KR20180031778A

KR20180031778A - 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 조성물 및 화장품학적 조성물에서의 그의 용도

Info

Publication number: KR20180031778A
Application number: KR1020187006362A
Authority: KR
Inventors: 도나타 벤시; 지오반니 카글리오
Original assignee: 라보라토리 데리바티 오르가니치 에스.피.아.
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2018-03-28
Also published as: AU2016304201A1; AU2016304201B2; WO2017021014A1; JP2018522051A; US20220023185A1; RU2018107593A3; US20180235864A1; EP3331492A1; BR112018002492A2; MX2018001577A; CA2994585A1; RU2703726C2; JP2021059588A; RU2018107593A

Abstract

본 발명은, 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 글리코사미노글리칸의 혼합물 0.1 내지 10.0 중량%를 포함하는 조성물로서, 이때 글리코사미노글리칸의 총량을 기준으로, 데르마탄 설페이트의 양은 5 중량% 이상 95 중량% 이하이고, 콘드로이틴 설페이트의 양은 5% 이상 95 중량% 이하인 조성물에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 또한 안티-에이징 조성물로서의 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 글리코사미노글리칸 조성물의 용도로서, 이때 글리코사미노글리칸의 총량을 기준으로, 데르마탄 설페이트의 양은 5 중량% 이상 95 중량% 이하이고, 콘드로이틴 설페이트의 양은 5% 이상 95 중량% 이하인 글리코사미노글리칸 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 조성물 및 화장품학적 조성물에서의 그의 용도

본 발명은 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 글리코사미노글리칸(GAG)의 조성물로서, 이때 GAG의 총량을 기준으로, 데르마탄 설페이트의 양이 1 중량% 이상 99 중량% 이하이고, 콘드로이틴 설페이트의 양은 1 중량% 이상 99 중량% 이하인 글리코사미노글리칸의 조성물에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 GAG의 혼합물 0.1 내지 15.0 중량%, 바람직하게는 0.2 내지 10.0 중량%를 포함하는 조성물로서, 그 혼합물이 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하고, 이때 데르마탄 설페이트의 양은 GAG의 총량을 기준으로 1 중량% 이상이고, 콘드로이틴 설페이트의 양은 GAG의 총량을 기준으로 1 중량% 이상인 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 특히 화장품학적 분야에서 유용하다.

약학 분야에서 GAG를 사용하는 것은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 혈액 응고를 방지하는 것으로 잘 알려진 저분자량 헤파린의 사용과는 별개로, GAG의 다른 약학적 용도가 제안되어 왔다. 예를 들어, US 2014/0343012에는 골관절염의 치료에 히알루론산과 기타 GAG, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트의 조합을 사용하는 것이 개시되어 있다.

WO 2006/015171에는 패혈증의 치료를 위해 데르마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 저분자량 헤파린과 같은 다양한 GAG를 사용하는 것이 개시되어 있다.

놀랍게도 데르마탄 설페이트와 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 혼합물을 함유하는 스킨 제품이 주름을 감소시키고 피부를 수분공급된 상태로 유지하기 위한 안티-에이징 조성물로서 매우 효과적이라는 것이 밝혀졌다.

특히, 본 발명은 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 GAG의 혼합물을 포함하는 화장품학적 조성물에 관한 것이다. 데르마탄 설페이트의 양은 GAG의 총량을 기준으로, 1 중량% 이상, 또는 2 중량% 이상, 또는 5 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상, 또는 20 중량% 이상, 또는 40 중량% 이상, 또는 50 중량% 이상, 또는 60 중량% 이상이다.

콘드로이틴 설페이트의 양은 GAG의 총량을 기준으로 1 중량% 이상, 또는 2 중량% 이상, 또는 5 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상, 또는 20 중량% 이상이다.

