CN102905710A - 来自脐带胶质的新生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于脐带的细胞外基质的生物材料(尤其是水凝胶)在再生医学中的应用。本发明尤其涉及一种由糖胺聚糖组成的生物材料及其制备方法和用途，所述糖胺聚糖仅在脐带的脐带胶质(可任选与细胞组合作为组合治疗)中存在。

Description

来自脐带胶质的新生物材料

发明技术领域

本发明涉及一种由脐带的细胞外基质形成的生物材料（尤其是水凝胶）在再生医学中的应用。本发明尤其涉及一种基本由糖胺聚糖组成的生物材料及其制备方法和用途，所述糖胺聚糖仅在脐带的脐带胶质中存在。该产品的实施方案可被单独使用，或与基于细胞的疗法组合使用。

发明背景

由聚合物形成的生物材料在再生医学中起重要作用，因为它们为移植细胞的附着、增殖和分化提供暂时的三维锚定。这种三维结构为细胞间的联系以及细胞与生物材料组分之间的联系提供合适的平台。基质和细胞之间随时间的生物相互作用决定了细胞的增殖能力、其形成新组织的组构、其分化以及释放指导再生过程的信号（Dawson等，2008）。

为了产生这些现象，需要将生物材料在应用部位保持有限的时间直至其重吸收，使其结构保持足够长的时间以便得到具有再生效果的合适的细胞作用。

水凝胶是一种特定类型的生物材料，其具有许多使其适用于组织工程的特性。

水凝胶是由具有天然或合成性质的交联亲水聚合物形成的结构，具有在其结构内包含其自身重量的10-20%直至数百倍的大量水的能力。这些凝胶显示具有三维点阵的半固体形态，该三维点阵是形成充当支持物的结构基质的理想候选物。这些三维结构可以通过物理交联和化学交联形成。物理交联产生可逆的水凝胶，根据最终应用其结构可以逆转，而共价化学交联产生固定的水凝胶，其结构在整个应用过程中都被保持（Coburn等，2007）。因此，水凝胶是使用三维网络形式交联的聚合材料（具有天然或合成性质），其在接触水时膨胀，形成软的弹性材料，并且在它们的结构中保留其大部分组分而无溶解。

水凝胶具有一系列特性，例如：

1.亲水性：由于它们的结构中存在水溶性基团（-OH、-COOH、-CONH₂、-CONH、SO₃H）。它们具有类似于自然组织的高含水量（Elisseeff等，2005）。

2.不溶于水：由于它们结构中紧密结合的三维聚合物网络的存在。

3.它们具有胶状的稠度，这是由亲水起始单体和聚合物的低交联密度决定的。

所述水凝胶能够在存在水或水溶液时膨胀，显著增加其体积直至达到化学-物理平衡，但不失去它们的形状。这种膨胀能力提供的水性微环境与细胞在软组织中遇到的水性微环境相当。水和多孔结构的存在还允许低分子量溶质和营养物的流动（这对于细胞活性是重要和必要的），以及将细胞废弃物输送到水凝胶外（Torres等，2000）。

糖胺聚糖（GAG），也称为粘多糖，是被发现在生物体中与称为蛋白多糖的蛋白细胞核结合形成大分子的杂多糖。这些可以发现于细胞表面或细胞外基质中，并实现细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用的重要功能。糖胺聚糖采取硫酸化和非硫酸化的形式，其具有常见的特征性的分子部分，该分子部分包括由两种不同的糖形成的二糖重复序列；其中一种通常是己糖醛（hexuronate），而另一种是己糖胺。二糖键合以及硫酸化位置的结构变化导致这些链的物理和化学性质多样性的增加。高硫酸化的含量和糖醛酸的存在给GAG提供大量的负电荷，所以WJ中的大量GAG使得该组织极度亲水。

存在数种类型的GAG，其直接参与基本细胞功能，不仅由于它们的结构，还因为它们是数个细胞信号转导分子的锚定位点。

透明质酸是WJ中最丰富的GAG。它是GAG家族中唯一非硫酸化的成员，其在体内的功能就像游离的碳水化合物，其结构由二糖：D-葡糖醛酸和（1-β-3）N-乙酰基-D-葡糖胺的重复组成（Goa等，1994；Laurent等，1992）。透明质酸由数种细胞类型合成，并被分泌进入细胞间隙，在细胞间隙中其与细胞外基质的其它组分相互作用以产生围绕细胞的支持和保护结构（Collins等，2008）。透明质酸是大的聚阴离子型线性聚合物，其具有分子量为100,000至5×10⁶Da的单个分子（Toole等，2004；Bertolami等，1992）。透明质酸具有占据大体积的螺旋结构，产生高粘度溶液。透明质酸的单个分子彼此结合，形成网络或点阵。在形成组织时，透明质酸被认为是参与细胞增殖和迁移的主要结构大分子。

透明质酸已经参与数个过程，例如血管形成、形态发生以及在细胞外基质的整体完整性和修复中。已知羊水中包含的大量透明质酸有利于胎儿伤口的修复（Longaker等，1989）。还可以观察到在健康皮肤和疤痕之间透明质酸分子性质的差异，典型疤痕的透明质酸与肥大性疤痕的透明质酸不同（Ueno等，1992）。

硫酸软骨素是由D-葡糖醛酸二聚体和N-乙酰半乳糖胺重复形成的线性聚合物。已经在针对关节疾病的疗法中检测了其有效性，通过抑制导致软骨组分的基质降解的酶的活性。通过抑制补体，硫酸软骨素可以充当抗炎剂，并可用于在手术和眼科诊所中治疗血栓栓塞病症。

硫酸皮肤素，也称为硫酸软骨素B，是一种有效的抗凝剂，由于其通过肝素辅因子II对凝血酶的选择性抑制作用，其在体内非常有效，因为其出血风险更低（Trowbridge等，2002）。

通常糖胺聚糖（尤其是肝素）具有调节血浆级联活性的能力，增强内在凝结途径的抑制并在不同点抑制典型的补体激活途径（Rabenstein，2001）。肝素的其它已知功能是血管发生的抑制，体液生长及其抗病毒活性。

硫酸类肝素具有与肝素密切相关的结构。其在动物组织中广泛分布，在其功能中，细胞附着和细胞增殖的调节是最重要的。硫酸类肝素具有抗蛋白降解的保护作用，调节它们通过基底膜输送以及干扰其内化（Rabenstein，2001）。

有数篇专利文献涉及获自人或动物来源的粘多糖。文献US 3,887,703涉及由来自胎牛或胎羊来源的皮肤皮层和脐带获得的粘多糖混合物。在前述专利中获得粘多糖的方法未描述脐带的膜、细胞和血管组分的去除。提取产物以粉末形式获得，而对于其中包含的单个粘多糖没有组成上或定量上的清楚认识。通过混合物中存在的己糖胺的量来鉴定活性产物。用提取物来制备用于治疗油性头皮和毛发以及炎症的注射形式和口服摄入形式的组合物。

专利文献US 5,814,621涉及一种基本上由与水相比更易溶于有机溶剂-水混合物的药物以及构成药物一部分的粘多糖组成的组合物，其中药物的晶体或颗粒分布在粘多糖颗粒的表面，并且与其单独形式相比，所述药物更快地溶于水。所述组合物可为颗粒形式。

专利申请WO 2008/021391 A1描述了包括脐带膜的生物材料。此外，它还包括一种或更多种脐带血管和/或脐带胶质。生物材料优选的是干燥的，可以是扁平状、管状或适合特定结构的形状。本发明还提供制备包括至少一层脐带膜的生物材料的方法，以及获得所述生物材料的方法及其用于修复组织或器官的用途。

说明书表征了来自脐带的生物材料。它描述了所述材料的组成包括胶原（I、III和IV型，这些占生物材料基质的75-80%）、纤连蛋白和糖胺聚糖。

它还提及生物材料还可以包括不是来自脐带的胶原，并具有商品化来源，或已经利用该领域当前水平已知的方法将其从其它组织分离。作者还补充了生物材料可以包括非结构的化合物例如生长因子、激素、抗生素、免疫调节因子等。

西班牙专利ES 8600613描述了以下方法：用于治疗机体组织，用于分离细胞膜、核酸、脂质和细胞质组分以及形成细胞外基质（其主要组分是胶原），和用于制备适于用做机体移植物的机体组织，其包括用至少一种清洁剂提取所述组织并且同时将其保持为适于被移植到体内的大小与形状。

专利文献ES2180653T3描述了将生物材料转化为已经历自溶作用去除至少70%细胞的物质的方法，以及处理所述材料以抑制其在移植入人或动物后矿化的方法。它要求起始生物材料可以是（尤其是）脐带；尽管它具体涉及猪的主动脉瓣。尽管如此，说明书没有包含涉及利用脐带实施的任何详情。使用获得的生物材料产生生物心瓣膜。

专利文献US 4,240,794涉及制备人或其它动物脐带以用做血管替代物。该文献具体描述了将脐带在醇中脱水的技术，然后是将其固定为所需形态的方法。根据描述，一旦从脐带上去除其它组织的可能残留，就将其固定在轴上，浸于特定的乙醇溶液至脱水必需的时间。脱水后，将脐带浸入1%醛溶液进行固定。

