ES2634545T3

ES2634545T3 - Células madre nativas de la gelatina de Wharton y su purificación

Info

Publication number: ES2634545T3
Application number: ES11725570.3T
Authority: ES
Inventors: Rouzbeh R. Taghizadeh
Original assignee: Auxocell Laboratories Inc
Current assignee: Auxocell Laboratories Inc
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2011-06-01
Publication date: 2017-09-28
Anticipated expiration: 2031-06-01
Also published as: EP2576768A1; CA2801009A1; US9920301B2; LT2576768T; CA3056049A1; US20200332261A1; EP2576768B1; CY1119382T1; DK2576768T3; US20150197728A1; BR112012030678B1; PL2576768T3; SG185811A1; US20170107496A1; US20170044490A1; US9441201B2; BR112012030678A2; CA2801009C; US20130183273A1; WO2011153205A1

Abstract

Un procedimiento para purificar células madre de gelatina de Wharton sin cultivar, consistiendo el procedimiento en: eliminar las arterias y las venas de un cordón umbilical que comprende la gelatina de Wharton; digerir el cordón umbilical triturando mecánicamente el cordón umbilical; lavar o diluir el cordón umbilical digerido antes de separarlo del cordón umbilical sin digerir; separar el cordón umbilical digerido y sin digerir; sedimentar el cordón umbilical digerido por centrifugación; filtrar el cordón umbilical digerido; separar las células madre de la gelatina de Wharton del filtrado; y congelar las células madre de la gelatina de Wharton sin cultivar.

Description

DESCRIPCION

Celulas madre nativas de la gelatina de Wharton y su purificacion 5 REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El tejido del cordon umbilical es rico en celulas madre. La sangre del cordon umbilical incluye celulas madre, que 10 incluyen celulas madre hematopoyeticas que se pueden usar para repoblar la sangre de una persona y el sistema inmunologico. La gelatina de Wharton, una sustancia gelatinosa dentro del cordon umbilical, contiene una poblacion adicional de celulas madre, distintas de las encontradas en la sangre del cordon. Como se usa en el presente documento, la "gelatina de Wharton" puede incluir ademas la capa amniotica epitelial del cordon umbilical. El procesamiento y el cultivo de la gelatina de Wharton permite el aislamiento de la celulas madre mesenquimales que 15 se pueden usar para regenerar una variedad de tejidos (vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 5,919,702).

RESUMEN DE LA INVENCION

Los autores de la presente invencion han descubierto que el proceso de cultivo de celulas a partir de la gelatina de 20 Wharton cambia sustancialmente las caracterfsticas de las celulas. En comparacion con una poblacion de celulas cultivadas in vitro, las celulas de la gelatina de Wharton sin cultivar son molecularmente diferentes como se puede observar, por ejemplo, en un perfil molecular diferente en su superficie celular. Mas importante aun, los inventores han descubierto que las celulas de la gelatina de Wharton mfnimamente manipuladas son sustancialmente mas potentes in vivo que las celulas de la gelatina de Wharton cultivadas.

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Los inventores han desarrollado un procedimiento para purificar celulas madre a partir de la gelatina de Wharton sin necesidad de un paso de cultivo. De acuerdo con la presente invencion, el procedimiento incluye la separacion de celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar a partir de un tejido digerido que incluye la gelatina de Wharton, un paso anterior de digestion del tejido triturando mecanicamente el tejido, y un anterior para digerir el tejido que 30 incluye la gelatina de Wharton, el tejido se diseca para eliminar las arterias y venas.

La digestion incompleta puede dejar fragmentos de tejido sin digerir. El procedimiento incluye la separacion del tejido digerido y sin digerir, como por ejemplo sedimentando el tejido sin digerir. El procedimiento de sedimentacion se acelera, por ejemplo, por centrifugacion. El tejido digerido se filtra para eliminar el tejido sin digerir, las celulas madre 35 de la gelatina de Wharton sin cultivar se pueden separar del filtrado, por ejemplo mediante sedimentacion o filtracion. El tejido digerido, que puede ser viscoso, se lava o diluye antes de un paso de separacion, aunque otros pasos como por ejemplo la centrifugacion vigorosa pueden ser eficaces incluso en ausencia de un paso de lavado o dilucion.

Ademas, los inventores han desarrollado procedimientos de recuperacion de celulas madre cultivadas y no 40 cultivadas a partir de la gelatina de Wharton. El procedimiento incluye celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar purificadas de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, y celulas madre mesenquimales cultivadas a partir del tejido sin digerir. De este modo, se obtienen celulas madre sin cultivar de potencia superior a partir del tejido digerido y las celulas adicionales se cultivan a partir de restos del tejido sin digerir. Las celulas madre mesenquimales se cultivan opcionalmente en un medio que incluye la gelatina de 45 Wharton.