데르마탄 설페이트/콘드로이틴 설페이트의 중량비는, 5/95, 또는 10/90, 또는 20/80, 또는 25/75, 또는 40/60, 또는 50/50 내지 95/5, 또는 90/10, 또는 85/15, 또는 80/20, 또는 75/25로 구성된다. 상기 정의된 비의 한계값의 조합으로부터 유래된 임의의 범위가 본 발명에 개시되어 있다. 예를 들어, 상기 범위는 5/95 내지 95/5 또는 25/75 내지 90/10 또는 50/50 내지 85/15일 수 있다.

데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트 모두의 존재가 필수적이지만, 다른 GAG가 존재할 수 있다는 것이 배제되는 것은 아니다.

GAG (또는 뮤코다당류)는 반복되는 이당류 단위로 이루어진 장쇄의 비분지된 다당류이다. 반복 단위 (케라탄 제외)는 아미노 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)과, 우론당 (글루쿠론산 또는 이두론산) 또는 갈락토즈로 이루어진다.

GAG의 비제한적인 예는 다음과 같다: 데르마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 헤파란 설페이트, 헤파린, 해중합 헤파린, 예를 들어 저분자량 헤파린 및 매우 낮은 분자량의 헤파린, 화학적으로 변형된 헤파린, 예를 들어 수퍼설페이트화된 헤파린, 히알루론산, 케라탄 설페이트.

데르마탄 설페이트와 콘드로이틴 설페이트의 합계량은 GAG의 총량의 40 중량% 이상, 바람직하게는 50 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 60 중량% 이상, 더 더욱 바람직하게는 70 중량% 이상 및 가장 바람직하게는 80 중량% 이상의 양으로 존재하는 것이 바람직하다.

상기 GAG 조성물은 바람직하게는 20 중량% 미만, 또는 10 중량% 미만, 또는 5 중량% 미만의 양의 히알루론산을 함유한다. 더욱 바람직하게는, GAG 조성물은 실질적으로 히알루론산이 없다. 헤파린의 양은 또한 바람직하게는 20 중량% 미만, 또는 10 중량% 미만, 또는 5 중량% 미만이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 실질적으로 헤파린이 없다. 바람직하게는, 케라탄 설페이트의 양은 또한 제한되고 바람직하게는 20 중량% 미만, 또는 10 중량% 미만, 또는 5 중량% 미만이다. 더욱 바람직하게는, GAG 조성물에는 실질적으로 케라탄 설페이트가 없다.

본 발명의 조성물은 노화되는 피부 또는 피부 병리 (예를 들어, 아토피 피부, 건성/심한 건성 피부, 피부 가려움 등)를 치료하는 데 사용하기 위한 임의의 적합한 조성물일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 수용액 또는 크림 형태일 수 있다.

따라서, 본 발명의 실시양태는 상기 정의된 GAG 조성물을 바람직하게는 1 내지 15 중량%의 양으로 포함하는 크림 또는 겔을 피부에 적용하는 것을 포함하는, 피부 치료 방법에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 피부의 주름 깊이를 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 피부에 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 화장품학적 조성물을 적용하는 것을 포함하고, 이때 상기 화장품학적 조성물에서 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트의 총량은 바람직하게는 0.1 중량% 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.2 중량% 내지 5 중량%, 더 더욱 바람직하게는 0.4 중량% 내지 3 중량%이다.

본 발명에 따른 GAG 조성물은 또한 경구 투여될 수 있다. 경구 투여에 유용한 상기 조성물은 GAG 조성물의 총량을 기준으로, 바람직하게는 70 중량% 이상의 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트, 더욱 바람직하게는 80 중량% 이상의 상기 두 성분을 포함한다. 경구 투여를 위한 조성물은 또한 경구 투여가능한 환제, 정제 또는 이와 유사한 것의 제조 시 전형적으로 사용되는 기타 부형제를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 경구 투여가능한 조성물에는 실질적으로 콜라겐이 없다. 또 다른 측면에서, 경구 투여가능한 조성물에는 실질적으로 엘라스틴이 없다. 명세서 전반적으로 실질적으로 없다라는 표현은 그 양이 1.0 중량% 미만, 바람직하게는 0.5 중량% 미만, 더욱 바람직하게는 0.1 중량% 미만, 또는 심지어 검출 한계 미만이 되도록 하는 양임을 말한다.