专利文献FR 2,563,727描述了一种从去程序化的结缔组织（用脐带胶质浸渍并保存于冷冻温度）制备皮移植片的方法。作者描述了一种锚定到脐带组织的装置，并通过注射压缩空气的插管将其膨胀。根据描述，然后将脐带切割并分离，但利用这种方法得到的产物不仅仅由WJ组成。

存在使用脐带获得感兴趣的细胞的专利文献，为了这个目的他们实施分离脐带胶质并将其去除的方法，从而获得所述细胞。例如，PCT文献98/17791描述从脐带分离前软骨细胞，其随后在治疗上用于产生软骨。类似地，在文献WO 2004/072273 A1中，从位于脐带血管周围区域内的脐带胶质提取祖细胞，用于修复人组织。

与其它生物材料不同，本发明的生物材料由脐带WJ中存在的不同GAG的组合组成。它主要由透明质酸组成，但此外，与其它GAG化合物不同，它包含硫酸皮肤素、硫酸类肝素、肝素、硫酸角质素、软骨素-4-硫酸盐和软骨素-6-硫酸盐。如脐带的WJ中存在的不同GAG的特定组合提高了生物材料的生物活性，因为它们中的每一种都发挥细胞行为的调节功能。例如，已知硫酸类肝素和肝素是FGF和EGF的主要结合部位（Kanematsu等，2003；Ishihara等，2002），其保护它们免遭蛋白水解并允许细胞环境中这些因子的局部浓度，产生适合于大细胞活化的分子微环境（Malkowski等，2007）。

但是，据我们所知，没有文献提及由源自脐带的脐带胶质的GAG形成的生物材料，所述脐带的脐带胶质：1）不含脐带膜和血管，2）其可以形成具有可调节粘度的水凝胶，3）其适用于范围广泛的人疾病。而且，前述专利实施例包括脐来源的产物，其与该文献中提出的当前实施方案有显著差异。本发明的生物材料仅仅基于形成脐带的细胞外基质（称为脐带胶质WJ）的糖胺聚糖。因此，虽然从文献有多次合成细胞外基质的尝试，但还没有实现模拟特定组织自然条件的准确的组合物。

本发明中开发的生物材料可提供一种三维支架，其具有作为组织工程基质的潜在应用。此外，当在疾病中作为一部分直接应用或与细胞组合应用时，它参与再生过程，对周边组织的细胞发挥趋化作用，从而为细胞过程的活化提供良好的环境。

这种生物材料中存在的GAG组合提供许多特异性的信号转导分子结合位点，其允许在应用位点组织自身细胞的高度活化以便合成高水平的细胞外基质，其将再生和修复被治疗的缺陷。

此外，本发明生物材料的来源提供来自非免疫原性区域的人或动物来源的天然产物。该材料在体内通过天然生物降解方法去除，从而阻止由其它生物材料引起的不期望的反应或副反应。例如，一些合成生物材料可能引起炎症、硬化(器官组织的硬化)、肉芽瘤的发病，粘膜坏死以及由用于其制备的有毒物质造成的组织并发症。

GAG在脐带中是提供强度、弹性和抗性以保护位于其中的血管系统免遭外部物理干扰（例如脐带扭转对胎儿将是致命的）最重要的功能之一。实际上，怀孕期间重要的疾病涉及这些分子合成中的缺陷（Gogiel等，2005）。因此，可认为由7种不同类型的GAG（能够成脐带的一部分）组成的生物材料将通过具有以下功能而具有很大程度的通用性：生物体中存在的生物活性的重演(recapitualtion)、具有有益于脐带的相同的机械性能，以及具有对于进一步处理和修饰（例如交联）的适用性。

附图描述

图1：本发明生物材料中存在的GAG的表征和定量。柱状图显示本发明生物材料中存在的不同类型的GAG，以及其各自的组成百分比。HA：透明质酸，KS：硫酸角质素，C6S：软骨素-6-硫酸盐，HS：硫酸类肝素，C4S：软骨素-4-硫酸盐，DS：硫酸皮肤素，H：肝素。

图2：通过组织学染色对样品中存在GAG和不存在细胞和DNA/RNA的验证。左图显示含有细胞的样品，右图显示单独的生物材料的染色。A、B：苏木素伊红染色；C、D：甲基绿焦宁染色；E、F：阿尔辛蓝染色。

图3：通过扫描电子显微镜显示的本发明生物材料的内部三维结构的图像。该图像以两种不同的放大率（A：10μm和B：5μm）显示本发明生物材料的内部结构，其中可以观察到GAG单位彼此相连，提供非常均匀的多孔结构。

图4：本发明生物材料中细胞毒性研究的结果。该图显示AMSC细胞（脂肪来源的间充质干细胞）（图A）、小鼠成纤维细胞（图B9）、L929（图C）、成骨细胞（图D）、软骨细胞（图E）和角质形成细胞（图F）的细胞毒性曲线。给出相对于对照（不含生物材料的细胞）和阳性对照（在根据ISO-10993标准确定的有毒生物材料PVC中的细胞）的结果。从图中可以观察到，在任一被检测的细胞类型中生物材料都不造成毒性，因为放置在生物材料上的细胞的线粒体活性没有显示与对照细胞的差异（在标准培养条件下）。

图5：三维生物材料的放大的图像。所显示为冻干后本发明固体生物材料的肉眼可见的三维结构，使用标准的24孔培养板作为冻干模子。

图6：倒置光学显微镜图像显示关节软骨细胞（软骨细胞）的活性，以及在本发明的生物材料中的共培养物中用MTT染色的MSC。分别在第3天和第7天染色。染成黑色的细胞是有活性的和代谢活跃的。

图7：本发明的生物材料和透明质酸中人软骨细胞增殖能力的对比。图中的数据显示：相对于在透明质酸中培养的软骨细胞，在本发明的生物材料中培养的软骨细胞的增殖能力显著增加。

图8：接触本发明的生物材料和透明质酸的成纤维细胞L-929的增殖率。该图显示当与在透明质酸中培养的细胞相比时，在本发明的生物材料中排列的细胞增殖显著增加。

图9：使用本发明的生物材料以及接触细胞培养表面放置的透明质酸水凝胶，在细胞培养塑料上接种的细胞的倒置荧光显微镜图像。在这些图像中，可以观察到接触本发明的生物材料的细胞从细胞培养表面分离并在本发明的生物材料中成簇。

图10：胶原II和多功能蛋白聚糖的表达的RT-PCR。来自琼脂糖胶的光密度扫描的结果。数据表示为相对于对照值（C）的强度的任意单位和平均值±s.e.m，n=3。（*p<0.05，**p<0.01）。该图像显示II型胶原表达的开始以及放置在本发明的生物材料上的AMSC中多功能蛋白聚糖的减少。这些表达特性表示在向软骨细胞表型分化的过程中成熟的关节软骨相应的细胞以及细胞外基质的合成。

图11：来自猪和人来源的3种不同浓度的本发明生物材料的储能模量结果。从来源于各样品的线性粘弹性区的单一激发频率/应变收集数据。通过温度扫描（包括生理值的温度）得到全部样品的粘弹性温度关系。

图12：来自猪和人来源的3种不同浓度的组织原的损耗模量结果。从来源于各样品线性粘弹性区的单一激发频率/应变收集数据。通过温度扫描（包括生理值的温度）得到全部样品的粘弹性温度关系。

图13：来自猪和人来源的3种不同浓度的本发明生物材料的损耗模量结果。从来源于各样品线性粘弹性区的单一激发频率/应变收集数据。通过温度扫描（包括生理值的温度）得到全部样品的粘弹性温度关系。

图14：光学显微镜图像，其显示在第1天（a）、第3天（b）和第4天（c）细胞从周边组织聚集（趋化作用）；其中（i）对应于阳性对照，（ii）对应于透明质酸实验方案，（iii）对应于阴性对照和（iv）对应于本发明的生物材料实验方案。

图15：光学显微镜图像，其显示在进行存活/死亡测定后确定迁移至软骨片段表面的细胞是否有活性。该图像显示来自软骨片段的绝大多数细胞是有活性的。

图16：光学显微镜图像，其显示在第5天（a）和第6天（b）细胞从周边组织聚集（趋化作用）；其中（i）对应于阳性对照，（ii）对应于透明质酸实验方案，（iii）对应于阴性对照和（iv）对应于本发明的生物材料实验方案。

发明详述

脐带包含形成软结缔组织（称为WJ）的一部分的大量GAG（硫酸化和非硫酸化的）。在这些GAG中，主要的非硫酸化GAG是透明质酸（Hadidian等，1948；Jeanloz等，1950），尽管还检测到更小比例的硫酸化GAG（Danishefsky等，1966）。此外，脐带的组织学研究表明肝素的存在（Moore等，1957）。还很有可能的是，脐带含有更多的仍未被鉴定的少量硫酸化GAG。

本发明涉及一种由GAG组成的可注射性水凝胶，所述GAG仅在脐带的WJ中存在。该水凝胶完全不含脐带中存在的细胞和任何其它血管组分，该生物材料可从脐带中获得，所以它没有免疫原性或免疫原性很低。本发明的生物材料（以其与细胞组合的形式或者单独）用于治疗和美容处理

