MX2012011354A

MX2012011354A - Nuevo biomaterial procedente de gelatina de wharton de cordon umbilical.

Info

Publication number: MX2012011354A
Application number: MX2012011354A
Authority: MX
Inventors: Julio Font Perez; Maria Begona Castro Feo; Maite Del Olmo Basterrechea
Original assignee: Histocell Sl
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2012-11-30
Also published as: CN102905710A; CA2794315A1; CA2794315C; JP2013523227A; KR101726906B1; CN102905710B; PT2552457E; AU2010350075A1; EP2552457B1; KR20130072202A; DK2552457T3; EP2552457A1; ES2550975T3; AU2010350075B2; JP5591995B2; US20130095143A1; US10226480B2; WO2011120535A1

Abstract

La presente invención se refiere a un biomaterial, específicamente un hidrogel, basado en la matriz extracelular del cordón umbilical para su aplicación en medicina regenerativa. La invención se refiere particularmente a un biomaterial compuesto por glicosaminoglicanos presentes exclusivamente en la gelatina de Wharton del cordón umbilical (que puede combinarse con células como una terapia de combinación), y también a los métodos para la producción y el uso del mismo.

Description

NUEVO BIOMATERIAL PROCEDENTE DE GELATINA DE WHARTON DE CORDÓN UMBILICAL CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un biomaterial, específicamente un hidrogel, formado a partir de la matriz extracelular del cordón umbilical para su aplicación en medicina regenerativa. La invención se refiere particularmente a un biomaterial compuesto esencialmente por los glicosaminoglicanos presentes exclusivamente en la gelatina de Wharton (GW) del cordón umbilical, y también a los métodos para la producción y el uso del mismo. Las realizaciones del producto pueden usarse individualmente o en combinación con terapias basadas en células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los biomateriales formados por polímeros desempeñan un papel fundamental en la medicina regenerativa puesto que proporcionan anclajes tridimensionales temporales para la adhesión, proliferación y la diferenciación de células trasplantadas. Esta estructura tridimensional proporciona una plataforma adecuada para la comunicación intercelular y la relación de las células con los componentes del biomaterial. La biointeracción que se produce entre la matriz y las células con el tiempo determina la capacidad proliferativa de las células, su organización para la formación de un nuevo tejido, su diferenciación y la secreción de moléculas de señalización que dirigen el proceso regenerativo (Dawson et al., 2008).

Con el fin de que se produzcan estos fenómenos, es necesario que el biomaterial permanezca en el sitio de aplicación durante un tiempo limitado hasta su reabsorción, conservando su estructura durante el tiempo suficiente para una acción celular adecuada con consecuencias regenerativas.

Los hidrogeles, un tipo específico de biomaterial, tienen varias propiedades que los hacen adecuados para su aplicación en la ingeniería de tejidos.

Los hidrogeles son estructuras formadas por polímeros hidrófilos interconectados de una naturaleza sintética o natural, con la capacidad para contener una gran cantidad de agua dentro de su estructura, desde el 10-20% hasta cientos de veces su propio peso. Estos geles muestran una morfología semisólida con una red tridimensional que es un candidato ideal para formar una matriz estructural que puede actuar como soporte. Esta estructura tridimensional puede formarse tanto mediante reticulación física como mediante reticulación química. La reticulación física conduce a hidrogeles reversibles cuya estructura puede invertirse según la aplicación final, mientras que la reticulación química covalente conduce a hidrogeles permanentes, cuya estructura se mantendrá a través de toda la aplicación (Coburn et al., 2007). Por tanto, los hidrogeles son materiales poliméricos (de una naturaleza sintética o natural) reticulados en forma de una red tridimensional que se hincha en contacto con agua, formando materiales elásticos blandos, y que retienen una fracción significativa de la misma en su estructura sin disolverse.

Los hidrogeles tienen una serie de características particulares, tales como: 1. Naturaleza hidrófila: debido a la presencia en su estructura de grupos solubles en agua (-OH, -COOH, -CONH2, -CONH, S03H). Tienen un alto contenido en agua similar al de los tejidos nativos (Elisseeff et al., 2005). 2. Insoluble en agua: debido a la existencia de una red polimérica tridimensional cohesiva en su estructura. 3. Tienen una consistencia gelatinosa que está determinada por el monómero de partida hidrófilo y la baja densidad de reticulación del polímero.

Tienen la capacidad para hincharse en presencia de agua o disoluciones acuosas, aumentando considerablemente su volumen hasta que alcanzan el equilibrio fisicoquímico, pero sin perder su forma. Esta capacidad para hincharse proporciona un microentorno acuoso comparable al que están sometidas las células en tejidos blandos. La presencia de agua y de una estructura porosa también permite el flujo de solutos de bajo peso molecular y de nutrientes que son cruciales y esenciales para la viabilidad celular, así como el transporte de desechos celulares fuera del hidrogel (Torres et al., 2000).

Los glicosaminoglicanos (GAG), también denominados mucopolisacáridos, son heteropolisacáridos que se encuentran en organismos unidos a un núcleo de proteína formando macromoléculas denominadas proteoglicanos. Éstos pueden encontrarse en las superficies de células o en la matriz extracelular y llevar a cabo importantes funciones para interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Están en formas sulfatadas y no sulfatadas con un resto molecular característico común que implica una secuencia repetida de disacáridos formados por dos azúcares diferentes: uno de ellos es habitualmente un hexuronato mientras que el otro es una hexosamina. La variación configuracional en los enlaces de los disacáridos y la posición de sulfatación conduce a un aumento de la diversidad en las propiedades físicas y químicas de estas cadenas. El alto contenido en sulfato y la presencia de ácido urónico confiere a los GAG una gran carga negativa, de modo que la gran cantidad de GAG en GW hace que este tejido sea extremadamente hidrófilo.

Existen varios tipos de GAG, que están directamente implicados en funciones celulares básicas, no sólo debido a su estructura, sino también porque son sitios de anclaje para varias moléculas de señalización celulares.

El ácido hialurónico es el GAG más abundante en GW. Es el único miembro no sulfatado de la familia de los GAG que funciona ¡n vivo como un hidrato de carbono libre, consistiendo su estructura en repeticiones de un disacárido: ácido D-glucurónico y (1-13-3) N-acetil-D-glucosamina (Goa et al., 1994; Laurent et al., 1992). Se sintetiza por varios tipos celulares y se secreta en el espacio extracelular en el que interacciona con otros componentes de la matriz extracelular para crear la estructura de soporte y protección que rodea las células (Collins ef. al., 2008). Es un polímero lineal polianiónico grande que presenta moléculas individuales que pueden tener un peso molecular de 100.000 a 5xl06 Da (Toóle et al., 2004; Bertolami et al., 1992). Tiene una estructura helicoidal que ocupa un gran volumen, lo que conduce a disoluciones de alta viscosidad. Las moléculas individuales de ácido hialurónico se asocian entre sí, formando redes o retículas. En tejidos en desarrollo, se considera que el ácido hialurónico es la principal macromolécula estructural implicada en la proliferación y migración celulares.

Se ha implicado el ácido hialurónico en varios procesos, tales como vascularización, morfogénesis, y en la integridad general y reparación de la matriz extracelular. Se sabe que una gran cantidad de ácido hialurónico contenido en el líquido amniótico favorece la reparación de heridas fetales (Longaker et al., 1989). Además se han observado variaciones en sus propiedades moleculares entre piel sana y cicatrices, siendo el ácido hialurónico de la cicatrización típica diferente al de la cicatrización hipertrófica (Ueno et al., 1992).

El sulfato de condroitina es un polímero lineal formado por un dímero de ácido D-glucurónico y repetición de N-acetilgalactosamina. Su utilidad se ha sometido a prueba en terapias dirigidas contra enfermedades articulares por medio de la inhibición de la actividad de las enzimas responsables de la degradación de la matriz de los componentes del cartílago. Puede actuar como antiinflamatorio por medio de la inhibición del complemento y es útil en el tratamiento de trastornos tromboembólicos, en cirugía y clínicas oftalmológicas.

El sulfato de dermatano, también conocido como sulfato de condroitina B, es un potente anticoagulante debido a su efecto inhibidor selectivo sobre la trombina a través del cofactor II de heparina, siendo muy eficaz in vivo debido a su menor riesgo hemorrágico (Trowbridge et al., 2002).

Los glicosaminoglicanos en general y la heparina en particular, tienen la capacidad para modular la actividad de la cascada plasmática, potenciando la inhibición de la ruta de coagulación intrínseca e inhibiendo la ruta de activación del complemento clásica en diferentes puntos (Rabenstein, 2001). Otras funciones conocidas de la heparina son la inhibición de la angiogénesis, el crecimiento humoral y su actividad antiviral.

El sulfato de heparano tiene una estructura que está relacionada estrechamente con la heparina. Está distribuido ampliamente en tejidos animales y entre sus funciones, la adhesión celular y la regulación de la proliferación celular, son primordiales. Tiene un efecto protector frente a la degradación de proteínas, regulando su transporte a través de la membrana basal y también interviniendo en la internalización de las mismas (Rabenstein, 2001).

Existen varios documentos de patente relativos a mucopolisacáridos obtenidos a partir de un origen humano o animal. El documento US 3.887.703 se refiere a mezclas de mucopolisacáridos obtenidos de los tegumentos cutáneos y cordones umbilicales procedentes de una fuente bovina fetal u ovina fetal. El procedimiento para obtener los mucopolisacáridos en la patente mencionada anteriormente no describe la eliminación de la membrana, células y componentes vasculares de los cordones umbilicales. El producto de extracción se obtiene en forma de un polvo sin una comprensión de la composición o cuantitativa clara de los mucopolisacáridos individuales contenidos en el mismo. Los productos activos se identifican mediante la cantidad de hexosaminas que están presentes en la mezcla. Se preparan composiciones en formas tanto inyectables como para ingesta oral para el tratamiento de cuero cabelludo y cabello grasos, y para inflamaciones, con los extractos.

El documento de patente US 5.814.621 se refiere a una composición que consiste esencialmente en un fármaco que es más soluble en una mezcla de disolvente orgánico-agua que en agua, y un mucopolisacárido que forma parte de un fármaco, en el que se distribuyen cristales o partículas del fármaco en la superficie de las partículas del mucopolisacárido y en el que dicho fármaco se disuelve en agua más rápidamente que si estuviera solo. Dicha composición puede estar en forma de gránulos.

La solicitud de patente WO 2008/021391 Al describe biomateriales que comprenden la membrana del cordón umbilical. Además, puede comprender adicionalmente uno o más vasos del cordón umbilical y/o gelatina de Wharton. El biomaterial está preferiblemente seco y puede ser plano, tubular o conformarse para adaptarse a una estructura particular. La invención también proporciona métodos de preparación del biomaterial que comprende al menos una capa de la membrana del cordón umbilical, así como los métodos para obtener dichos biomateriales y el uso de los mismos para reparar tejidos u órganos.

La descripción caracteriza el biomaterial procedente del cordón umbilical. Describe que la composición de dicho material comprende colágeno (tipo I, III y IV, siendo éstos el 75-80% del porcentaje de la matriz del biomaterial), fibronectina y glicosaminoglicanos.

También se menciona que el biomaterial también puede comprender colágeno que no proviene de cordones umbilicales y tiene un origen comercial, o se ha aislado de otros tejidos y métodos conocidos en el estado de la técnica. Los autores también añaden que el biomaterial puede comprender compuestos no estructurales tales como factores de crecimiento, hormonas, antibióticos, factores inmunomoduladores, etc.

La patente española ES 8600613 describe un procedimiento para el tratamiento de tejidos corporales, para separar membranas celulares, ácidos nucleicos, lípidos y componentes citoplasmáticos y formar una matriz extracelular cuyo componente principal es colágeno, y para hacer que el tejido corporal sea adecuado para usarse como injerto corporal, que comprende extraer dicho tejido con al menos un detergente mientras que al mismo tiempo se mantiene con un tamaño y una forma adecuados para el injerto del mismo en el cuerpo.

El documento de patente ES2180653T3 describe métodos para transformar materiales biológicos en sustancias que han experimentado autolisis para eliminar al menos el 70% de las células y métodos para el tratamiento de dicho material para inhibir su mineralización tras la implantación en un ser humano o animal. Reivindica que el material biológico de partida puede ser, entre otros, el cordón umbilical; aunque se refiere específicamente a una válvula aórtica de un cerdo. No obstante, la descripción no contiene ningún detalle con respecto a llevarlo a cabo con cordón umbilical. El biomaterial resultante se usa para crear una válvula cardiaca bioprotésica.