전형적으로, 화장품학적 조성물은 용액 또는 크림으로서 배합된다. 용액은 바람직하게는 30 내지 98 중량%, 더욱 바람직하게는 85 내지 97 중량%의 물을 포함하는 수성의 단상성 시스템이고; 수용액은 또한 겔 형태일 수 있으며, 여기서 그 구조는 일반적으로, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 5 중량%의 양으로 존재하는 특정 레올로지 성분, 즉 겔 형성제에 기인한 안정화 덕분에 달성된다. 상기 조성물은 습윤제, 산화방지제, 방부제, 안정화제, 및 화장용 겔에 통상 사용되는 기타 화합물과 같은 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

조성물이 크림 형태이거나, 수중 오일 및/또는 실리콘, 또는 오일 및/또는 실리콘 중 물 에멀젼으로 존재하면, 물은 통상적으로 바람직하게는 0 내지 75 중량%, 더욱 바람직하게는 30 내지 70 중량%, 더욱 바람직하게는 60 내지 70 중량%의 소량으로 존재하고; 이 경우, 상기 조성물은 또한 천연 오일 및 합성 오일/지방 또는 그의 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 오일 및/또는 실리콘 또는 지방을 바람직하게는 5 내지 50 중량%, 더욱 바람직하게는 8 내지 30 중량%, 가장 바람직하게는 10 내지 20 중량%의 양으로 포함하고; 이온성 및 비이온성 유화제로부터 선택된 하나 이상의 유화제를 바람직하게는 1 내지 20 중량%, 더욱 바람직하게는 2 내지 15 중량%, 가장 바람직하게는 4 내지 14 중량%의 양으로 포함한다. 따라서, 크림 형태의 본 발명에 따른 바람직한 조성물은 하나 이상의 합성 또는 천연 오일 또는 지방, 및 선택적으로 물, 유화제, 방부제, 산화방지제, 습윤제, 및 화장용 크림에 통상적으로 사용되는 기타 화합물을 포함할 것이다.

본 발명에 따른 화장품학적 조성물에서 GAG 조성물의 함량은 0.1 중량% 이상, 또는 0.2 중량% 이상, 또는 0.3 중량% 이상, 또는 0.5 중량% 이상, 또는 0.8 중량% 이상이다. 글리코사미노글리칸 조성물이 15.0 중량% 이하, 또는 10.0 중량% 이하, 또는 5.0 중량% 이하, 또는 3.0 중량% 이하, 또는 2.0 중량% 이하, 또는 1.5 중량% 이하, 또는 1.3 중량% 이하의 양으로 존재하는 것이 또한 바람직하다. 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 약 1 중량%, 예를 들어 0.9 중량% 내지 1.1 중량%의 양으로 존재한다. 본 발명에 따른 화장품학적 조성물에 존재하는 기타 GAG 또는 비-GAG 성분과 별개로, 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트의 합계량은 총 화장품학적 조성물의 0.1 중량% 이상, 바람직하게는 0.2 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 0.4 중량% 이상, 더 더욱 바람직하게는 0.5 중량% 이상인 것이 바람직하다.

한편, 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트의 합계량은 화장품학적 조성물의 총 중량의 바람직하게는 10 중량% 미만, 더욱 바람직하게는 5 중량% 미만, 더 더욱 바람직하게는 3 중량% 미만이다.

겔 조성물과 크림의 예는 다음과 같다:

스킨 제품에 본 발명에 따른 GAG 조성물을 사용하면 피부 기질이 향상되고, 그러한 향상이 안티-에이징, 안티-링클 및 보습 효과를 만들어 낸다는 것이 밝혀졌다.