在本发明的上下文中，下列术语如下所定义：

"水凝胶"是指胶体的形成，其中分散相（胶体）已经和连续相（水）组合以产生粘性的胶凝物质。胶体通常是合成产物或天然产物的亲水性丝的互穿网络。

"注射"是指将物质强制插入到空腔中。例如，将物质（通常有治疗价值）注射到伤口中，或注射到体腔、体循环或其它部位。就本发明的目的而言，注射可由穿入预期部位的各种模式构成。例如，注射可包括皮下范围0.5mm至15mm规格尺寸的注射针头。在关节镜或腹腔镜手术中，使用圆柱形孔(cylinder port)、针头，或其它类似物来治疗内部疾病。在该注射形式下，治疗剂例如支架强制穿过进入孔，该孔可以具有比皮下注射针头大很多的规格尺寸（例如0.5cm-4cm）。

"可注射性水凝胶"是指使用注射技术将水凝胶应用于穿透皮肤屏障的疾病的行动。例如，疾病可以是需要治疗的慢性伤口、受损的器官、受损的组织或皮肤屏障下的任何其它损伤。从皮下注射到关节镜/腹腔镜技术到特别设计的特殊装置，应用方法可以广泛地变化以将材料应用于患病区域。例如，可以使用堵缝枪类似物来递送高粘度物质；可以将使线穿过针头的装置应用于递送丝状聚合的水凝胶物质；可利用关节镜/腹腔镜孔来递送踝突软骨缺陷的水凝胶栓。本领域技术人员可以理解多种可能的注射技术。

"交联的水凝胶"是指水凝胶的离子或共价稳定作用，其可能是可逆或不可逆的。相比比非交联的水凝胶，交联的水凝胶具有更高的粘度、适于操作、具有稳定的三维形态，并且会在施加机械力时破裂。

"三维水凝胶"是指保持三维形式的交联的水凝胶，所述三维形式包括稳定的精细三维结构例如孔。与此相反，非交联的水凝胶将流动以填充放置它的任何容器。在交联的水凝胶中的这种流动阻力是交联的水凝胶保持稳定三维结构的能力的特征。

来自为本发明的目的而提取的WJ的脐带可以来源于哺乳动物，其包括动物和人两者。WJ的其他潜在来源是下述动物的脐带，例如：牛、绵羊、猪、羚羊、骆驼、鹿、山羊、马、大象、犀牛、河马、长颈鹿、野牛、水牛、虎、狮、豹、熊等。该生物材料由选自以下的糖胺聚糖的混合物形成：透明质酸、硫酸角质素、软骨素-6-硫酸盐、硫酸类肝素、软骨素-4-硫酸盐、硫酸皮肤素和肝素。

优选发现生物材料形成下述组合和比例的GAG混合物：透明质酸（40-80%）、硫酸角质素（2-25%）、软骨素-6-硫酸盐（3-10%）、硫酸类肝素（1-9%）、软骨素-4-硫酸盐（0.5-7%）、硫酸皮肤素（0.1-7%）和肝素（0.05-3%），更优选的GAG组合是：透明质酸（70%）、硫酸角质素（10%）、软骨素-6-硫酸盐（7%）、硫酸类肝素（5%）、软骨素-4-硫酸盐（4%）、硫酸皮肤素（3%）和肝素（1%）。

本发明还涉及由先前描述的水凝胶组成的生物材料，其任选地与细胞组合以起到组合治疗作用。生物材料现在含有有助于产品效果的健康细胞，由于这一事实，在严重受损的组织或不可能通过患者原位细胞补充的组织中，水凝胶在再生和组织修复过程中的作用得到增强。此外，加入生物材料支架以形成构造的细胞可以是：未分化的间充质干细胞或分化为另一种细胞株的间充质干细胞，未分化的造血干细胞或分化为另一种细胞株的造血干细胞、软骨细胞和成软骨细胞、成骨细胞和骨细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞或来自神经系统的其它细胞、来自白血细胞系统的细胞、角膜细胞、内皮细胞或上皮细胞。

本发明被分为下面几个部分：（i）从脐带的脐带胶质获得GAG的提取物，（ii）从脐带的脐带胶质分离的GAG水凝胶的制备，（iii）表征获得的水凝胶和（iv）水凝胶生物材料的用途。此外，之后的研究/实例显示当与透明质酸（HA）对比时，可注射性水凝胶影响积极细胞行为和相互作用的能力。

从脐带的WJ获得GAG的提取物

用于获得生物材料的方法包括下列步骤：

a.由动物或人来源获得脐带；

b.用盐溶液和抗生素处理脐带；

c.去除脐带表面的所有血液；

d.将脐带分为1-2cm的片段；

e.清洁内部残留的所有血液；

f.去除脐带膜和血管；

g.分离包括脐带胶质的胶凝物质；

h.酶法消化获得的胶凝物质；和

i.沉淀并分离GAG。

具体来说，进行下列步骤以从脐带的WJ分离糖胺聚糖：

获得脐带胶质

在分娩后立即收集脐带，对其进行处理或处理前在4℃保存。在这些条件下不应超过24小时。

为了处理，脐带优选的在II级生物安全的层流净化罩中无菌条件下放置。用含有抗生素混合物（青霉素、链霉素、两性霉素B）的细胞培养基DMEM（Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium）溶液或磷酸盐缓冲液1×（1×PBS）和/或红细胞裂解缓冲液将其连续清洗至少3次，以完全去除血液残留。

一旦去除掉脐带表面的血液，将其转移到培养皿，分成1-2cm的片段。将脐带切割为片段时，脐带血管内残留的血液有可能被排出，在这种情况下有必要彻底清洗脐带片段。

在结构水平上脐带具有两条脐带动脉和一条脐静脉，由WJ的坚固基质支持并覆盖薄膜。为了仅获得WJ，用机械方法去除膜和血管。为此，将脐带片段纵向切开，利用手术刀和镊子小心去除脐带膜和血管。利用这种机械分离获得的胶凝物质是WJ。从25到200g脐带通常获得20至160g脐带胶质。

从脐带胶质提取GAG。

使用文献（Rogers等，2006）中描述的方案，通过来自木瓜的木瓜蛋白酶的酶促消化从软骨获得GAG（SIGMA，Ref：P4762）（其中作了一些改动）从脐带的WJ获得GAG。将之前获得的WJ在60℃浸润于20ml提取缓冲液（5mM L-半胱氨酸、100mM Na₂HPO₄缓冲液、5mM EDTA、10mg（14U/mg）木瓜蛋白酶，pH 7.5）中24-48小时以便完全消化。

一旦WJ被完全消化，将其离心以去除无用的消化残留物。此时，观察到消化体积大于初始体积。这种增加是由于WJ中存在的GAG溶解并从而释放它们聚集的水。

一旦样品被离心，将上清转移到另一容器，然后沉淀出样品中存在的GAG。

从脐带的WJ沉淀和分离GAG。

利用5体积的100%乙醇沉淀出WJ的GAG。通过这个步骤，样品的GAG以及其中存在的盐被沉淀出。由于样品中存在的水分子与乙醇分子相互作用导致沉淀，这样的话水分子无法与样品的GAG相互作用，后者变得不溶于水，从而沉淀出。因此，就在添加乙醇并振摇管子以后，观察到白色沉淀。使GAG在-20℃下沉淀12小时。一旦沉淀出，将它们离心以去除100%乙醇，用5体积的75%乙醇清洗沉淀来去除可能残留的盐（它们沉淀出在样品上）。将样品再离心一次以完全去除上清。

一旦沉淀出GAG样品，将残留物在环境温度静置干燥至少30分钟，直至所有乙醇都被蒸发。一旦乙醇被蒸发，将GAG样品重悬于Milli-Q H₂O，并在使用前在4℃保存。由此获得的水凝胶可与可注射性血清混合和或直接应用于待治疗的区域。尽管如此，该类型材料机械抗性低；不考虑将其用于承载负荷，除非它与增强材料组合以形成复合材料。例如，在复合材料中磷酸钙支持物可以充当增强基质。此外；在组成该可注射性水凝胶的多糖分子中存在非常高的亲和力。水凝胶生物材料的高凝聚中该亲和力是明显的。但是，还存在对水凝胶的实质胶粘性质，这有利于注射处水凝胶的局部分离。最后，水凝胶的通用性表明其可被单独施用或与细胞组合施用。

存在需要更加具有抗性、稳定和耐久的可注射性水凝胶生物材料的其它治疗应用，所述生物材料的内部结构可以更好地促进来自应用部位中相邻组织的细胞或在其移植前位于生物材料上的特定细胞形成集落。在这种情况下，本发明的生物材料将作为生物活性三维基质来诱导组织伤口的治愈和修复。

透明质酸、软骨素-6-硫酸盐和软骨素-4-硫酸盐、硫酸角质素、硫酸皮肤素、硫酸类肝素和肝素调节细胞活性和并活化新细胞外基质的合成。生物材料中存在的GAG的多样性和组合物允许大量对于生长因子特异的结合位点的存在，所述生长因子调节细胞增殖和分化过程，以及细胞合成新的细胞外基质和生长因子的能力。这种作用在患病组织中导致更强的细胞应答能力，并加速再生，就极度退化的区域来说甚至允许治愈，如慢性溃疡的情况。