Ademas la invencion se refiere a la celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar purificadas y su uso. Como se usa en el presente documento, "purificado" indica que se han aislado y separado celulas madre de la gelatina de Wharton a partir de ciertos componentes acelulares de la gelatina de Wharton, pero no se indica que las celulas 50 madre se hayan purificado necesariamente a partir de otros tipos de celulas que ademas puedan estar presentes en la gelatina de Wharton. En algunas formas de realizacion, las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar purificadas carecen sustancialmente de gelatina de Wharton semi-solida. Pueden quedar algunos grados de gelatina de Wharton licuada (digeridos en un lfquido viscoso, por ejemplo), o las celulas pueden carecer completamente de gelatina de Wharton y opcionalmente en otro medio, como por ejemplo una solucion esteril, una solucion salina 55 equilibrada, una solucion crioprotectora, plasma, etc. En otras formas de realizacion, las celulas madre de la gelatina de Wharton se mantienen a una temperatura inferior a 0 °C, inferior a -20 °C, inferior a -80 °C, o inferior a -180 °C, por ejemplo en un vial, bolsa, u otro recipiente adecuado a dicha temperatura. Las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar purificadas de la invencion pueden diferir sustancialmente de las celulas madre mesenquimales cultivadas a partir de la gelatina de Wharton, incluyendo diferencias en el nivel de la expresion de la superficie 60 celular de una (o dos o tres o cuatro o mas) de CD49B, CD105, CD133, HLA-ABC, CD73, cD44, SSEA-4, CD29, y/o

CD90. En algunas formas de realizacion, por ejemplo, la poblacion de celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar tienen niveles reducidos de la expresion de la superficie celular de CD73 y CD105 en comparacion con las celulas madre mesenquimales cultivadas a partir de la gelatina de Wharton. Se ha informado que tanto CD73 como CD105 son marcadores de celulas madre mesenquimales. En consecuencia, el nivel reducido de CD73 y CD105 en 5 las superficies celulares de las celulas madre de la gelatina de Wharton es homogeneo con la identificacion de estas celulas como sustancialmente diferente de las celulas madre mesenquimales cultivadas.

Las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar son multipotentes y se pueden administrar a un sujeto como parte de un procedimiento terapeutico, por ejemplo, para curar un tejido o para ayudar en la regeneracion de tejidos. 10 En ciertas formas de realizacion, las celulas madre de la gelatina de Wharton son ventajosamente autologas o alogenicas al sujeto.

Tambien se desvela en esta invencion una solucion homogenea que incluye la gelatina de Wharton. La solucion se puede obtener, por ejemplo, digiriendo la gelatina de Wharton para obtener un lfquido viscoso y purificar partfculas, 15 como por ejemplo tejido o celulas sin digerir, a partir de lo digerido para obtener una solucion homogenea. La solucion se puede diluir opcionalmente, como por ejemplo mediante una solucion salina equilibrada u otra solucion esteril, para reducir la viscosidad. La solucion puede reducir el numero de celulas, eliminando sustancialmente todas las celulas o de otra forma reduciendo el numero de celulas en la solucion. La solucion se puede congelar (por ejemplo, a una temperatura de -20 °C o inferior), y se puede usar opcionalmente en un proceso de cultivo celular. 20 Por lo tanto, la invencion proporciona ademas procedimientos de mantenimiento de una celula mezclando la celula en una solucion homogenea incluyendo la gelatina de Wharton, por ejemplo anadiendo la celula a la solucion, anadiendo la solucion a una suspension que comprende la celula, o aplicando la solucion a una superficie a la que esta adherida la celula. La celula se puede cultivar in vitro. En una forma de realizacion, la celula es una celula madre multipotente, como por ejemplo una celula madre mesenquimal de la gelatina de Wharton.

25

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Otras caracterfsticas y ventajas de la presente invencion, asf como la invencion en si, pueden comprenderse mas plenamente a partir de la siguiente descripcion de varias formas de realizacion, cuando se leen junto con los dibujos 30 adjuntos, en las que:

La FIG. 1 describe graficamente la eficacia in vivo de celulas madres de la gelatina de Wharton (CMM GW) no cultivadas o de celulas mesenquimales expandidas en cultivo (CMM GW expandidas) en un ensayo de cotrasplante con celulas madre hematopoyeticas humanas de sangre de cordon umbilical, con los resultados mostrados como 35 porcentaje (%) de las celulas de la medula osea que expresan CD45 humano en su superficie, que sirve como un marcador sustituto del injerto de las celulas humanas trasplantadas en raton;

La FIG. 2 representa graficamente, para cada trece marcadores de superficie celular (CD49B, CD105, CD34, CD45, CD133, HLA-ABC, CD73, HLA-DR, CD14, CD44, SSEA-4, CD29 y CD90), en dos dimensiones el numero de celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar medidas para tener un nivel de expresion particular de marcador de la 40 superficie celular, y

La FIG. 3 es una representacion grafica comparable al numero de celulas madre mesenquimales expandidas por cultivo a partir de la gelatina de Wharton que tienen un nivel de expresion particular del marcador en la superficie celular.