피부 기질은 피부의 구조적 통합성, 기계적 탄성, 안정성 및 그 밖에 많은 특성을 담당한다. 피부 기질의 퇴화는 주름과 피부 노화의 그 밖의 징후의 발달에 중요한 역할을 한다. 피부 기질의 가장 잘 알려진 구성요소는 구조적 단백질 (콜라겐 및 엘라스틴)이고, 이들은 피부 건강과 젊음에 필수적이다. 구조적 단백질이 필요하지만 건강한 피부 기질을 위해서는 불충분하다. 주된 피부 기질 충전물인 히알루론산은 기계적 완충작용을 하고, 수분을 잡아 주어 오래가는 보습 특성을 담당한다.

데코린은 피부에서의 주요 프로테오글리칸으로서, 코어 단백질을 갖는 작은 프로테오글리칸이고, 이는 편자형상이고 그의 안쪽 오목한 부분은 공간을 제공하여 I형 콜라겐을 위한 결합 자리를 제공할 수 있다. 기질 피부에서 데코린의 양은 피부 탄성에 중요한 영향을 미친다. 실제로, 데코린 대 콜라겐의 특정 비가 최적 섬유 형성을 위해 필요하다.

본 발명에 따른 조성물은 피부의 장기간 수분공급량을 증가시키고 주름의 깊이를 감소시키는 데 효과적이다.

어떠한 이론에 구속시키지 않으면서, 본 발명에 따른 조성물의 보습, 안티-에이징 및 안티-링클 효과는 데코린, 콜라겐 I 및 히알루론산 합성효소 유전자 발현을 증가시키는 데 있어서 그 효과와 관련이 있을 수 있다.

실험 부분

GAG 조성물에서 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트의 농도는 다음 방법에 따라 전기영동에 의해 측정하였다.

정제수 중 약 0.7%의 농도로 GAG 조성물의 용액을 제조하였다. 저온유지장치를 켜고 전기영동을 위한 수반을 식혔다. 수반의 바깥쪽 탱크에 1M 바륨 아세테이트 버퍼 용액을 채우고 중심 탱크는 n-데칸으로 채웠다. 두 액체는 서로 섞이지 않는다: 데칸은 더 가벼워서 표면 상에 남았으며 버퍼 온도를 일정하게 유지하기 위해 사용되었다.

플렉시글라스 탱크는 정제수로 채웠고 또 다른 탱크는 0.1 M 바륨 아세테이트 용액으로 채웠다. 플레이트의 한쪽 면은 정제수 안에 약 1cm의 깊이까지 담그고, 페이퍼 타월로 말리고, 물과 바륨 아세테이트 사이에 몇 mm의 마른 플레이트를 두도록 남은 부분이 0.1 M 바륨 아세테이트 용액에 물들게 하였다. 플레이트를 페이퍼 타월로 말리고, 어플리케이터를 사용하여, 샘플을 흩뿌리고 플레이트의 일부에 있는 어떠한 표준물질도 물 속에 잠기게 하였다.

플레이트를 전기영동 셀 안 브릿지 상에서, 다공성 부분이 아래를 향하고 샘플이 흩뿌려진 쪽은 캐쏘드(음극)을 향하도록 두었다. 첫번째 전기영동 실행은 200 볼트에서 2분 동안 수행되었다. 샘플은 두 용액(물과 바륨 아세테이트) 사이 라인 상에서 이동하였고; 플레이트를 제거하였고, 말리고 정확하게 2분 동안 3% 에탄올 용액에 잠기게 하였다. 이러한 방식으로, 느리게 움직이는 밴드의 이동은 멈추었다. 플레이트를 말리고, 셀 안에 다시 놓고 200 볼트에서 15분 동안 2번째 실행을 수행하였다. 실행의 말기에, 플레이트를 제거하였고, 말리고 정확히 2분 동안 20% 에탄올 용액 안에 두었다. 이러한 방식으로, 빠르게 움직이는 (데르마탄 설페이트) 밴드가 멈추었다.

