文献US 5,814,621涉及一种基本上由与水相比更溶于有机溶剂-水混合物的药物组成，并且粘多糖构成药物的一部分，其中药物的晶体或颗粒分布在粘多糖颗粒的表面，并且与其的单独形式相比，所述药物更快的溶于水。所述组合物可以采用颗粒形式。

专利申请WO 2008/021391 A1描述了包括脐带膜的生物材料。此外，它还包括一种或更多种脐带血管和/或脐带胶质。生物材料优选的是干燥的，可以是平板状、管状或塑形为适合特定的结构。本发明还提供制备包括至少单层脐带膜的生物材料的方法，以及获得所述生物材料的方法及其用于修复组织或器官的用途。

说明书表征了来自脐带的生物材料。它描述了所述材料的组成包括胶原(I、III和IV型，这些占生物材料基质的75-80％)，纤连蛋白和糖胺聚糖。

它还提及生物材料还可以包括不是来自脐带的胶原，并具有商品化来源，或已经利用该领域当前水平已知的方法将其从其他组织分离。作者还补充了生物材料可以包括非结构的化合物诸如生长因子，激素，抗生素，免疫调节因子，等等。

西班牙专利ES 8600613描述了以下方法：用于治疗机体组织，用于分离细胞膜，核酸，脂类和细胞质组分以及形成细胞外基质，其主要组分是胶原，和用于制备适于用做机体移植物的机体组织，包括用至少一种去污剂提取所述组织并且同时将其维持为适于将其移植到体内的大小与形状。

专利文献ES 2 180 653 T3描述了将生物材料转化为物质(其经历自溶作用以去除至少70％的细胞)的方法，以及处理所述材料以抑制其在移植入人或动物后矿化的方法。它要求起始生物材料可以是，尤其是，脐带；尽管它具体涉及猪的主动脉瓣。尽管如此，说明书没有包含涉及利用脐带实施的任何细节。使用获得的生物材料产生生物心瓣膜。

专利文献US4,240,794涉及制备人或其他动物脐带以用做血管替代物。该文献具体描述了将脐带在醇中脱水的技术，然后是将其固定为所需形态的方法。根据描述，一旦从脐带上清除其他组织的可能残留，就将其固定在轴柄上，浸于特定的乙醇溶液至脱水必需的时间。脱水后，将脐带浸入1％醛溶液进行固定。

专利文献FR2,563,727描述了一种从去程序化的结缔组织(用脐带胶质浸渍并保存于冷冻温度)制备皮移植片的方法。作者描述了一种锚定到脐带组织的装置，并通过注射压缩空气的插管将其膨胀。根据描述，然后将脐带切割并分离，但利用这种方法得到的产物不仅仅由WJ组成。

存在使用脐带获得感兴趣的细胞的专利文献，为了这个目的他们实施分离脐带胶质并将其去除的方法，从而获得所述细胞。例如，PCT文献98/17791描述从脐带分离前软骨细胞，其随后在治疗上用于产生软骨。类似地，在文献WO 2004/072273 A1中，从位于脐带血管周围区域内的脐带胶质提取祖细胞，用于修复人组织。

但是，没有下列文献：提及从位于人脐带的脐带胶质中的GAG形成的生物材料(不含人脐带膜和血管)，其可以形成适合用于不同的人病状所需的粘度特性等的水凝胶。

因此，本发明的生物材料仅仅由形成脐带的细胞外基质(称为脐带胶质-WJ)的GAG组成。细胞外基质是组织的复杂和特定生物物质。源自膀胱血管的细胞外基质完全不同于源自真皮的细胞外基质(Hiles & Hodde，2006)。因此，虽然从文献已知数个合成细胞外基质的尝试，但还没有实现模拟某一组织自然条件的精确组合物。

本发明开发的生物材料提供一种允许其用做组织工程的基质的三维结构，此外，当在疾病中直接使用或与细胞一起使用时，它参与再生过程，对组织自身的细胞发挥呼叫作用，并为细胞过程的活化提供良好的环境。

WJ的特征在于其包含非常低数量的细胞，但是，包含大量的细胞外基质(胶原和GAG)。换句话说，WJ中发现的细胞受到高度刺激，能够产生高水平的基质。这归因于以下事实：大量生长因子在WJ中聚集，包括转化生长因子β(TGF-β)，1型胰岛素样生长因子(IGF-I)，成纤维细胞生长因子(FGF)，表皮生长因子(EGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)。这些生长因子通过结合特定受体实现它们的细胞活性调节作用，其中一些位于组成WJ的各种GAG中。这些生长因子控制细胞增殖，分化和合成以及形成WJ的细胞外基质的重建。大量的合成基质提供高的机械抗性，弹性和高的水合能力，其用于阻止子宫收缩或胎动引起的血管阻塞(Sobolewski等，2005)。

与其他生物材料不同，本发明的生物材料由来自脐带WJ的不同GAG的组合组成。它主要由透明质酸组成，但此外，与其他GAG化合物不同，它包含硫酸皮肤素，硫酸类肝素，肝素，硫酸角质素，软骨素-4-硫酸盐和软骨素-6-硫酸盐。GAG的这种组合提高了生物材料的生物活性，因为它们中的每一种都发挥细胞行为的调节功能。例如，已知硫酸类肝素和肝素是FGF和EGF的主要结合部位(Kanematsu等，2003；Ishihara等，2002)，其保护它们免遭蛋白水解并允许细胞环境中这些因子的局部浓度，产生适合于大细胞活化的分子微环境(Malkowski等，2007)。

这种生物材料中存在的GAG组合提供许多特异性的信号转导分子结合位点，其允许在应用位点组织自身细胞的高度活化以便合成高水平的细胞外基质，其将再生和修复被治疗的缺陷。

此外，本发明生物材料的来源提供非免疫原性区域的人来源的自然结构，去除了掺入正常生理循环的那些，阻止动物来源的生物材料的反应或一些合成生物材料可能造成的副作用，诸如炎症，硬化(器官组织的硬化)，肉芽瘤的发病，粘膜坏死以及由用于其制备的有毒物质造成的组织并发症。

GAG在脐带中最重要的功能之一是提供强度、弹性和抗性以保护位于其中的血管系统免遭外部侵害。实际上，这些分子的合成缺陷涉及怀孕期间重要的病状(Gogiel等，2005)。获得由7种不同类型的GAG(能够成脐带的一部分)组成的生物材料将能够在它们的纤维之间形成交联，模拟生物体中存在的情况，从而提供类似于脐带给予的强度，弹性，抗性和收缩。

附图说明

图1：本发明生物材料中存在的GAG的表征和定量。

柱状图显示本发明生物材料中存在的不同类型的GAG，以及它们中每一种的百分比。HA：透明质酸，KS：硫酸角质素，C6S：软骨素-6-硫酸盐，HS：硫酸类肝素，C4S：软骨素-4-硫酸盐，DS：硫酸皮肤素，H：肝素。

图2：通过组织学染色对样品中存在GAG和不存在细胞和DNA/RNA的验证。

左图显示含有细胞的样品，右图显示单独的生物材料的染色。A、B：苏木素伊红染色；C、D：甲基绿焦宁染色；E、F：阿尔辛蓝染色。

图3：通过扫描电子显微术显示的本发明生物材料的内部三维结构的图像。

该图显示两种不同的放大率(A：10μm和B：5μm)下本发明生物材料的内部结构，其中可以观察到GAG单位彼此相连，提供非常均匀的多孔结构。

图4：本发明生物材料的细胞毒性研究的结果。

该图显示AMSC细胞(脂肪来源的间充质干细胞)(图A)，小鼠成纤维细胞(图B9)，L929(图C)，成骨细胞(图D)，软骨细胞(图E)和角质形成细胞(图F)的细胞毒性曲线。给出相对于对照(不含生物材料的细胞)和阳性对照(在根据ISO-10993标准确定的有毒生物材料PVC中的细胞)的结果。