45 DESCRIPCION DETALLADA

La presente aplicacion proporciona procedimientos para purificar las celulas madre de la gelatina de Wharton sin necesidad de un paso de cultivo. Las celulas resultantes son particularmente utiles terapeuticamente, teniendo potencia superior en comparacion con las celulas madre expandidas en cultivo a partir de la gelatina de Wharton. La 50 aplicacion proporciona ademas una solucion homogenea a partir de la gelatina de Wharton que se puede usar, por ejemplo, en un proceso de mantenimiento de las celulas, como por ejemplo en cultivo.

Para proporcionar una comprension completa de la invencion, se describiran ahora ciertas formas de realizacion ilustrativas.

55

Purificacion de las celulas madre de la gelatina de Wharton

La purificacion de las celulas madre de la gelatina de Wharton requiere separar las celulas sin cultivar del tejido digerido que incluye la gelatina de Wharton. El tejido del cordon umbilical se puede diseccionar para eliminar las 60 arterias y venas, y despues procesar para maximizar el area de superficie disponible. Este proceso puede

generalmente involucrar cualquier forma de aumento mecanico del area de superficie del tejido, pero mas a menudo involucra cortar finamente o triturar microscopicamente el tejido en pequenas cadenas de hebras microscopicas, como por ejemplo con tijeras de diseccion o un bisturf.

5 Antes de separar las celulas del tejido digerido, cualquier fragmento restante del tejido sin digerir se descarta opcionalmente para facilitar la posterior purificacion de las celulas. Dependiendo del tamano, el tejido sin digerir se puede por ejemplo eliminar mediante extraccion ffsica (p. ej. con forceps), decantar, aspirar, sedimentar (opcionalmente acelerado por centrifugacion), o filtrar.

10 La separacion de las celulas a partir del tejido digerido se logra mediante la sedimentacion de las celulas a partir de una mezcla homogenea que contiene el tejido digerido. Aunque se puede usar sedimentacion por gravedad, el proceso de sedimentacion se puede acelerar mediante, por ejemplo, una centrffuga para mejorar el movimiento descendente de las celulas a traves de (y, en cierto sentido fuera de) la mezcla. Uno de estos procesos de describe en el ejemplo 1. Despues de la separacion, las celulas madre de la gelatina de Wharton carecen sustancialmente de

15 la gelatina de Wharton. Dado que el tejido digerido es generalmente viscoso, el tejido se puede lavar o diluir con una solucion esteril apropiada (como por ejemplo una solucion salina tamponada) en cualquier etapa del proceso. De hecho, despues de que las celulas se hayan separado de la mezcla, se pueden realizar mas lavados para limpiar tanto como se desee las celulas.

20 Celulas madre nativas de gelatina de Wharton

Las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar purificadas se pueden usar inmediatamente en un paciente, si hay una necesidad inmediata. Tfpicamente, sin embargo, las celulas se crioconservan en nitrogeno lfquido hasta que sean necesarias, tfpicamente con un crioprotector como por ejemplo DMSO o dextrano, y a menudo en una

25 solucion como por ejemplo un plasma autologo o albumina serica humana al 5 %. Como celulas madre multipotentes, las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar se pueden usar para el tratamiento de o para regenerar cualquiera de las variedades de tejidos como por ejemplo un hueso, cartflago, grasa o musculo. Estas celulas pueden facilitar injerto hematopoyetico y tienen el potencial de regular y suprimir las respuestas inmunitarias en el huesped.

30

Como se describe en el ejemplo 4, una poblacion de celulas sin cultivar a partir de la gelatina de Wharton es demostrablemente diferente, a nivel molecular, de una poblacion de celulas a partir de la gelatina Wharton que se han ampliado en un cultivo ex vivo. Por ejemplo, aunque ambas poblaciones incluyen celulas que expresan CD49B, CD105, HLA-ABC, CD73, CD44, SSEA-4, cD29, y cD90, las poblaciones difieren en sus perfiles de expresion para

35 la mayorfa si no todos estos marcadores. Por lo tanto, se pueden usar estos u otros marcadores individualmente o en combinacion (como por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho de estos marcadores), para identificar y caracterizar una poblacion de celulas madre, como por ejemplo aquellas derivadas del tejido del cordon umbilical, y/o para caracterizar la potencia biologica de las celulas.