상기 플레이트를 말리고, 25분 동안 200 볼트에서의 3번째 전기영동 실행을 위해 셀 안에 두었다; 이러한 방식으로 콘드로이틴 설페이트 밴드가 이동한다. 최종적으로, 플레이트를 말리고 10분 동안 염색용액으로 옮긴 다음, 이어서 완전한 변색이 일어날 때까지 탈색 용액으로 옮겼으며, 용액은 가끔 바꾸어 주었다.

덴시토미터로 플레이트를 판독하는 것은 다음과 같은 조건에서 수행되었다:

- 파장: 600 mm

- 광 모드: 반사

상기 기기는, 이동 밴드가 크로마토그램으로 표시되는 보고서를 작성하였다. 각각의 피크에 대해, 전기영동 이동도의 값(Rf), 면적 및 면적% (각각의 피크의 면적 x 100/모든 피크 면적의 합)이 표시된다.

히알루론산의 검출은 종래의 기술에 따라 HPLC로 수행될 수 있다. 헤파린 및 헤파란 설페이트는 또한 전기영동 기법에 의해 검출된다.

시험관 내 실험

시험관 내 실험은 본 발명에 따른 GAG 조성물의 1%를 포함하는 용액 상에서 수행되었다. GAG 조성물은 75 중량% 데르마탄 설페이트 및 25 중량% 콘드로이틴 설페이트로 구성되었다. 실험은 3D 조직 상에서 수행되었다.

시험관 내 대체물들 사이에, 3D 조직은 사람에게 가장 가까운 생물학적 모델이라고 하는 강점이 있다: 이 조직은 다층 구조를 갖고 생체 내 조직으로서 조직 기능을 갖는다; 또한, 시험되어야 할 제품을 생체 내와 동일한 농도 및 모드로 조직 표면 상에 적용할 수 있다.

국소적으로 적용된 제품으로 사람 피부를 처리하면, 역동적 경로를 갖는 유전자 반응으로 이어지며, 사건의 연속에 책임이 있는 전사 레벨에서 첫 번째 세포 신호를 나타낸다. 3D 살아 있는 사람 조직은 직접적인 유전자 반응 및 또한 가용성 매개체 및 특이적 바이오마커 발현을 통한 세포 신호전달 및 혼선의 결과를 고려하여 효능을 평가하기 위한 적절한 시험 시스템이다.

"코스메토제노믹스(cosmetogenomics)"의 개념을 성분과 가공된 제품의 효능을 예측하기 위한 셋-업 실험 모델에 적용하였다. 항상성 모델이, 진피 및 표피 격막을 재생하는 "전층(Full-thickness) 피부 모델" (FT-피부)에 대한 화장품 시험을 위해 특별히 개발되었다: 이러한 모델은 제품 적용 후 단기간(24h/48H) 및 장기간 (최대 2주) 후 진피의 세포외 기질 변형을 연구할 수 있도록 하는 특이성을 갖는다. 제품의 상대적 효능은 대조군의 미처리된 조직과 비교하여 정량화된다.

활성 1 중량% 용액의 효능은 24h 및 48h의 처리 후 피부의 항상성 조건에 대해 FT 피부 모델 상에서 시험관 내에서 평가되었다.

페니온(Phenion)^® 전층 피부 모델은 헨켈(Henkel)에 의해 제조된다 (독일 뒤셀도르프, 직경 1.3 cm). 이러한 모델에서, 표피 각질형성세포 및 진피 섬유모세포 (건강한 공여자로부터 받은 생검 물질로부터 유래됨)는 배양 조건 하에 사람 피부를 닮은 다층 피부 등가물을 형성한다. 섬유모세포는 섬유모세포 견인력 하에 수축하지 않는 특화된 안정한 기질 안에서 성장한다. 이러한 진피 등가물의 개발 후, 각질형성세포가 덮여지고 수일 안에 뚜렷하게 인식할 수 있는 층들을 갖는 표피로 발달한다. 표피 및 진피 모두 생리적 기능 단위 및 유사 사람 피부를 형성하고, 표피는 다양한 분화 표지자를 생성한다 (사이토케라틴 10, 필라그린, 트랜스글루타미나아제, 및 인볼루크린). 표피-진피 이음부는 기저막 단백질 (라미닌 및 콜라겐 IV)에 의해 특성화된다. 진피 격막에서, 엘라스틴과 피브로넥틴의 데노보 합성(de novo synthesis)이 입증되었다. 기저 층의 증식 세포는 Ki-67 염색으로 식별된다. 상기 모델은 5주의 배양 기간 후 완전히 발달된다.