从图中可以观察到，在任一被检测的细胞类型中生物材料都不造成毒性，因为放置在生物材料上的细胞的线粒体活性没有显示与对照细胞的差异(在标准培养条件下)。

图5：三维生物材料的显微图像

该图显示冻干后本发明固体生物材料的肉眼可见的三维结构，使用标准的24孔培养板作为模子。所述图像对应于在孔中固化的生物材料的量。

发明详述

脐带包含形成软结缔组织(称为WJ)的一部分的大量GAG(硫酸化和非硫酸化的)。在这些GAG中，主要的非硫酸化GAG是透明质酸(Hadidian等，1948；Jeanloz等，1950)，尽管还检测到更小比例的硫酸化GAG(Danishefsky等，1966)。此外，脐带的组织学研究表明肝素的存在(Moore等，1957)。还很有可能的是，脐带含有更多的仍未被识别的少量硫酸化GAG。

此处描述的本发明是一种由GAG组成的水凝胶，所述GAG仅仅从脐带的WJ获得。这种水凝胶完全不含人脐带(从其获得生物材料)的WJ中存在的细胞，所以它没有免疫原性成分。

生物材料由糖胺聚糖的混合物形成，所述糖胺聚糖选自：透明质酸、硫酸角质素、软骨素-6-硫酸盐、硫酸类肝素、软骨素-4-硫酸盐、硫酸皮肤素和肝素。

优选的发现生物材料形成下述组合和比例的GAG混合物：透明质酸(65-75％)、硫酸角质素(5-15％)、软骨素-6-硫酸盐(6-8％)、硫酸类肝素(3-7％)、软骨素-4-硫酸盐(2-6％)、硫酸皮肤素(1-5％)和肝素(0.1-2％)、更优选的GAG组合是：透明质酸(70％)、硫酸角质素(10％)、软骨素-6-硫酸盐(7％)、硫酸类肝素(5％)、软骨素-4-硫酸盐(4％)、硫酸皮肤素(3％)和肝素(1％)。

本发明还涉及由先前描述的水凝胶组成的生物材料，其任选的包含细胞。因为以下事实：生物材料具有与患病组织相同类型的健康细胞，在严重受损的组织或不可能通过患者原位细胞补充的组织的再生和组织修复过程中水凝胶的作用得到增强。其中，生物材料包含的细胞可以是：未分化的间充质干细胞或分化为另一种细胞株的间充质干细胞，干细胞未分化的造血干细胞或分化为另一种细胞株的造血干细胞，软骨细胞和成软骨细胞，成骨细胞和骨细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，肌细胞，脂肪细胞，神经元或来自神经系统的其他细胞，来自白血细胞系统的细胞，小鼠角膜细胞，内皮细胞或上皮细胞。

本发明被分为下面几个部分：(i)从脐带的脐带胶质获得GAG的提取物，(ii)从脐带的脐带胶质分离的GAG产生水凝胶，(iii)表征获得的水凝胶和(iv)生物材料的用途。

从脐带的WJ获得GAG的提取物

用于获得生物材料的方法包括下列步骤：

a.获得人脐带；

b.用盐溶液和抗生素处理脐带；

c.消除脐带表面的所有血液；

d.将脐带分为1-2cm的片段；

e.清除内部残留的所有血液；

f.清除脐带膜和血管；

g.分离包括脐带胶质的胶凝物质；

h.酶消化获得的胶凝物质；和

i.沉淀并分离GAG；

具体来说，进行下列步骤以从脐带的WJ分离糖胺聚糖：

获得脐带胶质

在分娩后立即收集脐带，将其进行处理或处理前在4℃保存，在所述条件下不应超过24小时。

为了处理，脐带优选的在II级生物安全的层流净化罩中无菌条件下放置。用含有抗生素混合物(青霉素、链霉素、两性霉素-B)的细胞培养基DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)溶液或磷酸盐缓冲液1X(1X PBS)和/或红细胞裂解缓冲液将其连续清洗至少3次，以完全去除血液残留。

一旦清除掉脐带表面的血液，将其转移到培养皿，分成1-2厘米的片段。将脐带切割为片段时，脐带血管内残留的血液有可能被释放，在这种情况下有必要彻底清洁脐带片段。

在结构水平上脐带具有两条脐带动脉和一条脐静脉，由WJ的坚固基质支持并覆盖薄膜。只是为了获得WJ，用机械方法去除膜和血管。为了这样做，将脐带片段纵向切开，利用手术刀和镊子小心去除脐带膜和血管。利用这种机械分离获得的胶凝物质是WJ。从25到200g脐带通常获得20-160g脐带胶质。

从脐带胶质提取GAG

使用文献(Rogers等，2006)描述通过木瓜蛋白酶(SIGMA，Ref：P-4762)的酶促消化从人软骨获得GAG的方案，其中做了一些改动，以从脐带的WJ获得GAG。

将之前获得的WJ在60℃浸润于10ml提取缓冲液(5mM L-半胱氨酸，100mM Na₂HPO₄缓冲液，5mM EDTA，10mg(14U/mg)木瓜蛋白酶，pH 7.5)中24-48小时以便完全消化。

一旦WJ被完全消化，将其离心以去除无用的消化残留物。在这个时间点，观察到消化体积大于初始体积。这种增加归因于WJ中存在的GAG的溶解，从而释放它们聚集的水。

样品一旦被离心，将上清转移到另一容器，然后沉淀出样品中存在的GAG。

从脐带的WJ沉淀和分离GAG

利用5倍体积的100％乙醇沉淀出WJ的GAG。通过这个步骤，样品的GAG以及其中存在的盐被沉淀析出。由于样品中存在的水分子与乙醇分子相互作用导致沉淀，这样的话水分子无法与样品的GAG相互作用，后者变得不溶于水，从而沉淀析出。因此，就在添加乙醇并振摇管子以后，观察到发白的沉淀。将GAG在-20℃静置12小时进行沉淀。一旦沉淀析出，将它们离心以去除100％乙醇，用5倍体积的75％乙醇清洗沉淀来去除可能残留的盐(它们沉淀析出在样品上)。将样品再离心一次以完全去除上清。

一旦沉淀出GAG的样品，将固体残留物在环境温度静置干燥至少30分钟，直至所有乙醇都被蒸发。一旦乙醇被蒸发，将GAG样品重悬于Milli-Q H₂O，并在4℃长期保存。

这类材料的机械抗性较低；它们不被考虑带有负载，除非它们与另一类型的复合材料或磷酸钙类材料组成，它们是为了在受损区域进行再生的生物活性作用。但是，组成该水凝胶的多糖分子间的最大亲和力使得它们维持彼此之间的高凝聚，保留在注射部位并具有胶粘性质。

交联：获得水凝胶

存在需要更具抗性和耐久的生物材料的其他治疗应用，所述生物材料具有允许来自应用部位相邻组织的细胞或在其移植前排列在生物材料上的细胞形成集落的内部结构。在这种情况下，本发明的生物材料将作为生物活性三维基质来诱导组织伤口的治愈和修复。