在生物材料用作稳定的三维支架的地方，需要有稳定（交联）策略以便促进应用。为实现这一目标，可将GAG化学修饰或交联以形成本发明的可注射性水凝胶。这些化学修饰（交联、聚合）通常涉及醇或羧基，并于注射后或注射前在原位出现。此外，这一过程涉及水溶性聚合物的链变为不溶性的（Elisseeff等，2005）。

通过交联获得的可注射性水凝胶具有使其能够用于组织工程的独特的性质：用于携带营养物或废弃物的高含水量、弹性以及在3D微环境下原位包裹或固定细胞的能力。交联密度直接影响可注射性水凝胶的孔径大小，从而影响其物理特性，例如含水量或机械抗性。具有大交联密度进而非常小的孔径的可注射性水凝胶将吸收更少的水份，比具有更低交联度和大孔径的可注射性水凝胶具有更大的机械抗性。

通过交联的可注射性水凝胶的形成可以通过数种方法来进行，所述方法包括但不限于：温度变化、化学反应和光聚合作用。可通过标准皮下注射方法在注射后在原位进行交联或在注射前在体外进行交联，从而使用的技术更类似于如本文献之前所定义的腹腔镜检查/关节镜检查。

在本发明的一个实施方案中如下进行交联反应：获得待交联的聚合物的水溶液（本实例中是GAG的水溶液），添加将促成交联的化学试剂。在这种情况下，为了获得稳定的水凝胶，使用EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐），因为EDC活化水溶液中的羧基。这些活化的羧基能够与伯胺或羟基反应，产生酰胺或酯键。一旦形成水凝胶，将其用PBS清洗数次以去除可能剩余的EDC残留物。（Pieper等，1999；Wissink等，2001）。

任选地，可以在交联反应期间在为了所述目的设计的模子中将可注射性水凝胶固化，这样的话所需的形状和大小取决于使用的模子。可以通过所谓的冻干方法干燥这些水凝胶，由于去除了水凝胶中存在的GAG分子间插入的水分子，从而获得多孔结构（图5）。此外，一旦生物材料被冻干，可以通过扫描电子显微镜（SEM）表征水凝胶的三维结构（图3）。一旦获得其最终形状的水凝胶，通过暴露于紫外线将其灭菌40分钟。水凝胶上进行的无菌试验显示生物材料被彻底灭菌。如本领域技术人员将认识到的那样，其他灭菌技术可以是环氧乙烷气体处理或γ辐照。

一旦被灭菌，可注射性水凝胶准备好直接使用或与细胞联用。基于增殖能力实验的结果，利用本发明水凝胶的细胞结合测定显示生物材料无细胞毒性（图4）。

生物凝胶的用途

本发明的生物材料（与细胞组合的形式或单独的形式）可以其可注射形式应用于关节系统疾病和美容处理。其中，可以使用的细胞是：未分化的间充质干细胞或分化为另一种细胞株的间充质干细胞、未分化的造血干细胞或分化为另一种细胞株的造血干细胞、软骨细胞和成软骨细胞、成骨细胞和骨细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞或来自神经系统的其它细胞、来自白血细胞系统的细胞、角膜细胞、内皮细胞或上皮细胞。

取决于水凝胶的预期的治疗或美容应用，注射技术将是不同的，水凝胶的粘度应适合注射系统的口径。

本发明的水凝胶的粘度可为从10到150,000cS；在非交联的水凝胶的情况下为从10到15,000cS，优选为10到2,000cS。交联的水凝胶可具有从15,000到150,000cS的粘度。根据需要可以通过交联改变水凝胶的粘度。

表1。如本发明的生物材料中所描述，来源于脐带胶质的各种非交联的和交联的水凝胶的粘度值。

水凝胶	粘度（cS）
		5%-10%人/猪来源（交联的）	70,000
50%人/猪来源	15,000
		40%人/猪来源	9,100

30%人/猪来源	4,900
		20%人/猪来源	2,000
10%人/猪来源	150-580
		5%人/猪来源	19-58
1%人/猪来源	4-6

本发明开发的生物材料优选以可注射形式用于下列疾病：重建、填充或重构软组织；治疗皱纹、皱褶和疤痕、烧伤、溃疡、软组织增大、脸部脂肪萎缩、椎间盘疾病；修复软骨、肌骨胳损伤、骨关节炎和关节周炎；治疗肿瘤、阴道疾病、脑损伤、骨髓修复、神经变性病症，心血管疾病和润滑过程，作为止痛剂和抗炎剂。

本发明的交联的可注射性水凝胶可以具有实质的多孔结构。在一个实施方案中孔径为0.5-1,000μm，优选0.5-500μm，其粘度大于15,000cS。所述生物材料优选作为支架应用于下列疾病：治疗烧伤、溃疡和皮肤表皮缺陷；治疗眼科疾病，例如角膜损伤、视网膜损伤或白内障；修复软骨；治疗骨关节系统，例如骨软骨缺陷、骨关节炎或骨缺陷的情况，和阴道疾病解决中的佐剂；治疗牙龈炎和牙周炎；用于开发细胞培养系统。

软骨疾病是世界范围内重要的社会经济问题。从这种意义上讲，尽管很难记录它们的发病率，据估计有5亿人患有关节损伤。

软骨病作为损伤或疾病的结果出现，如果不进行治疗，可能导致退行性疾病例如骨关节炎（OA）。

OA是最常见的关节炎类型之一，在美国和欧洲有3500万到4000万人患有OA。它是一种变性疾病，引起软骨的分解并伴随骨的反应。它通常影响手、膝、髋部、脚和颈部，在成人中，它被认为是身体失能的最常见原因之一。

关节软骨是高度特化的无血管组织，保护动关节的骨免受引起关节表面间的摩擦的与体重和撞击有关的力。该组织由单一的细胞类型（软骨细胞）以及重要并且丰富的细胞外基质组成。所述基质由II型胶原纤维（主要的分子）的致密网络以及这一网络内的蛋白多糖大聚集物（包含GAG例如硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸和聚集蛋白聚糖(aggrecan)）组成。

软骨的特化结构以及其有限的修复能力使得这类损伤的治疗非常复杂。血管形成的缺失使其再生能力非常有限，因为再生过程中干细胞无法接近受损区域发挥作用。

近年来，已经使用可生物降解的生物材料来治疗软骨损伤。从这种意义上讲，宏观的合成聚合物（乳酸、羟基乙酸、己内酯…）已经成为最重要的和许多组的生物材料。但是，这些固体的宏观材料需要侵入性手术方法的使用，例如常规手术。为了克服这些限制，目前正在开发可以通过最低限度的侵入性技术植入（例如通过注射或关节镜技术）的新的生物基质。

因此，本发明的可注射性生物材料的一个应用是骨关节炎退化过程中受损的关节软骨的再生。通过局部注射技术例如关节镜检查或通过任何注射装置，本发明的可以方便的在待再生的区域施用。除了方便施用之外，可注射性水凝胶具有形成稳定植入物的性质，其适合退化组织的大小和几何形状。

本发明的生物材料的另一应用是用于伤口的治疗。在美国，慢性糖尿病、褥疮和静脉曲张性溃疡是影响3百万至6百万人的重要问题。该疾病影响发达国家人口的1-3%，普遍认为医院中15%的患者患有这种疾病。患有这些病害的大量患者造成相当大的社会经济和保健反响，因此形成高的治疗费用，患者的生活质量也被显著改变。

溃疡是对生物体具有深远影响的创伤，具有相当复杂的生理病理学。在创面床上存在的成纤维细胞（真皮的细胞）、角质形成细胞（表皮的细胞）、细胞外基质和血浆衍生的蛋白之间发生复杂的协同相互作用。不同伤口愈合期：止血、炎症、修复和重建的进展是典型的，但是这些伤口的慢性病性质和复发具有临床重要性。尽管目前存在大量可用的治疗和支架，但治愈百分比和治愈速度仍然非常低，因此需要更有效的治疗方法可以实现快速的创伤愈合。近年来获得越来越多的关于慢性溃疡的生理病理学的知识已经开发出新的支架，它是所述疾病治疗的显著进步。但是迄今为止，没有覆盖皮肤的理想支架；所述支架必须符合一系列基本特点，例如：1）快速粘附到伤口，2）提供防止液体损失的有效屏障，3）机械弹性和长期稳定性，4）容易灭菌，5）易于处理和运输，以及6）它们必须是无害的。

总之，本发明的生物材料具有能够有效治疗所述疾病的支架或稀释剂所必需的大部分特点。从这种意义上讲，为了评价本生物材料的治疗效果，已经进行了体内实验研究，如实施例9和10所描述。

实施例

实施例1：获得脐带胶质。

用人和猪来源的脐带进行下列实施例。为了从各自脐带的WJ分离GAG，按照下面的方法进行。

在每种情况下，分娩后立即将50g脐带收集到无菌瓶，之前已经在瓶中保存了300ml 1×浓度的PBS(对于1升H₂O：8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄，pH=7.4溶于1 L H₂O）和3ml青霉素（30,000单位）、链霉素（30,000μg）和两性霉素-B（75μg）的1×浓度的抗生素混合物（LONZA，Ref：17-745E）。脐带在处理前可以在4℃保存不超过24小时，但在本实施例中，在收到脐带后立即将其处理。