처리: 음성 대조군으로서 100 μL의 1% 용액 및 식염수를 24h 및 48h 동안 항상성 조건(스트레스가 적용되지 않음)에서 2개의 배양액으로 표피 표면 상에 적용하였다. 제품은 24h 후 다시 적용되었다. 다음의 바이오마커가 실시간 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 분석되었다: 데코린, 콜라겐 I 및 히알루로네이트 합성효소 1. 단백질 양은 상보적 면역형광 정량 분석에 의해 분석하였다. 데코린 및 콜라겐 I 단백질 발현은 웨스턴 블로테낼리시스(Western Blotanalysis)에 의해 정량화되었다.

RNA 추출, cDNA 역전사 및 실시간 PCR

세 단계 동안, 사용할 준비가 된 시약을 사용하였다. RNAqueous 방법은 세포 샘플로부터 전체 RNA를 추출하기 위해 사용되는, 신속하고 페놀이 없는 필터 기본 RNA 단리 시스템이다. 고용량 cDNA 역전사 키트를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 형광계 PCR 화학을 이용하는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 7500 페스트 리얼 타임(Fast Real Time) PCR 기기, 즉 태크맨(TaqMan) 검사를 사용하여, 유의미한 바이오마커의 유전자 발현을 연구하였다. 유전자 발현은 유전자에서 유전 정보, 예컨대 DNA 서열이 기능성 유전자 산물, 예컨대 단백질 또는 RNA로 제조되는 과정이다. 상대적 정량화는 칼리브레이터 샘플에서 동일한 서열에 대해 상대적인 시험 샘플에서의 핵산 서열 발현의 변화를 결정한다. GAPDH를 내인성 대조군 유전자로서 사용하여 입력량을 정규화하였다. 각각의 복제를 세 번씩 평가하였다. 2X 태크맨 패스트 유니버셜 PCR 마스터 믹스 (2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix)에서 태크맨 유전자 발현 검사 및 cDNA (25 ng)를 부가하여 총 부피 25 μL를 수득하였다. ABI PRISM 7500 패스트에서 열 조건 단계는 다음과 같다: 95℃ 20초; 40 주기(95℃ 3초+60℃ 30초).

웨스턴 블롯 분석(Western Blot Analysis)

방법의 원리

웨스턴 블롯팅은 단백질의 검출 및 분석을 위해 잘 정립되고 널리 사용되는 기법이다. 이 방법은 막 위에 부동화된 단백질에 대한 항체의 특이적 결합을 통해 항체:단백질 복합체를 만들고 몇 가지 검출 방법 중 하나로 상기 결합된 항체를 검출하는 것을 기본으로 한다. 단백질 샘플은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 도입된다. 이어서 겔을 한 장의 니트로셀룰로즈 상에 놓고 겔에서 단백질은 니트로셀룰로즈로 전기영동법으로 옮겨진다. 이어서 니트로셀룰로즈를 블록킹 버퍼에 담그고 단백질의 비-특이적 결합을 "차단"한다. 이어서 니트로셀룰로즈를 관심 대상의 단백질에 대한 특이적 항체로 인큐베이팅한다. 이어서 니트로셀룰로즈를 제2 항체로 인큐베이팅하는데, 이는 제1 항체에 대해 특이적이다. 전형적으로 제2 항체는 공유적으로 부착된 효소를 갖고, 이는 발색 기질이 제공될 때 유색 반응을 야기할 것이다.

