CN104661666A - 浸渗有人脐带沃顿胶质干细胞的伤口敷料纳米筛 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在有此需要的个体中治疗伤口(例如，抑制瘢痕形成)的方法，其包括将所述伤口与有效量的组合物接触，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。本发明涉及医用辅料(例如，药物组合物)，其包含沃顿胶质干细胞(WJSC)、已经用WJSC调节的细胞培养基、WJSC的裂解物、已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基或其组合。

Description

浸渗有人脐带沃顿胶质干细胞的伤口敷料纳米筛

相关申请

本申请要求于2012年8月15日提交的美国临时申请No.61/683,391的权益。上面申请的整体教导通过引用并入本文。

发明背景

未愈合伤口是患有糖尿病、肾衰竭、烧伤和褥疮的患者中的慢性问题。糖尿病伤口导致足溃疡，其最终落得下肢截肢(lower limb amputation)并且一些个体容易出现异常的伤口愈合，导致称为瘢痕瘤(keloid)的难看瘢痕，这是美容损害和社会心理负担。目前用来加速伤口愈合的方法仅取得了有限的成功，并且当治疗时，瘢痕瘤频繁复发。瘢痕瘤表现得像良性肿瘤使得其治疗起来甚至更具挑战性。仅在美国，每年估计花费250亿美元来治疗慢性伤口并且由于人口老龄化以及糖尿病和肥胖发生率的提高，所述问题日益成为全世界性的。

发明内容

本文示出的是具有可用于愈合伤口和抑制瘢痕(例如，瘢痕瘤抑制)之某些独特性质的来自人脐带沃顿胶质干细胞(stem cell from humanumbilical cord Wharton’s jelly，hWJSC)的用途。本文还示出的是WJSC/提取物(1)破坏致瘤性细胞的能力和(2)促进细胞增殖的能力，将所述能力提供给包含WJSC/提取物(例如，浸渗(impregnate)有WJSC/提取物的芦荟(aloe vera)-纳米纤维筛)的医用敷料(例如，伤口敷料贴剂)，将其施加到伤口以递送特定分子，从而导致瘢痕形成(例如瘢痕瘤形成)的抑制和/或伤口愈合。

因此，在一个方面中，本发明涉及在有此需要的个体中治疗伤口的方法，所述方法包括将所述伤口与有效量的组合物接触，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(Wharton’s jelly stem cell，WJSC)，(ii)已经用WJSC调节(condition)的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。

在另一个方面中，本发明涉及在有此需要的个体中治疗伤口以抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括将所述伤口与有效量的组合物接触，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。

在再一个方面中，本发明涉及医用敷料，其包含沃顿胶质干细胞(WJSC)、已经用WJSC调节的细胞培养基、WJSC的裂解物、已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基或其组合。

在另一些方面中，本发明涉及药物组合物，其包含本文所述的医用敷料。

沃顿胶质干细胞及其提取物相比其他干细胞来源具有若干优点并且是用于多种基于细胞之治疗的有吸引力的干细胞。此外，hWJSC大量释放透明质酸(HA)和糖胺聚糖(GAG)，这些是用于组织修复的基本结构单元(building block)。

附图说明

图1示出瘢痕瘤/伤口愈合的伤口敷料贴剂的图示。A：hWJSC；B：hWJSC提取物；C：hWJSC-PCM；D：芦荟-纳米纤维筛；E：浸渗有hWJSC的芦荟-纳米纤维筛；F：浸渗有hWJSC提取物的芦荟纳米纤维筛；G：浸渗有hWJSC-PCM的芦荟-纳米纤维筛；H、I、J：最终的伤口敷料贴剂；K：示出芦荟-纳米纤维和hWJSC交替层的伤口敷料贴剂截面；L：伤口敷料贴剂；M：将伤口敷料贴剂施加到瘢痕瘤上。

图2示出PCL/芦荟纳米纤维膜的制造，a)旋转转鼓(rotating drum)，b)具有纳米纤维膜的旋转转鼓，c)PCL/芦荟的SEM图像(2500×)，d)纳米纤维的更高放大倍率(10000×)。纤维直径为400nm至425nm，厚度为0.5mm至1mm并且膜孔隙度为85％至95％。

图3A至3C：(3A)暴露于hWJSC-CM(0小时至72小时)的CCD成纤维细胞的划痕-伤口测定(scratch-wound assay)(D0至D3)。a至d：在未调节的培养基KOSR培养基(UCM)中生长的CCD成纤维细胞(对照)；e至h：在CCD-CM中生长的CCD成纤维细胞(对照)；i至l：在hWJSC-CM中生长的CCD成纤维细胞(治疗)。在a、e和i中的白色箭头表示在D0没有CCD成纤维细胞之单层中间的垂直划痕。在j、k和l中的黑色箭头示出与对照相比，CCD迁移到hWJSC-CM臂(arm)中的划痕更快。在hWJSC-CM臂中的划痕到D2完全闭合。(3B)在48小时和72小时，与两个对照相比，在hWJSC-CM臂中细胞侵入到划痕伤口的平均±SEM数是显著更大的(＊p＜0.05)。(3C)在72小时，与两个对照相比，在hWJSC-CM臂中的平均±SEM CCD生存力(MTT测定)是显著更大的(＊p＜0.05)。

图4A至4E：(4A、4B)与对照相比，在hWJSC-CM治疗臂中的胶原蛋白(Sircol测定)和弹性蛋白(Fastin测定)的平均±SEM水平是显著更高的(＊p＜0.05)。(4C至4E)qRT-PCR分析示出，与对照相比，在hWJSC-CM臂中的(4C)I型胶原蛋白、(4D)III型胶原蛋白和(4E)纤连蛋白的表达显著更高(＊p＜0.05)。GAPDH是内对照。使用比较Ct(ΔΔCT)法进行了数据分析和相对定量。

图5A至5C：(5A)小鼠切除伤口的数字化图像，其示出与对照(GFP-CCD、CCD-CM和UCM)相比，在暴露于GFP-hWJSC和hWJSC-CM(治疗臂)(白色箭头)的SCID小鼠中到第14天(D14)之更快的伤口闭合。(15B)在第7天，与对照相比，在治疗臂(GFP-hWJSC和hWJSC-CM)中，SCID小鼠中切除伤口之平均±SEM百分比愈合率是显著更快的(＊p＜0.05)。在第14天，与对照相比，GFP-hWJSC治疗臂的平均±SEM百分比伤口闭合率是显著更快的(＊p＜0.05)。(5C)在第3天、第7天和第14天(D3、D7、D14)所采集的鼠伤口组织活检之苏木精和伊红组织切片。与对照相比，在治疗组(GFP-hWJSC和hWJSC-CM)中的伤口表皮和真皮示出更快的上皮再形成、复层鳞状上皮的形成、增加的细胞构成和脉管系统以及随时间而增加的皮脂腺和毛囊数量。D：真皮；E：表皮；HF：毛囊；SG：皮脂腺；SSE：复层鳞状上皮。比例尺＝100μm。