El documento de patente US 4.240.794 se refiere a preparar cordones umbilicales humanos o de otros animales para su uso como sustituto vascular. El documento describe específicamente una técnica para deshidratar el cordón umbilical en alcohol seguido por un método para fijarlo en la configuración deseada. Se describe que una vez que se ha limpiado el cordón umbilical de posibles restos de otros tejidos, se monta en un mandril y se sumerge en una disolución de alcohol etílico específica durante el tiempo necesario para deshidratarlo. Tras la deshidratación, se sumerge el cordón en una disolución de aldehido al 1% para la fijación.

El documento de patente FR 2.563.727 describe un método para producir un injerto de piel a partir de tejido conjuntivo desprogramado impregnado con gelatina de Wharton y almacenado a temperaturas de congelación. Los autores describen un dispositivo que se ancla al tejido umbilical y se expande por medio de una cánula que inyecta aire comprimido. Se describe que el cordón umbilical se corta entonces y se aisla pero el producto que resulta de este procedimiento no está compuesto por GW exclusivamente.

Existen documentos de patente que usan cordón umbilical para obtener células de interés, fin para el que llevan a cabo procedimientos para separar gelatina de Wharton y eliminarla, obteniendo por tanto dichas células. Por ejemplo, el documento PCT 98/17791 describe el aislamiento de pre-condrocitos del cordón umbilical, que se usan posteriormente de manera terapéutica para producir cartílago. De manera similar, en el documento WO 2004/072273 Al se extraen células progenitoras de gelatina de Wharton que se encuentra dentro de la región perivascular del cordón umbilical y se usan para reparar tejidos humanos.

A diferencia de otros biomateriales similares, el biomaterial de la presente invención está compuesto por una combinación de diferentes GAG presentes en la GW del cordón umbilical. Está compuesto principalmente por ácido hialurónico, pero además, a diferencia de otros compuestos de GAG, contiene sulfato de dermatano, sulfato de heparano, heparina, sulfato de queratano, 4-sulfato de condroitina y 6-sulfato de condroitina. La combinación específica de los diferentes GAG tal como está presente en la GW del cordón umbilical mejora la bioactividad del biomaterial, puesto que cada uno de ellos lleva a cabo funciones reguladoras del comportamiento celular. Por ejemplo, se sabe que el sulfato de heparano y la heparina son los principales sitios de unión para FGF y EGF (Kanematsu et al., 2003; Ishihara et al., 2002), que los protegen frente a la proteólisis y permiten concentraciones locales de estos factores en el entorno celular, creando el microentorno molecular adecuado para una gran activación celular (Malkowski et al., 2007) Sin embargo, según nuestros conocimientos, no hay ningún documento que mencione un biomaterial formado por GAG derivado de gelatina de Wharton de cordón umbilical que esté: 1) libre de vasos sanguíneos y membrana del cordón umbilical, 2) que pueda formar un hidrogel con viscosidad ajustable, 3) que sea aplicable a una amplia gama de patologías humanas. Además, los ejemplos de patentes mencionados anteriormente contienen productos derivados de cordón umbilical que difieren significativamente de la presente realización presentada en este documento. El biomaterial de la presente invención se basa en los glicosaminoglicanos que forman exclusivamente la matriz extracelular del cordón umbilical denominada GW. Por tanto, aunque se encuentran numerosos intentos para sintetizar matriz extracelular en la bibliografía, no se ha logrado una composición exacta que simule las condiciones naturales de un tejido específico.

El biomaterial desarrollado en la presente invención puede ofrecer un armazón tridimensional que tiene posibles aplicaciones como matriz de base para la ingeniería de tejidos. Además, cuando se aplica directamente o se combina con células como constructo en una patología, interviene en el proceso regenerativo, ejerciendo un efecto quimiotáctico sobre las células del tejido circundante, proporcionando por tanto un entorno favorable para la activación de procesos celulares.

La combinación de GAG presentes en este biomaterial proporciona varios sitios de unión de moléculas de señalización específicos que permitirán en el sitio de aplicación, una alta activación de las células del propio tejido para la síntesis de altos niveles de matriz extracelular que regenerarán y repararán el defecto tratado.

Además, el origen del biomaterial de la invención proporciona un producto natural de origen humano o animal procedente de una zona no inmunogénica. Este material se elimina a través de procesos de biodegradacion naturales en el cuerpo, previniendo por tanto las reacciones o efectos secundarios no deseados provocados por otros biomateriales. Por ejemplo, algunos biomateriales sintéticos pueden provocar inflamación, induración (endurecimiento de tejidos de órganos), aparición de granulomas, necrosis en mucosas y complicaciones tisulares debido a la toxicidad de las sustancias usadas en la producción de los mismos.

Una de las funciones más importantes de los GAG en el cordón umbilical es proporcionar fuerza, elasticidad y resistencia para proteger el sistema vascular ubicado en el mismo frente a alteraciones físicas externas (por ejemplo, el retorcimiento del cordón sería fatal para el feto). De hecho, la deficiencia en la síntesis de estas moléculas está implicada en importantes patologías durante el embarazo (Gogiel et al., 2005). Por tanto, se cree que un biomaterial compuesto por los 7 tipos diferentes de GAG que forman parte del cordón umbilical presentaría un gran grado de versatilidad a través de la presentación de las siguientes capacidades: recapitulación de la bioactividad que se produce en el organismo, presentación de las mismas propiedades mecánicas de las que se beneficia el cordón umbilical, y presentación de la idoneidad para la modificación y el procesamiento adicional (tal como, reticulación).

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Caracterización y cuantificación de GAG presentes en el biomaterial de la invención. El diagrama de barras muestra los diferentes tipos de GAG presentes en el biomaterial de la invención, así como la contribución porcentual en la composición de cada uno. HA: ácido hialurónico, KS: sulfato de queratano, C6S: 6-sulfato de condroitina, HS: sulfato de heparano, C4S: 4-sulfato de condroitina, DS: sulfato de dermatano, H: heparina.

Figura 2: Verificación de la presencia de GAG en la muestra y de la aparente falta de células y ADN/ARN en la misma por medio de tinción histológica. Las imágenes en la parte izquierda muestran las muestras con células y las imágenes en la parte derecha muestran la tinción del biomaterial solo. A, B: tinción con hematoxilina-eosina; C, D: tinción con verde de metilo-pironina; E, F: tinción con azul alciano.

Figura 3: Imágenes de la estructura tridimensional interna del biomaterial de la invención mediante microscopía electrónica de barrido. La imagen muestra la estructura interna del biomaterial de la invención a dos aumentos diferentes (A: 10 0m y B: 5 Sm), en la que pueden observarse las unidades de GAG interconectadas entre sí, ofreciendo una estructura porosa muy homogénea.

Figura 4: Resultados del estudio de toxicidad de las células en el biomaterial de la invención. Los gráficos muestran las curvas de citotoxicidad de las células CMMA (células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo) (figura A), fibroblastos de ratón (figura B9), L929 (figura C), osteoblastos (figura D), condrocitos (figura E) y queratinocitos (figura F). Se facilitan los resultados con respecto a un control (células sin biomaterial) y a un control positivo (células en un biomaterial tóxico tal como se determina según la norma ISO-10993, PVC). Tal como puede observarse en los gráficos, el biomaterial no provoca toxicidad en ninguno de los tipos celulares sometidos a prueba, puesto que la actividad mitocondrial de las células dispuestas en el biomaterial no muestra diferencias con respecto las células de control (en condiciones de cultivo convencionales).

Figura 5: Imagen ampliada del biomaterial tridimensional. Se muestra la estructura tridimensional macroscópica del biomaterial sólido de la invención tras liofilización para lo que se usó como molde una placa de cultivo de 24 pocilios convencional.

Figura 6: Imagen de microscopía óptica invertida que muestra la viabilidad de células de cartílago articular (condrocitos) y CMM teñidas con MTT en cocultivo en el biomaterial de la presente invención. La tinción es tanto a los 3 días como a los 7. Las células teñidas de color negro son viables y metabólicamente activas.

Figura 7: Una comparación de la capacidad proliferativa de condrocitos humanos en el biomaterial de la presente invención y en ácido hialurónico. Los datos en el gráfico muestran un aumento significativo en la capacidad de proliferación de condrocitos mantenidos en el biomaterial de la presente invención con respecto a los cultivados en ácido hialurónico.

Figura 8: Velocidad de proliferación de los fibroblastos L-929 en contacto con el biomaterial de la presente invención y ácido hialurónico. El gráfico muestra un aumento significativo en la proliferación de células dispuestas en el biomaterial de la presente invención en comparación con células cultivadas en ácido hialurónico.

Figura 9: Imagen de microscopía óptica invertida de células sembradas sobre plástico de cultivo celular, con el biomaterial de la presente invención, e hidrogeles de ácido hialurónico puestos en contacto con la superficie de cultivo celular. En estas imágenes, puede observarse que las células en contacto con el biomaterial de la presente invención se desprenden de la superficie de cultivo celular y forman agrupaciones dentro del biomaterial de la presente invención.

Figura 10: RT-PCR de la expresión de colágeno II y versicano. Resultados del barrido densitométrico de los geles de agarosa. Se expresan los datos como unidades arbitrarias de intensidad relativa al valor de control (C) y son la media ± e.e.m., n = 3. (*p < 0,05, **p < 0,01). La imagen muestra el inicio de la expresión de colágeno tipo II y la disminución del versicano en las CMMA dispuestas en el biomaterial de la presente invención. Estas características de expresión son indicativas de las células en el proceso de diferenciación hacia un fenotipo de condrocito y la síntesis de matriz extracelular correspondiente a cartílago articular maduro.

Figura 11: Resultados del módulo de almacenamiento para tres concentraciones diferentes del biomaterial de la presente invención derivado de fuentes porcinas y humanas. Se recogieron datos de una deformación/frecuencia de excitación individual derivada de las respectivas regiones viscoelásticas lineales de las muestras. Un barrido de temperatura a lo largo de temperaturas que incluyen los valores fisiológicos produjo una relación de temperatura viscoelástica para todas las muestras.

Figura 12: Resultados del módulo de pérdida para tres concentraciones diferentes de histogel derivado de fuentes porcinas y humanas. Se recogieron datos de una deformación/frecuencia de excitación individual derivada de las respectivas regiones viscoelásticas lineales de las muestras. Un barrido de temperatura a lo largo de temperaturas que incluyen los valores fisiológicos produjo una relación de temperatura viscoelástica para todas las muestras.

Figura 13: Resultados del módulo de pérdida para tres concentraciones diferentes del biomaterial de la presente invención derivado de fuentes porcinas y humanas. Se recogieron datos de una deformación/frecuencia de excitación individual derivada de las respectivas regiones viscoelásticas lineales de las muestras. Un barrido de temperatura a lo largo de temperaturas que incluyen los valores fisiológicos produjo una relación de temperatura viscoelástica para todas las muestras.

Figura 14: Imágenes de microscopía óptica que muestran el reclutamiento celular de tejidos circundantes (quimiotaxia) en los días 1 (a), 3 (b) y 4 (c); en las que (i) corresponde al control positivo, (ii) corresponde a la configuración experimental con ácido hialurónico, (iii) corresponde al control negativo y (iv) corresponde a la configuración experimental con biomaterial de la invención.

Figura: 15: Imágenes de microscopía óptica que muestran tras la realización de un ensayo Live/Dead para determinar si eran viables o no las células que migran hasta la superficie de los fragmentos de cartílago. La imagen muestra que la amplia mayoría de células que emergen de los fragmentos de cartílago son viables.

Figura 16: Imágenes de microscopía óptica que muestran el reclutamiento celular de tejidos circundantes (quimiotaxia) en los días 5 (a) y 6 (b); en las que (i) corresponde al control positivo, (ii) corresponde a la configuración experimental con ácido hialurónico, (iü) corresponde al control negativo y (iv) corresponde a la configuración experimental con biomaterial de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El cordón umbilical contiene grandes cantidades de GAG (sulfatados y no sulfatados) que forman parte del tejido conjuntivo blando denominado GW. Entre estos GAG, el principal GAG no sulfatado es el ácido hialurónico (Hadidian eí al., 1948; Jeanloz eí al., 1950), aunque también se detectan menores proporciones de GAG sulfatados (Danishefsky et al., 1966). Además, estudios histológicos del cordón umbilical han sugerido la presencia de heparina (Moore eí al., 1957). También es muy probable que el cordón umbilical tenga más GAG sulfatados minoritarios que no se han identificado aún.

La presente invención se refiere a un hidrogel inyectable compuesto por los GAG presentes exclusivamente en la GW del cordón umbilical. Este hidrogel está completamente libre de células y cualquier otro componente vascular presente en el cordón umbilical a partir del que puede obtenerse el biomaterial, de modo que tiene de poca a ninguna inmunogenicidad. El biomaterial de la invención, o bien en su forma combinada con células o bien solo, es útil para tratamientos terapéuticos y cosméticos.