为了进行处理，脐带在II级生物安全层流净化罩的无菌条件下放置，进行连续清洗以完全去除它们包含的血液残留物。为此，将它们置于两个容器，向其中加入包含3ml青霉素（30,000单位）、链霉素（30,000μg）和两性霉素-B(75μg)的抗生素混合物的300ml 1×PBS（对于1升H₂O：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄、pH=7.4溶于1L H₂O）（LONZA，Ref：17-745E）；通过10秒内将瓶垂直倾斜5次将其人工振荡，弃去液体，重复这一操作至少3次直至去除大部分血液。然后用500ml 1×浓度的红细胞裂解液（对于1升H₂O：8.99g NH₄Cl、1g KHCO₃、37mg EDTA，pH 7.3）清洗脐带直至完全去除血液残留物。

一旦去除掉脐带表面的血液，将其转移到10cm培养皿，用无菌剪将其切成1-2cm的片段。因为将脐带切成片段时血管中残留的血液被排出，添加10ml 1×PBS（包含1ml抗生素（10,000单位）、链霉素（10,000μg)和两性霉素-B(25μg)的混合物）以彻底清洁所述片段，将片段表面压在其支持表面，用无菌手术刀沿着片段作水平移动。重复该步骤直至去除内部的所有血液残留物。将完全清洁的脐带片段转移到无菌管，立刻进行处理，尽管如果需要，它们可以在﹣80℃长期低温保存。

然后用机械方法去除围绕脐带的膜以及位于其中的血管。为此，将脐带片段纵向打开，利用手术刀和镊子小心去除脐带膜和血管。利用这种机械分离获得的胶凝物质是WJ。获得25g WJ。

实施例2：从脐带胶质提取GAG

用人和猪来源的脐带进行下列实施例。使用描述的从人软骨获得GAG的方案（其中作了一些改动）从脐带的WJ获得GAG（Rogers等，2006）。

将实施例1中获得的WJ浸于20ml提取缓冲液（242μl 200mM L-半胱氨酸、1.42ml 704mM Na₂HPO₄缓冲液、100μl 0.5M EDTA，10mg（14U/mg），pH 7.5）木瓜蛋白酶（SIGMA，Ref：P4762），将其在60℃放置12小时以完全消化WJ，一旦其被消化，将样品在1,500g的离心速度下离心5分钟以去除消化残留物。观察到消化体积约为30ml，超过20ml的起始体积约10ml，这是由于WJ中存在的GAG的溶解，进而由于这些聚集的水的释放。

样品一旦被离心，将上清转移到另一管，然后沉淀出样品中存在的GAG。

实施例3：从脐带的WJ沉淀和分离GAG。

利用5体积的100%乙醇沉淀出存在于实施例2的上清中的WJ的GAG。通过这个步骤，样品的GAG以及其中存在的盐被沉淀出。这是由于以下事实：样品中存在的水分子与乙醇分子相互作用，这样的话水分子无法与样品的GAG相互作用。将GAG在-20℃静置12小时进行沉淀。一旦沉淀出，将它们在1,500g下离心5分钟，从而去除所有的100%乙醇。将沉淀用5体积的75%乙醇清洗以去除可能残留的盐，它们可能沉淀出在样品上。然后将其在1,500g下离心约5分钟，完全去除上清。

一旦沉淀出样品，将固体残留物在环境温度干燥约30分钟，直至所有乙醇都被蒸发。从约25g WJ样品起始沉淀出的GAG的量范围是50至300mg，这取决于起始原料。在这些特定情况下，获得约250mg GAG沉淀。为获得本发明的水凝胶，将GAG沉淀重悬于1ml Milli-Q H₂O，并在4℃下保存。

实施例4：包含脐带WJ的GAG的可注射性水凝胶的产生。

水凝胶的含水量可以为其自身重量的10%至100倍，这取决于其应用需要的粘度。

将沉淀的GAG用1ml H₂O重悬后获得的水凝胶用可注射性生理血清溶液重悬，将其在涡旋振荡器中温和搅拌直至完全溶解和匀浆。一旦水凝胶溶解，将其在4℃下保存。

实施例5：包含来自脐带WJ的GAG的交联的水凝胶的产生。

为了产生更加均一和稳定的水凝胶，依照实施文献（Cui等，2006）描述的方法。从根据实施例3的获自WJ的GAG提取物制备水溶液。具体来说，在H₂O中制备1%的GAG溶液。为此，向沉淀和分离后获得的200mg GAG中添加10ml H₂O（实施例3）。向溶液中添加1.2g己二酸二肼（ADH），利用0.1N HCl将溶液的pH调节为pH＝3.5。一旦调节到所述pH，向溶液中添加0.6g固定剂EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐）（SIGMA，Ref：E6383）。混合物在环境温度恒定搅拌条件下保持30分钟到1小时，直至获得稳定的水凝胶。

一旦形成稳定的水凝胶，将其用1×PBS(对于1升H₂O：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄，pH=7.4溶于1L H₂O)清洗3次，每次5分钟，以去除过量的EDC。就水凝胶的物理形状而言，它具有其固化时所在模子的形状，这样的话可以使用标准的96、48、24、12和6孔培养板，培养皿或具有所需形状的任何其它容器。

此外，水凝胶可以在大的容器（例如烧杯）中固化，一旦其固化，可以将水凝胶切割成特定的形状和厚度。具体来说，在本实施例中水凝胶在24-孔板的孔中固化，一旦固化，将其用500μl的1×PBS清洗3次（5分钟）。

在这种情况下，根据标准技术将24-孔板中交联的水凝胶冻干。

在本实施例中，通过扫描电子显微术（SEM）来分析水凝胶的三维结构。一旦冻干水凝胶，进行下列步骤：切割冻干水凝胶的切片，在AUTOSAMDRI-814干燥机中用CO₂将该切片干燥到临界点，并在SPUTTER中用金进行金属化。在JEUL扫描电子显微镜（JSM35）中20KV的电压下观察所述制品。

脱水的水凝胶的SEM分析(图3)显示它具有均匀的多孔结构。显微照片显示高孔隙度三维结构的存在，孔径范围是0.5至500μm。孔的这个范围包括微孔和大孔的存在。大孔(300-500μm)是必需的，以便进行合适的细胞群集，这样的话大量细胞汇集，不同的细胞类型共存，有利于形成结构化组织，例如，可以形成血管网络。中等大小的孔允许细胞掺入。微孔(0.5-50μm)是细胞存活必需的，因为它们负责进行气体、营养物的有效扩散和细胞代谢产生的废物的去除。基于扫描电子显微镜获得的米尺测量孔径。

这种生物材料显示更高的结构灵敏性，提示其应用不仅满足生物活性性质和营养作用，而且是可以暂时容纳细胞直至进行组织修复的结构，例如尤其是溃疡和其它皮肤表皮疾病的治疗，软骨的修复和眼科治疗。生物材料中包含的细胞可以是邻近于植入部位的组织的细胞（其能够形成集落），也可以是在其临床应用前体外排列在生物材料上的细胞，这样的话其再生作用被增强。

这种生物材料具有大小范围是0.5-1000微米的孔的均匀分布，通过扫描电子显微镜技术测定。这种孔隙范围适合于气体和营养物扩散通过其整个结构，以及允许细胞增殖。

实施例6：本发明生物材料中存在的GAG的表征和定量。

通过质谱（ESI/MS）技术分析和定量本发明生物材料中存在的不同GAG。考虑到通过这种技术只能测定分子量为200至2,000道尔顿的分子并且GAG分子大部分超过这个范围，首先将样品用酶消化以便获得分子量在200-2,000Da之间的GAG链。

作为GAG鉴定和定量的标准品，使用它们中每一种浓度已知的标准商品化化合物。具体来说，用于进行GAG定量的标准品如下：对于透明质酸：透明质酸钾（SIGMA，Ref：53750）；对于硫酸软骨素：硫酸软骨素钠（SIGMA，Ref：C4384）；对于硫酸皮肤素：硫酸皮肤素钠（SIGMA，Ref：C3788）；对于硫酸角质素：硫酸角质素（CHEMOS，Ref：7295）；对于肝素：肝素钠（SIGMA，Ref：H8537）；和对于硫酸类肝素：硫酸类肝素钠（SIGMA，Ref51541）。

基于使用各种GAG标准品得到的结果获得样品中存在的GAG的定量值。

按照文献描述的方法（Mahoney等，2001），进行GAG的酶促消化。为此，使用对每种GAG的消化特异的酶。

对于透明质酸，使用透明质酸酶（SIGMA，Ref：H3506）；对于硫酸软骨素，使用软骨素酶（SIGMA，Ref：C2780）；对于硫酸皮肤素，使用软骨素酶B（SIGMA，Ref：C8058）；对于肝素，使用肝素酶I（SIGMA，Ref：H2519）；对于硫酸类肝素，使用肝素酶I（SIGMA，Ref：H2519）；对于硫酸角质素，使用角质素酶（K2876）。

通过将440U相应酶重悬于10ml下列缓冲液来制备这些酶：2ml 100mM磷酸盐缓冲液pH=7.77、770μL 1M NaCl、1mg BSA和7.23ml H₂O。