图6A至6C：(6A)小鼠糖尿病伤口的数字化图像，其示出与对照(UCM)相比，在暴露于GFP-hWJSC和hWJSC-CM(治疗臂)(白色箭头)的糖尿病小鼠中到第28天(D28)的更快伤口闭合。(6B)与对照相比，在D7，在GFP-hWJSC治疗臂中和在D28，在hWJSC-CM治疗臂中，糖尿病小鼠中糖尿病伤口之平均±SEM百分比愈合率是显著更快的(＊p＜0.05)。(6C)在第7天、第14天和第28天(D7、D14、D28)所采集的鼠糖尿病伤口组织活检之苏木精和伊红组织切片。到D7，与对照相比，在治疗组(GFP-hWJSC和hWJSC-CM)中的伤口表皮和真皮示出上皮细胞再形成、皮脂腺和一些毛囊的形成。到D14和D28，与对照相比，治疗臂(GFP-hWJSC和hWJSC-CM)的伤口组织活检的表皮示出复层鳞状上皮的形成并且真皮示出增加的细胞构成、脉管系统以及皮脂腺和毛囊数量。E：表皮；HF：毛囊；SG：皮脂腺；S：基质；SSE：复层鳞状上皮。比例尺＝100μm。

图7：在D14和D28的糖尿病小鼠伤口组织活检的荧光免疫组织化学图像，其示出绿色荧光蛋白(GFP)标记的hWJSC(短细箭头)和阳性人角质形成细胞标志物(红色)(粗长箭头)。a、d表示细胞角蛋白克隆AE1/AE3；b、e表示内披蛋白并且c、f表示聚丝蛋白DAPI：蓝色。比例尺＝50μm。

图8A至8B：在第3天至第28天(D3至D28)，在(8A)切除伤口组织活检和(8B)糖尿病伤口组织活检中使用TaqMan探针之小鼠ICAM-1、TIMP-1和VEGF-A的qRT-PCR mRNA表达。(8A)在D3，在GFP-hWJSC治疗的切除伤口中的ICAM-1 mRNA水平显著高于对照(CCD-CM和GFP-CCD)(＊p＜0.05)。在D3，与对照相比，在GFP-hWJSC治疗的切除伤口中TIMP-1表达也是显著上调的(＊p＜0.05)。在D3，与对照相比，在hWJSC-CM治疗的切除伤口中，VEGF-A mRNA表达示出6倍的增加(＊p＜0.05)。在D7，与对照相比，GFP-hWJSC和hWJSC-CM治疗的切除伤口臂示出显著更高的ICAM-1、TIMP-1和VEGF-A表达水平(＊p＜0.05)。在D14，切除伤口的ICAM-1水平在组之间没有显著差异，但是，与对照相比，在GFP-hWJSC和hWJSC-CM治疗的切除伤口中，VEGF-A水平是显著更高的(＊p＜0.05)。(8B)对于糖尿病伤口，与对照相比，hWJSC-CM治疗臂示出在D7和D14显著更高水平的TIMP-1以及在D7和D28显著更高水平的VEGF-A。在D28，GFP-hWJSC臂的VEGF-A水平显著高于对照(＊p＜0.05)。

图9：示出伤口敷料贴剂制备的示意图。通过电纺丝来制备AV/PCL纳米支架并用GFP-hWJSC或hWJSC-CM浸渗。

图10A至10F(10A、10B)示出孔和小环境(niche)之AV/PCL随机排列的纳米纤维的低和高放大倍率扫描电子显微照片(2500×；15,000×)。(10C)：示出hWJSC附着并在纳米纤维上生长的扫描电子显微照片(2500×)。(10D、10E)：在72小时之后，浸渗有GFP-hWJSC的AV/PCL纳米支架之侧视图和表面视图的共聚焦荧光图像。注意到，GFP-hWJSC生长到纳米支架中。(10F)：不同形状的最终实际伤口敷料贴剂。

图11A至11I：(11A)暴露于hWJSC-CM+AV/PCL(治疗)、CCD-CM+AV/PCL(对照)和UCM+AV/PCL(对照)的CCD成纤维细胞(72小时；D0至D3)的划痕-伤口测定。a至i：注意到，在D0，在治疗和对照测定中没有细胞(白色箭头)的空白(vacant)线性划痕(伤口)。b至j：注意到，在D1，CCD从伤口边缘迁移到空白区域内，其中在hWJSC-CM+AV/PCL治疗组(黑色箭头)中迁移最大。c至k和d至l：注意到，与对照相比，在D2和D3，hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中的CCD的更快迁移，其中到D2和D3伤口完全覆盖。(11B)示出与对照相比，在hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中，平均±SEM伤口闭合百分比显著更高(p＜0.05)的直方图。(11C、11D、11E、11F)示出与对照相比，在hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中，划痕-伤口测定中的细胞生存力、总胶原蛋白、弹性蛋白和SOD浓度显著更高(p＜0.05)的直方图。(11G、11H、11I)是这样的直方图，其示出与对照相比，在hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中，划痕-伤口测定中胶原蛋白III和纤连蛋白的qRT-PCR cDNA表达水平显著更高(p＜0.05)而MMP-1尽管更高但是与对照没有显著差异。

图12A至12C：(12A)与所有其他臂相比，在GFP-hWJSC+AV/PCL治疗臂中，到第7天，在SCID小鼠中的切除伤口的数字化图像示出更快的伤口闭合。(12B)在第7天，与对照相比，在GFP-hWJSC+AV/PCL臂中，SCID小鼠中的平均±SEM百分比伤口闭合率是显著更快的(p＜0.05)。在第14天，与对照相比，在GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL臂中，伤口闭合率是显著更高的(p＜0.05)。(12C)在第3天、第7天和第14天采集的切除伤口组织活检的代表性苏木精和伊红组织切片。(对于每组，检查4个至7个组织切片)。a至e：在第3天，在GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中的伤口组织活检示出增加的肉芽形成(granulation)、上皮细胞再形成以及少量皮脂腺和毛囊的出现，而对照则示出断裂的上皮和覆盖有血液、纤维蛋白和渗出物的伤口表面。f至j和k至o：在第7和14天，与对照相比，在治疗臂(GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL)中的伤口的表皮示出复层鳞状上皮的形成、增加数量的皮脂腺和毛囊以及更多的细胞构成和脉管系统。D：真皮；E：表皮；HF：毛囊；K；角蛋白；SG：皮脂腺；SSE：复层鳞状上皮。比例尺＝100μm。