En el contexto de la presente invención, se definen los siguientes términos en el presente documento: "Hidrogel" se refiere a la formación de un coloide en el que la fase dispersa (coloide) se ha combinado con la fase continua (agua) para producir una sustancia similar a una gelatina viscosa. El coloide es normalmente una red interpenetrante de filamentos hidrófilos de producción natural o sintética.

"Inyección" se refiere a la inserción forzosa de una sustancia en una cavidad. Por ejemplo, una sustancia (habitualmente de valor terapéutico) se inyecta en una herida, o en la cavidad corporal, la circulación, u otra ubicación. Para el fin de la presente invención, la inyección puede consistir en diversos modos de penetración en la ubicación deseada.

Por ejemplo, la inyección puede implicar agujas hipodérmicas de tamaños de calibre que oscilan entre 0,5 mm y 15 mm. En cirugía artroscópica o laparoscópica, se usa un orificio de cilindro, aguja, u otro objeto similar para tratar patologías internas. En esta forma de inyección, se hace pasar de manera forzosa un agente terapéutico tal como un armazón a través del orificio de acceso que puede tener un tamaño de calibre considerablemente mayor que una aguja hipodérmica (por ejemplo 0,5 cm -4 cm).

"Hidrogel inyectable" se refiere al acto de aplicar un hidrogel usando una técnica de inyección a una patología, que penetra la barrera de la piel. Por ejemplo, la patología podría ser una herida crónica, un órgano dañado, tejido dañado, o cualquier otra lesión bajo la barrera de la piel que necesite tratamiento. El método de aplicación puede variar ampliamente desde jeringa hipodérmica hasta técnicas artroscópicas/laparoscópicas para dispositivos ad hoc diseñados específicamente para aplicar materiales a zonas afectadas.

Por ejemplo, podría utilizarse un análogo a una pistola selladora para suministrar una sustancia de alta viscosidad; podría aplicarse un dispositivo que bobina hilo a través de una aguja para suministrar una sustancia de hidrogel polimerizado filamentoso; podría utilizarse un orificio artroscópico/laparoscópico para suministrar un tapón de hidrogel a un defecto condilar cartilaginoso. Un experto en la técnica puede apreciar las multitudes de posibilidades para las técnicas de inyección.

"Hidrogel reticulado" se refiere a la estabilización iónica o covalente de un hidrogel que puede ser o no reversible. Los hidrogeles reticulados tienen mayores viscosidades que los hidrogeles no reticulados, son adecuados para la manipulación, presentan morfologías tridimensionales estables y pueden romperse con la aplicación de fuerza mecánica.

"Hidrogel tridimensional" se refiere a un hidrogel reticulado que mantiene una forma tridimensional que incluye estructuras tridimensionales más finas estables tales como poros. En cambio, un hidrogel no reticulado con flujo para llenar cualquier recipiente en el que se coloca. Esta resistencia al flujo en un hidrogel reticulado es característica de la capacidad de un hidrogel reticulado para mantener una estructura tridimensional estable.

El origen de los cordones umbilicales a partir de los que se extrae la GW para los fines de la presente invención puede proceder de mamíferos incluyendo tanto humanos como animales. Fuentes potenciales adicionales de GW son los cordones umbilicales de animales tales como: vacas, ovejas, cerdos, antílopes, camellos, ciervos, cabras, caballos, elefantes, rinocerontes, hipopótamos, jirafas, bisontes, búfalo, tigres, leones, leopardos, osos, etc. El biomaterial está formado por una mezcla de glicosaminoglicanos seleccionados del grupo que comprende: ácido hialurónico, sulfato de queratano, 6- sulfato de condroitina, sulfato de heparano, 4-sulfato de condroitina, sulfato de dermatano y heparina.

El biomaterial se encuentra preferiblemente formando la siguiente combinación y proporción de la mezcla de GAG: ácido hialurónico (40-80%), sulfato de queratano (2-25%), 6-sulfato de condroitina (3-10%), sulfato de heparano (1-9%), 4-sulfato de condroitina (0,5-7%), sulfato de dermatano (0,1-7%) y heparina (0,05-3%), más preferiblemente la combinación de GAG es: ácido hialurónico (70%), sulfato de queratano (10%), 6-sulfato de condroitina (7%), sulfato de heparano (5%), 4-sulfato de condroitina (4%), sulfato de dermatano (3%) y heparina (1%).

La presente invención también se refiere al biomaterial compuesto por el hidrogel descrito previamente, que se combina opcionalmente con células para un efecto terapéutico compuesto. La acción del hidrogel se potencia, por tanto, en el proceso regenerativo y de reparación de tejido en tejidos dañados gravemente o en tejidos sin la posibilidad de reclutamiento celular in situ por parte del paciente, como resultado del hecho de que el biomaterial contiene ahora células sanas que pueden contribuir a la eficacia del producto. Las células añadidas al armazón del biomaterial para formar el constructo pueden ser, entre otras: células madre mesenquimatosas no diferenciadas o células madre mesenquimatosas diferenciadas en otra estirpe celular, células madre hematopoyéticas no diferenciadas o células madre hematopoyéticas diferenciadas en otra estirpe celular, condrocitos y condroblastos, osteoblastos y osteocitos, queratinocitos, fibroblastos, miocitos, adipocitos, neuronas u otras células del sistema nervioso, células del sistema de glóbulos blancos, células corneales, células endoteliales o células epiteliales.

Los siguientes aspectos relacionados con la presente invención se presentan tal como sigue: (i) obtener un extracto de GAG a partir de gelatina de Wharton del cordón umbilical (ii) producir el hidrogel de GAG aislado de la gelatina de Wharton del cordón umbilical (iii) caracterizar el hidrogel obtenido y (iv) usar el biomaterial de hidrogel. Además, siguen estudios/ejemplos que demuestran la capacidad del hidrogel inyectable para afectar al comportamiento e interacciones celulares positivos en comparación con ácido hialurónico (HA).

Obtención de un extracto de GAG a partir de la GW del cordón umbilical.

El procedimiento para obtener el biomaterial comprende las siguientes etapas: a. obtener un cordón umbilical de origen animal o humano; b. tratar el cordón umbilical con una disolución salina y antibióticos; c. eliminar toda la sangre de la superficie del cordón; d. fragmentar el cordón en secciones de 1-2 cm; e. limpiar toda la sangre retenida en el interior; f. eliminar los vasos sanguíneos y la membrana del cordón umbilical; g. separar la sustancia gelatinosa que comprende la gelatina de Wharton; h. digerir enzimáticamente la sustancia gelatinosa obtenida; e i. precipitar y aislar los GAG; Específicamente, se realiza lo siguiente para aislar los glicosaminoglicanos de la GW del cordón umbilical: Obtención de la gelatina de Wharton.

Se recoge el cordón umbilical inmediatamente después del parto y se procesa o se mantiene a 49C hasta su procesamiento. No deben transcurrir más de 24 horas en estas condiciones.

Para el procesamiento, el cordón umbilical se mantiene preferiblemente en condiciones estériles en una campana extractora de flujo laminar de nivel de bioseguridad II. Se somete a al menos tres lavados sucesivos con una disolución de DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) o con tampón fosfato IX (PBS IX) con una mezcla de antibióticos (penicilina, estreptomicina, anfotericina B) y/o una disolución de tampón de lisis de eritrocitos, para eliminar por completo los residuos sanguíneos.

Una vez que la superficie del cordón umbilical se limpia de sangre, se transfiere a una placa Petri y se fragmenta en secciones de 1-2 cm. Cuando se corta el cordón en fragmentos, es posible que se libere sangre retenida en el interior de los vasos sanguíneos del cordón umbilical, de modo que será necesario en este caso lavar meticulosamente los fragmentos de cordón.

El cordón umbilical tiene a nivel estructural dos arterias umbilicales y una vena umbilical, sostenidas por una matriz consistente que es GW y cubierta por una membrana delgada. Con el fin de obtener exclusivamente la GW, se eliminan mecánicamente la membrana y los vasos sanguíneos. Para ello, los fragmentos de cordón umbilical se seccionan longitudinalmente y con la ayuda de un bisturí y pinzas, se eliminan cuidadosamente tanto los vasos sanguíneos como la membrana del cordón umbilical. La sustancia gelatinosa que se obtiene como consecuencia de esta separación mecánica es la GW. Generalmente, se obtienen entre 20 y 160 g de gelatina de Wharton a partir de 25 a 200 g de cordón umbilical.

Extracción de GAG a partir de gelatina de Wharton.

Se usó el protocolo descrito en la bibliografía (Rogers et al., 2006) para obtener GAG a partir de cartílago por medio de digestión enzimática con la enzima papaína procedente de látex de papaya (SIGMA, ref.: P4762), con algunas modificaciones, para obtener GAG a partir de la GW del cordón umbilical. Se sumergió la GW obtenida en el punto anterior en 20 mi de la disolución de tampón de extracción (L-cisteína 5 mM, disolución de tampón de Na2HP04 100 mM, EDTA5 mM, 10 mg (14 U/mg) de papaína, pH 7,5) durante 24-48 horas a 609C para la digestión completa.

Una vez que se ha digerido por completo la GW, se centrifuga para eliminar el residuo de la digestión inservible. En este punto, se observa que el volumen de digestión es mayor que el volumen inicial. Este aumento se debe a la disolución de los GAG presentes en la GW y por tanto a la liberación del agua que acumulan.

Una vez que se centrifuga la muestra, se transfiere el sobrenadante a otro recipiente y entonces se precipitan los GAG presentes en la muestra.

Precipitación y aislamiento de GAG a partir de la GW del cordón umbilical.

Se precipitan los GAG de la GW con 5 volúmenes de etanol al 100%. Por medio de esta etapa, se precipitan los GAG de la muestra así como las sales presentes en la misma. La precipitación se produce debido al hecho de que las moléculas de agua presentes en la muestra interaccionan con las moléculas de etanol, de manera que las moléculas de agua no pueden interaccionar con los GAG de la muestra, volviéndose estos últimos insolubles en agua, y por tanto precipitando. Por tanto, justo tras la adición del etanol y la agitación del tubo, se observa un precipitado blanquecino. Se deja que los GAG precipiten durante 12 horas a -209C. Una vez que han precipitado, se centrifugan para eliminar el etanol al 100% y se lava el precipitado con 5 volúmenes de etanol al 75% para eliminar las posibles sales residuales que hayan precipitado en la muestra. Se centrifuga la muestra una vez más para eliminar por completo el sobrenadante.

Una vez que ha precipitado la muestra de GAG, se deja que se seque el residuo durante al menos 30 minutos a la temperatura ambiental hasta que se haya evaporado todo el etanol. Una vez que se ha evaporado el etanol, se resuspende la muestra de GAG en H20 Milli-Q y se almacena a 49C hasta su uso. El hidrogel así obtenido puede mezclarse con un suero inyectable y/o aplicarse directamente a la zona que va a tratarse. A pesar de lo anterior, la resistencia mecánica de este tipo de material es baja; no se considera para soportar cargas a menos que se combine con un material de refuerzo para formar un material compuesto. Por ejemplo, un soporte de fosfato de calcio podría servir como una matriz de refuerzo dentro de un material compuesto. Además; existe una afinidad muy alta entre las moléculas de polisacárido que componen este hidrogel inyectable. Esta afinidad es aparente en la alta cohesión del biomaterial de hidrogel. Sin embargo, existe también un carácter adhesivo sustancial con respecto al hidrogel que es beneficioso para el aislamiento local del hidrogel cuando se inyecta. En último lugar, la versatilidad del hidrogel dicta que puede administrarse solo o en combinación con células.

Existen otras aplicaciones terapéuticas que requieren un biomaterial de hidrogel inyectable más resistente, estable y permanente con una estructura interna que facilite mejor su colonización por células procedentes o bien de los tejidos adyacentes al sitio de aplicación o bien por células específicas dispuestas en el biomaterial antes de su implantación. En este caso, el biomaterial de la presente invención actuaría como una matriz tridimensional bioactiva para inducir la cicatrización y reparación de una herida de tejido.

El ácido hialurónico, el 6- y 4-sulfato de condroitina, el sulfato de queratano, el sulfato de dermatano, el sulfato de heparano y la heparina regulan la actividad celular y activan la síntesis de una nueva matriz extracelular. La diversidad y composición de GAG presentes en el biomaterial permite la existencia de varios sitios de unión específicos para factores de crecimiento que regulan los procesos de proliferación y diferenciación celular, así como la capacidad de las células para la síntesis de una nueva matriz extracelular y factores de crecimiento. Este efecto conduce a una mayor capacidad para la respuesta celular en los tejidos afectados y acelera la regeneración e incluso permite la cicatrización en el caso de zonas extremadamente degradadas, como es el caso de úlceras crónicas.