40 Productos adicionales

Ademas el proceso de purificacion produce productos utiles adicionales. Por ejemplo, cuando se separan las celulas del tejido digerido, el tejido digerido con una reduccion del numero de celulas es una solucion rica, esteril que se puede usar para el mantenimiento de las celulas (en cultivos, por ejemplo). Se aprecia que algunas celulas pueden

45 estar presentes aunque en numero sustancialmente reducido, dentro de esta solucion rica esteril con una reduccion del numero de celulas derivada a partir del tejido digerido. Alternativamente, la solucion puede estar totalmente desprovista de celulas. Esta solucion homogenea se puede congelar (por ejemplo, a -20 °C o menos) para un uso posterior.

50 Cualquier fragmento de tejido sin digerir despues del proceso de digestion es ademas particularmente util, ya que se puede usar como una fuente de celulas madre mesenquimales cultivadas usando procedimiento estandar para ampliar las celulas madre mesenquimales en el cultivo a partir de la gelatina de Wharton. De hecho, la solucion homogenea de la gelatina de Wharton que es, en cierto sentido, un subproducto del proceso de purificacion se puede usar en el cultivo de celulas madre mesenquimales a partir de los fragmentos del tejido sin digerir. De esta

55 forma, el proceso de purificacion cuyo primer proposito es la preparacion de celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar puede proporcionar ademas, como un beneficio anadido, celulas madre mesenquimales que se amplfan en el cultivo a partir de los fragmentos del tejido sin digerir con la ayuda de la solucion de la gelatina de Wharton con una reduccion del numero de celulas.

60 En consecuencia, la presente invencion proporciona dos fuentes para la siembra y derivacion de la gelatina de

Wharton expandida en cultivo derivada de celulas madre mesenquimales La primera fuente es el tejido del cordon umbilical sin digerir. Porque la digestion enzimatica raramente digiere completamente el tejido, el tejido sin digerir restante se puede utilizar como una fuente de siembra para la expansion de celulas madre mesenquimales. Una segunda fuente para la derivacion de las celulas madre mesenquimales son las celulas madre de la gelatina de 5 Wharton derivada a partir del tejido digerido. La digestion enzimatica escinde los enlaces cruzados del colageno dentro de la gelatina de Wharton y libera las celulas incrustadas. Como se describe previamente, se pueden procesar y crio conservar las celulas liberadas en la forma de suspensiones celulares unicas para un uso terapeutico posterior. Alternativamente, estas celulas se pueden usar como una fuente de siembra para la expansion de las celulas madre mesenquimales. Ademas, la gelatina de Wharton con una reduccion del numero de celulas despues 10 de la digestion se puede usar como un suplemento para la derivacion de las celulas madre mesenquimales a partir de los tejidos digeridos y sin digerir. Este uso como suplemento no es necesario para la derivacion del cultivo pero puede reducir el tiempo necesario para la derivacion y ampliacion.

Ademas del cultivo de adherencia bidimensional usado rutinariamente para la expansion de las celulas madre 15 mesenquimales, se pueden utilizar biorreactores para ampliar las celulas madre mesenquimales en cultivos de suspension tridimensionales. Los biorreactores permiten la produccion escalada e imitan estrechamente las caracterfsticas de perfusion in vivo del cordon umbilical. Las celulas madre mesenquimales pueden derivar inicialmente de los cultivos bidimensionales o tridimensionales y por consiguiente propagarse en cultivos tridimensionales para la produccion escalada. Los biorreactores pueden suplementarse con microesferas portadoras 20 para permitir la adherencia y la propagacion de las celulas madre mesenquimales dentro de los biorreactores.

EJEMPLOS

La invencion se ilustra en los siguientes ejemplos, que se proporcionan solo para propositos ilustrativos, y de 25 ninguna forma deben interpretarse como una limitacion del alcance o el contenido de la invencion.

Ejemplo 1. Purificacion de celulas madre nativas de la gelatina de Wharton y solucion homogenea de gelatina de Wharton.

30 Los cordones umbilicales se recogieron en recipientes para muestras esteriles dentro de las 48 horas siguientes al momento de la entrega. En un armario de seguridad biologica, se anadieron 10 ml de tampon B (50 pg/ml de gentamicina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina en la solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco) al cordon umbilical en una camara de recogida de cordones umbilicales. Tambien se pueden anadir otros antibioticos, como por ejemplo 0,25 pg/ml de anfotericina B, 100 pg/ml de estreptomicina y/o 10 pg/ml 35 de ciprofloxacina, al tampon B o sustituirlos por cualquiera de los antibioticos en el tampon B. Despues se mezcla el contenido de la camara de recogida mediante agitacion por rotacion suave y se mantiene a temperatura ambiente menos de 72 horas. El contenido se mezclo de nuevo por agitacion por rotacion suave durante aproximadamente 1015 segundos para limpiar el tejido del cordon umbilical. Si se detecto sangre coagulada en la superficie del cordon umbilical, se elimino cuidadosamente usando herramientas de diseccion.