图13A至13D：(13A)到第28天，与对照相比，在GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL治疗臂中，db/db小鼠中之糖尿病伤口的数字化图像示出完全的伤口闭合。(13B)在第7天，糖尿病伤口的GFP-hWJSC+AV/PCL治疗臂之平均±SEM百分比伤口闭合率显著高于对照，而在第14天，hWJSC-CM+AV/PCL治疗组的平均±SEM百分比伤口闭合率显著高于对照(p＜0.05)。(13C)在第7天，与对照相比，在GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中，糖尿病伤口组织活检的组织学检查示出上皮细胞再形成、皮脂腺和毛囊。在第14天和第28天，与对照相比，相同的治疗组示出复层鳞状上皮的形成、增加的细胞构成和脉管系统以及增加的皮脂腺和毛囊数量。在第28天，没有接受任何治疗的对照的糖尿病伤口没有复层鳞状上皮，仅有少量的皮脂腺和毛囊并且没有表现出典型的正常皮肤表型。D：真皮；E：表皮；HF：毛囊；SG：皮脂腺；S：基质；SSE：复层鳞状上皮。比例尺：100μm。(13D)a、d：在糖尿病伤口中，在第14天和第28天出现人细胞角蛋白的阳性染色，而在第14天，人内披蛋白明显并且在第28天出现人聚丝蛋白。长箭头：在糖尿病伤口组织活检中活的GFP-hWJSC。短箭头：阳性人角质形成细胞标志物(细胞角蛋白、内披蛋白和聚丝蛋白)。

图14A至14B：(14A)在第7天，用GFP-hWJSC+AV/PCL治疗之小鼠的切除伤口中的ICAM-1 mRNA水平显著高于对照，而在第14天，hWJSC-CM+AV/PCL治疗臂的TIMP-1和VEGF-A表达显著高于所有其他组(p＜0.05)。(14B)对于糖尿病伤口，在第14天，与其他组相比，两个治疗组(GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL)的TIMP-1水平均显著更高，而在第14天，与其他组相比，仅GFP-hWJSC+AV/PCL治疗组的VEGF-A表达显著更高(p＜0.05)。

图15A至15D：(15A)对附着至塑料的人瘢痕瘤细胞之倒置相衬光学(phase-contrast inverted optical)图像，并且其示出在贴壁培养条件下的纺锤状成纤维细胞样细胞形态。(15B)在此培养条件下，瘢痕瘤细胞在混悬液中聚簇成球体。(15C)在贴壁培养以及(15D)球体培养中的瘢痕瘤细胞之CD标志物的FACS分析。数据来自三次独立实验并且各等值线图表示对于每个CD标志物，FITC阳性细胞相对未染色对照的百分比。

图16A至16B：(16A)暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的人瘢痕瘤细胞之形态学变化的相衬图像。a至c：注意到，对照(未治疗的、CCD-CM、CCD-CL)的瘢痕瘤细胞在72小时形成完全的汇合单层，具有其典型的成纤维细胞形态和若干圆形有丝分裂细胞(白色箭头)。d、e：暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的瘢痕瘤细胞具有减少的细胞数、无有丝分裂细胞并且早经历细胞死亡。(16B)在对照(未治疗的、CCDCM、CCD-CL)中，瘢痕瘤细胞之CD标志物(CD29、CD44、CD73、CD90、CD 105)的表达仍然很高，而治疗组(hWJSC-CM和hWJSC-CL)的那些降低。

图17A至17F：(17A)示出与对照(未治疗的、CCD-CM、CCD-CL)相比，在72小时，暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的人瘢痕瘤细胞的细胞增殖(MTT测定)显著降低的直方图。所有值均是来自三次不同重复的平均值±SEM。＊p＜0.05。(17B至17F)细胞周期分析(流式细胞术-PI)示出与对照(未治疗、CCD-CM、CCD-CL)相比，暴露于治疗(hWJSC-CM和hWJSC-CL)的人瘢痕瘤细胞增加了亚-Gl(细箭头)和G2/M(粗箭头)。

图18A至18B：(18A)人瘢痕瘤细胞的等值线图(膜联蛋白V-FITC流式细胞术)，其示出与对照相比，当暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL时，显著更多的阳性细胞。值是来自三次不同重复的平均值±SEM。(18B)与对照(未治疗、CCD-CM、CCD-CL)相比，当暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL时，TUNEL阳性人瘢痕瘤细胞的图像。将DNA酶处理的细胞用作阳性对照(PC)。

图19A至19C：(19A)划痕-伤口测定的相衬图像，其示出在对照中(未治疗、CCD-CM、CCD-CL)中，人瘢痕瘤细胞从划痕的边缘迁移到空白区域，其中空白区域到48小时完全闭合，而治疗(hWJSC-CM和hWJSC-CL)的瘢痕瘤细胞停止其迁移并且空白区域在48小时时没有被覆盖(箭头)。(19B)人瘢痕瘤细胞的免疫细胞化学图像，其示出阳性的角质形成细胞相关的标志物(细胞角蛋白、内披蛋白、聚丝蛋白)以及(19C)TAF-相关的标志物(FSP)、(Tn-C)和VEGF。

图20A至20C：免疫细胞化学图像，其示出与对照(未治疗、CCD-CM、CCD-CL)相比，在暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL 72小时的人瘢痕瘤细胞中之弱阳性TAF相关的标志物(Tn-C(20A)、FSP(20B)和VEGF(20C))。

图21A至21B：暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的人瘢痕瘤细胞的免疫组织化学图像，其示出与对照(未治疗、CCD-CM、CCD-CL)相比，BECLIN-1(21A)和LC3B(21B)的阳性染色。

图22A至22B：(22A)基因表达谱(qRT-PCR)，其示出与对照(未治疗、CCDCM、CCD-CL)相比，在暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL72小时的人瘢痕瘤细胞中的抗凋亡相关基因(BCL2和SURVIVIN)的下调以及促凋亡和自噬相关基因(BAX、ATG5、ATG7和BECLIN-1)的上调。(22B)qRT-PCR，其示出与对照(未治疗、CCD-CM、CCD-CL)相比，在暴露于hWJSC-CM和hWJSCCL的人瘢痕瘤细胞中TAF相关基因(L-6、a-SMA、Tn-C、FAP、FGF和VEGF)的上调。使用比较Ct(DDCt)法进行数据分析和相对定量。

图23A至23D：(23Aa)在对照臂(瘢痕瘤细胞+基质胶)的两个下肢中均形成瘢痕瘤样块以及(23Ab)从对照臂小鼠移除瘢痕瘤肿瘤。(23B)示出肿瘤样块之重量的直方图。(23C)示出肿瘤样块之大小的直方图。(23D)来源于对照臂之肿瘤样块的H&E染色，其示出纤维胶原蛋白的结节(nodule)(23Da、23Db)广泛的玻璃状胶原蛋白和基底细胞空泡变化(basal cell vacuolar change)(23Dc至23Df)。