Se requiere una estrategia de estabilización (reticulación) con el fin de facilitar aplicaciones en las que el biomaterial va a funcionar como un armazón tridimensional estable. Con el fin de lograr este objetivo, los GAG pueden modificarse químicamente o reticularse para formar el hidrogel inyectable de la presente invención. Estas modificaciones químicas (reticulación, polimerización) implican normalmente grupos alcohol o carboxílicos, y pueden producirse in situ después de la inyección, o antes de la inyección. Además, este procedimiento implica que las cadenas de un polímero soluble en agua se vuelvan insolubles (Elisseeff eí al., 2005).

Los hidrogeles inyectables obtenidos por medio de reticulación tienen propiedades únicas que los hacen potencialmente útiles para la ingeniería de tejidos: alto contenido en agua para portar nutrientes o sustancias de desecho, elasticidad y la capacidad de encapsular o inmovilizar células in situ en un microentorno tridimensional. La densidad de reticulación afecta directamente al tamaño del poro del hidrogel inyectable y por tanto a las propiedades físicas del mismo, tales como el contenido en agua o la resistencia mecánica, por ejemplo. Un hidrogel inyectable con una densidad de reticulación grande y por tanto un tamaño de poro muy pequeño absorberá por tanto menos agua y tendrá mayor resistencia mecánica que un hidrogel inyectable con un menor grado de reticulación y un tamaño de poro grande.

La formación de hidrogel reticulado para inyección puede llevarse a cabo por medio de varios métodos incluyendo, pero sin limitarse a: cambios de temperatura, reacciones químicas y fotopolimerización. La reticulación puede llevarse a cabo in situ después de la inyección mediante metodologías de jeringa hipodérmica convencionales o ex vivo antes de la inyección y utilizando por tanto técnicas más cercanas a la laparoscopia/artroscopia tal como se definió anteriormente en este documento.

En una realización de la presente invención, la reacción de reticulación se lleva a cabo tal como sigue: se obtiene una disolución acuosa del polímero que va a reticularse (en este caso, una disolución acuosa de GAG) y se añade el reactivo químico que provocará la reticulación. En este caso, para obtener el hidrogel estabilizado, se usa EDC (clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil-carbodiimida) porque EDC activa grupos carboxilo en disoluciones acuosas. Estos grupos carboxilo activados pueden reaccionar con aminas primarias o grupos hidroxilo, dando como resultado enlaces amida o éster. Una vez que se forma el hidrogel, se lava varias veces con PBS para eliminar los residuos de EDC que puedan quedar. (Pieper et al., 1999; Wissink et al., 2001).

Opcionalmente, el hidrogel inyectable puede solidificar en un molde destinado para tal procedimiento durante la reacción de reticulación, de manera que adopte la forma y el tamaño deseados dependiendo del molde que se use. Estos hidrogeles pueden secarse por medio del procedimiento denominado liofilización para obtener así una estructura porosa debido a la eliminación de las moléculas de agua intercaladas entre las moléculas de GAG presentes en el hidrogel (figura 5). Además, una vez que se liofiliza el biomaterial, la estructura tridimensional del hidrogel puede caracterizarse por medio de microscopía electrónica de barrido (MEB) (figura 3). Una vez que se obtiene el hidrogel en su forma final, se esteriliza por medio de exposición a radiación ultravioleta durante un periodo de 40 minutos. Las pruebas de esterilidad realizadas sobre el hidrogel demostraron que el biomaterial se esterilizaba de forma óptima. Técnicas adicionales para la esterilización podrían ser tratamiento con gas de óxido de etileno o irradiación con radiación gamma tal como se dará cuenta un experto en la técnica.

Una vez esterilizado, el hidrogel inyectable está listo para usarse directamente o en asociación con células. Los ensayos de asociación de células con el hidrogel de la invención demostraron que el biomaterial no es citotoxico basándose en los resultados de los experimentos de la capacidad de proliferación (figura 4).

Usos del biogel.

El biomaterial de la invención, o bien en su forma combinada con células o bien solo, puede aplicarse en su forma inyectable en enfermedades del sistema articular y en tratamientos estéticos. Las células que pueden usarse son, entre otras: células madre mesenquimatosas no diferenciadas o células madre mesenquimatosas diferenciadas en otra estirpe celular, células madre hematopoyéticas no diferenciadas o células madre hematopoyéticas diferenciadas en otra estirpe celular, condrocitos y condroblastos, osteoblastos y osteocitos, queratinocitos, fibroblastos, miocitos, adipocitos, neuronas u otras células del sistema nervioso, células del sistema de glóbulos blancos, células corneales, células endoteliales o células epiteliales.

Dependiendo de la aplicación terapéutica o cosmética a la que se destinará el hidrogel, la técnica de inyección será diferente y la viscosidad del hidrogel se adaptará al calibre del sistema de inyección.

La viscosidad del hidrogel de la presente invención puede oscilar entre 10 y 150.000 cS; en el caso de hidrogel no reticulado es de desde 10 hasta 15.000 cS, preferiblemente entre 10 y 2.000 cS. El hidrogel reticulado puede tener una viscosidad que oscila entre 15.000 y 150.000 cS. La viscosidad del hidrogel puede modificarse mediante reticulación según las necesidades.

Tabla 1. Valores de viscosidad de diversos hidrogeles no reticulados y reticulados derivados de gelatina de Wharton tal como se describe en el biomaterial de la presente invención.

Hidrogel Viscosidad (cS) 5%-10% de derivado de ser humano/cerdo 70.000 (RETICULADO) 50% de derivado de ser humano/cerdo 15.000 40% de derivado de ser humano/cerdo 9.100 30% de derivado de ser humano/cerdo 4.900 20% de derivado de ser humano/cerdo 2.000 10% de derivado de ser humano/cerdo 150-580 5% de derivado de ser humano/cerdo 19-58 1% de derivado de ser humano/cerdo 4-6 El biomaterial desarrollado en la presente invención es útil en los siguientes tratamientos terapéuticos y cosméticos: remodelación, relleno o reconstrucción de tejidos blandos, el tratamiento de arrugas, pliegues y cicatrices, quemaduras, úlceras, aumento de tejidos blandos, lipoatrofia facial, enfermedades de los discos intervertebrales, reparación de cartílago, lesiones musculoesqueléticas, osteoartritis y periartritis; tratamiento de tumores, enfermedades vaginales, lesiones cerebrales, reparación de médula, trastornos degenerativos, enfermedades cardiovasculares y procesos de lubricación, como analgésico y antiinflamatorio.

El hidrogel inyectable reticulado de la invención puede tener una estructura sustancialmente porosa. En una realización, el diámetro de poro es de 0,5-1.000 µ??, preferiblemente de 0,5-500 µ??, con una viscosidad mayor de 15.000 cS. Dicho biomaterial puede aplicarse preferiblemente como armazón en las siguientes patologías: tratamiento de quemaduras, úlceras y defectos dermoepidérmicos, tratamiento de enfermedades oftalmológicas, tales como lesiones corneales, lesiones retinianas o cataratas; reparación de cartílago, tratamiento del sistema osteoarticular, como en el caso de defectos osteocondrales, osteoartritis o defectos óseos, y como adyuvante en la resolución de enfermedades vaginales, tratamiento de gingivitis y periodontitis; uso en el desarrollo de sistemas de cultivo celular.

Las enfermedades condrales son un importante problema socioeconómico en todo el mundo. En este sentido, a pesar de la dificultad para registrar su incidencia, se estima que las lesiones articulares afectan a 500 millones de personas.

Las patologías condrales se producen como resultado de lesiones o enfermedades que, si no se tratan, pueden dar como resultado enfermedades degenerativas tales como la osteoartritis (OA).

La OA es uno de los tipos más comunes de artritis que afecta a 35-40 millones de personas en los Estados Unidos y Europa. Es una enfermedad degenerativa que provoca la desintegración del cartílago acompañada por una reacción en los huesos. Afecta generalmente a las manos, rodillas, caderas, los pies y el cuello, y en adultos, se considera una de las causas más comunes de incapacitación física.

El cartílago articular es un tejido avascular altamente especializado que protege al hueso de la articulación diartrodial frente a fuerzas asociadas con el peso y los impactos que conducen a fricciones entre las superficies articulares. Este tejido está formado por un único tipo celular, los condrocitos, y por una importante y rica matriz extracelular. Dicha matriz consiste en una red densa de fibras de colágeno tipo II (molécula predominante) y, dentro de esta red, macroagregados de proteoglicanos, que contienen GAG tales como sulfato de condroitina, sulfato de queratano, ácido hialurónico y agrecano.

La arquitectura especializada del cartílago y su capacidad de reparación limitada hace que el tratamiento de este tipo de lesiones sea muy complicado. La ausencia de vascularización hace que su capacidad regenerativa sea muy limitada, puesto que las células madre no pueden acceder a la zona dañada para contribuir en el proceso regenerativo.

En los últimos años, se han usado biomateriales biodegradables para el tratamiento de lesiones condrales. En este sentido, los polímeros sintéticos macroscópicos (de ácido láctico, ácido glicólico, caprolactona...) se han convertido en los grupos más importantes y numerosos de biomateriales. Sin embargo, estos materiales macroscópicos sólido requieren el uso de intervenciones quirúrgicas agresivas, tales como cirugía convencional. Para el fin de superar estas limitaciones, están desarrollándose actualmente nuevas biomatrices que pueden implantarse mediante técnicas mínimamente invasivas, tales como mediante inyección o artroscopia.

Por tanto, una de las aplicaciones del biomaterial inyectable de la presente invención es la regeneración del cartílago articular dañado en los procesos degenerativos de la osteoartritis. El biomaterial de la presente invención puede administrarse fácilmente en la zona que va a regenerarse por medio de técnicas de inyección percutánea tales como artroscopia, o por medio de cualquier dispositivo de inyección. Además de la fácil administración, el hidrogel inyectable tiene la propiedad de formar un implante estable que se ajusta al tamaño y la geometría del tejido deteriorado.

Otra aplicación del biomaterial de la presente invención es en el tratamiento de heridas. Las úlceras venosas, de decúbito y diabéticas crónicas son un importante problema que afecta a entre 3 y 6 millones de personas en los Estados Unidos. Esta patología afecta al 1-3% de la población de los países desarrollados y el 15% de los pacientes ingresados en hospitales padecen este estado. El gran número de pacientes que padecen estas lesiones produce considerables repercusiones socioeconómicas y sanitarias, estableciéndose por tanto un alto coste de tratamiento, y alterándose considerablemente la calidad de vida del paciente.

Las úlceras son traumatismos que tienen un efecto profundo sobre el organismo con una fisiopatología considerablemente compleja. Se produce una interacción sinérgica compleja entre los fibroblastos (células de la dermis), los queratinocitos (células de la epidermis), la matriz extracelular y proteínas derivadas del plasma en el lecho de la herida. La evolución a través de las diferentes fases de cicatrización de heridas: hemostasia, inflamación, reparación y remodelación, es típica, pero la naturaleza crónica y la reaparición de estas heridas es de importancia clínica. A pesar de la gran variedad de tratamientos y armazones disponibles hoy en día, la eficacia de cicatrización y la tasa de cicatrización continúan siendo extremadamente bajas, necesitándose por tanto tratamientos más eficaces que puedan lograr una rápida cicatrización de heridas. El conocimiento progresivo adquirido sobre la fisiopatología de las úlceras crónicas en los últimos años ha facilitado la generación y el desarrollo de nuevos armazones que son avances significativos en el tratamiento de esta enfermedad. Aunque, hasta ahora, no hay ningún armazón ideal para cubrir la piel; dicho armazón debe cumplir con una serie de características básicas tales como: 1) rápida adhesión a la herida, 2) proporcionar una función de barrera eficaz frente a la pérdida de fluidos, 3) elasticidad mecánica y estabilidad a largo plazo, 4) fácil de esterilizar, 5) fácil de manipular y transportar y 6) deben ser inocuos.

En resumen, el biomaterial de la presente invención tiene la mayoría de las características necesarias para que un armazón o diluyente sea eficaz en el tratamiento de las enfermedades mencionadas. En este sentido, para el fin de evaluar el efecto terapéutico de los presentes biomateriales, se han llevado a cabo estudios experimentales ¡n vivo, tal como se describe en los ejemplos 9 y 10.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Obtención de la gelatina de Wharton.

Se realizó el siguiente ejemplo con cordones umbilicales de fuentes tanto humanas como porcinas. Para aislar los GAG a partir de la GW de los cordones umbilicales respectivos, se siguió el procedimiento a continuación.

En cada caso, se recogió un cordón umbilical de 50 g inmediatamente después del parto en un frasco estéril en el que se habían depositado previamente 300 mi de PBS a una concentración IX (para 1 litro de H20: 8 g de NaCI, 0,2 g de KCI, 1,44 g de Na2HP04, 0,24 g de KH2P04, pH = 7,4 en 1 I de H20) y 3 mi de una mezcla de antibióticos de penicilina (30.000 unidades), estreptomicina (30.000 µg) y anfotericina B (5 µg) (LONZA, ref.: 17-745E) a una concentración IX. Pueden almacenarse los cordones umbilicales a 42C durante no más de 24 horas hasta su procesamiento, pero en este ejemplo se procesaron los cordones umbilicales inmediatamente después de recibirse.