含有160U/ml酶浓度的酶促消化缓冲液如下制备：将4.5ml酶(2000U)添加到7.5ml消化缓冲液，1.5ml 1M NaCl，0.333ml 3M乙酸钠pH=5.2和5.67ml H₂O。用于酶促消化的样品和标准品如下制备：将500μL消化缓冲液（80U酶）添加到500μL各种GAG的标准品（浓度为2mg/ml），这样的话标准品最终溶液的浓度为1mg/ml。对于GAG样品同样如此：将500μL消化缓冲液（80U酶）添加到500μL GAG样品。

将样品在37℃消化1小时，之后通过在60℃热变性5分钟将酶灭活。

一旦消化完成，通过质谱分析样品和标准品。质谱是一种实验方法，用于确定待分析的样品中存在的某些离子的质荷比。质谱仪由三个基本部件组成：离子源、质量分析器和检测器。通过离子源将待分析的样品离子化，它们在质量分析器中分离并被检测产生质谱，其中显示与特定离子类型的相对丰度比较的质荷值。

具体来说，在该实施例中，如下将样品注射入质谱仪：按照0.2ml/分钟的流速将20μL样品样品直接注射入质谱仪（Thermo LCQ型号）。使用阴性电喷射电离（ESI/MS）方法，层析时间设为10分钟。选择根据文献（Mahoney等，2001）对应于已知的各类GAG分子量的±6Da范围的分子离子。所述离子存在于标准GAG样品和待分析的样品，所以样品中各种GAG的存在被定性显示。为了确保结果的再现性，样品和标准品一式两份进行注射。

对于不同GAG的定量，对于1mg/ml各GAG的标准品做标准线。做出的标准线包括下列浓度的各标准GAG（透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸类肝素和硫酸角质素），用于制备标准线：750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、100μg/ml、0μg/ml。利用H₂O进行标准线的稀释，包含相等比例的酶促消化缓冲液和H₂O的混合物被用作该线的空白对照。

本发明生物材料中各GAG的鉴定结果和比例如下，考虑到生物材料的来源是天然的，这意味着在它们的组成中存在变化（图1）：

70%透明质酸

10%硫酸角质素

7%软骨素-6-硫酸盐

5%硫酸类肝素

4%软骨素-4-硫酸盐

3%硫酸皮肤素

1%肝素。

实施例7：用于检测生物材料中细胞残余存在的组织学研究

本发明的生物材料包含天然来源的GAG组合。这种天然来源增强了它们的再生效果以及对细胞活性的作用，因为GAG的结构以及它们之间的相互作用与生理条件下在细胞外基质中发现的类似。

脐带是一种免疫原性不高的组织，实际上，WJ中包含的干细胞的异源使用在许多情况下被认为可用于治疗。还有一些情况从脐带的血管发展动脉或静脉系统，也用于异源使用。但是，为了确保本发明的生物材料不含细胞和细胞残余（它们可引起炎症反应或植入物排斥反应），进行苏木素曙红、阿尔新蓝和甲基绿焦宁组织染色（图2）。

苏木素曙红：这是组织病理水平使用最广泛的组化染色。它允许观察细胞和细胞组分。苏木素显示对细胞的酸成分（特别是核酸）的亲和力，而曙红显示对碱性区域的亲和力，允许很好的观察细胞的细胞质。对GAG样品的制品(图2B)进行染色，用细胞的延展物(extensions)作为阳性对照(图2A)。

进行苏木素曙红染色的方法如下进行：通过无菌拭子将GAG样品在载玻片上延展，并将该延展物静置干燥至少24小时。一旦载玻片被干燥，将延展物用70%甲醇固定5分钟。随后，通过用H₂O清洗去除固定剂。载玻片用苏木素染色3分钟（PANREAC，DC Harris苏木素溶液）。随后，通过用H₂O清洗去除过量的染料。所有载玻片都经过含0.5% HCl的H₂O以去除染料的非特异性结合。用H₂O清洗载玻片。载玻片用曙红（0.5%溶于H₂O）染色30秒。载玻片用H₂O清洗以去除过量的曙红。向所述制品添加数滴Fluoromount-G封固剂（SOUTHERN BIOTECH，Ref：0100-01），用盖玻片覆盖，并在显微镜下观察。

用苏木素曙红染色的结果（图2，图像A和B）显示被分析的GAG样品中没有细胞。

阿尔新蓝：阿尔新蓝是主要的阳离子染料之一（在其分子中包含正电荷），其结合多糖带负电荷的位点，所述多糖载有硫酸盐，磷酸盐或碳酸盐基团（构成蛋白聚糖的一部分）。这些静电键取决于培养基的pH；在中性pH染料结合含中性基团的蛋白聚糖；在酸性pH它结合蛋白聚糖硫酸盐；和在碱性pH它结合蛋白聚糖磷酸盐。当pH=1时，阿尔新蓝结合弱和强硫酸化的蛋白聚糖，其包含硫酸软骨素，硫酸皮肤素硫酸类肝素和硫酸角质素（构成脐带胶质GAG的一部分）。对GAG样品的制品（图2F）进行染色，细胞的延展物（extensions）被用作对照（图2E）。

本实施例中进行阿尔新蓝染色的方法具体如下进行：

透过过无菌拭子将GAG样品在载玻片上延展，该延展物静置干燥至少24小时。一旦载玻片被干燥，将延展物用70%甲醇固定5分钟。随后，通过用1×PBS清洗去除固定剂。将载玻片浸于0.1N HCl pH＝1中5分钟。随后将它们用溶于0.1N HCl pH＝1的1%阿尔新蓝染色2小时。将载玻片浸于0.1N HCl中5分钟，立刻用H₂O清洗以去除过量的染料。向所述制品添加数滴Fluoromount-G封固剂（SOUTHERN BIOTECH，Ref：0100-01），用盖玻片覆盖，并在显微镜下观察。用阿尔新蓝染色的结果（图2，图像E和F）显示被分析的生物材料样品中存在GAG。

甲基绿焦宁：这种染色用于组织包含的核酸的组织学研究，以及显示淋巴细胞和浆细胞的存在。它还用于组织切片和细胞学制品中浆细胞和RNA的鉴定。焦宁把浆细胞的细胞质和大部分核仁染为红色。甲基绿将DNA染为蓝绿色（略呈紫色）。对GAG样品的制品（图2D）进行染色，细胞的延展物被用作阳性对照（图2C）。

本实施例中进行甲基绿焦宁染色的方法具体如下进行：

透过过无菌拭子将各GAG样品在载玻片上延展，该延展物静置干燥至少24小时。一旦载玻片被干燥，将延展物用70%甲醇固定5分钟。随后，通过用H₂O清洗去除固定剂。将载玻片浸于0.1N HCl pH＝1中5分钟。随后将它们用甲基绿焦宁染色5分钟（0.012%甲基绿溶于H₂O，0.01%焦宁溶于H₂O，0.75%甲醇），立即用H₂O清洗以去除过量的染料。向所述制品添加数滴Fluoromount-G封固剂（SOUTHERN BIOTECH，Ref：0100-01），用盖玻片覆盖，并在显微镜下观察。用甲基绿焦宁染色的结果（图2，图像C和D）显示被分析的GAG样品中没有核酸。

实施例8：数种细胞类型在本发明生物材料上的毒性。

生物材料能够用于移植或作为组织工程基质的主要需求是没有细胞毒性。

为了验证本发明的生物材料不引起毒性作用，通过MTT法（Roche Diagnostics，USA）测定细胞毒性，并由欧洲替代方法验证中心（ECVAM，European Centre for the Validation of AlternativeMethods）对排列在本发明生物材料上的细胞进行验证。使用的细胞类型与生物材料针对的疾病有关，例如，皮肤角质形成细胞和成纤维细胞，骨的成骨细胞，软骨的软骨细胞和脂肪来源的间充质干细胞，以及ISO 10993中指定的用于L929毒性测定的细胞系。

MTT测定法基于活细胞的线粒体酶将某些底物转化为其它次级代谢产物的能力。形成的化合物的量取决于线粒体脱氢酶的活性，这是培养物中存在的活细胞数目的明确指标。

具体来说，这种线粒体检测，细胞增殖试剂盒I(MTT)目录号1465 007罗氏，通过细胞线粒体琥珀酸脱氢酶将（黄色）四唑盐变为不溶性的（蓝色）甲臜晶体来测定转化。随后将细胞透化，溶解形成的晶体，产生染色的溶液，这通过ELISA微板读数器在550nm波长处测量其吸光度进行定量。得到的结果显示于图4。

如下所述进行该方法：

1.将细胞种于96-孔板，每孔50μl生物材料，密度为2,000-5,000个细胞/孔（取决于细胞类型）。先前已经确定每一细胞类型的合适细胞浓度。成纤维细胞，成骨细胞，软骨细胞和脂肪来源的间充质干细胞，所有均来自人来源的原代培养物，按照每孔4,000个细胞的浓度接种，L929小鼠成纤维细胞系按照每孔200个细胞的浓度接种，获自人皮肤原代培养的角质形成细胞按照每孔5,000个细胞的浓度接种。

2.在开始细胞毒性测定前，将细胞静置在37℃和5% CO₂条件下稳定24小时。该测定包括阳性对照（细胞+培养基+已知诱导细胞毒性的材料，就本例来说是聚乙烯多氯化物或PVC），对照（细胞+标准培养基），以及接触本发明生物材料的细胞。