具体实施方式

本文所述的是这样的组合物和方法，所述组合物和方法使得能够抑制诸如在易于出现瘢痕形成(例如瘢痕瘤形成)个体中的该病症以及促进伤口愈合(例如，在糖尿病和非糖尿病个体中)。

因此，在一个方面中，本发明涉及在有此需要的个体中治疗伤口的方法，所述方法包括将所述伤口与有效量的组合物接触，所述组合物包含(本质上由......组成、由......组成)(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。

可使用本文描述的方法治疗任意数量的伤口。伤口的实例包括外科手术切口、来自疾病或病症的未愈合伤口(例如糖尿病伤口(溃疡)、由于肾功能障碍或衰竭引起的伤口、静脉和动脉溃疡)、创伤性损伤伤口、溃疡、烧伤、褥疮、切除的瘢痕瘤伤口。在一个特定的方面中，治疗的伤口处于变为瘢痕或瘢痕瘤的风险之中。在另一个方面中，治疗的伤口是糖尿病伤口。

在另一个方面中，本发明涉及治疗和/或抑制瘢痕和/或过度的瘢痕形成和/或生长的方法。在一个特定的方面中，本发明涉及在有此需要的个体中治疗伤口以抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括将所述伤口与有效量的组合物接触，所述组合物包含(本质上由......组成、由......组成)(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。在一个特定的方面中，所述瘢痕是异常瘢痕，例如瘢痕瘤或增生性瘢痕(hypertrophic scar)(过度的瘢痕生长)。

如本文进一步详细描述的，将伤口保持在其中促进(例如，增强)伤口愈合和/或抑制瘢痕形成(例如，部分地、完全地)的条件下。

在再一个方面中，本发明涉及包含医用敷料的组合物，所述医用敷料包含(本质上由......组成、由......组成)(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或其组合。

在本文描述的方法和组合物中，将伤口和/或瘢痕与包含(本质上由......组成、由......组成)沃顿胶质干细胞(WJSC)和/或其提取物的组合物接触。如本文所使用的，“沃顿胶质”是指在脐带中出现的粘胶质样物质。在人脐带沃顿胶质(本文称为“WJSC”，并且在一些特定的实施方案中，被一些工作者称为人WJSC(“hWJSC”))中已经报道了大量具有高增殖率和低群体倍增时间的真正的、完全表征的间充质干细胞(MSC)。在一些方面中，已经示出可从约1cm的脐带收获约4.6×10⁶新鲜的活hWJSC，并且这些hWJSC的干性比体外骨髓MSC更持久(10代相比于3代)。还示出hWJSC有低免疫原性(hypoimmunogenic)，因此使得其能够用于自体和同种异体环境(setting)两者中而不考虑移植物抗宿主病，并且在低温保存之后hWJSC的解冻存活率大于90％。

可使用多种方法来从脐带获得WJSC(例如，Weiss等，Stem Cells，24：781-792(2006)，Fong等，Reprod Biomed Online，15：708-718(2007)，Fong等，Reprod Biomed Online，21：391-401(2010)，Wang等，Stem Cells，22：1330-1337(2004)，Romanov等，Stem Cells，21：105-110(2003)，Sarugaser等，Stem Cells，23：220-229(2005)，Karahuseyinoglu等，Stem Cells，25：319-331(2007)，其全部通过引用并入本文)。例如，如本文所举例的可从一段或更多段已经剪开的脐带获得WJSC，脐带翻转在包含酶促溶液的培养皿上，并且在约37℃下在约5％CO₂的空气气氛中孵育约45分钟以允许沃顿胶质从脐带松开和分离。然后，可将分离的沃顿胶质经过针头(例如，18G针头；21G针头)注射以进一步打碎并从沃顿胶质释放WJSC。或者，可在分离之后立即将纯的粘沃顿胶质本身冷冻、解冻并从解冻的沃顿胶质回收健康的hWJSC，其可在培养基中生长并繁殖。

用于所述方法的WJSC可从单个供体或多个供体获得。此外，用于本文所述方法的WJSC可以是新鲜分离的、冷冻的(例如，低温保存的)或其组合。

通常，WJSC是哺乳动物来源的。如本文所使用的，术语“哺乳动物”和“哺乳动物的”是指任何脊椎动物，包括单孔类动物(monotremes)、有袋类动物(marsupials)和胎盘动物(placental)，其哺乳其幼崽并且生育活的幼崽(真兽类(eutharian)或胎盘哺乳动物)或者产卵(后兽类(metatharian)或非胎盘哺乳动物)。哺乳动物的实例包括灵长类(例如，人、猴子、黑猩猩)、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)、犬科、猫科和反刍动物(例如，牛、猪、马)。在一个特定的方面中，WJSC是人WJSC(hWJSC)。

用于本文所提供的方法的WJSC可以是分离的、纯的或基本上纯的。如本文所使用的，“分离的”(例如，分离的WJSC)是指就其所出现的复杂(例如细胞的)环境而言基本上分离的，例如从器官、身体、组织、血液或培养基分离的。在一些情况下，分离的材料将形成组合物(例如，包含其他物质的粗提取物)、缓冲系统、培养系统或试剂混合物的一部分。在另一些情况下，可将材料纯化为基本上均质的。例如，分离的WJSC的组合物可包含所有存在细胞的至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％(基于总细胞数)。

本文所述的方法和组合物还可包含WJSC的提取物。如本文所使用的，WJSC的提取物包括已经与WJSC接触的(例如，培养的)组合物，例如WJSC的裂解物，细胞培养基(例如，WJSC调节的培养基)等。在一个方面中，将伤口和/或瘢痕与WJSC的裂解物接触。在另一个方面中，将伤口和/或瘢痕与WJSC的裂解物以及WJSC接触。WJSC的裂解物，本文还称为WJSC裂解物，是指(一种或更多种)裂解的WJSC的内容物。如本领域已知的，裂解的细胞(例如裂解的WJSC)是指使其膜分解或破裂从而导致细胞内容物释放的细胞，其被称为细胞裂解物。可使用多种方法来裂解细胞(例如，通过病毒、酶促和/或渗透机制)。例如，如本文所示，通过将细胞与裂解缓冲液接触来裂解细胞。