Para el procesamiento, se mantuvieron los cordones umbilicales en condiciones estériles en una campana extractora de flujo laminar de nivel de bioseguridad II y se sometieron a lavados sucesivos para eliminar por completo los residuos de sangre que contenían. Para ello, se colocaron en dos recipientes, en los que se añadieron 300 mi de PBS IX (para 1 litro de H20: 8 g de NaCI, 0,2 g de KCI, 1,44 g de Na2HP04, 0,24 g de KH2P04, pH = 7,4 en 1 I de H20) que contenía 3 mi de una mezcla de antibióticos de penicilina (30.000 unidades), estreptomicina (30.000 E_g) y anfotericina B (75 C3g) (LONZA, ref.: 17-745 E); se agitaron manualmente inclinando verticalmente el frasco 5 veces durante 10 segundos, y se desechó el líquido, repitiéndose esta operación al menos 3 veces hasta que se retiró la mayor parte de la sangre. Entonces se lavaron los cordones umbilicales con 500 mi de una disolución de lisis de eritrocitos a una concentración IX (para 1 litro de H20: 8,99 g de NH CI, 1 g de KHC03, 37 mg de EDTA, pH 7,3) hasta la eliminación completa de los residuos de sangre.

Una vez que se limpió de sangre la superficie de los cordones umbilicales, se transfirieron a una placa Petri de 10 cm y se cortaron con tijeras estériles en fragmentos de 1-2 cm. Puesto que se liberó sangre retenida en los vasos sanguíneos mientras que se cortaban los cordones umbilicales en fragmentos, se añadieron 10 mi de PBS IX que contenía 1 mi de una mezcla de los antibióticos (10.000 unidades), estreptomicina (10.000 Eg) y anfotericina B (25 Elg) para limpiar meticulosamente dichos fragmentos, y se presionó la superficie del fragmento contra su superficie de soporte, realizando movimientos de desplazamiento horizontal a lo largo del fragmento con un bisturí estéril. Este proceso se repitió hasta que se eliminaron todos los residuos de sangre del interior. Se transfirieron los fragmentos de cordón umbilical completamente limpios a un tubo estéril y se procesaron inmediatamente, aunque si es necesario, pueden crioconservarse indefinidamente a -809C.

Entonces se retiraron mecánicamente la membrana que rodea los cordones umbilicales y los vasos sanguíneos ubicados en los mismos. Para ello, se abrieron longitudinalmente los trozos de cordón umbilical y con la ayuda de un bisturí y pinzas se retiraron cuidadosamente tanto los vasos sanguíneos como la membrana del cordón umbilical. La sustancia gelatinosa que se obtuvo como consecuencia de esta separación mecánica es la GW. Se obtuvieron 25 g de GW.

Ejemplo 2. Extracción de GAG a partir de gelatina de Wharton.

Se realizó el siguiente ejemplo con cordones umbilicales de fuentes tanto humanas como porcinas. Se utilizó un protocolo descrito para obtener GAG a partir de cartílago humano, con algunas modificaciones, para obtener GAG a partir de la GW del cordón umbilical (Rogers er o/., 2006).

Se sumergieron ambas GW obtenidas en el ejemplo 1 en 20 mi de la disolución de tampón de extracción (242 El de L-cisteína 200 mM, 1,42 mi de tampón de Na2HP04 704 mM, 100 SI de EDTA 0,5 M, 10 mg (14 U/mg), pH 7,5) papaína (SIGMA, ref.: P4762) y se mantuvieron a 609C durante 12 horas para digerir completamente la GW, y una vez que se digirieron, se centrifugaron las muestras a 1.500 g durante 5 minutos para eliminar el residuo de la digestión. Se observó que los volúmenes de digestión eran de aproximadamente 30 mi, aproximadamente 10 mi más que el volumen inicial de 20 mi, debido a la disolución de los GAG presentes en la GW y por tanto debido a la liberación del agua que éstos habían acumulado.

Una vez que se centrifugaron las muestras, se transfirió el sobrenadante a otro tubo y entonces se precipitaron los GAG presentes en las muestras.

Ejemplo 3. Precipitación y aislamiento de GAG a partir de la GW del cordón umbilical.

Se precipitaron los GAG de la GW presentes en el sobrenadante del ejemplo 2 con 5 volúmenes de etanol al 100%. Por medio de esta etapa, se precipitaron los GAG de las muestras así como las sales presentes en las mismas. Esto se debe al hecho de que las moléculas de agua presentes en las muestras interaccionan con las moléculas de etanol, de manera que las moléculas de agua no pueden interaccionar con los GAG de las muestras. Se dejaron precipitar los GAG durante 12 horas a -20QC. Una vez que precipitaron, se centrifugaron a 1.500 g durante 5 minutos, eliminándose por tanto todo el etanol al 100%. Se lavó el precipitado con 5 volúmenes de etanol al 75% para eliminar las posibles sales residuales que puedan haber precipitado en la muestra. Entonces se centrifugó durante aproximadamente 5 minutos a 1.500 g y se eliminó completamente el sobrenadante.

Una vez que han precipitado las muestras, se dejó secar el residuo sólido durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiental hasta que se hubo evaporado todo el etanol. La cantidad de GAG que precipitan partiendo de una muestra de aproximadamente 25 g de GW puede oscilar entre 50 y 300 mg, dependiendo del material de partida. En estos casos específicos, se obtuvieron aproximadamente 250 mg de precipitado de GAG. Para obtener el hidrogel de la presente invención, se resuspendieron los precipitados de GAG en 1 mi de H20 Milli-Q y se almacenaron a 42C.

Ejemplo 4. Producción de un hidrogel inyectable que contiene GAG de la GW del cordón umbilical.

El contenido en agua del hidrogel puede ser de desde el 10% hasta 100 veces su propio peso, dependiendo de la viscosidad requerida para su aplicación.

Se resuspendió el hidrogel obtenido tras la resuspensión de los GAG precipitados en 1 mi de H20 en una disolución de suero fisiológico inyectable y se dejó agitar moderadamente en un vórtex hasta que se produjeron la disolución y homogeneización completas. Una vez que se disolvió el hidrogel, se almacenó a 42C.

Ejemplo 5. Producción de un hidrogel reticulado que contiene GAG a partir de la GW del cordón umbilical.

Para producir un hidrogel más consistente y estable, se siguió el procedimiento descrito en la bibliografía (Cui et al., 2006). Se preparó una disolución acuosa a partir de los extractos de GAG obtenidos a partir de la GW según el ejemplo 3. Específicamente, se preparó una disolución de GAG en H20 al 1%. Para ello, se añadieron 10 mi de H20 a los 200 mg de GAG obtenidos tras su precipitación y aislamiento (ejemplo 3). Se añadieron 1,2 g de dihidrazida adípica (ADH) a la disolución y se ajustó el pH de la disolución a pH = 3,5 con HCI 0,1 N. Una vez que se ajustó este pH, se añadieron 0,6 g del fijador, EDC (clorhidrato de l-et¡l-3-(3-dimetilaminopropil-carbodiimida) (SIGMA, ref.: E6383), a la disolución. Se mantuvo la mezcla entre 30 minutos y 1 hora con agitación constante a la temperatura ambiental hasta que se obtuvo el hidrogel estable.

Una vez que se formó el hidrogel estable, se lavó 3 veces con PBS IX (para 1 litro de H20: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCI, 1,44 g de Na2HP04, 0,24 g de KH2P04, pH = 7,4 en 1 1 de H20) 5 minutos cada vez para eliminar el exceso de EDC. Con respecto a la forma física del hidrogel, tendrá la forma del molde en que solidifica, de manera que pueden usarse placas de cultivo de 96, 48, 24, 12 y 6 pocilio, placas Petri o cualquier otro recipiente convencional con la forma deseada.

Adicionalmente, puede solidificarse el hidrogel en un recipiente grande tal como un vaso de precipitados, y una vez que se solidifica, el hidrogel puede cortarse con forma y grosor característicos. Específicamente, en este ejemplo el hidrogel solidificó en los pocilios de placas de 24 pocilios y una vez que solidificó se lavó 3 veces durante 5 minutos con 50001 de PBS IX.

En este caso, se liofilizó el hidrogel reticulado en placas de 24 pocilios según técnicas convencionales.

En este ejemplo, se analizó la estructura tridimensional del hidrogel por medio de microscopía electrónica de barrido (MEB). Una vez que se liofilizó el hidrogel, se realizó lo siguiente: se cortó una sección del hidrogel liofilizado y se secó esta sección hasta el punto crítico con C02 en un secador AUTOSAMDRI-814 y se metalizó con oro en un pulverizador. Se observaron las preparaciones a una tensión de 20 KV en el microscopio electrónico de barrido JEUL (JSM35).

El análisis por MEB (figura 3) del hidrogel deshidratado indicó que tiene una estructura porosa uniforme. La micrografía muestra la existencia de una estructura tridimensional altamente porosa, con un diámetro de poro que oscila entre 0,5 y 500 µ?t?. Este intervalo de poros implica la existencia de micro y macroporosidad. Los macroporos (300-500 lüm) son necesarios para que se lleve a cabo una colonización celular adecuada, de modo que se concentra un alto número de células y de modo que coexisten diferentes tipos celulares, favoreciendo la formación de tejidos estructurados, por ejemplo, de modo que puede formarse una red vascular. Los poros intermedios permiten la integración celular. Los microporos (0,5-50 µ??) son necesarios para la supervivencia celular, puesto que son responsables de llevar a cabo la correcta difusión de gases, nutrientes y la eliminación de los productos de desecho que resultan del metabolismo celular. Se mide el tamaño de poro basándose en la escala métrica obtenida por medio del microscopio electrónico de barrido.

Este biomaterial muestra una mayor sensibilidad estructural, que está indicada para aplicaciones en las que no sólo se busca una naturaleza bioactiva y una acción trófica, sino también una estructura que pueda alojar temporalmente células hasta que se realice la reparación del tejido, tal como el tratamiento de úlceras y otras enfermedades dermoepidérmicas, la reparación de cartílago y tratamientos oftalmológicos, entre otros. Las células contenidas en el biomaterial pueden ser las de los tejidos adyacentes al sitio de implantación que han conseguido colonizar, o también células dispuestas ex vivo en el biomaterial antes de su aplicación clínica, de manera que se potencia su acción regenerativa.

Este biomaterial tiene una distribución homogénea de poros con un tamaño en un intervalo de 0,5-1000 micrómetros, determinado por medio de técnicas de microscopía electrónica de barrido. Este intervalo de porosidad es adecuado tanto para la difusión de gases y nutrientes a través de toda su estructura como para permitir que las células lo colonicen.

Ejemplo 6. Caracterización y cuantificación de GAG presentes en el biomaterial de la invención Se analizaron y cuantificaron los diferentes GAG presentes en el biomaterial de la invención por medio de la técnica de espectrometría de masas (ESI/EM). Dado que por medio de esta técnica sólo pueden determinarse moléculas con un peso molecular de entre 200 y 2.000 Dalton y que las moléculas de GAG superan este intervalo en su mayor parte, en primer lugar se digirió enzimáticamente la muestra con el fin de obtener, por tanto, cadenas de GAG con un peso molecular de entre 200 y 2.000 Da.

Como patrón para la identificación y cuantificación de los GAG, se usaron compuestos comerciales patrón que representan cada GAG con una concentración conocida. Específicamente, los patrones usados para realizar la cuantificación de GAG fueron los siguientes: para el ácido hialuronico: la sal de potasio de ácido hialuronico (SIGMA, ref.: 53750); para el sulfato de condroitina: la sal de sodio de sulfato de condroitina (SIGMA, ref.: C4384); para el sulfato de dermatano: la sal de sodio de sulfato de dermatano (SIGMA, ref : C3788); para el sulfato de queratano: sulfato de queratano (CHEMOS, ref.: 7295); para la heparina: la sal de sodio de heparina (SIGMA, ref.: H8537); y para el sulfato de heparano: la sal de sodio de sulfato de heparano (SIGMA, ref. 51541).

Se obtuvieron los valores de la cuantificación de GAG presentes en la muestra basándose en los resultados obtenidos para cada patrón de GAG usado.

Con el fin de realizar la digestión enzimática de los GAG, se siguió el procedimiento descrito en la bibliografía (Mahoney et al., 2001). Para ello, se usaron las enzimas específicas para la digestión de cada GAG.