절차

FT-스킨(FT-SKIN)을 바이오-플렉스 셀 라이시스(BIO-PLEX CELL LYSIS) 버퍼(BIORAD)에 놓고 프로테아제 억제제 혼합물을 새로 부가하고 균일화하고 얼음 위에서 30분 동안 보관한 후, 4℃에서 10분 동안 16,000 x g에서 원심분리하였다. 단백질 측정은 RC DC 단백질 검사 (BIORAD)로 수행하였다. 동일한 부피의 2X Laemmli 샘플 버퍼를 용해물에 부가한 후, 각각의 샘플을 100℃에서 5분 동안 샘플 버퍼에서 가열하고 트리스-글리신 익스텐디드(Tris-Glycine Extended) (TGX) 미리 틀에 넣은 무염료 겔 7.5% (Bio-Rad) 상에서 분리되도록 준비하고 (총 단백질 50 ㎍) PVDF 막(BIORAD)으로 옮긴다. 상기 막을 TBST 0.05% 중 5% 블록킹 용액(BSA)을 사용하여 실온에서 1 시간 동안 블록킹하였다. 막은 래빗 다클론성 항체 안티 DCN (NBP-84970, NovusBio) 및 안티 COL1(PA5-29569, Thermo Scientific)로 실온에서 1시간 인큐베이션으로 인큐베이팅하였다. 막을 각각 5분씩 TBST로 3회 세척하여 세정하였다.

결합된 항체들은 실온에서 TBST 중 1 시간 동안 라벨링된 고트 안티-래빗 IgG 2차 항체(656120, Invitrogen)의 권장된 희석으로 검출되었다. TBST에서 3회 세척 후, 상기 막은 클래러티 웨스턴 ECL 서브스트레이트(CLARITY WESTERN ECL SUBSTRATE) (BIORAD)로 신호 발생의 준비가 되었다. DCN 및 COL1의 화학발광밴드는 케미독(Chemidoc) XRS 시스템 (BIORAD)을 사용하여 가시화되었고 이미지랩(ImageLab) 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다 (각각 100/50KDa 및 250 kDa).

도 1 내지 3에, 상기 실험에서 수득된 결과가 보고되어 있다. 처리한 지 48시간 후, 데코린 유전자 발현의 증가율 (도 1)은 46%이고, 콜라겐 I 유전자 발현에서의 증가율 (도 2)은 61%이며, 히알루론산 합성효소 유전자 발현에서의 증가율 (도 3)은 559%이다.

생체 내 실험

시험은 처리하는 4주 동안 25명의 자원자에 대해 수행하였다. 자원자를 위에서 정의된 바와 같은 수중 오일 에멀젼 크림으로 처리하였다.

GAG 조성물은 75 중량% 데르마탄 설페이트 및 25 중량% 콘드로이틴 설페이트로 이루어졌다. 참고로, GAG 없는 동일한 크림이 사용되었다(기본 에멀젼).

두 가지 측정을 25명의 자원자에 대해 수행하였다: 즉 주름 깊이 및 보습 수준. 주름 깊이는 더마톱 블루(Dermatop Blue)™로 평가하였다. 보습 수준은 처음 적용한 지 3시간 후와 적용한 지 8일 후 하루에 2회씩 코네오미터리(corneometry)에 의해 측정하였다.

안티-링클 효과

본 발명에 따른 크림을 사용한 자원자들은 4주 후 23.1%의 평균 주름 깊이 감소율을 나타낸 것에 비해 기본 에멀젼을 사용하는 자원자들은 16.4%의 감소율을 나타내었다.

보습 효과

처음 적용한 지 3 시간 후, 기본 에멀젼이 본 발명에 따른 크림보다 더욱 효과적인 것으로 나타났다 (기본 에멀젼 +39.9%에 비해 본 발명 크림 +28.7%); 그러나, 8일 후, 상황이 완전히 바뀌었다 (기본 에멀젼 +33.5%에 비해 본 발명 크림 +52.3%).

이러한 데이터는 시험관 내 데이터가 생체 내 시험에 의해 확인됨을 입증한다. 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 GAG 조성물을 사용하면 보습 효과와 통계적으로 적당한 주름 깊이의 감소율을 만들어낸다.