在本文所述的方法和组合物中，还可将伤口和/或瘢痕与已经用WJSC调节的细胞培养基接触。已经用WJSC调节的细胞培养基，本文称为WJSC调节的培养基(WJSC-CM(例如，hWJSC-CM))，是包含从WJSC获得的生物学活性组分的细胞培养基，其在培养基中培养或已经在培养基中培养(例如，生长)并且已经释放到培养基物质中以影响某些细胞功能(例如，生长，裂解)。WJSC-CM可以但是通常不包含之前在培养基中培养的WJSC。WJSC可在培养基中培养一代或更多代(例如，约1代、2代、3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、10代、11代、12代、13代、14代、15代、16代、17代、18代、19代、20代或更多代)，并且WJSC可在达到约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的汇合度(confluency)之后进行传代。此外，在其中WJSC-CM不包含WJSC的方面中，可在数分钟(例如，约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟)、数小时(例如，约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时)、数天(例如，约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天)、数周(例如，约1周、2周、3周、4周)、数月(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月)或数年(例如，约1年、2年、3年、4年、5年)之后，从培养物移除WJSC。此外，如本文所述，根据用于使用其的指示，可进一步操作WJSC-CM，例如，过滤、灭菌(例如，过滤灭菌)、调节pH和/或重量摩尔渗透压浓度、稀释、浓缩、冻干、冷冻干燥等。

如本领域已知的，培养基或细胞培养基是为生长、储存或转运细胞特定地制造的制剂。存在的多种培养基允许培养通常的细胞(例如，基础培养基)或特定的细胞类型(例如，鉴别培养基、选择性培养基、测试培养基和确定成分培养基)。培养基可以是液体或固体形式。在一个方面中，固体培养基是已经用试剂(例如AGAR或GELATIN)固化的液体培养基。

在本文所述的方法和组合物中，还可将伤口和/或瘢痕与已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和/或瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基接触，本文称为“预处理的WJSC调节的培养基(WJSC-primed conditionedmedium，WJSC-PCM)。如本文所述，通过在收集调节的培养基之前将hWJSC暴露于常氧(例如，约5％O₂)或特定的低氧(例如，低氧气，例如少于约5％，包括约4％、3％、2％、1％、0.5％或更少氧气)和/或凋亡的培养基环境(例如，伤口环境)来制备预处理的调节的培养基。

如本文所使用的，凋亡细胞是这样的细胞，其经历或已经经历凋亡(是程序性细胞死亡的形式)并且具有小于2n的DNA含量(“亚-G1细胞“)。这样的细胞通常是凋亡的DNA断裂的结果，其中在凋亡期间，DNA由细胞内切核酸酶降解。因此，凋亡细胞的细胞核包含比健康G0/G1细胞的细胞核更少的DNA。

例如，可将培养基(例如，含有补充有knockout血清替代物(KOSR)培养基、L-谷氨酰胺和/或抗生素/抗真菌混合物之DMEM高葡萄糖的培养基)暴露于WJSC，在不同氧环境中(例如，少于或等于约5％)的濒死/活的凋亡原发性皮肤(例如，市售的包皮成纤维细胞(ATCC，MarylandUSA))和/或瘢痕瘤(例如，获得自在接受知情同意和IRB批准之后经历外科手术以移除瘢痕瘤的患者)培养物以及从WJSC分离(例如，在约24小时至72小时之后)的调节培养基。目的是利用通过皮肤和瘢痕瘤细胞所释放的任何有用成分。

如本领域技术人员所理解的，可将多种浓度的调节的培养基和/或预处理的调节的培养基用于所述方法中。例如，在本文所述的方法中，可使用以约40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％体积/体积(v/v)稀释在例如其他培养基中的调节的培养基。

还如本领域技术人员所理解的，可将WJSC、凋亡的皮肤细胞和/或瘢痕瘤细胞保持在培养基中以及多种条件下从而制备WJSC-CM和/或WJSC-PCM。例如，所述条件可包括将培养物保持在约37℃下在约5％CO₂中。此外，可将WJSC、凋亡的皮肤细胞和/或瘢痕瘤细胞培养数小时或数天。在一些方面中，可将WJSC、凋亡的皮肤细胞和/或瘢痕瘤细胞培养约1小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、14天等。

用于本文所提供的组合物和方法中的WJSC、凋亡的皮肤细胞和/或瘢痕瘤细胞可获得自不同个体(例如，同种、异种)、相同物种的不同个体(例如，同种异体)或相同的个体(例如，自体)。

如本文所示，可将(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合植入、“接种”或“浸渗”到能够支撑三维组织形成的人工结构中。使用这些结构(通常称为胞外基质或支架)，例如，来重演体内环境并且允许细胞影响其自身微环境。支架可用作一个或多个目的，例如允许细胞附着和迁移、递送和保持细胞以及生化因子、使得重要的细胞营养物质扩散并表达产物和/或施加某些机械和生物学影响来修改细胞时相的行为。

如本领域技术人员所理解的，可使用用组合物来浸渗支架的多种方法。例如，可将组合物注射入支架中，例如，在将支架与伤口接触之前或之后。如果在与伤口接触之前，用组合物浸渗支架，则可将包含组合物的支架保持在其中允许组合物重演体内环境并允许细胞影响其自身微环境的条件下。如本领域技术人员所理解的，可储存(例如，冷冻)这样的支架直到需要时。

因此，在某些方面中，可将伤口与组合物接触，所述组合物包含(本质上由......组成，由......组成)(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合，其中所述组合物还包含支架。在一个方面中，将伤口与包含所述组合物的支架接触。在另一些方面中，可将伤口首先与支架接触，然后将所述组合物添加至已经存在于伤口的支架。可在将支架与伤口接触之后立即将所述组合物添加至存在于伤口的支架或在过去一段时间之后将所述组合物添加至存在于伤口的支架(例如，可在将支架与伤口接触之后数分钟、数小时、数天或数周将所述组合物引入支架中)。

用于所述组合物和方法的支架可具有许多使得其适用于伤口愈合的特征。这样的特征的一个实例包括有利于细胞接种和遍及细胞和营养物两者之整个结构扩散的孔径。另一个特征是可生物降解性，例如，其中通过周围组织来吸收支架而不需要外科手术移除。在某些方面中，降解发生的速率尽可能地与组织形成的速率一致：这意味着，当细胞围绕自身制造其自己的天然基质结构时，支架能够在体内提供结构完整性并且最终分解而留下新组织(neotissue)，新形成的组织将负责机械负荷。或者，可期望的是拥有永久的支架。支架的另一些有用特征包括非免疫原性、透明性、纳米级纤维、低浓度、再吸收率等。

如本文所述，在一些特定的方面中，使用纳米纤维支架。可使用多种纳米纤维支架。在一个方面中，支架的孔隙度为约0.5μm至约10μm。在另一些方面中，纳米纤维支架的纤维直径为约250nm至约650nm并且纤维厚度为约250nm至650nm。