3.将其在培养箱中37℃温育实验方案指定的时间段直至进行测定，就本例来说是接触24、48和72小时。

4.温育期结束后，对每孔各100μl培养基中的培养物添加10μlMTT溶液(0.5mg/ml)，并在培养箱中37℃温育4小时。

5.温育结束后，可以观察到细胞内部的甲臜晶体。每份培养物或每孔中添加100μl增溶液，并在培养箱37℃温育过夜。细胞因此被透化，晶体用指定的100μl增溶剂溶解，产生可方便定量的染色溶液。

6.一旦晶体被溶解，用ELISA读数器在550nm处直接读取培养板。在读取前，建议用乙醇清洁板的底面。从图4可以看出，本发明的生物材料不对被检测细胞系的任意一种产生毒性作用，与对照相比不存在显著差异。

实施例9：本发明可注射形式的生物材料用于治疗骨关节炎的用途

为了在骨关节炎(OA)中体内鉴定本发明生物材料的治疗效果，使用实施例3获得的水凝胶，将其重悬在含有异体、软骨来源的软骨细胞的可注射性生理血清溶液中。在一个膝盖处接受前十字韧带切除术的兔被用作实验模型。通过外侧关节切开术进行韧带的这种切除。随后，为了使膝盖失稳，等待数月到数周的时间，在此期间发生类似于骨关节炎的软骨侵蚀。此外，在膝盖处未进行关节切开术的动物被用作对照组。

利用关节镜手术通过清洗和清创术制备受损的关节表面，用本发明的可注射性细胞/生物材料覆盖损伤处。放置生物材料4周后，处死动物并提取软骨。将获得的软骨用4%多聚甲醛固定以便其后续的组织学处理。为了获得组织切片，将样品包埋入石蜡，为此将其在50、70、90和100%的醇中放置5分钟。随后将样品放入Citrosol(商品名)中5分钟，并包埋入石蜡直至获得固体块。利用切片机获得5μm组织切片，利用这些切片进行组织染色和免疫染色。

通过免疫组化技术分析组织切片中软骨细胞外基质的不同标记物。被研究的软骨细胞外基质的特异性分子和分子标记物是I型和II型胶原、聚集蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖。使用单克隆抗体进行免疫染色。用于标记组织切片的技术是直接的免疫染色，使用标记荧光染料的单克隆抗体。使用共焦显微镜观察标记。

获得的结果显示生物材料/细胞组合诱导受损软骨的再生，因为：

-一旦被植入，可注射性生物材料及其细胞组分不引起毒性，即，在组织切片的肉眼可见和显微镜水平没有观察到炎症现象。

-生物材料适合待修复的伤口的几何形状和大小，并停留在移植区域内。

-没有观察到邻近植入物区域的健康组织细胞表型的改变。

-在植入物区域的对软骨特异的细胞外基质分子（例如II型胶原）的存在表明再生过程的起始，伴随与天然组织相同质量的新细胞外基质的形成。

这些事实证明,与细胞疗法组合的本发明的生物材料（与细胞治疗组合）促进软骨缺陷的再生，这与对照动物（其不存在任何软骨修复的迹象）不同。

实施例10：三维生物材料的用途

实施例5获得的本发明固体生物材料具有能够有效治愈慢性溃疡的敷料必需的大部分特点。从这种意义上讲，为了评价对慢性溃疡的治疗效果，使用Swiss白化小鼠（在背部区域接受约3cm²的热蚀）进行体内实验研究。对照组由相同类型的伤口但用商品化的透明质酸凝胶治疗的动物组成。

对于本发明生物材料的应用，通过清洗、消毒和手术清创术制备诱导伤害的表面。然后将生物材料经注射应用于伤口，在伤口处生物材料在深度和表面均覆盖并充满患病区域。在放置生物材料15天后，处死动物，切除伤口区域并在4%多聚甲醛中固定用于其后续的组织学检查。为了进行处理，将样品包埋入石蜡，为了这个目的将其置于50、70、90和100%的醇中5分钟。随后将样品放入Citrosol中5分钟，并包埋入石蜡直至获得固体块。利用切片机获得5μm组织切片，利用这些切片进行组织染色和免疫染色。

通过免疫组化技术分析组织切片中的不同表皮表型标记物，例如5和10角蛋白、分化标记物，例如外皮蛋白和兜甲蛋白、皮肤标记物波形蛋白，和基质成分例如层粘连蛋白。用于标记组织切片的技术是直接的免疫染色，使用标记荧光染料的单克隆抗体。使用共焦显微镜观察标记。

获得的结果显示生物材料在溃疡再生中是有效的，因为：

-用于伤口的生物材料是免疫无活性的，未显示毒性症状。

-生物材料适合待修复的伤口的几何形状和大小，在深度和表面均完全覆盖患病区域。

-随着愈合过程进展，生物材料降解，并被皮肤的上皮组分取代。

-组织切片显示生物材料诱导成纤维细胞和角质形成细胞（它们在其中仍是有活性的）的迁移和增殖。

-本发明的生物材料诱导伤口愈合的有效性是对照动物的两倍，此外，新疤痕组织的质量显著高于没有应用本发明生物材料的动物中的新疤痕组织的质量。

实施例11：在共培养物中以本发明的生物材料的可注射形式的关节软骨细 胞和间充质干细胞（MSC）的活性和代谢活性。

为了确定活性和代谢活性，在24-孔板中将2×l0⁶细胞在800μL 10mg/ml本发明的生物材料。将软骨细胞和MSC放置培养7天。在第3天和第7天，用MTT活体染料进行染色，其将代谢活跃的细胞染色，从而获得细胞活性的测量。

图6。倒置光学显微镜图像，其显示关节软骨细胞（软骨细胞）的活性和本发明的生物材料中的共培养物中用MTT染色的MSC。在第3天和第7天染色。染成黑色的细胞是有活性的和代谢活跃的。总之，基于图6中显示的结果，与检测的细胞组合中的对照相比，本发明的生物材料保持细胞活性。

实施例12：与透明质酸（HA）相比本发明培养的细胞中的增殖能力。

根据实施例8中描述的技术，在本发明的生物材料中和HA中使用MTT进行细胞增殖能力的检测。检测的细胞包括：人软骨细胞、成纤维细胞L-929、人成纤维细胞，和人脂肪组织（AMSC）间充质干细胞。在培养24、48和72小时观察增殖。图7和8均表明在类似浓度下，与HA相比，本发明的生物材料中培养的细胞的增殖和存活显著更高。

实施例13：与透明质酸（HA）相比本发明的生物材料中细胞的亲和力和三 维生长能力。

使用本发明的生物材料的目的是增强细胞从周边组织到损伤区域的聚集，以及作为细胞群体治疗学应用于损伤的载体。因此，本发明的生物材料在保持细胞稳态中的重要性是明显的。

为了确定软骨细胞在本发明的生物材料内部形成聚集物的能力，我们在6-孔板中用1.0或2.0mg/ml本发明的生物材料培养每孔750k软骨细胞。开始培养后72小时，可以观察到在2.0mg/mL浓度下软骨细胞在水凝胶中聚集成簇，而在1.0mg/mL下水凝胶中没有聚集。开始培养96小时后，在2.0mg/mL本发明的生物材料中软骨细胞完全聚集成簇，而在1.0mg/mL水凝胶中的软骨细胞开始成簇。换句话说，与对照相比，本发明的材料容易在较高浓度下发生聚集和簇的形成。

与标准品的细胞培养塑料表面相比，与本发明的生物材料接触排列的细胞呈现对本发明的生物材料更高的亲和力。它们从细胞培养板分离并迁移至本发明的生物材料中，在该生物材料中它们形成有活性的簇。但是，当使用相同浓度的HA作为对照时，细胞呈现对细胞培养塑料更高的亲和力。在相同浓度下在本发明的生物材料和HA之间的一致性存在实质性的不同。HA比本发明的生物材料粘度低。图9表明，与HA相比，本发明的生物材料中观察到的该迁移效应。使用存活/死亡测定来将有活性的（绿色）细胞与无活性的（红色）细胞区分开。总之，相比细胞培养塑料，该实验中使用的细胞对本发明的生物材料具有更强的亲和力，这一发现未对HA和塑料重复进行。

实施例14：本发明中培养的细胞对比HA中培养的细胞的功能性的观察。

在该实施例中，确定了与组织再生相关的标记物的表达。

为了确定在本发明的生物材料中和对照HA中MSC中不同软骨标记物的表达，在T75瓶中，在两种不同浓度的水凝胶（0.1和0.5mg/mL）和HA中培养细胞，每瓶有7.5×10⁵个细胞。4天后，通过细胞的离心和后续的RNA纯化，用Agilent总RNA分离迷你试剂盒（Agilent technologies，USA）从样品中提取RNA。RNA提取后，合成cDNA并根据II型胶原和多功能蛋白聚糖表达的标准方案进行RT-PCR。