40

El cordon umbilical se transfirio a una placa Petri usando pinzas esteriles y cortando segmentos de 3-5 cm usando unas tijeras o pinzas para el cordon umbilical. Cada segmento se disecciono individualmente como sigue. Brevemente, un segmento a diseccionar se coloco en una placa Petri de 150 mm. Las dos arterias y una vena del cordon umbilical se colocaron visualizando la seccion transversal del segmento del tejido. Usando tijeras de 45 diseccion, se hizo una incision entre las dos arterias. Con dos tejidos o forceps Dumont, se saco el cordon a lo largo de la longitud del tejido, arrancando cuidadosamente el tejido de las arterias y venas. Una vez que el tejido estuvo abierto, se localizo y extirpo la vena usando un forceps de punta fina esteril en cada mano. Las dos arterias se localizaron y extirparon posteriormente, y el tejido diseccionado se coloco en la tapa interior, esteril de la placa de diseccion de 150 mm.

50

Despues con las tijeras de diseccion se trituro el tejido en pequenas hebras/cadenas durante al menos 5 minutos o hasta que se obtuvo un tejido triturado homogeneo. La diseccion y el triturado se realizaron en diferentes partes de la placa de diseccion para minimizar la contaminacion con excesiva sangre y/o vasos diseccionados. El tejido triturado final parecfa tejido triturado y tenia pocos o ningun fragmento de tejido obvio. Generalmente, las piezas de 55 tejido triturado tenian una seccion transversal de aproximadamente 1 mm2. El tejido triturado estaba situado en un tubo conico esteril, etiquetado.

Ademas una vez que todos los segmentos del tejido del cordon umbilical fueron diseccionados, triturados y anadidos al tubo conico, se anadieron 10 ml de solucion CB (2,5 mg/ml de colagenasa NB6 (Serva) y 2 mm de cloruro calcico 60 en la solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco). Se mezclo el contenido del tubo invirtiendolo/agitandolo

varias veces hasta que se obtuvo una mezcla uniforme. Se coloco parafina alrededor de la tapa del tubo para evitar fugas y contaminacion cruzada. Se pulverizo la parte exterior del tubo con etanol al 70 % y se coloco en un agitador orbital/mezclador a aproximadamente 175 RPM en el interior de una incubadora a 37 °C durante dos horas aproximadamente. Cada hora se agito energicamente el tubo para ayudar a disociar el tejido. Despues de 5 aproximadamente dos horas, se pulverizo de nuevo el tubo con etanol al 70 % y se devolvio al armario de seguridad biologica.

Despues el tejido digerido se filtro usando una unidad de filtrado Steriflip® (Millipore) para eliminar cualquier tejido sin digerir del tejido digerido. Dado que la gelatina de Wharton digerida tiene una consistencia viscosa similar a la miel, 10 se actuo con cuidado para evitar la contaminacion al abrir las tapas y manipular la gelatina. El tubo se coloco en posicion vertical, y se quito la tapa cuidadosamente. Para eliminar la gelatina que conecta el tubo y la tapa de la forma mas completa y esteril posible, se separaron el tubo y la tapa hasta que les siguieron pequenas hebras de gelatina. Los movimientos circulares eliminaron las hebras finales de gelatina de la tapa. Se actuo con cuidado para no contaminar el cuello del tubo con la gelatina. Una vez quitada la tapa, se anadieron 20 ml de solucion salina 15 tamponada con fosfato Dulbecco para diluir la gelatina. La tapa se reemplazo y ajusto, y el tubo se invirtio o agito varias veces para mezclar. Se quito de nuevo la tapa cuidadosamente y la unidad de filtrado Steriflip® se enrosco en la parte superior del tubo y se cerro hermeticamente. Despues el montaje se volco para que el tubo conico de 50 ml quedara boca abajo.

20 Se conecto una fuente de vacfo regulada al puerto de vacfo en el lateral de la unidad de filtrado. Mientras se realizaba el filtrado, se mantuvo la unidad de filtrado en una posicion vertical. Si fue necesario, el montaje de tubo/filtro se agito verticalmente para desprender el tejido retenido en el filtro. Una vez que se filtro todo el lfquido, se apago la fuente de vacfo y se saco el tubo conico de 50 ml. Se anadieron 10 ml de solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco al tubo conico de 50 ml para lavar cualquier celula restante que pudiera haberse adherido a los 25 laterales o al fondo del tubo. La tapa del tubo se reemplazo y ajusto y el tubo se invirtio o agito varias veces para lavar el fondo y los laterales del tubo. Se volvio a quitar la tapa y se volvio a conectar el tubo a la unidad de filtrado. Se volvio a aplicar vacfo hasta que todo el lfquido atraveso el filtro, en cuyo momento se desconecto el montaje de la fuente de vacfo.