可使用多种材料(例如，天然的、合成的、可生物降解的、永久的及其组合)来形成支架。天然材料的实例包括蛋白材料(例如胶原蛋白或纤维蛋白)，以及多糖材料(例如壳聚糖或糖胺聚糖(GAG))。在GAG之中，可将例如与交联剂(例如，戊二醛、水溶性碳二亚胺等)组合的透明质酸用作支架材料。支架的官能团可用于将小分子(药物)递送到特定组织。支架的另一个形式包括脱细胞的组织提取物，从而将留下的细胞残余物(remnant)/胞外基质充当支架。

通常使用的合成材料包括聚己酸内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)和在人体内降解以形成乳酸的聚(L-乳酸-共-e-己内酯)、易于从身体移除的天然存在的化学物质。

在文献中已经描述了用于制备用作组织工程支架之多孔结构的许多不同方法。这样方法的实例包括纳米纤维自组装以产生水凝胶支架；纺织技术；纤维粘合(fiber bonding)；用于制备具有规律孔隙度但是有限厚度之多孔结构的溶剂浇铸以及颗粒沥滤(solvent casting and particulateleaching，SCPL)；将气体用作致孔剂的气体发泡；不需要使用固体致孔剂的乳化/冷冻干燥技术；涉及使用具有低熔点之溶剂的热致相分离(thermally induced phase separation，TIPS)；以及使用计算机辅助设计和制造技术的CAD/CAM技术。

在一个特定的方面中，使用电纺丝来制备支架(例如，纳米纤维支架)。电纺丝是一种高度通用的技术，其可用于生产具有高表面积的亚微米至纳米级直径的连续纤维(例如，Zhang等，Int J Nanomed，2(4)：623-638(2007))。通常，电纺丝涉及使用经过喷丝头(spinneret)进入的溶液以及向尖端施加高电压。带电溶液中静电排斥的积累导致其喷射细纤维流。所安装的具有相反或接地电荷的集电板或棒拉出连续纤维，其形成高度多孔的网络。这种技术的优点包括其简单性和易于变化。在实验室水平，通常的电纺丝设置仅需要高压电源(高达30kV)、注射器、平顶针头和导电集电器。通过修改变量(例如到集电器的距离、施加电压的大小或溶液流速)，可改变整个支架结构。

如本领域技术人员所理解的，可将多种另外的组分添加至支架。例如，可使用一种或更多种化妆品成分。在一个特定的方面中，将芦荟与纳米纤维支架组合以机械地保持细胞并促进其产物释放到微环境中。在再一个方面中，使用芦荟和PCL来产生纳米纤维支架。在某些方面中，纳米纤维支架中PCL与芦荟的比值为约10∶5。支架中的芦荟和PCL均是可生物降解的。

还如本领域技术人员所理解的，组合物可包含有助于伤口愈合的另一些组分。例如，组合物还可包含一种或更多种抗生素、银、纤维蛋白或其组合。

伤口可与组合物接触的时间量将根据许多因素(包括伤口的类型、个体的病症等)来变化，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。因此，时间量可为数分钟、数小时、数天、数周、数月和数年不等。在某些方面中，将伤口与组合物接触约24小时至约21天。

在另一些方面中，本发明涉及包含本文所述之医用敷料的药物组合物。可用生理上可接受的载体或赋形剂来配制用于本文所述方法的药物组合物以制备药物组合物。载体和组合物可以是无菌的。制剂应适于施用模式。

引入这些组合物的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、眼内、静脉内、皮下、表面、经口和鼻内施用。施用可发生在局部，例如在伤口的部位(例如，边缘)和/或全身性。本发明的药物组合物还可作为与其他化合物的组合疗法的一部分施用。

如本文所示，可将组合物与方法用于治疗伤口或瘢痕(例如，瘢痕瘤)。如本文所使用的，“治疗”是指愈合伤口或瘢痕。在一个方面中，完全愈合伤口或瘢痕。在另一些方面中，部分愈合伤口或瘢痕，例如，伤口愈合但是具有减少的或最小的瘢痕形成；瘢痕形成的量是减少或降低的。

此外，在本文所述的方法中，将伤口与有效量(治疗有效量)的组合物接触(即，足以治疗伤口或瘢痕，例如通过缓解与伤口或瘢痕相关的症状和/或还减少伤口或瘢痕之严重程度的量)。可通过标准的临床技术来确定在特定个体的伤口或瘢痕的量，所述量在治疗中是治疗有效的并且取决于伤口或瘢痕的症状和严重程度。用于制剂中的精确剂量还取决于施用途径以及伤口或瘢痕的严重程度，并且应该根据医师的判断和每个个体的情况来决定。有效剂量可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线来推断。

例如，如本文所述，对于hWJSC，使用约0.5×10⁶个细胞/100μl至10×10⁶个细胞/100μl；对于hWJSC-CM和hWJSC-PCM，使用约50％w/v至100％w/v浓度的约50μl至200μl并且调节约24小时至72小时；对于hWJSC-CL，使用约50μl至200μl的约10μg/ml至50μg/ml的蛋白质。

本文所述的组合物和方法可用于多种个体。在一个特定的方面中，所述个体是哺乳动物。如本文所使用的，术语“哺乳动物”和“哺乳动物的”是指任何脊椎动物，包括单孔类动物、有袋类动物和胎盘动物，其哺乳其幼崽并且生育活的幼崽(真兽类或胎盘哺乳动物)或者产卵(后兽类或非胎盘哺乳动物)。哺乳动物的实例包括灵长类(例如，人、猴子、黑猩猩)、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)、犬科、猫科和反刍动物(例如，牛、猪、马)。在一个特定的方面中，所述个体是人。在另一些方面中，所述个体是犬科(例如，狗)、猫科(例如，猫)、牛科(例如，牛)、马科(例如，马)等。

因此，本文所述组合物和方法可用于经过包括外科手术切口之任何形式的外科手术的住院个体(例如，促进伤口愈合并抑制任何瘢痕瘤形成)或用于经历创伤的个体。此外，本文所述的组合物和方法可用于患有缓慢愈合的糖尿病和非糖尿病伤口的个体；在事故/外科手术之后易于形成瘢痕瘤的患者；在床上不动的患有褥疮的个体；烧伤受害者；以及创伤受害者。所述组合物和方法还可用于经过美容手术以防止瘢痕瘤形成的个体以及用在动物护理(兽医)行业中。

本发明还涉及有效量的组合物用于在有此需要的个体中治疗(治疗)伤口的用途，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。在另一个方面中，本发明还涉及有效量的组合物用于制造用来在有此需要的个体中治疗(治疗)伤口之药物的用途，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。

在另一个方面中，本发明涉及有效量的组合物用于制造用来在有此需要的个体中治疗(治疗)伤口以抑制瘢痕形成之药物的用途，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。