Para el ácido hialuronico, se usó hialuronidasa (SIGMA, ref : H3506); para el sulfato de condroitina, se usó condroitinasa (SIGMA, ref : C2780); para el sulfato de dermatano, se usó condroitinasa B (SIGMA, ref : C8058); para la heparina, se usó heparinasa I (SIGMA, ref : H2519); para el sulfato de heparano, se usó heparinasa I (SIGMA, ref : H2519); para el sulfato de queratano, se usó queratanasa (K2876).

Se prepararon estas enzimas resuspendiendo 440 U de la enzima correspondiente en 10 mi del siguiente tampón: 2 mi de tampón fosfato 100 mM pH = 7,77, 770 SI de NaCI 1 M, 1 mg de BSA y 7,23 mi de H20.

Se preparó el tampón de digestión enzimática con una concentración de enzima de 160 U/ml tal como sigue: se añadieron 4,5 mi de enzima (2000 U) a 7,5 mi de tampón de digestión, 1,5 mi de NaCI 1 M, 0,333 mi de acetato de sodio 3 M, pH = 5,2 y 5,67 mi de H20. Se prepararon las muestras y los patrones que iban a someterse a digestión enzimática tal como sigue: se añadieron 500 CHI de tampón de digestión (80 U de enzima) a 500 ?? de patrón para cada GAG a una concentración de 2 mg/ml, de manera que la disolución final del patrón estaba a una concentración de 1 mg/ml. Se realizó lo mismo con la muestra de GAG: se añadieron 500 Eli de tampón de digestión (80 U de enzima) a 500 01 de la muestra de GAG.

Se digirieron las muestras a 37^C durante 1 hora, después de lo que se inactivo la enzima por medio de desnaturalización térmica a 602C durante 5 minutos.

Una vez que se realizaron las digestiones, se analizaron las muestras y los patrones por medio de espectrometría de masas. La espectrometría de masas es una metodología experimental usada para determinar la razón de masa con respecto a carga de determinados iones presentes en la muestra que va a analizarse. El espectrómetro de masas consiste en 3 componentes básicos: fuente de iones, analizador de masa y detector. La muestra que va a analizarse se ioniza por medio de las fuentes de iones, se separan en el analizador de masa y se detectan para producir un espectro de masas, en el que se muestran los valores de masa con respecto a carga en comparación con la abundancia relativa de una especie iónica específica.

Específicamente, en este ejemplo se llevó a cabo la inyección de muestras en el espectrómetro de masas tal como sigue: se inyectaron 20 El de las muestras a una velocidad de flujo de 0,2 ml/minuto directamente en el detector de masas/masas (modelo LCQ. de Thermo). Se usó el método de ionización por electropulverización negativa (ESI/E ) y se fijó el tiempo del cromatograma en 10 minutos. Se seleccionaron los iones moleculares con un intervalo de ± 6 Da, correspondientes, según la bibliografía (Mahoney et al., 2001), al peso molecular de cadenas reconocidas para cada tipo de GAG. Dichos iones seguían estando presentes tanto en la muestra de GAG patrón como en la muestra que iba a analizarse, de modo que se demostró por tanto cualitativamente la presencia de cada GAG en la muestra. Para garantizar la reproducibilidad de los resultados, se inyectaron las muestras y los patrones por duplicado.

Para la cuantificación de los diferentes GAG, se obtuvo una recta patrón para el patrón para cada GAG a 1 mg/ml. La recta patrón obtenida consistía en las siguientes concentraciones de cada uno de los GAG patrón (ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, heparina, sulfato de heparano y sulfato de queratano) usados para obtener las rectas patrón: 750 Elg/ml, 500 Eg/rnl, 250 [3g/ml, 100 Sg/ml y 0 Elg/ml. Se llevaron a cabo las diluciones de la recta patrón con H20 y se usó una mezcla que contenía proporciones iguales de tampón de digestión enzimática y H20 como blanco de la recta.

Los resultados de la cualificación y las proporciones de cada GAG en el biomaterial de la invención son los siguientes, teniendo en cuenta que el origen del biomaterial es natural, lo que implica la existencia de variaciones en su composición (figura 1): 70% de ácido hialurónico 10% de sulfato de queratano 7% de 6-sulfato de condroitina 5% de sulfato de heparano 4% de 4-sulfato de condroitina 3% de sulfato de dermatano 1% de heparina Ejemplo 7. Estudio histológico para determinar la presencia de restos celulares en el biomaterial El biomaterial de la invención contiene una combinación de GAG de un origen natural. Este origen natural potencia su efecto regenerativo y su efecto sobre la actividad celular, puesto que las estructuras de los GAG y las interacciones entre ellos son similares a como se encuentran en la matriz extracelular en condiciones fisiológicas.

El cordón umbilical es un tipo de tejido que presenta de poca a ninguna inmunogenicidad, de hecho, se considera el uso heterólogo de las células madre contenidas en la GW para tratamientos en varios trabajos. También existen trabajos en los que se desarrollan sistemas arteriales o venosos a partir de la vasculatura del cordón umbilical, también para uso heterólogo. Sin embargo, para garantizar que el biomaterial de la invención está libre de células y de restos celulares, que pueden provocar reacciones inflamatorias o reacciones de rechazo de implantes, se han realizado tinciones histológicas con hematoxilina-eosina, azul alciano y verde de metilo-pironina (figura 2).

Hematoxilina-eosina: ésta es la tinción histoquímica usada más ampliamente a nivel h i stop ato lógico. Permite observar células y componentes celulares. La hematoxilina presenta afinidad por los componentes ácidos de la célula, especialmente ácidos nucleicos, y la eosina presenta afinidad por las zonas básicas, permitiendo una buena observación del citoplasma celular. Se tiñeron preparaciones de la muestra de GAG (figura 2B) y se usaron extensiones de células como control positivo (figura 2A).

El procedimiento que se llevó a cabo para realizar la tinción con hematoxilina-eosina fue el siguiente: se extendió una muestra de GAG sobre un portaobjetos con la ayuda de bastoncillo estéril, y se dejó secar la extensión durante al menos 24 horas. Una vez que se secaron los portaobjetos, se fijaron las extensiones con metanol al 70% durante 5 minutos. Después de este tiempo, se eliminó el fijador mediante lavado con H20. Se tiñeron los portaobjetos con hematoxilina durante 3 minutos (PANREAC, disolución de hematoxilina de Harris DC). Después de este tiempo, se eliminó el colorante en exceso mediante lavado con H20. Se hicieron pasar todos los portaobjetos a través de H20 con HCI al 0,5% para eliminar los enlaces inespecíficos del colorante. Se lavaron los portaobjetos con H20. Se tiñeron los portaobjetos con eosina (al 0,5% en H20) durante 30 segundos. Se lavaron los portaobjetos con H20 para eliminar el exceso de eosina. Se añadieron varios gotas del medio de montaje Fluoromount-G (SOUTHERN BIOTECH, re : 0100-01) a la preparación, se cubrieron con un cubreobjetos y se observó bajo un microscopio.

Los resultados de la tinción con hematoxilina-eosina (figura 2, imágenes A y B) indican la ausencia de células en la muestra de GAG analizados.

Azul alciano: el azul alciano es uno de los principales colorantes catiónicos (contiene cargas positivas en su molécula), que se unen a sitios con cargas negativas de los polisacáridos con radicales sulfato, fosfato o carbonato que forman parte de proteoglicanos. Estos enlaces electrostáticos dependen del pH del medio; a un pH neutro, el colorante se une a proteoglicanos con radicales neutros; a pH ácido, se une a proteoglicanos sulfatados; y a pH básico, se une a proteoglicanos de fosfato. A pH = I, el azul alciano se une a proteoglicanos débil y fuertemente sulfatados, que contienen sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano y sulfato de queratano que forman parte de GAG de gelatina de Wharton. Se tiñeron preparaciones de la muestra de GAG (figura 2F) y se usaron extensiones de células como control (figura 2E).

El procedimiento que se llevó a cabo para realizar la tinción con azul alciano en este ejemplo en particular fue el siguiente: Se extendió una muestra de GAG sobre un portaobjetos con la ayuda de bastoncillo estéril, y se dejó secar la extensión durante al menos 24 horas. Una vez que se secaron los portaobjetos, se fijaron las extensiones con metanol al 70% durante 5 minutos. Después de este tiempo, se eliminó el fijador mediante lavado con PBS IX. Se sumergieron los portaobjetos en HCI 0,1 N, pH = 1 durante 5 minutos. Después de este tiempo, se tiñeron con azul alciano al 1% en HCI 0,1 N, pH = 1 durante 2 horas. Se sumergieron los portaobjetos en HCI 0,1 N, pH = 1 durante 5 minutos y se lavaron inmediatamente con H20 para eliminar el colorante en exceso. Se añadieron varios gotas del medio de montaje Fluoromount-G (SOUTHERN BIOTECH, ref.: 0100-01) a las preparaciones, se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron bajo un microscopio. Los resultados de la tinción con azul alciano (figura 2, imágenes E y F) indican la presencia de GAG en la muestra analizada de biomaterial.

Verde de metilo-pironina: se usa esta tinción para la investigación histológica del ácido nucleico contenido en tejidos, así como para demostrar la presencia de células linfáticas y células plasmáticas. También es útil en la identificación de células plasmáticas y ARN en secciones de tejido y preparaciones citologicas. La pironina tiñe el citoplasma de las células plasmáticas y la mayoría de los nucléolos de color rojo. El verde de metilo tiñe el ADN con un color verde azulado (purpúreo). Se tiñeron preparaciones de la muestra de GAG (figura 2D) y se usaron extensiones de células como control (figura 2C).

El procedimiento que se llevó a cabo para realizar la tinción con verde de metilo-pironina en este ejemplo en particular fue el siguiente: Se extendió una muestra de GAG sobre un portaobjetos con la ayuda de un bastoncillo estéril, y se dejó secar la extensión durante al menos 24 horas. Una vez que se secaron los portaobjetos, se fijaron las extensiones con metanol al 70% durante 5 minutos. Después de este tiempo, se eliminó el fijador mediante lavado con H20. Se sumergieron los portaobjetos en HCI 0,1 N, pH = 1 durante 5 minutos. Después de este tiempo, se tiñeron con verde de metilo-pironina durante 5 minutos (verde de metilo al 0,012% en H20, pironina al 0,01% en H20, metanol al 0,75%) y se lavaron inmediatamente con H20 para eliminar el colorante en exceso. Se añadieron varios gotas del medio de montaje Fluoromount-G (SOUTHERN BIOTECH, ref.: 0100-01) a las preparaciones, se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron bajo un microscopio. Los resultados de la tinción con verde de metilo-pironina (figura 2, imágenes C y D) indican la ausencia de ácidos nucleicos en la muestra analizada de GAG.

Ejemplo 8. Pruebas de citotoxicidad con varios tipos celulares sobre el biomaterial de la invención.

El principal requisito para que un biomaterial pueda usarse para implantación o como matriz para ingeniería de tejidos es la ausencia de citotoxicidad.

Con el fin de verificar que el biomaterial de la invención no provoca efectos tóxicos, se determinó la citotoxicidad por medio del método de MTT (Roche Diagnostics, EE.UU.), validado por el ECVAM (Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos) sobre las células dispuestas en el biomaterial de la invención. Los tipos celulares usados están asociados con las patologías a las que se dirige el biomaterial, tales como, queratinocitos y fibroblastos cutáneos, osteoblastos óseos, condrocitos de cartílago y células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo, así como la línea celular indicada en la norma ISO 10993 para ensayos de toxicidad de L929.

El ensayo MTT se basa en la capacidad de las enzimas mitocondriales de las células vivas para transformar determinados sustratos en otros metabolitos secundarios. La cantidad de compuesto formado depende de la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial, que es un claro indicador del número de células viables que existen en el cultivo.

Específicamente, esta prueba mitocondrial, kit de proliferación celular I (MTT) n.s de cat. 1 465 007 Roche, determina la transformación llevada a cabo por la deshidrogenasa mitocondrial celular de succinatos de sal de tetrazolio (de color amarillo) en cristales de formazano insolubles (de color azul). Posteriormente, se permeabilizaron las células y se solubilizan los cristales formados, lo que conduce a una disolución coloreada que puede cuantificarse midiendo su absorbancia en un lector de microplacas de ELISA a una longitud de onda de 550 nm. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 4.