Claims

데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 글리코사미노글리칸의 혼합물 0.1 내지 10.0 중량%를 포함하는 조성물로서, 이때 글리코사미노글리칸의 총량을 기준으로, 데르마탄 설페이트의 양은 5 중량% 이상 95 중량% 이하이고, 콘드로이틴 설페이트의 양은 5% 이상 95 중량% 이하인 조성물.
제1항에 있어서,
글리코사미노글리칸의 총량을 기준으로, 데르마탄 설페이트의 양은 10 중량% 이상 90 중량% 이하이고, 콘드로이틴 설페이트의 양은 10% 이상 90 중량% 이하인 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 화장품학적 조성물.
제3항에 있어서,
글리코사미노글리칸 혼합물은 총 조성물을 기준으로 0.5 내지 5 중량%의 양으로 존재하는 화장품학적 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서,
글리코사미노글리칸 혼합물은 적어도 또 다른 글리코사미노글리칸을 포함하는 화장품학적 조성물.
제3항 또는 제4항에 있어서,
글리코사미노글리칸 혼합물이 데르마탄 설페이트와 콘드로이틴 설페이트의 혼합물로 이루어진 화장품학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 수용액, 액체 형태이거나 겔과 같은 점성 형태로 존재하고, 또한 물, 및 선택적으로 습윤제, 산화방지제, 방부제, 안정화제, 및 화장용 겔에 통상 사용되는 기타 화합물로부터 선택된 기타 첨가제를 포함하는 화장품학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 크림 형태로 존재하고, 또한 천연 오일 및 합성 오일/지방 또는 그의 혼합물로부터 선택된 하나 이상의 오일 및 또는 실리콘 또는 지방, 이온성 및 비이온성 유화제로부터 선택된 하나 이상의 유화제, 및 선택적으로 물, 및 습윤제, 산화방지제, 방부제, 안정화제, 및 화장용 크림에 통상 사용되는 기타 화합물로부터 선택된 기타 첨가제를 포함하는 화장품학적 조성물.
안티-에이징 조성물로서의 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 글리코사미노글리칸 조성물의 용도로서, 이때 글리코사미노글리칸의 총량을 기준으로, 데르마탄 설페이트의 양은 5 중량% 이상 95 중량% 이하이고, 콘드로이틴 설페이트의 양은 5% 이상 95 중량% 이하인 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
안티-링클 조성물로서의 데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 글리코사미노글리칸 조성물의 용도로서, 이때 글리코사미노글리칸의 총량을 기준으로, 데르마탄 설페이트의 양은 5 중량% 이상 95 중량% 이하이고, 콘드로이틴 설페이트의 양은 5 중량% 이상 95 중량% 이하인 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트를 포함하는 글리코사미노글리칸의 조성물로서, 이때 글리코사미노글리칸의 총량을 기준으로, 데르마탄 설페이트의 양은 20 중량% 이상 90 중량% 이하이고, 콘드로이틴 설페이트의 양은 10 중량% 이상 80 중량% 이하이며, 이때 데르마탄 설페이트와 콘드로이틴 설페이트의 합계량은 GAG의 총량의 60 중량% 이상의 양으로 존재하고, 헤파린의 양은 5 중량% 미만이고 히알루론산의 양은 20 중량% 미만인, 글리코사미노글리칸의 조성물.
제11항에 있어서,
데르마탄 설페이트 대 콘드로이틴 설페이트의 중량비가 50/50 내지 90/10로 구성된 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서,
헤파란 설페이트를 추가로 포함하는 조성물.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
데르마탄 설페이트 및 콘드로이틴 설페이트의 합계량이 GAG의 총량의 80 중량% 이상의 양으로 존재하는 조성물.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 글리코사미노글리칸 조성물을 포함하는 경구 투여가능한 조성물로서, 이때 실질적으로 콜라겐 및 엘라스틴이 없는 경구 투여가능한 조성물.