示例

实施例1

方法/材料

实验设计

在动物模型中体外和体内进行二维(没有芦荟纳米筛的人沃顿胶质干细胞(hWJSC)、hWJSC调节的培养基(hWJSC-CM)、预处理的hWJSC调节的培养基(hWJSC-PCM)或hWJSC细胞裂解物(hWJSC-CL))和三维(具有芦荟纳米筛的hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL)研究。对于体外研究，在生长于培养皿的皮肤成纤维细胞单层上制造线性划痕以模拟伤口(常规的划痕测定((Linag等，NatureProtocols，2：329-333(2007)))。在暴露于具有或不具有芦荟纳米筛的hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL的划痕单层上进行形态学改变、增殖速率、胶原蛋白、弹性蛋白和基因组测定。对于动物研究，在免疫缺陷(Animal Resource Centre，Australia)和糖尿病小鼠(Jackson Laboratories，USA)的背部皮肤上制造直的和圆形伤口。将动物中的伤口分别暴露于(通过在伤口的若干部位注射)具有/不具有芦荟纳米筛的hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL(hWJSC：约0.5×10⁶个细胞/100μl至10×10⁶个细胞/100μl；hWJSC-CM和hWJSC-PCM：50μl至200μl约50％w/v至100％w/v浓度并且调节约24小时至72小时；hWJSC-CL：50μl至200μl的约10μg/ml至50μg/ml的蛋白质)。与伤口组织活检的组织病理学和免疫组织化学检查一起测量愈合率(伤口闭合的时间)以得到更详细的伤口愈合和闭合信息。有两组对照用于所有体外和体内动物实验。(对照1：未治疗的伤口；对照2：用与实验臂相同的方式但是用皮肤成纤维细胞和皮肤成纤维细胞调节的培养基(CM)、预处理的调节的培养基(PCM)或细胞裂解物(CL)治疗的伤口)。

从脐带分离纯的人沃顿胶质及其储存

用无菌剪刀将数段人脐带(1.5cm)剪开并且在37℃下，在5％CO₂空气气氛中将内表面暴露于酶的混合物(1型胶原酶、4型胶原酶、透明质酸酶)45分钟。然后在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)高葡萄糖培养基中洗涤带段(cord pieces)以除去所有酶痕量，接着置于含有5ml新鲜DMEM高葡萄糖培养基的60mm无菌培养皿中。使用一对钟表制造镊子(watchmaker forcep)的钝背表面来从各带段的内表面中将胶状沃顿胶质刮到培养基中。在移出沃顿胶质之后，丢弃剩余的带段并且将培养基中的胶状沃顿胶质转移到15ml Falcon管中。然后经过连接到10ml注射器的21号针头将胶状沃顿胶质注射以打碎胶质并释放hWJSC。将细胞悬液在300×g下离心5分钟并收集上清液(不含细胞的沃顿胶质)。可新鲜使用该胶质来浸渗纳米芦荟筛或在-80℃冷冻以进一步使用。例如，可将沃顿胶质的胶状块冷冻，并且在解冻之后，可从沃顿胶质分离hWJSC并在培养物中使其生长。

hWJSC、hWJSC调节的培养基(CM)、hWJSC裂解物和预处理的hWJSC调节的培养基(PCM)的制备

根据Fong等，Reprod Biomed，15：708-718(2007)；Fong等，ReprodBiomed，21：391-401(2010)(这两者均通过引用并入本文)的方法来从废弃的脐带获取和繁殖人沃顿胶质干细胞(hWJSC)。

首先通过在包含补充有20％胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1％胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、抗生素/抗真菌混合物(lnvitrogen)和16ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(FGF)(Millipore Bioscience Research Agents，Temecula，CA)的80％DMEM高葡萄糖之复合培养基中培养hWJSC来制备hWJSC调节的培养基(CM)(提取物)。当hWJSC单层达到80％的汇合度时，用具有/不具有knockout血清替代物培养基(KOSR)的包含补充有L-谷氨酰胺和抗生素/抗真菌溶液之DMEM高葡萄糖的简单培养基来替换培养基。在约24小时、48小时或72小时之后，将该简单培养基分离、过滤并称为hWJSC-CM。

分别地，使用含有蛋白酶抑制剂混合物和二硫苏糖醇的哺乳动物细胞提取试剂盒(BioVision，Mountain View，CA)从生长至80％汇合度的早期传代hWJSC(P3至P7)制备hWJSC裂解物。简言之，将培养的细胞用不含钙和镁的磷酸缓冲盐水(即，PBS(-))洗涤一次，用TrypLETMexpress来解离并在500g×下离心5分钟以获得细胞沉淀。将所述沉淀重悬于100μl的细胞裂解缓冲液中并上下吹打数次，然后在冰上孵育15分钟。随后将内容物在12000g×下离心5分钟(Eppendorf，德国)并且分离澄清的上清液(细胞裂解物)，在-80℃下储存直到使用。

在收集调节的培养基之前，通过将hWJSC暴露于特定的低氧和/或凋亡培养基环境来制备预处理的调节的培养基。分别地，将具有/不具有knockout血清替代物培养基(KOSR)的包含补充有L-谷氨酰胺和抗生素/抗真菌溶液之DMEM高葡萄糖的简单培养基暴露于WJSC，在不同氧环境(例如，小于或等于约5％)中的濒死/活的凋亡原发性皮肤和瘢痕瘤培养物，并且在约24小时至72小时之后从WJSC分离调节的培养基。目的是利用通过皮肤和瘢痕瘤细胞释放的任何有用成分。该CM称为预处理的调节的培养基(PCM)。

纳米芦荟筛的制备

收集新鲜的芦荟叶，并用水充分洗涤并风干。将风干的芦荟植物粉碎(pulverize)并用甲醇提取。使用旋转蒸发仪(rota vapour)来蒸发残留的甲醇，然后冷冻干燥终产物。将聚己酸内酯(PCL)(分子量80,000)和芦荟的粗提物通过持续搅拌24小时溶解于六氟丙醇(hexafluropropanolol)中。以1.0mL/小时的流量和高电压将PCL/芦荟的混合聚合物溶液加入连接到22G针头的3ml标准注射器中并且在玻璃盖玻片上电纺丝为纳米纤维、灭菌并用作hWJSC生长的支架。将相同的支架分别在CM/PCM/裂解物中浸泡。