30 El volumen total del filtrado era de aproximadamente 50 ml. Si fue necesario, se anadio al filtrado solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco para llegar al volumen final de 50 ml. Se coloco la tapa en el tubo de filtrado y se cerro hermeticamente. Se pulverizo la parte exterior del tubo con alcohol al 70 % y se sello con pelfcula para evitar las fugas y la contaminacion cruzada. El tubo se invirtio/agito varias veces hasta que la gelatina y la solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco se homogeneizaron. Despues el tubo se coloco en un agitador (a 175 RPM) en una 35 incubadora a 37 °C durante cinco minutos para homogeneizar mas la gelatina, con inversiones/agitaciones adicionales cuando se necesitaron hasta que se obtuvo una mezcla uniforme. Se pulverizo de nuevo el tubo con etanol al 70 % y se devolvio al armario de seguridad biologica.

La gelatina de Wharton homogeneizada, digerida se dividio en varios tubos conicos de 50 ml dependiendo del peso 40 inicial del cordon umbilical. Si el peso inicial no fue superior a 15 gramos, se uso un unico tubo conico. Si el peso inicial no fue superior a 30 gramos, se usaron dos tubos conicos. El numero de tubos usados fue igual al peso inicial del cordon umbilical en gramos, dividido por 15, redondeado hacia arriba. Cada tubo recibio un volumen aproximadamente igual de gelatina, se actuo con cuidado de no contaminar los cuellos de los tubos.

45 Despues el volumen de cada tubo se llevo hasta 50 ml con solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco, y el contenido de cada tubo se homogeneizo de nuevo. Posteriormente, cada tubo se cerro hermeticamente, se pulverizo con etanol al 70 %, se sello con pelfcula, se invirtio/agito varias veces, y se coloco en un agitador (a 175 RPM) en una incubadora a 37 °C durante cinco minutos para homogeneizar mas la gelatina, con inversiones/agitaciones adicionales cuando se necesitaron hasta que se obtuvo una mezcla uniforme.

50

Una vez homogeneizados, se hicieron girar a los tubos durante 20 minutos a 750 x g a 37 °C. Despues de girar normalmente quedo sedimento celular en el fondo de cada tubo de 50 ml. En la ausencia de un sedimento, se volvio a hacer girar a los tubos a 1000 x g durante 15 minutos a 37 °C. Se pulverizo a los tubos con etanol al 70 % y se les devolvio al armario de seguridad biologica. El sobrenadante se decanto lentamente, a un ritmo constante, sin agitar o 55 balancear el tubo para evitar que se desprendiera el sedimento. El sobrenadante decantado, una solucion homogenea de gelatina de Wharton con una reduccion del numero de celulas, se almaceno a o por debajo de - 20 °C como un reactivo separado para el cultivo de celulas madre.

Para cada sedimento celular, se anadieron 10 ml de solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco. Los tubos se 60 cerraron firmemente y se mezclaron con agitador vortex, invirtieron, y/o se transfirieron con pipeta varias veces para

que se mezclaran correctamente hasta que las celulas quedaran completamente en suspension. Despues los contenidos de todos los tubos de muestra se combinaron usando una pipeta en un tubo. Los tubos de muestra se volvieron a lavar con solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco para desprender cualquier celula restante, que se anadio ademas al tubo combinado, y el volumen se llevo a 50 ml usando solucion salina tamponada con fosfato 5 Dulbecco. Se cerro el tubo y se mezclo con agitador vortex/invirtio varias veces para mezclar. Se hizo girar al tubo durante 15 minutos a 500 x g a 37 °C. Normalmente quedo sedimento celular en el fondo de cada tubo. En la ausencia de un sedimento, se volvio a hacer girar al tubo a 750 x g durante 10 minutos a 37 °C. Se decanto cuidadosamente el sobrenadante en una matraz de residuos para no alterar el sedimento celular.

10 Posteriormente, se anadieron 25 ml de solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco al sedimento celular y, despues de cerrar y mezclar con agitador vortex/invertir varias veces el tubo para volver a suspender las celulas, las celulas pasaron a traves de un filtro Tube-top de 70 micrometres. El filtro se coloco en la parte superior de un tubo conico de 50 ml esteril. Las celulas resuspendidas se liberaron gota a gota de la pipeta de 25 ml esteril, directamente por encima del centro del filtro pero sin tocar el filtro. La suspension celular filtrada se recogio en el tubo conico de 50 15 ml. Se uso una solucion salina adicional 20 ml tamponada con fosfato Dulbecco adicional para lavar el tubo anterior para maximizar la recuperacion de las celulas, despues de lavar el tubo, estos 20 ml pasaron tambien gota a gota a traves del filtro. La solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco adicional paso gota a gota a traves del filtro para llegar al volumen final de 50 ml.