透明质酸，软骨素-6-和-4-硫酸盐，硫酸角质素，硫酸皮肤素，硫酸类肝素和肝素调节细胞活性和并活化新细胞外基质的合成。生物材料中存在的GAG的多样性允许大量对生长因子(调节细胞增殖和分化过程，以及细胞合成新的细胞外基质和生长因子的能力)特异的结合位点的存在。这种作用在患病组织中引起更强的应答能力，并加速再生，就极度退化的区域来说(就像慢性溃疡的情况)甚至允许治愈。

为了生物材料能够被用作三维基质，GAG的提取物必须稳定，增加其机械性能并允许形成三维结构。为了实现这些目标，可以将GAG化学修饰或交联以形成固体水凝胶形式的材料。这些化学修饰通常包括醇或羧基。

为了获得稳定和固体的水凝胶，必须让样品经历交联反应(交联、聚合)。这一过程包括水溶性聚合物的链变为不溶性的(Elisseeff等，2005)。

通过交联获得的水凝胶具有独特的性质，使得它们能够用于组织工程：用于携带营养物或废物的高含水量，弹性以及在3D微环境下原位包裹或固定细胞的能力。交联密度直接影响水凝胶的孔径大小，从而影响其物理特性，举例来说诸如含水量或机械抗性。具有大交联密度进而非常小的孔径的水凝胶将吸收更少的水份，比具有更低交联度和大孔径的水凝胶具有更大的机械抗性。

通过交联的水凝胶形成可以通过数种方法进行：温度变化，化学反应和光聚合作用。

在本发明中如下进行交联反应：获得待交联的多聚体的水溶液(本实例中是GAG的水溶液)，添加将促成交联的化学试剂。在本实例中，为了制备水凝胶，使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)，因为EDC活化水溶液中的羧基。这些活化的羧基能够与伯胺或羟基反应，产生酰胺或酯键。一旦形成水凝胶，将其用PBS清洗数次以去除可能剩余的EDC残留物。如此制备GAG分子以吸收大量水份，形成具有固体和多孔外观的水凝胶(Pieper等，1999；Wissink等，2001)。

交联过程中在为了所述目的设计的模子中具有特定形状和大小的水凝胶固化，这样的话所需的形状和大小取决于使用的模子。

可以通过称为冻干的方法干燥固体水凝胶从而获得多孔结构，这归因于水凝胶中存在的GAG分子间插入的水分子的去除(图5)。此外，一旦生物材料被冻干，可以通过扫描电子显微术(SEM)表征水凝胶的三维结构(图3)。通过冻干法将获得的固体水凝胶冷冻，一旦被冷冻，将其放入真空室以便通过称为升华的过程去除水。实质上通过各种冷冻循环去除了初始水凝胶包含的所有自由水。

一旦获得其最终形状的水凝胶，通过暴露于紫外线将其灭菌40分钟。水凝胶上进行的无菌试验显示生物材料被彻底灭菌。

一旦被灭菌，水凝胶就是最终的产品形式，准备好直接应用或与细胞联用。

利用本发明水凝胶的细胞结合测定证明所述生物材料不造成对细胞的毒性作用，其增殖能力类似于标准培养条件下存在的增殖能力(图4)。

生物凝胶的用途

本发明的生物材料(与细胞组合的形式或单独的形式)可以采用其注射用形式用于关节系统疾病和美容治疗。其中，可以使用的细胞是：未分化的间充质干细胞或分化为另一种细胞株的间充质干细胞，未分化的造血干细胞或分化为另一种细胞株的造血干细胞，软骨细胞和成软骨细胞，成骨细胞和骨细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，肌细胞，脂肪细胞，神经元或来自神经系统的其他细胞，来自白血细胞系统的细胞，小鼠角膜细胞，内皮细胞或上皮细胞。

取决于水凝胶的预期应用，注射技术将是不同的，水凝胶的粘性应适合注射系统的口径。注射用水凝胶的粘性是10到15,000cSt，优选的10-2,000cSt。交联的水凝胶的粘性可以大于15,000cSt。根据需要可以通过交联改变水凝胶的粘性，能够获得大于15,000cSt的粘性。

本发明开发的生物材料优选的以注射用形式用于下列病状：重建，填充或重构软组织，治疗皱纹，皱褶和疤痕，烧伤，溃疡，软组织增大，脸部脂肪萎缩，椎间盘疾病，软骨修复，肌骨胳损伤，骨关节炎和关节周炎；治疗肿瘤，阴道疾病，脑损伤，骨髓修复，神经变性病症，心血管疾病和润滑过程，作为止痛剂和抗炎药。

采用其固体形式的本发明生物材料具有实质的多孔结构。在所述结构中，孔径是1,000μm，优选的500μm，可以具有大于15000cSt的粘性。采用其固体形式的所述生物材料优选的用于下面病状：治疗烧伤、溃疡和皮肤表皮缺陷，治疗眼科疾病，诸如角膜损伤，视网膜损伤或白内障；修复软骨，治疗骨关节系统，诸如骨软骨缺陷、骨关节炎或骨缺陷，和阴道疾病解析中的佐剂，治疗牙龈炎和牙周炎；用于开发细胞培养系统。

软骨疾病是世界范围内重要的社会经济问题。从这种意义上讲，尽管很难记录它们的发病率，据估计关节损伤折磨5亿人。

软骨病状作为损伤或疾病的结果出现，如果不进行治疗，可能导致退行性疾病诸如骨关节炎(OA)。

OA是最常见的关节炎类型之一，其在美国和欧洲折磨3500万到4000万人。。它是一种变性疾病，引起软骨的分解并伴随骨的反应。它通常影响手，膝，髋部，脚和颈部，在成人中，它被认为是身体失能的最常见原因之一。

关节软骨是高度特化的无血管组织，保护动关节的骨免受与体重和撞击有关的力，它们会引起关节表面间的摩擦。该组织由单一的细胞类型(软骨细胞)以及重要并且丰富的细胞外基质组成。所述基质由II型胶原纤维(主要的分子)的致密网络以及这一网络内的蛋白多糖大聚集物(包含GAG诸如硫酸软骨素，硫酸角质素，透明质酸和聚集蛋白聚糖)组成。

软骨的特化结构以及其有限的修复能力使得这类损伤的治疗非常复杂。血管化的缺失使其再生能力非常有限，因为再生过程中干细胞无法接近受损区域发挥作用。

近年来，已经使用可生物降解的生物材料来治疗软骨损伤。从这种意义上讲，宏观的合成多聚体(乳酸、羟基乙酸、己内酯…)已经成为最重要的和各种类型的生物材料。但是，这些固体的宏观材料需要侵入性手术方法的使用，诸如常规手术。为了克服这些限制，目前正在开发可以通过最低限度的侵入性技术植入(诸如通过注射或关节镜技术)的新的生物基质。

因此，本发明注射用生物材料的一个应用是骨关节炎退化过程中受损的关节软骨的再生。通过经皮技术(诸如关节镜技术或通过任何注射装置)，所述生物材料可以方便的在待再生的区域施用。除了方便施用之外，注射用水凝胶具有形成稳定植入物的性质，其适合退化组织的大小和几何形状。

所述生物材料的另一应用是三维生物材料用于伤口治疗的用途。

在美国，慢性糖尿病，褥疮和静脉曲张性溃疡是折磨3-6百万人的重要问题。这种病状折磨发达国家人口的1-3％，普遍认为医院中15％的患者患有这种疾病。患有这些病害的大量患者造成相当大的社会经济和保健反响，因此形成高的治疗费用，患者的生活质量也被显著改变。