El procedimiento que va a seguirse es el siguiente: 1. Se sembraron las células en placas de 96 pocilios con 50 Elg de biomaterial en cada pocilio a una densidad de 2.000-5.000 células/pocilio dependiendo del tipo celular. Se ha determinado previamente la concentración de células adecuada para cada tipo celular. Se sembraron los fibroblastos, osteoblastos, condrocitos y células madre mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo, todos procedentes de un cultivo primario de origen humano, a una concentración de 4.000 células por pocilio, se sembró la línea de fibroblastos de ratón L929 a una concentración de 200 células por pocilio y se sembraron los queratinocitos obtenidos a partir de piel humana en cultivo primario a una concentración de 5.000 células por pocilio. 2. Se dejó que se estabilizase el cultivo a 379C y el 5% de C02 durante 24 horas antes de iniciar los ensayos de citotoxicidad. Este ensayo incluyó controles positivos (células + medio + material conocido que induce citotoxicidad, en este caso se usó poli(cloruro de vinilo) o PVC), control (células + medio de cultivo convencional), y células en contacto con el biomaterial de la invención. 3. Se permitió que se incubasen las células a 37^C en el incubador durante el periodo de tiempo indicado en el protocolo hasta que se llevaron a cabo las determinaciones, que en este caso eran a las 24, 48 y 72 horas de contacto. 4. Tras finalizar el periodo de incubación, se añadieron 10 T? de la disolución de MTT (0,5 mg/ml) al cultivo en cada pocilio por cada 100 SI de medio, y se incubó durante 4 horas a 379C en el incubador. 5. Tras finalizar la incubación, pudieron observarse los cristales de formazano en el interior de las células. Se añaden 100 121 de la disolución de solubilización a cada cultivo o pocilio y se incuba a 37^C en el incubador durante la noche. Por tanto, se permeabilizaron las células y, por tanto, se solubilizaron los cristales con los 100 Hg de solubilizador tal como se indica, lo que conduce a una disolución coloreada fácilmente cuantificable. 6. Una vez que se solubilizaron los cristales, se lee la placa de cultivo directamente con un lector de ELISA a 550 nm. Antes de la lectura, es aconsejable limpiar la superficie inferior de la placa con etanol. Tal como puede observarse en la figura 4, el biomaterial de la invención no provocó efectos tóxicos sobre ninguna de las líneas celulares sometidas a prueba, no habiendo diferencias significativas con respecto al control.

Ejemplo 9. Uso del biomaterial de la invención en su forma inyectable para el tratamiento de osteoartritis Para la evaluación in vivo del efecto terapéutico del biomaterial de la invención en osteoartritis (OA), se usó el hidrogel obtenido en el ejemplo 3 y se resuspendió en una disolución de suero fisiológico inyectable que contenía condrocitos alogénicos, derivados de cartílago. Se usaron conejos que se sometieron a resección del ligamento cruzado anterior en una de sus rodillas como modelo experimental. Esta resección del ligamento se realizó por medio de artrotomía lateral. A continuación, con el fin de desestabilizar la rodilla, se esperó un periodo que osciló entre meses y semanas, tiempo durante el cual se produjeron erosiones en el cartílago similares a la osteoartritis. Además, se usaron animales sin artrotomía en la rodilla, como grupo control.

Se preparó la superficie articular con herida por medio de lavado y desbridamiento mediante cirugía artroscópica y se cubrieron las lesiones con la mezcla de célula/biomaterial de la invención inyectable. Cuatro semanas después de depositar el biomaterial, se sacrificaron los animales y se extrajo el cartílago. Se fijó el cartílago obtenido en paraformaldehído al 4% para su posterior procesamiento histológico. Para obtener las secciones histológicas, se incluyó la muestra en parafina, fin para el que se mantuvo durante 5 minutos en alcoholes al 50, 70, 90 y 100%. Posteriormente, se pusieron las muestras en citrosol durante 5 minutos y se incluyeron en parafina hasta obtener un bloque sólido. Se obtuvieron secciones histológicas de 5 µ?? usando un microtomo y se realizaron la tinción histológica y el inmunomarcaje usando estas secciones.

Se analizaron diferentes marcadores de la matriz extracelular del cartílago en las secciones histológicas por medio de técnicas inmunohistoquímicas. Las moléculas específicas de la matriz extracelular del cartílago y los marcadores moleculares estudiados fueron colágeno tipo I y tipo II, agrecano y versicano. Se realizó el inmunomarcaje usando anticuerpos monoclonales. La técnica usada para el mareaje de la sección de tejido era inmunomarcaje directo, usando anticuerpos monoclonales marcados con un flurocromo. Se observó el mareaje usando microscopía confocal.

Los resultados obtenidos demostraron que la combinación de biomaterial/célula inducía la regeneración del cartílago con herida puesto que: - El biomaterial inyectable y su componente celular no provocaron toxicidad una vez que se implantaron, es decir, no se observaron fenómenos de inflamación a nivel macroscópico o microscópico en las secciones histológicas.

- El biomaterial se ajusta a la geometría y el tamaño de la herida que va a repararse y permanece en la zona de la implantación.

- No se observaron alteraciones en el fenotipo de las células del tejido sano junto a la zona del implante.

- La presencia de moléculas de la matriz extracelular específicas para cartílago, tales como colágeno tipo II, en la zona del implante indicó el inicio del proceso regenerativo con la formación de nueva matriz extracelular de la misma calidad que la del tejido nativo.

Estos hechos demuestran que el biomaterial de la invención, combinado con una terapia celular, promueve la regeneración del defecto condral, a diferencia de en los animales control que no presentaron ningún signo de reparación de cartílago.

Ejemplo 10. Uso del biomaterial tridimensional El biomaterial sólido de la invención obtenido en el ejemplo 5 tiene la mayoría de las características necesarias para que un aposito sea eficaz en la curación de una úlcera crónica. En este sentido, para el fin de evaluar el efecto terapéutico en úlceras crónicas, se ha llevado a cabo el estudio experimental in vivo usando ratones Swiss albinos que se sometieron a una abrasión térmica de aproximadamente 3 cm2 en la zona dorsal. El grupo control consistió en animales sometidos a este mismo tipo de herida pero tratados con un gel de ácido hialurónico comercial.

Para la aplicación del biomaterial de la invención, se preparó la superficie de la herida inducida por medio de lavado, desinfección y desbridamiento quirúrgico. Se aplicó entonces el biomaterial a la herida mediante inyección, donde cubrió y rellenó tanto en profundidad como superficialmente la zona afectada. 15 días después de colocar el biomaterial, se sacrificaron los animales y se extirpó la zona de la herida y se fijó en paraformaldehído al 4% para su posterior examen histológico. Para el procesamiento, se incluyó la muestra en parafina, fin para el que se mantuvo durante 5 minutos en alcoholes al 50, 70, 90 y 100%. Posteriormente se pusieron las muestras en citrosol durante 5 minutos y se incluyeron en parafina hasta obtener un bloque sólido. Se obtuvieron secciones histológicas de 5 µ?t? usando un microtomo y se realizaron la tinción histológica y el inmunomarcaje usando estas secciones.

Se analizaron diferentes marcadores de fenotipo epidérmicos, tales como queratina 5 y 10, marcadores de diferenciación, tales como involucrina y loricrina, el marcador dérmico vimentina y componentes de la matriz tales como laminina, en las secciones histológicas por medio de técnicas inmunohistoquímicas. La técnica usada para el mareaje de la sección de tejido era inmunomarcaje directo, usando anticuerpos monoclonales marcados con un flurocromo. Se observó el mareaje usando microscopía confocal.

Los resultados obtenidos demostraron que el biomaterial era eficaz en la regeneración de la úlcera puesto que: - El biomaterial aplicado en la herida era inmunológicamente inerte y no se presentaron signos de toxicidad.

- El biomaterial se ajusta a la geometría y el tamaño de la herida que va a repararse, cubriendo completamente la zona afectada tanto en profundidad como superficialmente.

- A medida que avanza el proceso de cicatrización, se degradó el biomaterial y se sustituyó por componentes dermoepidérmicos.

- Las secciones histológicas mostraron que el biomaterial indujo la migración y proliferación de fibroblastos y queratinocitos, que siguieron siendo viables en el mismo.

- El biomaterial de la invención indujo una cicatrización de la herida que era el doble de eficaz con respecto a los animales control, y además la calidad del nuevo tejido cicatricial era significativamente mayor que la de los animales sin la aplicación del biomaterial de la invención.

Ejemplo 11: Viabilidad y actividad metabólica de células de cartílago articular y células madre mesenquimatosas (CMM) en cocultivo en la forma inyectable del biomaterial de la presente invención.

Para determinar la viabilidad y actividad metabólica, se cultivaron 2xl06 células en 800 (SI de 10 mg/ml del biomaterial de la presente invención en placas de 24 pocilios. Se mantuvieron los condrocitos y las CMM en cultivo durante 7 días. En los días 3 y 7, se realizó la tinción con colorante vital MTT, que tiñe las células que son metabólicamente activas, por tanto se obtiene una medida de la viabilidad celular.

Figura 6. Imagen de microscopía óptica invertida que muestra la viabilidad de células de cartílago articular (condrocitos) y CMM teñidas con MTT en cocultivo en el biomaterial de la presente invención. La tinción es tanto a los 3 días como a los 7. Las células teñidas de color negro son viables y metabólicamente activas. En resumen, basándose en los resultados presentados en la figura 6, el biomaterial de la presente invención mantiene viabilidad celular frente al control en el ensamblaje celular sometido a prueba.

Ejemplo 12: Capacidad proliferativa de células hechas crecer en la presente invención en comparación con ácido hialurónico (HA).

Se llevó a cabo la capacidad proliferativa de las células en el biomaterial de la presente invención y HA utilizando MTT, según la técnica descrita en el ejemplo 8. Las células sometidas a prueba incluyeron: condrocitos humanos, fibroblasto L-929, fibroblastos humanos y células madre mesenquimatosas de tejido adiposo humano (C MA). Se observó proliferación a las 24, 48 y 72 horas de cultivo. Las figuras 7 y 8 ilustran ambas que la proliferación y supervivencia de células cultivadas es significativamente mayor en el biomaterial de la presente invención en comparación con HA a concentraciones similares.

Ejemplo 13: Afinidad y capacidad para el crecimiento tridimensional de células en el biomaterial de la presente invención en comparación con ácido hialurónico (HA).

Un objetivo de utilizar el biomaterial de la presente invención es potenciar el reclutamiento celular en la zona de lesión desde el tejido circundante así como actuar como vehículo para la aplicación de poblaciones celulares terapéuticas a una lesión. Por tanto, la importancia del biomaterial de la presente invención en el mantenimiento de la homeostasis celular es evidente.

Para determinar la capacidad de los condrocitos para formar agregados en el interior del biomaterial de la presente invención, se cultivaron 750k condrocitos por pocilio en placas de 6 pocilios con o bien 1,0 o bien 2,0 mg/ml del biomaterial de la presente invención. 72 horas después del inicio del cultivo, se observó que los condrocitos formaban agrupaciones en el hidrogel a 2,0 mg/ml de concentración mientras que no había agregaciones en el hidrogel a 1,0 mg/ml. 96 horas después del inicio del cultivo, se agregaron por completo los condrocitos en 2,0 mg/ml de biomaterial de la presente invención en agrupaciones mientras que aquéllos en el hidrogel de 1,0 mg/ml comenzaron a formar agrupaciones. En otras palabras, la agregación y formación de agrupaciones se producen fácilmente en la concentración superior del material de la presente invención en comparación con el control.

Las células dispuestas en contacto con el biomaterial de la presente invención demuestran una mayor afinidad por el biomaterial de la presente invención con respecto a la de las superficies de plástico de cultivo celular convencionales. Se desprenden de la placa de cultivo celular y migran hacia el biomaterial de la presente invención en el que forman agrupaciones viables. Sin embargo, cuando se usa la misma concentración de HA como control, las células demuestran una mayor afinidad por el plástico de cultivo celular. A las mismas concentraciones, existen diferencias sustanciales en la consistencia entre el biomaterial de la presente invención y HA. HA es menos viscoso que el biomaterial de la presente invención. La figura 9 ilustra este efecto migratorio observado en el biomaterial de la presente invención en comparación con HA. Se usó el ensayo Live/dead para diferenciar células viables (de color verde) de células no viables (de color rojo). En conclusión, las células utilizadas en este experimento tienen una mayor afinidad por el biomaterial de la presente invención que el plástico de cultivo celular, un hallazgo que no se repite para HA y plástico.

Ejemplo 14: una observación de la funcionalidad de células cultivadas en la presente invención frente a células cultivadas en HA.

En este ejemplo, se determinó la expresión de marcadores asociados con la regeneración de tejido.

Para determinar la expresión de diferentes marcadores de cartílago en CMM en el biomaterial de la presente invención y HA de control, se cultivaron las células en frascos T75 con 7,5x 105 células por frasco en dos concentraciones diferentes del hidrogel (0,1 y 0,5 mg/ml) y HA. Después de cuatro días, se extrajo el ARN de las muestras mediante centrifugación de las células y posterior purificación el ARN con el minikit de aislamiento de ARN total Agilent (Agilent technologies, EE.UU.). Tras la extracción del ARN, se sintetizó ADNc y se llevó a cabo RT-PCR según protocolos convencionales para la expresión de colágeno tipo II y versicano.