20 Se hizo girar el filtrado durante 10 minutos a 500 x g a 37 °C. Normalmente quedo sedimento celular en el fondo de

cada tubo despues de girar. En la ausencia de un sedimento, se volvio a hacer girar al tubo a 750 x g durante 10

minutos a 37 °C. Se pulverizo la parte exterior del tubo con alcohol al 70 % antes de devolverlo al armario de seguridad biologica, donde el sobrenadante se decanto cuidadosamente en una matraz de residuos, para no alterar el sedimento celular. Se llevo el volumen del tubo hasta 4,3 ml usando una solucion salina tamponada con fosfato 25 Dulbecco y se mezclo el contenido del tubo mediante pipeteo, agitacion, y/o mezcla con agitador vortex. Con una

pipeta de 1000 pL, la suspension celular se mezclo y se extrajo una alicuota de 0,3 ml para analisis de control de

calidad, dejando 4,0 ml de una suspension celular purificada de celulas madre de gelatina de Wharton sin cultivar.

Ejemplo 2. Almacenamiento de las celulas madre de gelatina de Wharton sin cultivar.

30

La suspension celular purificada del Ejemplo 1 se crioconservo en una bolsa de congelacion de 25 ml. Usando una jeringa de 60 ml con una aguja de 18 G, se anadieron 16 ml de plasma autologo, el 5 % de albumina serica humana, o una combinacion de los mismos a los 4 ml de suspension de celulas madre de gelatina de Wharton purificada. Se uso una almohadilla con alcohol para limpiar la parte superior de un vial con DMSO 55 %/ destrano 5 %. Despues, 35 se extrajeron 5 ml de mezcla de DMSO/Dextrano usando una jeringa de 60 ml con una aguja de 18 G y se anadieron lentamente a la suspension celular. El tubo de suspension celular se cerro hermeticamente y se invirtio suavemente para mezclar, teniendo cuidado de no hacer espuma o burbujas. Usando la misma jeringa de 60 ml, se transfirieron 25 ml de suspension celular a la bolsa de congelacion. La bolsa de congelacion se almaceno en un recipiente metalico en un soporte de poliestireno extruido a -80°C de 16 a 24 horas, opcionalmente seguido por un periodo 40 intermedio en un congelador de nitrogeno lfquido en el que las celulas fueron expuestas solo a la fase de vapor del nitrogeno lfquido y, finalmente, la fase lfquida del nitrogeno lfquido para un almacenamiento permanente. Alternativamente, la bolsa de congelacion con celulas se puede almacenar permanentemente en la fase vapor del nitrogeno lfquido.

45 Ejemplo 3. Eficacia in vivo

La eficacia terapeutica de las celulas madre de la gelatina de Wharton se demostro en un ensayo de cotrasplante con celulas progenitoras hematopoyeticas de la sangre del cordon umbilical para renovar un sistema hematopoyetico de mamfferos.

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Las celulas madre hematopoyeticas de la sangre del cordon umbilical se pueden administrar a mamfferos para reconstituir un sistema hematopoyetico danado, por ejemplo, por radiacion. El cotrasplante de las celulas madre de la gelatina de Wharton mejora el proceso de reconstitucion, mejorando el injerto de las celulas madre hematopoyeticas administradas y, por lo tanto, la capacidad de proliferar y reproducir un sistema hematopoyetico en 55 el nuevo huesped.

Para probar la eficacia de las celulas madre de la gelatina de Wharton, se coadministraron con celulas madre hematopoyeticas de la sangre del cordon umbilical (deficientes en NOD/SCID IL2Ry) a ratones que habfan sido irradiados subletalmente el dfa anterior con 300 cGy de radiacion gamma que extirpaba la medula osea. Se 60 administraron 1.000.000 de celulas sangufneas del cordon umbilical mononucleares a los ratones a traves de la vena

de la cola, ya fueran solas o con 10.000, 50.000 o 100.000 celulas madre de la gelatina de Wharton, o con 1.000.000 de celulas madre mesenquimales cultivadas a partir de la gelatina de Wharton. Sesenta dfas despues, se obtuvo la medula osea de los ratones para medir el numero de celulas que expresan CD45 humano, un marcador de superficie celular de las celulas hematopoyeticas humanas y un marcador surrogado de los injertos de celulas madre 5 hematopoyeticas humanas.

Como se indica en la FIG. 1, los ratones irradiados que no recibieron ninguna celula carecfan de las celulas que expresan el CD45 humano en su medula osea el dfa 60. Aunque los ratones recibieron solo celulas sangufneas del cordon umbilical mostraron un numero sustancial de celulas de la medula osea que expresan el CD45 humano, este 10 numero se triplico en ratones que recibieron celulas madre mesenquimales cultivadas a partir de la gelatina de Wharton o celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar. Sorprendentemente, 100.000 celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar proporcionan un beneficio igual o mayor que el beneficio de 1.000.000 de celulas madre mesenquimales expandidas en cultivo a partir de la gelatina de Wharton, lo que sugiere que las celulas madre de lagelatina de Wharton sin cultivar pueden ser mas de diez veces mas potentes in vivo que las celulas madre 15 mesenquimales cultivadas. De hecho, tan solo 10.000 celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar fueron casi tan eficaces como 1.000.000 celulas madre mesenquimales cultivadas. Mientras que el mecanismo preciso para la eficacia reducida de las celulas madre mesenquimales cultivadas no esta claro, las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar, mfnimamente manipuladas parecen tener ventajas terapeuticas importares in vivo.