溃疡是对生物体具有巨大影响的创伤，具有相当复杂的生理病理学。在创面床上存在的成纤维细胞(真皮的细胞)，角质形成细胞(表皮的细胞)，细胞外基质和血浆衍生的蛋白之间发生复杂的协同相互作用，这样的话存在不同的创伤愈合期，止血，炎症，修复和重建。

但是，慢性病性质和复发是临床进展中最相关的发生方式。尽管目前存在大量可用的治疗和敷料，但治愈百分比和治愈速度仍然非常低，因此需要更有效的治疗方法，以实现快速的创伤愈合。近年来获得越来越多的关于慢性溃疡的生理病理学的知识已经开发出新的敷料，它是所述疾病治疗的显著进步。但是迄今为止，没有覆盖皮肤的理想敷料；所述敷料必须符合一系列基本特点，诸如快速粘附到伤口，提供防止液体损失的有效屏障，耐受机械压力以提供长期稳定性，它们必须容易灭菌，易于处理和运输，并且它们必须是无害的。

本发明的固体生物材料具有能够有效治愈慢性溃疡的敷料必需的大部分特点。从这种意义上讲，为评价对慢性溃疡的治疗效果，利用小鼠进行体内实验研究。

实施例

实施例1.获得脐带胶质

为了从脐带的WJ分离GAG，进行下列步骤：

分娩后立即将50g脐带收集到无菌瓶，之前已经在瓶中保存了300ml1X浓度的PBS(对于1升H₂O来说：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，pH＝7.4溶于1L H₂O)和3ml青霉素(30,000单位)，链霉素(30,000μg)和两性霉素-B(75μg)(LONZA，Ref：17-745E)的1X浓度的抗生素混合物。脐带可以在4℃保存不超过24小时直至进一步处理，但在本实施例中，在收到脐带后立即将其处理。

为了进行处理，脐带在II级生物安全层流净化罩的无菌条件下放置，进行连续清洗以完全去除它包含的血液残留物。为此，将其置于容器中，添加300ml的1X PBS(对于1升H₂O来说：8g NaCl，0.2g KCl，1.44gNa₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，pH＝7.4溶于1L H₂O)，包含3ml青霉素(30,000单位)，链霉素(30,000μg)和两性霉素-B(75μg)(LONZA，Ref：17-745E)的抗生素混合物；通过竖直地摇动瓶子5次(10秒)，将其人工振荡，弃去液体，重复这一操作至少3次直至去除大部分血液。然后用500ml 1X浓度的红细胞裂解液(对于1升H₂O来说：8.99g NH₄Cl，1g KHCO₃，37mg EDTA，pH 7.3)清洗脐带直至完全去除血液残留物。

一旦清除掉脐带表面的血液，将其转移到10cm培养皿，用无菌剪切成1-2厘米的片段。因为将脐带切成片段时血管中残留的血液被释放，添加10ml 1X PBS(包含1ml抗生素(10,000单位)，链霉素(10,000μg)和两性霉素-B(25μg)的混合物)以彻底清洁所述片段，将片段表面压在其支持表面，用无菌手术刀沿着片段作水平移动。重复该步骤直至去除内部的所有血液残留物。将完全清洁的脐带片段转移到无菌管，立刻进行处理，尽管如果需要，它们可以在-80℃长期低温保存。

然后用机械方法去除围绕脐带的膜以及位于其中的血管。为了这样做，将脐带片段纵向打开，利用手术刀和镊子小心去除脐带膜和血管。利用这种机械分离获得的胶凝物质是WJ。获得40g WJ。

实施例2.从脐带胶质提取GAG

使用描述的用于从人软骨获得GAG的方案(其中有一些改动)以从脐带的WJ获得GAG(Rogers等，2006)。

将实施例1获得的WJ浸润于10ml提取缓冲液(242μl的200mM L-半胱氨酸，1.42ml的704mM Na₂HPO₄缓冲液，100μl的0.5M EDTA，10mg(14U/mg)，pH 7.5木瓜蛋白酶(SIGMA，Ref：P-4762))，将其在60℃放置24小时以完全消化WJ，一旦其被消化，将样品在800rpm离心5分钟以去除消化残留物。观察到消化体积是30ml，超过10ml的起始体积大约20ml，这源于WJ中存在的GAG的溶解，进而归因于这些聚集的水的释放。

样品一旦被离心，将上清转移到另一管，然后沉淀出样品中存在的GAG。

实施例3.从脐带的WJ沉淀和分离GAG

利用5倍体积的100％乙醇沉淀出存在于上清中的WJ的GAG。通过这个步骤，样品的GAG以及其中存在的盐被沉淀析出。这归因于以下事实：样品中存在的水分子与乙醇分子相互作用，这样的话水分子无法与样品的GAG相互作用。将GAG在-20℃静置12小时进行沉淀。一旦沉淀析出，将它们在2500rpm离心5分钟，从而去除所有的100％乙醇。将沉淀用5倍体积的75％乙醇清洗以去除可能残留的盐，它们可能沉淀析出在样品上。然后将其在2500rpm离心约5分钟，完全去除上清。

一旦沉淀出GAG的样品，将固体残留物在环境温度静置干燥约30分钟，直至所有乙醇都被蒸发。从约40g WJ样品起始沉淀出的GAG的量范围是50-300mg，这取决于起始原料。就这个具体例子来说，获得200mg GAG沉淀物，将其用2ml Milli-Q H₂O重悬，并在4℃保存直至产生水凝胶。

实施例4.包含脐带WJ的GAG的注射用水凝胶的产生。

水凝胶的含水量可以为其自重的10％到100倍，取决于其应用需要的粘性。

将沉淀的GAG用2ml H₂O重悬后获得的水凝胶再用注射用生理血清溶液重悬以产生1000cSt的粘性。随后将该水凝胶用8ml注射用生理血清溶液重悬以产生200厘沲(cSt)的粘性，将其在涡旋振荡器中温和搅拌直至完全溶解和匀浆，以防止凝胶结构的降解。

一旦水凝胶被溶解，将其在4℃保存，在这种条件下它可以长期保存。

实施例5.包含来自脐带WJ的GAG的固体水凝胶的产生。

为了产生固体水凝胶，实施文献(Cui等，2006)描述的方法。从根据实施例3的获自WJ的GAG提取物制备水溶液。具体来说，在H₂O中制备1％的GAG溶液。为此，向沉淀和分离后获得的200mg GAG中添加10ml H₂O(实施例3)。向溶液中添加1.2g己二酸二肼(ADH)，利用0.1N HCl将溶液的pH调节为pH＝3.5。一旦调节到所述pH，向溶液中添加0.6g固定剂，EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)(SIGMA，Ref：E6383)。混合物在环境温度恒定搅拌条件下维持30分钟到1小时，直至获得固体水凝胶。

一旦形成固体水凝胶，将其用1X PBS(对于1升H₂O来说：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，pH＝7.4溶于1L H₂O)清洗3次，每次5分钟，以去除过量的EDC。就水凝胶的物理形状而言，它具有其固化所在模子的形状，这样的话可以使用标准的96、48、24、12和6孔培养板，培养皿或具有所需形状的任何其他容器。此外，水凝胶可以在大的容器(诸如烧杯)中固化，一旦其固化，可以将水凝胶切割成特定的形状和厚度。具体来说，在本实施例中水凝胶在24孔板的孔中固化，一旦固化，将其用500μl的1X PBS清洗3次(5分钟)。