图10表明，与HA对照的结果相比，来自MSC的软骨因子胶原II和多功能蛋白聚糖的基因表达分析的结果，所述MSC在本发明的生物材料中培养。II型胶原形成了关节软骨基质的大部分（90%），并且是细胞向软骨细胞表型分化的标记物。培养4天后，在本发明的生物材料中培养的MSC开始II型胶原的表达，而当其在HA中培养时未观察到这一现象。多功能蛋白聚糖是软骨的细胞外基质中的较少组分。它被认为是之前的软骨细胞样细胞中去分化或失去软骨细胞表型的标记物。由于软骨细胞指示细胞成熟，其表达多功能蛋白聚糖较少，同时其聚集蛋白聚糖、硫酸软骨素和胶原II表达的增加。与在浓度匹配的HA中细胞的对照群体相比，在本发明的生物材料中的MSC显示基因多功能蛋白聚糖的表达减少，同时胶原II表达增加。因此，本发明的生物材料显示诱导软骨细胞表型分化或合成关节软骨再生相关分子的能力。

实施例15来自人和猪来源的本发明的生物材料的流变学表征。

通常会进行生物材料的机械表征，以便提供关于组织工程支架的相关的并且可比较的信息。对于水凝胶，机械研究可提供关于水凝胶对于使用各种技术注射的适用性的重要信息，或化学方法例如交联的完成程度。

在本实施例中，如前所述，从WJ分离的GAG支架分装为3种百分比的溶液（1%、5%、10%），分别2ml体积，以便评价浓度对流变学参数的影响。实验中使用TA Instruments型号AR2000ex流变仪。首先，对于各样品，在涉及储能模量和损耗模量以及粘度的后续研究中进行应变扫描，以确认各样品在其线性粘弹性范围（未显示数据）内检测。

测定线性粘弹性范围后，通过从20℃至50℃变化的生理相关温度扫描用恒定频率来确定各样品的损耗模量、储能模量和粘度。将数据作图，并列于图11-13。

在图11中，人在10%浓度的值高于猪在10%浓度的值。人在5%的值超过猪在5%的值。由于双锥粘度计的内部质量(interial qualities)，在更低浓度（对于两者为1%，对于猪为5%）下结果具有更低的信噪比。定量地和定性地，与猪的样品相比（按克计），人的样品显示较大模量。而且，观察到随检测温度改变模量略有降低—这一发现与在恒定振荡频率、在变更温度下的粘弹性温度效应一致。在图12中，对于各自的浓度，来自人的数值的结果超过猪的样品。由于双锥粘度计的内部质量，在更低浓度（对于两者为1%，对于猪为5%）下的结果具有低的信噪比。如储能模量结果中所示，观察到模量随温度的预期的微小降低。损耗模量值高于储能模量值，从而表明粘度效应相对于弹性效应的优势。考虑到分离的GAG是具有固定流动特性的非交联的水凝胶，这一发现是预料之中的。来自猪和人来源的3种不同浓度的本发明的生物材料的损耗模量结果。在图13中，对于各自的浓度，来自人的数值的结果超过猪的样品。由于双锥粘度计的内部质量，在更低浓度（对于两者为1%，对于猪为5%）下的结果具有较低的信噪比。范围广泛的粘度是可能的通过改变样品的浓度（即使按每克计），人水凝胶始终更有粘度。在该实施例中，本发明的人生物材料的10%溶液具有类似于蓖麻油的平均粘度。

总之，仅通过调节提取的GAG的浓度便可得到多种粘度和模量。

实施例16：来自周边组织的细胞聚集（趋化作用）。

本测验的目的是确定本发明的生物材料对来自组织的细胞的趋化能力。为此，我们使用来自两个不同人患者的人软骨样品。已经证明，在MSC和软骨细胞的活性和增殖检测中2mg/mL的浓度是适合的，所以在当前实施例中使用该浓度。使用非吸附板以避免吸附前底物的存在）实验设置如下：

·阴性对照：DMEM中的片段

·透明质酸：在2mg/mL下HA中的片段

·感兴趣的材料：在2mg/mL下在本发明的生物材料中的片段

而且，用粘性空斑(sticky plaque)作为阳性对照。在补充有10%胎牛血清的DMEM中培养组织。每天收集图像并将其列于图14。结果显示任何对照或暴露于HA的片段中均无细胞。但是，在本发明的生物材料的片段中，观察到已有大量细胞从最早的时间点迁移至软骨的外表面。使用存活/死亡测定来确定迁移至软骨片段的表面的细胞是否有活性。图15中显示的结果表明，来自软骨片段的绝大多数细胞有活性。但是，未观察到细胞从软骨片段的表面迁移至本发明的生物材料周围。

基于该组的结果，我们可以得出结论：

1.本发明的生物材料具有从天然组织聚集软骨细胞的能力。

2.由本发明的生物材料聚集的软骨细胞是有活性的。

由于各种可能的实施方案可由上述发明组成，并且由于在以上陈述的实施方案中可做出各种修改，应当理解本文描述的所有内容应当被解释为说明性的，而不应解释为限制意义。

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Claims (27)

1.一种可注射性水凝胶形式的生物材料，其特征在于所述生物材料包括存在于脐带中的糖胺聚糖（GAG）混合物，所述脐带不含脐带膜、血管以及细胞或细胞残余。

2.根据权利要求1所述的生物材料，其提取自人类来源的脐带。

3.根据权利要求1所述的生物材料，其提取自动物来源的脐带。

4.根据权利要求1-3所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括选自透明质酸、硫酸角质素、软骨素-6-硫酸盐、硫酸类肝素、软骨素-4-硫酸盐、硫酸皮肤素和肝素的糖胺聚糖混合物。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括占GAG总混合物40-80%的透明质酸。

6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括占GAG总混合物2-25%的硫酸角质素。

7.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括占GAG总混合物3-10%的软骨素-6-硫酸盐。

8.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括占GAG总混合物1-9%的硫酸类肝素。

9.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括占GAG总混合物0.5-7%的软骨素-4-硫酸盐。

10.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括GAG的总混合物0.1-7%的硫酸皮肤素。

11.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括占GAG总混合物0.05-3%的肝素。

12.根据权利要求4所述的源自人类脐带的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含：透明质酸（70%）、硫酸角质素（10%）、软骨素-6-硫酸盐（7%）、硫酸类肝素（5%）、软骨素-4-硫酸盐（4%）、硫酸皮肤素（3%）和肝素（1%）。

13.根据权利要求1-12所述的生物材料，其特征在于，所述可注射性水凝胶具有10cS-150,000cS的粘度。

14.根据权利要求13所述的生物材料，其特征在于，具有10至15,000cS的粘度。

15.根据权利要求14所述的生物材料，其特征在于，具有10至2,000cS的粘度。

16.根据权利要求14所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料具有三维结构。

17.根据权利要求15所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料具有孔径为0.5-1000μm的实质的多孔结构。

18.根据权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述孔径是0.5-500μm。

19.根据权利要求1-19所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料还包括细胞。

20.根据权利要求19所述的生物材料，其特征在于所述细胞选自：未分化的间充质干细胞或分化为另一种细胞株的间充质干细胞、和/或未分化的造血干细胞或分化为另一种细胞株的造血干细胞、和/或软骨细胞、和/或成软骨细胞、和/或成骨细胞、和/或骨细胞、和/或角质形成细胞、和/或成纤维细胞、和/或肌细胞、和/或脂肪细胞、和/或神经细胞和/或来自神经系统的其它细胞、和/或来自白血细胞系统的细胞、和/或角膜细胞、和/或内皮细胞和/或上皮细胞。

21.根据任何在前的权利要求所述的一种生物材料，其中生物材料与增强材料组合形成复合材料。

22.一种获得根据权利要求1-20所述的生物材料的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

a)获得人脐带；

b)用盐溶液和抗生素处理脐带；

c)去除脐带表面的所有血液；

d)将脐带分为1-2cm的片段；

e)清洁内部残留的所有血液；

f)去除脐带膜和血管；

g)分离包括脐带胶质的胶凝物质；

h)酶法消化获得的胶凝物质；和

i)沉淀并分离GAG。

23.根据权利要求22所述的用于获得所述生物材料的方法，其特征在于，所述方法还包括溶解权利要求22的步骤i)中获得的所述GAG。

24.根据权利要求22所述的用于获得所述生物材料的方法，其特征在于，所述方法还包括交联权利要求22的步骤i)中获得的所述GAG。

25.根据权利要求24所述的用于获得所述生物材料的方法，其特征在于，通过温度变化、化学反应或光聚合进行所述共价交联。

26.根据权利要求24所述的用于获得所述生物材料的方法，其特征在于，通过对所述WJ中单个GAG组分的侧基修饰进行离子交联。

27.根据权利要求1-21所述的生物材料的用途，其用于重建、填充或重构软组织；治疗皱纹、皱褶和疤痕、烧伤、溃疡、软组织增大、脸部脂肪萎缩、椎间盘疾病；修复软骨、肌骨胳损伤、骨关节炎和关节周炎；治疗肿瘤、阴道疾病、脑损伤、骨髓修复、神经变性病症，心血管疾病和润滑过程，作为止痛剂和抗炎剂；治疗烧伤，溃疡和皮肤表皮缺陷；治疗眼科疾病，例如角膜损伤、视网膜损伤或白内障；修复软骨；治疗骨关节系统，例如骨软骨缺陷、骨关节炎或骨缺陷的情况，和解决阴道疾病的佐剂；治疗牙龈炎和牙周炎；以及用于开发细胞培养系统。

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