20 Ejemplo 4. Diferencias en los perfiles de los marcadores de superficie celular

Ademas las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar difieren notablemente a nivel molecular de las celulas madre mesenquimales cultivadas a partir de la gelatina de Wharton.

25 Se analizaron los niveles de trece marcadores de superficie celular en una poblacion de celulas madre de la gelatina de Wharton no cultivadas utilizando ensayos estandar de anticuerpos y citometrfa de flujo, los resultados de describen en la FIG. 2. La FIG. 2 proporciona, para cada marcador analizado, un estandar de representacion bidimensional que muestra el porcentaje de celulas demostrando un nivel de expresion particular del marcador, detectado por el ensayo de anticuerpos. Los resultados de las celulas madre de la gelatina de Wharton se 30 representan con una lfnea oscura, y los resultados a partir de un control se representan con una lfnea clara. Como se indica, las celulas madre de la gelatina de Wharton mostraron altos niveles de CD49B, CD105, HLA-ABC, CD73, CD44, SSEA-4, CD29, y CD90 en comparacion con el control de antfgenos. Las celulas madre de la gelatina de Wharton no demuestran expresion sustancial de los marcadores CD34 y CD45 que serfa tfpico de las celulas hematopoyeticas, o de CD14, HLA-DR o CD133.

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La expresion de los mismos marcadores se analizo en celulas madre mesenquimales cultivadas a partir de la gelatina de Wharton; los resultados se muestran en la FIG. 3. Como se indica, en comparacion con el antfgeno de control, las celulas madre mesenquimales cultivadas demostraron altos niveles de CD49B, CD105, HLA-ABC, CD44, CD29, CD73 y CD90; un intervalo mas amplio de niveles de expresion de SSEA-4; y una falta de CD14, CD34, 40 CD45 y HLA-Dr. Comparando la FIG. 2 y la FIG. 3, incluso para los marcadores como por ejemplo CD105 que son elevados tanto en celulas madre mesenquimales cultivadas como en celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar, los patrones de expresion pueden ser muy diferentes, como los niveles observados de expresion en celulas madre de la gelatina de Wharton sustancialmente solapadas con el control de antfgenos, mientras que las celulas madre mesenquimales cultivadas ex vivo muestran niveles mas altos de expresion con poco solapamiento con el 45 control de antfgenos. Por lo tanto, las celulas que han sido purificadas a partir de la gelatina de Wharton sin cultivar no son especialmente potentes in vivo, tambien son marcadamente diferentes de las celulas madre mesenquimales cultivadas y expandidas a partir de la gelatina de Wharton como queda evidenciado por los patrones de sus marcadores de superficie celular.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para purificar celulas madre de gelatina de Wharton sin cultivar, consistiendo el

procedimiento en:

eliminar las arterias y las venas de un cordon umbilical que comprende la gelatina de Wharton; digerir el cordon umbilical triturando mecanicamente el cordon umbilical; lavar o diluir el cordon umbilical digerido antes de separarlo del cordon umbilical sin digerir; separar el cordon umbilical digerido y sin digerir;

10 sedimentar el cordon umbilical digerido por centrifugacion; filtrar el cordon umbilical digerido;

separar las celulas madre de la gelatina de Wharton del filtrado; y congelar las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar.

15 2. Un procedimiento para purificar celulas madre de la gelatina de Wharton cultivadas y sin cultivar,

comprendiendo el procedimiento:

la purificacion de las celulas madre de la gelatina de Wharton de acuerdo con el procedimiento de la reivindicacion 1; y

20 el cultivo de las celulas madre mesenquimales a partir del cordon umbilical sin digerir.
3. El procedimiento de la reivindicacion 2, donde las celulas madre mesenquimales se cultivan en el

cordon umbilical digerido.

25 4. Celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar, purificadas que carecen sustancialmente de

gelatina de Wharton semisolida para su uso en terapia donde las celulas tienen los niveles del CD73 reducido, y del CD105 reducidos en comparacion con las celulas madre mesenquimales cultivadas a partir de la gelatina de Wharton.

30 5. Las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar para uso de acuerdo con la reivindicacion 4

donde las celulas madre de la gelatina de Wharton se mantienen en una solucion esteril.
6. Las celulas madre de la gelatina de Wharton sin cultivar, purificadas para uso de acuerdo con las

reivindicaciones 4 o 5 donde las celulas madre de gelatina de Wharton son autologas o alogenicas al sujeto.

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