在这种情况下，在24孔板中交联的固体水凝胶经历冻干过程，其包括下列步骤：在-80℃冷冻水凝胶。将冷冻的水凝胶样品放入冷冻干燥器的真空室。水凝胶样品置于真空，并且温度按照0.1℃/分钟的速率升温至-40℃，将温度在-40℃维持20分钟。随后按照0.1℃/分钟的速率将温度升至-20℃，维持-20℃的温度15分钟。随后按照0.1℃/分钟的速率将温度升至0℃，维持0℃的温度15分钟。之后按照0.1℃/分钟的速率将温度升至25℃，在此温度维持一段时间，所述时间是真空室内外压力达到相同所需的。

在本实施例中，为了通过扫描电子显微术(SEM)表征三维的水凝胶，一旦水凝胶被冻干，进行下列步骤：切割冻干水凝胶的切片，在AUTOSAMDRI-814干燥机中用CO₂将该切片干燥到临界点，并在SPUTTER中用金进行金属化。在JEUL扫描电子显微镜(JSM35)中20KV的电压下观察所述制品。

水凝胶的SEM分析(图3)显示它具有均匀的多孔结构，并且它包含孔的互联网络。显微照片显示高孔隙度三维结构的存在，孔径范围是0.5-500μm。孔的这个范围包括微孔和大孔的存在。大孔(300-500μm)是必需的，以便进行合适的细胞群集，这样的话大量细胞汇集，不同的细胞类型共存，有利于形成结构化组织，例如，可以形成血管网络。中等大小的孔允许细胞掺入。微孔(0.5-50μm)是细胞存活必需的，因为它们负责进行气体、营养物的有效扩散和细胞代谢产生的废物的去除。基于扫描电子显微镜获得的米尺测量孔径。

在这种情况下，与注射用生物材料的先前实施例不同，固体水凝胶提供三维结构，它是细胞在其整个结构(内部和外部)中生长和群集的基质。这种生物材料显示更高的结构灵敏性，提示其应用不仅满足生物活性性质和营养作用，而且是可以暂时容纳细胞直至进行组织修复的结构，诸如尤其是溃疡和其他皮肤表皮疾病的治疗，软骨的修复和眼科治疗。生物材料中包含的细胞可以是邻近于植入部位的组织的细胞(其能够形成集落)，也可以是在其临床应用前体外排列在生物材料上的细胞，这样的话其再生作用被增强。

这种生物材料具有大小范围是0.01-500微米的孔的均匀分布，通过扫描电子显微术技术测定。这种孔隙范围适合于气体和营养物扩散通过其整个结构，以及允许细胞进入其中。

实施例6.本发明生物材料中存在的GAG的表征和定量。

通过质谱(ESI/MS)技术分析和定量本发明生物材料中存在的不同GAG。考虑到通过这种技术只能测定分子量为200-2000道尔顿的分子并且GAG分子大部分超过这个范围，首先将样品用酶消化以便获得分子量在200-2000Da之间的GAG链。

作为GAG鉴定和定量的标准品，使用它们中每一种浓度已知的标准商品化化合物。具体来说，用于进行GAG定量的标准品是：对于透明质酸：透明质酸钾(SIGMA，Ref：53750)；对于硫酸软骨素：硫酸软骨素钠(SIGMA，Ref：C4384)；对于硫酸皮肤素：硫酸皮肤素钠(SIGMA，Ref：C3788)；对于硫酸角质素：硫酸角质素(CHEMOS，Ref：7295)；对于肝素：肝素钠(SIGMA，Ref：H8537)；和对于硫酸类肝素：硫酸类肝素钠(SIGMA，Ref51541)。

基于使用各种GAG标准品得到的结果获得样品中存在的GAG的定量值。

按照文献描述的方法(Mahoney等，2001)，进行GAG的酶促消化。为此，使用对每种GAG的消化特异的酶。

对于透明质酸，使用透明质酸酶(SIGMA，Ref：H3506)；对于硫酸软骨素，使用软骨素酶(SIGMA，Ref：C2780)；对于硫酸皮肤素，使用软骨素酶B(SIGMA，Ref：C8058)；对于肝素，使用肝素酶I(SIGMA，Ref：H2519)；对于硫酸类肝素，使用肝素酶I(SIGMA，Ref：H2519)；对于硫酸角质素，使用角质素酶(K2876)。

通过将440U相应酶重悬于10ml下列缓冲液制备这些酶：2ml 100mM磷酸盐缓冲液pH＝7.77，770μl 1M NaCl，1mg BSA和7.23ml H₂O。

含有160U/ml酶浓度的酶促消化缓冲液如下制备：将4.5ml酶(2000U)添加到7.5ml消化缓冲液，1.5ml 1M NaCl，0.333ml 3M醋酸钠pH＝5.2和5.67ml H₂O。用于酶促消化的样品和标准品如下制备：将500μl消化缓冲液(80U酶)添加到500μl各种GAG的标准品(浓度为2mg/ml)，这样的话标准品最终溶液的浓度为1mg/ml。对于GAG样品同样如此：将500μl消化缓冲液(80U酶)添加到500μl GAG样品。

样品在37℃消化1小时，之后通过在60℃热变性5分钟将酶灭活。

一旦消化完成，通过质谱分析样品和标准品。质谱是一种实验研究法，用于确定待分析的样品中存在的某些离子的质荷比。质谱仪由三个基本部件组成：离子源，质量分析器和检测器。通过离子源将待分析的样品离子化，它们在质量分析器中分离并被检测产生质谱，其中显示与特定离子类型的相对丰度比较的质荷值。

具体来说，在本实施例中，如下将样品注射入质谱仪：按照0.2ml/分钟的流速将20μl样品直接注射入质量/质量检测器(Thermo LCQ model)。使用阴性电喷射电离(ESI-)方法，层析时间设为10分钟。选择根据文献(Mahoney等，2001)对应于已知的各类GAG分子量的±6Da范围的分子离子。所述离子存在于标准GAG的样品和待分析的样品，所以样品中各种GAG的存在被定性显示。为了确保结果的再现性，样品和标准品一式两份进行注射。

对于不同GAG的定量，对于1mg/ml各GAG的标准品做标准线。做出的标准线包括下列浓度的各标准GAG(透明质酸，硫酸软骨素，硫酸皮肤素，肝素，硫酸类肝素和硫酸角质素)，用于制备标准线：750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，100μg/ml，0μg/ml。利用H₂O进行标准线的稀释，包含相等比例的酶促消化缓冲液和H₂O的混合物被用作该线的空白对照。

本发明生物材料中各GAG的鉴定结果和比例如下，考虑到生物材料的来源是天然的，这意味着在它们的组成中存在小的变化(图1)：

70％透明质酸

10％硫酸角质素

7％软骨素-6-硫酸盐

5％硫酸类肝素

4％软骨素-4-硫酸盐

3％硫酸皮肤素

1％肝素

实施例7.为了检测生物材料中细胞残余存在的组织学研究

本发明的生物材料包含天然来源的GAG组合。这种天然来源增强了它们的再生效果以及对细胞活性的作用，因为GAG的结构以及它们之间的相互作用与生理条件下在细胞外基质中发现的类似。