La figura 10 ilustra los resultados de los análisis de expresión génica de los factores de cartílago colágeno II y versicano de CMM cultivadas en el biomaterial de la presente invención frente a un control de HA. El colágeno tipo II forma la mayoría de la matriz de cartílago articular (90%) y es un marcador de la diferenciación celular hacia el fenotipo de condrocito. Las CMM cultivadas en el biomaterial de la presente invención comienzan la expresión de colágeno tipo II tras 4 días de cultivo, un fenómeno no observado cuando se cultivan en HA. El versicano es un componente minoritario en la matriz extracelular de cartílago. Se considera un marcador de desdiferenciación o pérdida del fenotipo de condrocito en células similares a condrocitos previamente. A medida que maduran las células dirigidas a condrocitos, expresan menos versicano y aumentan de manera concomitante su expresión de agrecano, sulfato de condroitina y colágeno II. Las CMM en el biomaterial de la presente invención en comparación con la población de control de células en HA de concentración coincidente demuestran una reducción en la expresión del gen de versicano con y un aumento de la expresión de colágeno II. Por tanto, el biomaterial de la presente invención indica una inducción de diferenciación del fenotipo de condrocito o la capacidad para la síntesis de moléculas relacionadas con la regeneración de cartílago articular.

Ejemplo 15 Caracterización reométrica del biomaterial de la presente invención derivado de fuentes humanas y porcinas.

Se llevan a cabo de manera rutinaria caracterizaciones mecánicas de biomateriales con el fin de proporcionar información tanto relevante como comparativa sobre armazones para ingeniería de tejidos. Con los hidrogeles, los estudios mecánicos pueden proporcionar información importante sobre la idoneidad de un hidrogel para inyección usando diversas técnicas, o el grado de finalización de un proceso químico tal como reticulación.

En este ejemplo, se tomaron alícuotas de armazones de GAG aislados de GW tal como se describió anteriormente, en disoluciones al tres por ciento (1%, 5%, 10%) en volúmenes respectivos de 2 mi con el fin de evaluar el efecto de la concentración sobre parámetros reológicos. Se empleó un reómetro modelo AR2000ex de TA Instruments en el experimento. En primer lugar, para cada muestra, se llevó a cabo un barrido de deformación con el fin de confirmar que cada muestra se sometía a prueba dentro de su intervalo viscoelástico lineal (datos no mostrados) en estudios posteriores que implicaban el módulo de almacenamiento y pérdida, así como la viscosidad.

Tras la determinación del intervalo viscoelástico lineal, se determinaron el módulo de pérdida, el módulo de almacenamiento y la viscosidad para cada muestra con frecuencia constante a lo largo de un barrido de temperatura fisiológicamente relevante que varió desde 209C hasta 509C. Se representaron gráficamente los datos y se presentan en las figuras 11 - 13.

En figura 11, los valores humanos de la concentración del 10% fueron mayores que los valores porcinos a la concentración del 10%. Los valores humanos al 5% superaron a los porcinos al 5%. Los resultados a concentraciones inferiores (1% para ambos, y 5% para porcinos) tuvieron una razón de señal con respecto a ruido inferior debido a las cualidades internas del cono del viscosímetro. Cuantitativa y cualitativamente, las muestras humanas comparadas en una base de gramos con las muestras porcinas presentaron mayores módulos. Además, se observó una ligera disminución en los módulos a lo largo del cambio de temperatura sometido a prueba; un hallazgo que concuerda con los efectos de temperatura viscoelásticos a temperatura cambiante bajo una frecuencia de oscilación constante. En figura 12, los resultados de los valores humanos superaron a los de las muestras porcinas a lo largo de las concentraciones respectivas. Los resultados a concentraciones inferiores (1% para ambos, y 5% para porcinos) tuvieron una baja razón de señal con respecto a ruido debido a las cualidades internas del cono del viscosímetro. Como en los resultados del módulo de almacenamiento, se observa una disminución ligera esperada en los módulos con la temperatura. Los valores del módulo de pérdida son mayores que los valores del módulo de almacenamiento en todos los casos respectivos, indicando por tanto el predominio de efectos viscosos sobre efectos elásticos. Esto es un hallazgo esperado dado que los GAG aislados son un hidrogel no reticulado con comportamiento de flujo inherente. Los resultados del módulo de pérdida para tres concentraciones diferentes del biomaterial de la presente invención derivado de fuentes porcinas y humanas. En la figura 13, los resultados de valores humanos superaron a los de las muestras porcinas a lo largo de las concentraciones respectivas. Los resultados a concentraciones inferiores (1% para ambos, y 5% para porcinos) tuvieron una baja razón de señal con respecto a ruido debido a las cualidades internas del cono del viscosímetro. Es posible un amplio intervalo de viscosidades a través de la variación de la concentración de las muestras aunque en una base por gramo, el hidrogel humano es sistemáticamente más viscoso. Una disolución al 10% disolución del biomaterial humano de la presente invención en este ejemplo presenta una viscosidad promedio similar a la del aceite de ricino.

En conclusión, está disponible un amplio intervalo de viscosidades y módulos simplemente ajustando la concentración de los GAG extraídos.

Ejemplo 16: Reclutamiento celular de los tejidos circundantes (quimiotaxia).

El objetivo de esta prueba era determinar la capacidad quimiotáctica del biomaterial de la presente invención para las células de un tejido. Para esto, se usaron muestras de cartílago humano de dos pacientes humanos diferente. Como se ha probado que la concentración de 2 mg/ml es adecuada en pruebas de viabilidad y proliferación para CMM y condrocitos, se utilizó esta concentración en el presente ejemplo. Se utilizaron placas no adherentes para evitar la presencia de un sustrato pro-unión. La configuración experimental fue tal como sigue: - Control negativo: fragmento en DMEM - Ácido hialurónico: fragmento en HA a 2 mg/ml - Material de interés: fragmento en el biomaterial de la presente invención hasta 2 mg/ml Además, como control positivo, se utilizó una placa de lisis adhesiva. Se cultivó el tejido en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%. Se captaron imágenes diariamente y se presentan en la figura 14. Los resultados no muestran células en ninguno de los controles ni en el fragmento expuesto a HA. Sin embargo, en el fragmento que estaba en el biomaterial de la presente invención, se observó que un gran número de células han migrado hasta la superficie exterior del cartílago desde el punto de tiempo inicial. Se utilizó el ensayo Live/Dead para determinar si las células que migran hasta la superficie de los fragmentos de cartílago eran viables o no. Los resultados se muestran en la figura 15 e indican que la gran mayoría de las células que emergen de los fragmentos de cartílago son viables. Sin embargo, no se observó que migrasen células de la superficie de los fragmentos de cartílago hasta el biomaterial circundante de la presente invención.

Basándose en este conjunto de resultados, puede concluirse: 1. El biomaterial de la presente invención presenta la capacidad para reclutar células de cartílago a partir de tejido nativo. 2. Las células de cartílago que se reclutan por el biomaterial de la presente invención son viables.

Puesto que podrían obtenerse diversas realizaciones posibles de la invención anterior, y puesto que podrían realizarse diversos cambios en las realizaciones expuestas anteriormente, ha de entenderse que todo el contenido en el presente documento descrito ha de interpretarse como ilustrativo y no en un sentido limitativo.

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Claims

REIVINDICACIONES
Biomaterial en forma de un hidrogel inyectable, caracterizado porque comprende la mezcla de glicosaminoglicanos (GAG) presentes en el cordón umbilical, libre de membrana del cordón umbilical, vasos sanguíneos y células o restos celulares. Biomaterial según la reivindicación 1, extraído de cordón umbilical de origen humano.
Biomaterial según la reivindicación 1, extraído del cordón umbilical de origen animal.
Biomaterial según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque comprende una mezcla de glicosaminoglicanos seleccionados del grupo que consiste en: ácido hialurónico, sulfato de queratano, 6-sulfato de condroitina, sulfato de heparano, 4-sulfato de condroitina, sulfato de dermatano y heparina.
Biomaterial según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende ácido hialurónico al 40-80% de la mezcla total de GAG.
Biomaterial según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende sulfato de queratano al 2-25% de la mezcla total de GAG.
Biomaterial según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende 6-sulfato de condroitina al 3-10% de la mezcla total de GAG.
Biomaterial según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende sulfato de heparano al 1-9% de la mezcla total de GAG.
Biomaterial según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende 4-sulfato de condroitina al 0,5-7% de la mezcla total de GAG.
Biomaterial según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende sulfato de dermatano al 0,1-7% de la mezcla total de GAG.
Biomaterial según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende heparina al 0,05-3% de la mezcla total de GAG.
Biomaterial derivado de cordón umbilical humano según la reivindicación 4, caracterizado porque contiene: ácido hialuronico (70%), sulfato de queratano (10%), 6-sulfato de condroitina (7%), sulfato de heparano (5%), 4-sulfato de condroitina (4%), sulfato de dermatano (3%) y heparina (1%).
Biomaterial según las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el hidrogel inyectable tiene una viscosidad de 10 cS-150.000 cS.
Biomaterial según la reivindicación 13, caracterizado porque tiene una viscosidad de entre 10 y 15.000 cS.
Biomaterial según la reivindicación 14, caracterizado porque tiene una viscosidad de entre 10 y 2.000 cS.
Biomaterial según la reivindicación 14, caracterizado porque tiene una estructura tridimensional.
Biomaterial según la reivindicación 15, caracterizado porque tiene una estructura sustancialmente porosa con un diámetro de poro de 0,5-1000 Em.
Biomaterial según la reivindicación 17, caracterizado porque el diámetro de poro es de 0,5-500 (Em.
Biomaterial según las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque comprende adicionalmente células.
Biomaterial según la reivindicación 19, caracterizado porque dichas células se seleccionan del grupo que consiste en células madre mesenquimatosas no diferenciadas o células madre mesenquimatosas diferenciadas en otra estirpe celular y/o células madre hematopoyéticas no diferenciadas o células madre hematopoyéticas diferenciadas en otra estirpe celular y/o condrocitos y/o condroblastos y/o osteoblastos y/o osteocitos y/o queratinocitos y/o fibroblastos y/o miocitos y/o adipocitos y/o neuronas y/u otras células del sistema nervioso y/o células del sistema de glóbulos blancos y/o células corneales y/o células endoteliales y/o células epiteliales.
Biomaterial según cualquier reivindicación anterior, combinándose el biomaterial con un material de refuerzo para formar un material compuesto.
Procedimiento para obtener el biomaterial según las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) obtener un cordón umbilical humano; b) tratar el cordón umbilical con una disolución salina y antibióticos; c) eliminar toda la sangre de la superficie del cordón; d) fragmentar el cordón en secciones de 1-2 cm; e) limpiar toda la sangre retenida en el interior; f) eliminar la membrana del cordón umbilical y los vasos sanguíneos; g) separar la sustancia gelatinosa que comprende la gelatina de Wharton; h) digerir enzimáticamente la sustancia gelatinosa obtenida; y i) precipitar y aislar los GAG;
23. Procedimiento para obtener el biomaterial según la reivindicación 22, caracterizándose dicho procedimiento porque comprende además disolver los GAG obtenidos en la etapa i) según la reivindicación 22.
24. Procedimiento para obtener el biomaterial según la reivindicación 22, caracterizándose dicho procedimiento porque comprende además reticular los GAG obtenidos en la etapa i) según la reivindicación 22.
25. Procedimiento para obtener el biomaterial obtenido según la reivindicación 24, caracterizado porque se lleva a cabo la reticulación covalente mediante cambios en la temperatura, reacciones químicas o fotopolimerización.
26. Procedimiento para obtener el biomaterial obtenido según la reivindicación 24, caracterizado porque se lleva a cabo reticulación iónica mediante modificaciones de grupos laterales en componentes de GAG individuales en la GW.
27. Uso del biomaterial según las reivindicaciones 1-21, para la remodelación, el relleno o la reconstrucción de tejidos blandos, el tratamiento de arrugas, pliegues y cicatrices, quemaduras, úlceras, aumento de tejidos blandos, lipoatrofia facial, enfermedades de los discos intervertebrales, reparación de cartílago, lesiones musculoesqueléticas, osteoartritis y periartritis; tratamiento de tumores, enfermedades vaginales, lesiones cerebrales, reparación de médula, trastornos degenerativos, enfermedades cardiovasculares y procesos de lubricación, como analgésico y antiinflamatorio; tratamiento de quemaduras, úlceras y defectos dermoepidérmicos, tratamiento de enfermedades oftalmológicas, tales como lesiones corneales, lesiones retinianas o cataratas; reparación de cartílago, tratamiento del sistema osteoarticular, como en el caso de defectos osteocondrales, osteoartritis o defectos óseos, y un adyuvante en la resolución de enfermedades vaginales, tratamiento de gingivitis y periodontitis; y uso en el desarrollo de sistemas de cultivo celular.