脐带是一种免疫原性不高的组织，实际上，WJ中包含的干细胞的异源使用在许多情况下被认为可用于治疗。还有一些情况从脐带的血管发展动脉或静脉系统，也用于异源使用。

但是，为了确保本发明的生物材料不含细胞和细胞残余(它们可引起炎症反应或植入物排斥反应)，进行苏木素-曙红、阿尔新蓝和甲基绿-焦宁组织染色(图2)。

苏木素-曙红：这是组织病理水平使用最广泛的组化染色。它允许观察细胞和细胞组分。苏木素显示对细胞的酸成分(特别是核酸)的亲和力，而曙红显示对碱性区域的亲和力，允许很好的观察细胞的细胞质。对GAG样品的制品(图2B)进行染色，细胞的延展(extensions)被用作阳性对照(图2A)。

进行苏木素-曙红染色的方法如下进行：通过无菌拭子将GAG样品在载玻片上延展，并将该延展物静置干燥至少24小时。一旦载玻片被干燥，将延展物用70％甲醇固定5分钟。随后，通过用H₂O清洗去除固定剂。载玻片用苏木素染色3分钟(PANREAC，DC Harris苏木素溶液)。随后，通过用H₂O清洗去除过量的染料。所有载玻片都经过含0.5％HCl的H₂O以去除染料的非特异性结合。用H₂O清洗载玻片。载玻片用曙红(0.5％溶于水H₂O)染色30秒。载玻片用H₂O清洗以去除过量的曙红。向所述制品添加数滴Fluoromount-G封固剂(SOUTHERN BIOTECH，Ref：0100-01)，用盖玻片覆盖，并在显微镜下观察。

用苏木素-曙红染色的结果(图2，图像A和B)显示被分析的GAG样品中没有细胞。

阿尔新蓝：阿尔新蓝是主要的阳离子染料之一(在其分子中包含正电荷)，其结合多糖带负电荷的位点，所述多糖载有硫酸盐，磷酸盐或碳酸盐基团(构成蛋白聚糖的一部分)。这些静电键取决于培养基的pH；在中性pH染料结合含中性基的蛋白聚糖；在酸性pH它结合蛋白聚糖硫酸盐；和在碱性pH它结合蛋白聚糖磷酸盐。当pH＝1时，阿尔新蓝结合弱和强硫酸化的蛋白聚糖，其包含硫酸软骨素，硫酸皮肤素硫酸类肝素和硫酸角质素(构成脐带胶质GAG的一部分)。对GAG样品的制品(图2F)进行染色，细胞的延展被用作阳性对照(图2E)。

本实施例中进行阿尔新蓝染色的方法具体如下进行：

透过过无菌拭子将GAG样品在载玻片上延展，该延展物静置干燥至少24小时。一旦载玻片被干燥，将延展物用70％甲醇固定5分钟。随后，用1X PBS清洗去除固定剂。将载玻片浸于0.1N HCl pH＝1中5分钟。随后将它们用溶于0.1N HCl pH＝1的1％阿尔新蓝染色2小时。将载玻片浸于0.1N HCl中5分钟，立刻用H₂O清洗以去除过量的染料。向所述制品添加数滴Fluoromount-G封固剂(SOUTHERN BIOTECH，Ref：0100-01)，用盖玻片覆盖，并在显微镜下观察。

用阿尔新蓝染色的结果(图2，图像E和F)显示被分析的生物材料样品中存在GAG。

甲基绿-焦宁：这种染色用于组织包含的核酸的组织学研究，以及显示淋巴细胞和浆细胞的存在。它还用于组织切片和细胞学制品中浆细胞和RNA的鉴定。焦宁把浆细胞的细胞质和大部分核仁染为红色。甲基绿将DNA染为蓝绿色(略呈紫色的)。对GAG样品的制品(图2D)进行染色，细胞的延展被用作阳性对照(图2C)。

本实施例中进行甲基绿-焦宁染色的方法具体如下进行：

透过过无菌拭子将各GAG样品在载玻片上延展，该延展物静置干燥至少24小时。一旦载玻片被干燥，将延展物用70％甲醇固定5分钟。随后，通过用H₂O清洗去除固定剂。将载玻片浸于0.1N HCl pH＝1中5分钟。随后将它们用甲基绿-焦宁染色5分钟(0.012％甲基绿溶于H₂O，0.01％焦宁溶于H₂O，0.75％甲醇)，立即用H₂O清洗以去除过量的染料。向所述制品添加数滴Fluoromount-G封固剂(SOUTHERN BIOTECH，Ref：0100-01)，用盖玻片覆盖，并在显微镜下观察。

用甲基绿-焦宁染色的结果(图2，图像C和D)显示被分析的GAG样品中没有核酸。

从图4的图像可以看出，在本发明的材料中观察不到细胞和核酸残留。但是，通过阿尔新蓝染色在开发的生物材料中观察到GAG的存在。

实施例8.数种细胞类型在本发明生物材料上的毒性。

生物材料能够用于移植或作为组织工程基质的主要要求是完全没有细胞毒性。

为了验证本发明的生物材料不引起毒性作用，通过MTT法(Roche Diagnostics)测定细胞毒性，并由欧洲替代方法验证中心(ECVAM，European Centre for the Validation of Alternative Methods)对排列在本发明生物材料上的细胞进行验证。使用的细胞类型与生物材料针对的病状有关，诸如，皮肤角质形成细胞和成纤维细胞，骨的成骨细胞，软骨的软骨细胞和脂肪来源的间充质干细胞，以及ISO 10993中指定的用于L929毒性测定的细胞系。

MTT测定法基于活细胞的线粒体酶将某些底物转化为其他次级代谢产物的能力。形成的化合物的量取决于线粒体脱氢酶的活性，这是培养物中存在的活细胞数目的明确指标。

具体来说，这种线粒体检测，细胞增殖试剂盒I(MTT)Cat.No.1465 007罗氏，通过细胞线粒体琥珀酸脱氢酶将(黄色)四唑盐变为不溶性的(蓝色)甲臜晶体来测定转化。随后将细胞透化，溶解形成的晶体，产生染色的溶液，这通过ELISA微板读数器在550nm波长处测量其吸光度进行定量。得到的结果显示于图4。

如下所述进行该方法：

1.将细胞种于防粘的96孔板，每孔50μl生物材料，密度为2000-5000个细胞/孔(取决于细胞类型)。先前已经确定每一细胞类型的合适细胞浓度。成纤维细胞，成骨细胞，软骨细胞和脂肪来源的间充质干细胞，所有均来自人来源的原代培养物，按照4000个细胞每孔的浓度接种，L929小鼠成纤维细胞系按照200个细胞每孔的浓度接种，获自人皮肤原代培养的角质形成细胞按照5000个细胞每孔的浓度接种。

2.在开始细胞毒性测定前，将细胞静置在37℃和5％CO2条件下稳定24小时。该测定包括阳性对照(细胞+培养基+已知诱导细胞毒性的材料，就本例来说是聚乙烯多氯化物或PVC)，对照(细胞+标准培养基)，以及接触本发明生物材料的细胞。

3.将其在培养箱中37℃温育实验方案指定的时间段直至进行测定，就本例来说是接触24，48和72小时。

4.温育期结束后，对每孔各100μl培养基中的培养物添加10μlMTT溶液(0.5mg/ml)，并在培养箱中37℃温育4小时。

5.温育结束后，可以观察到细胞内部的甲臜晶体。每份培养物或每孔中添加100μl增溶液，并在培养箱37℃温育过夜。细胞因此被透化，晶体用指定的100μl增溶剂溶解，产生可方便定量的染色溶液。

6.一旦晶体被溶解，用ELISA读数器在550nm处直接读取培养板。在读取前，建议用乙醇清洁板的底面。

从图4可以看出，本发明的生物材料不对被检测细胞系的任意一种产生毒性作用，与对照相比不存在显著差异。

实施例9.本发明注射用形式的生物材料用于治疗骨关节炎的用途

为了在OA中体内鉴定本发明生物材料的治疗效果，使用实施例3获得的水凝胶，将其用8ml注射用生理血清溶液重悬以产生200cSt的粘性。在一个膝盖处接受前十字韧带切除术的兔被用作实验模型。通过外侧关节切开术进行韧带的这种切除。随后，为了使膝盖失稳，等待数月到数周的时间，在此期间发生类似于骨关节炎的软骨侵蚀。此外，在膝盖处未进行关节切开术的动物被用作对照组。

利用关节镜手术通过清洗和清创术制备受损的关节表面，用本发明的注射用生物材料覆盖损伤处。放置生物材料4周后，处死动物并提取软骨。将获得的软骨用4％多聚甲醛固定以便其后续的组织学处理。为了获得组织切片，将样品包埋入石蜡，为此将其置于50、70、90和100％的醇中5分钟。随后将样品放入citrosol 5分钟，并包埋入石蜡直至获得固体块。利用切片机获得5μm组织切片，利用这些切片进行组织染色和免疫染色。

通过免疫组化技术分析组织切片中软骨细胞外基质的不同标记物。被研究的软骨细胞外基质的特异性分子和分子标记物是II型胶原，硫酸角质素，软骨素-4-硫酸盐和软骨素-6-硫酸盐。使用单克隆抗体进行免疫染色。用于标记组织切片的技术是直接的免疫染色，使用标记荧光染料的单克隆抗体。使用共焦显微镜观察标记。

获得的结果显示生物材料诱导受损软骨的再生，因为：

一旦被植入，注射用生物材料不引起毒性，即，在组织切片的肉眼可见和显微镜水平没有观察到炎症现象。

生物材料适合待修复的伤口的几何形状和大小，并停留在移植区域内。

没有观察到邻近植入物区域的健康组织细胞表型的改变。

在植入物区域的对软骨特异的细胞外基质分子(诸如II型胶原)的存在表明再生过程的起始，伴随与天然组织相同质量的新细胞外基质的形成。

在植入物区域观察到软骨细胞的存在，其表明细胞迁移、粘附和增殖的刺激。

这些事实证明本发明的生物材料促进软骨缺陷的再生，这与对照动物(其不存在任何软骨修复的迹象)不同。

实施例10.三维生物材料的用途

实施例5获得的本发明固体生物材料具有能够有效治愈慢性溃疡的敷料必需的大部分特点。从这种意义上讲，为了评价对慢性溃疡的治疗效果，使用Swiss白化小鼠(在背部区域接受约3cm²的热蚀)进行体内实验研究。使用接受相同类型的伤害但用商品化的透明质酸凝胶治疗的动物作为对照组。

对于本发明生物材料的应用，通过清洗、消毒和手术清创术制备诱导伤害的表面，用本发明的可塑固体生物材料在深度和表面两方面均覆盖和填充所述损伤。在放置生物材料15天后，处死动物，切除伤口区域并在4％多聚甲醛中固定用于其后续的组织学检查。为了进行处理，将样品包埋入石蜡，为了这个目的将其置于50，70，90和100％的醇中5分钟。随后将样品放入citrosol 5分钟，并包埋入石蜡直至获得固体块。利用切片机获得5μm组织切片，利用这些切片进行组织染色和免疫染色。

通过免疫组化技术分析组织切片中的不同表皮表型标记物，诸如5和10角蛋白，分化标记物，诸如外皮蛋白和兜甲蛋白，皮肤标记物波形蛋白，和基质成分诸如层粘连蛋白。用于标记组织切片的技术是直接的免疫染色，使用标记荧光染料的单克隆抗体。使用共焦显微镜观察标记。

获得的结果显示生物材料在溃疡再生中是有效的，因为：

用于伤口的生物材料是免疫无活性的，未显示毒性症状。

生物材料适合待修复的伤口的几何形状和大小，在深度和表面均完全覆盖患病区域。

生物材料促进止血现象，这是愈合过程开始的迹象。

随着愈合过程进展，生物材料降解，并被皮肤的上皮组分取代。

组织切片显示生物材料诱导成纤维细胞和角质形成细胞(它们在其中仍是有活性的)的迁移和增殖。

本发明的生物材料诱导伤口愈合的有效性是对照动物的两倍，此外，新疤痕组织的质量显著高于没有应用本发明生物材料的动物。

参考文献

-Collins M.N，Birkinshaw C.2008.“Physical properties of crosslinked hyaluronic acid hydrogels”.Journal of Material Science.Materials in Medicine，19：3335-3343.

-Coburn J.A，Pandit A.2007.“Development of naturally-derived biomaterials and optimization of their biomechanical properties”.Topics in Tissue Engineering，3：1-14.

-Cui F.Z，Tian W.M，Hou S.P，Xu Q.Y，Lee I.S.2006.“Hyaluronic acid hydrogel immobilized with RGD peptides for brain tissue engineering”.Journal of Material Science.Materials in Medicine，17：1393-1401.

-Danishefsky I，Bella Jr.A.1996.“The sulfated mucopolysaccharides from human umbilical cord”，J.of Biological Chemistry，241：143-146.

-Dawson J.I，Oreffo R.2008.“Bringing the regeneration gap：stem cells，biomaterials，and clinical translation in bone tissue engineering”.Archives of Biochemistry and Biophysics，473：124-131.

-Elisseeff J，Ruffner M，Kim T.G，Williams C.2005.“Cellular photoencapsulation in hydrogels”.Culture of Cells for Tissue Engineering，Chapter 9.

-Goa K.L，Benfield P.1994.“Hyaluronic acid.A review of its pharmacology and use as a surgical aid in ophthalmology，and its therapeutic potential in joint disease and wound healing.”Drugs，47：536-566.

-Gogiel T，Galewska Z，Jaworski S.2005.“Pre-eclampsia-associated alterations in Wharton′s jelly proteoglycans”.Acta Biochim Pol，52：501-507.

-Hadidian Z，Pirie N.W.1948.“The preparation and some properties of hyaluronic acid from human umbilical cord”.The Biochemical Journal，42：260-265.

-Hiles M，Hodde J.2006.“Tissue engineering a clinically useful extracellular matrix biomaterial”.Int Urogynecol Journal，17：39-43.

-Ishihara M，Obara K，Ishizuka T，Fujita M，Sato M，Masuoka K，Saito Y，Yura H，Matsui T，Hattori H，Kikuchi M，Kurita A.2002.“Controlled release  of fibroblasts growth factors and heparin from photocrosslinked chitosan hydrogels and subsequent effect on in vivo vascularization”.Journal of Biomedical Materials Research，78：364-371.

-Jeanloz R.W，Forchielli E.1950.“Studies on hyaluronic acid and related substances I.Preparation of hyaluronic acid and derivatives from human umbilical cord”.Journal of Biological Chemistry，186：495-511.

-Kanematsu A，Yamamoto S，Ozeki M，Noguchi T，Kanatani I，Ogawa O，Tabata Y.2003.“Collagenous matrices as release carriers of exogenous growth factors”.Biomaterials，25：4513-4520.

-Laurent T.C，Fraser J.R.E.1992.“Hyaluronan”.The FASEB Journal，6：2397-2404

-Longaker M，Chiu E.S，Harrison M.R，Crombleholme，Langer J.C，Duncan B.W，Adzick N.S，Verrier E.D，Stern R.1989.“Studies in fetal wound healing”Annals of Surgery，210：667-672.

-Mahoney D.J，Aplin R.T，Calabro A，Hascall V.C，Day A.J.2001.“Novel methods for the preparation and characterization of hyaluronan oligosaccharides of defined length”.Glycobiology，11：1025-1033.

-Malkowski A，Sobolewski K，Jaworski S，Bankowski E.2007.“FGF binding by extracellular matrix components of Wharton′s jelly”.Acta Biochim Pol，54：357-363.

-Moore R.D，Schoenberg M.D.1957.“Studies on connective tissue.I.The polysaccharides of the human umbilical cord”.A.M.A.Archives of pathology，64：39-45.

-Pieper J.S，Oosterhof A，Dijkstra P.J，Veerkamp J.H，van Kuppevelt T.H.1999.“Preparation and characterization of porous crosslinked collagenous matrices containing bioavailable chondroitin sulphate”，Biomaterials，20：847-858.

-Rabenstein D.L.2002.“Heparin and heparin sulfate：structure and function”.Natural products reports，19：312-331.

-Rogers B.A，Murphy C.L，Cannon S.R，and Briggs T.W.R.2006.“Topographical variation in glycosaminoglycan content in human articular cartilage”.The Journal of Bone and Joint Surgery，88：1670-1674.

-Sobolewski K，

A，

E，Jaworski S.2005.“Wharton′s jelly as a reservoir of peptide growth factors.”Placenta，26，747-752.

-Toole B.P.2004.“Hyaluronan：from extracellular glue to pericellular cue”.Nature Cancer Reviews，4，528-539.

-Torres D.S，Freyman T.M，Yannas I.V，Spector M.2000.“Tendon cell contraction of collagen-GAG matrices in vitro：effect of cross-linking.Biomaterials，21，607-619.

-Trowbridge J.M，Gallo R.2002.“Dermatan sulfate：new functions from an old glycosaminoglycan”.Glycobiology，12：117-125.

-Ueno N，Chakrabarti B，Garg H.G.Hyaluronic acid of human skin and post-burn scar：heterogeneity in primary structure and molecular weight”.1992.Biochem Int，26：787-796.

-Wissink M.J.B，Beernink R，Pieper J.S，Poot A.A，Engbers G.H.M，Beugeling T，van Aken W.G，Feijen J.2001.“Binding and release of basic fibroblast growth factor from heparinized collagen matrices”，Biomaterials，22：2291-2299.

Claims (27)

1.一种生物材料，其特征在于，该生物材料包括源自人脐带的糖胺聚糖(GAG)的混合物，所述脐带不含人脐带膜和血管。

2.根据权利要求1的生物材料，其特征在于，所述GAG的混合物从存在于人脐带中的脐带胶质提取。

3.根据权利要求1-2的生物材料，其特征在于，其包括选自透明质酸、硫酸角质素、软骨素-6-硫酸盐、硫酸类肝素、软骨素-4-硫酸盐、硫酸皮肤素和肝素的糖胺聚糖混合物。

4.根据权利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG总混合物65-75％的透明质酸。

5.根据权利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG总混合物5-15％的硫酸角质素。

6.根据权利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG总混合物6-8％的软骨素-6-硫酸盐。

7.根据权利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG总混合物3-7％的硫酸类肝素。

8.根据权利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG总混合物2-6％的软骨素-4-硫酸盐。

9.根据权利要求3的生物材料，其特征在于，其包括占GAG总混合物1-5％的硫酸皮肤素。

10.根据权利要求3的生物材料，其特征在于其包括占GAG总混合物0.1-2％的肝素。

11.根据权利要求3的源自人脐带的生物材料，其特征在于，其包含：透明质酸(70％)、硫酸角质素(10％)、软骨素-6-硫酸盐(7％)、硫酸类肝素(5％)、软骨素-4-硫酸盐(4％)、硫酸皮肤素(3％)和肝素(1％)。

12.根据权利要求1-11的源自人脐带的生物材料，其特征在于，该生物材料是水凝胶。

13.根据权利要求12的生物材料，其特征在于，其是注射用水凝胶。

14.根据权利要求12-13的生物材料，其特征在于所述注射用水凝胶具有10到15,000cSt的粘性。

15.根据权利要求12的生物材料，其特征在于具有10到2,000cSt的粘性。

16.根据权利要求12的生物材料，其特征在于具有大于15,000cSt的粘性。

17.根据权利要求12的生物材料，其特征在于，其是固体水凝胶。

18.根据权利要求17的生物材料，其特征在于，具有孔径为0.5-1000μm的充分多孔结构。

19.根据权利要求18的生物材料，其特征在于，所述孔径是0.5-500μm。

20.根据权利要求1-19的生物材料，其特征在于，该生物材料还包括细胞。

21.根据权利要求20的生物材料，其特征在于，所述细胞选自：未分化的间充质干细胞或分化为另一种细胞株的间充质干细胞、和/或未分化的造血干细胞或分化为另一种细胞株的造血干细胞、和/或软骨细胞和/或成软骨细胞、和/或成骨细胞和、和/或骨细胞、和/或角质形成细胞、和/或成纤维细胞、和/或肌细胞、和/或脂肪细胞、和/或神经元和/或来自神经系统的其他细胞、和/或来自白血细胞系统的细胞、和/或小鼠角膜细胞、和/或内皮细胞和/或上皮细胞。

22.用于获得权利要求1-21的生物材料的方法，其特征在于，其包括下列步骤：

a)获得人脐带；

b)用盐溶液和抗生素处理脐带；

c)消除脐带表面的所有血液；

d)将脐带分为1-2cm的片段；

e)清洁内部残留的所有血液；

f)清除脐带膜和血管；

g)分离包括脐带胶质的胶凝物质；

h)酶法消化获得的胶凝物质；和

i)沉淀并分离GAG。

23.用于获得权利要求1-21的生物材料的方法，其特征在于，所述生物材料包括通过权利要求22所得GAG的溶解而获得的水凝胶，该水凝胶具有10到15,000cSt的粘性。

24.用于获得权利要求17-19的生物材料的方法，其特征在于，其包括通过基于权利要求22所得GAG的交联获得的水凝胶，其具有孔径为0.5-1000μm的充分多孔的三维结构。

25.根据权利要求24所述的用于获得生物材料的方法，其特征在于，所述孔径优选的是0.5-500μm。

26.根据权利要求24-25所述的用于获得生物材料的方法，其特征在于，通过温度变化、化学反应或光聚合进行交联。

27.根据权利要求1-26的生物材料的用途，用于重建、填充或重构软组织，治疗皱纹，皱褶和疤痕，烧伤，溃疡，软组织增大，脸部脂肪萎缩，椎间盘疾病，软骨修复，肌骨胳损伤，骨关节炎和关节周炎；治疗肿瘤，阴道疾病，脑损伤，骨髓修复，神经变性病症，心血管疾病和润滑过程，作为止痛剂和抗炎药；治疗烧伤，溃疡和皮肤表皮缺陷，治疗眼科疾病，诸如角膜损伤，视网膜损伤或白内障；修复软骨，治疗骨关节系统，诸如骨软骨缺陷、骨关节炎或骨缺陷的情况，和解析阴道疾病的佐剂，治疗牙龈炎和牙周炎；用于开发细胞培养系统。

Images