芦荟/聚己酸内酯纳米纤维膜的制造

聚己酸内酯(PCL，分子量80,000)、氯仿和甲醇购自Sigma-Aldrich(USA)并且芦荟经干燥的粉末是由安娜大学的纺织工程，金奈，印度(Textile engineering at Anna University，Chennai，India)赠送的。通过搅拌将PCL/芦荟(约15％w/v：约10∶5的比)溶解于氯仿/甲醇(3∶1)中，均匀分布达24小时。在自动电纺丝机器((Nanon-01A，MECC Co.Ltd.Japan)Nanon上进行电纺丝来制造纳米纤维膜。将作为背衬材料的覆盖有铝箔的旋转转鼓用于收集纳米纤维膜。将旋转速度固定在150rpm以使纳米纤维在旋转转鼓上均匀喷涂。使用注射泵以3.0ml/小时的流量和使用高压电源施加的24kV电压将PCL/芦荟样品加入连接到18G钝不锈钢针头的10ml标准注射器中。图2说明制成的膜和纳米纤维的形态。在电纺丝之后，将制成的膜暴露于通风厨中的温和对流空气流中过夜以移除任何残留溶剂。在室温下，在真空下将纳米纤维干燥过夜以移除存在于纳米纤维支架中的残留溶剂。将膜切割成10×10cm片并储存在干燥器中。将不同大小(10mm至15mm)的盖玻片铺在覆盖有铝箔的矩形不锈钢台上以收集纳米纤维从而研究与培养的细胞的生物相容性以及观察纳米纤维的结构和性质。用金(JEOL JFC-1600 Auto Fine Coater，Japan)来溅射涂覆电纺纳米纤维并在10kV加速电压下通过场发射扫描电子显微术(SEM；FEI-OUANTA 200F，Czech Republic)观察电纺纳米纤维以用于表征。

PCL/芦荟支架是随机筛设计并且具有高孔隙度(约85％至95％)以及约400nm至425nm的纤维直径和约0.5mm至1mm的厚度(图1)。纳米纤维支架的高孔隙度为细胞提供了更多结构空间以更有效地促进支架与环境之间的营养物和代谢废物的交换。此外，所述支架为细胞粘附提供了较大的表面并且还有助于保持机械稳定性以保护伤口床(woundbed)免受微生物侵入。这些特征是组织工程的纳米纤维支架的优选标准。所述支架为细胞粘附提供表面并且还保持机械稳定性。当医师操作并将其植入伤口时，所述支架保留其结构完整性和稳定性。所述支架(例如，芦荟纳米筛)在伤口中提供足够的生物力学支撑。使用评估材料之机械性能的装置(Instron USA)来测试PCL/芦荟样品的吸收能力和生物相容性。以兆帕测量的结果示出良好的吸收能力和生物相容性。用于制造支架的材料包括合成聚合物和天然聚合物两者的整合，例如，为细胞(例如hWJSC、表皮和真皮成纤维细胞)的生长提供有利的基材。

hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC裂解物/hWJSC-PCM浸渗到纳米芦荟筛中

将纳米芦荟筛用以下物质浸渗并制备成用于施加到伤口上的伤口敷料贴剂：(1)单独的hWJSC(2)hWJSC-CM、hWJSC裂解物或hWJSC-PCM(3)具有或不具有纤维蛋白的hWJSC或hWJSC-CM或hWJSC裂解物或hWJSC-PCM。

用绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)来标记hWJSC

用GFP或RFP来标记hWJSC以使用常规慢病毒转染方法在体外和动物研究中进行追踪。在荧光显微术下于hWJSC中观察到的绿色或红色有助于其鉴定。

细胞增殖((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑鎓溴化物(MTT)测定)

在0.1％明胶包被的24孔组织培养板(BD，Franklin Lakes，NJ)中以2×10⁴个细胞/孔的接种密度在基础培养基中培养皮肤成纤维细胞并且在用具有或不具有纳米凝胶筛的hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL治疗72小时之后，评估其细胞增殖速率。使用常规MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑鎓溴化物)测定来评估细胞增殖。

划痕测定

在0.1％明胶包被的60mm培养皿(Nalgene NUNC International，Rochester，NY)中以0.5×10⁶的接种密度在基础(KOSR)培养基中培养皮肤成纤维细胞并培养24小时。将皮肤成纤维细胞和hWJSC的各自0.25×10⁶个细胞一起接种到平皿中。在对照壁和实验臂两者中用2ml带刻度血清移液管在中线上从培养皿顶部至底部垂直地制造均匀的划痕以模拟伤口。用PBS轻轻地洗涤细胞碎片并且将对照细胞臂和混合细胞臂培养在基础(KOSR)培养基中。在培养皿中在皮肤成纤维细胞的汇合单层上制造类似的划痕并且在37℃下在5％CO₂气氛中将细胞分别暴露于具有或不具有纳米凝胶的hWJSC-CM、hWJSC-PCM、hWJSC-CL 72小时。使用Olympus倒置相衬显微镜每24小时有规律地监测细胞(hWJSC并且特别是皮肤成纤维细胞以示出hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL的存在加速了皮肤成纤维细胞的增殖以及由此划痕的闭合)到划痕(伤口)的迁移并进行成像，持续直到72小时或划痕(伤口)完全闭合，二者之中更早的。将培养皿上的记号用作参照点以在成像期间获得相同的场(field)。

胶原蛋白(Sircol)测定

对于对照臂和治疗臂两者，均在0.1％明胶包被的T-25组织培养瓶(BD，Franklin Lakes，NJ)中以0.5×10⁶个细胞至1×10⁶个细胞的接种密度在基础培养基中培养皮肤成纤维细胞。在基础(KOSR)培养基中培养对照臂，而在37℃下在5％CO₂气氛中用具有或不具有纳米凝胶筛的hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL来培养治疗臂72小时。根据制造商的说明书，使用Sircol^TM(胶原蛋白测定)试剂盒(Bioclour，Carrickfergus，UK)来评估对照臂和治疗臂两者所分泌的胶原蛋白水平。简言之，在1.5ml微量离心管(Eppendorf)中，将1mlSircol试剂添加至100μl的标准品和样品(1∶20，在蒸馏水中稀释)；充分混合并置于机械摇动器上30分钟以使胶原蛋白-染料复合物沉淀。然后，将内容物在12000rpm离心10分钟并且小心地倒出上清液以避免沉淀的损失。在12000rpm离心10分钟后，通过分层750μl冰冷酸-盐洗涤试剂(试剂盒内容物)来移除未结合的染料。小心地移除上清液并且添加250μl碱试剂(试剂盒内容物)并涡旋以溶解结合的染料。使用微板ELISA读数器(μQuant-BioTek，Winooski，VT)来进行分光光度法以测量在555nm处的吸光度并且基于标准品的浓度来计算胶原蛋白的浓度。

弹性蛋白测定

如上对Sircol测定的描述，如上准备对照臂和治疗臂平皿并培养72小时。根据制造商的说明书使用Fastin^TM(弹性蛋白测定)试剂盒(Bioclour，Carrickfergus，UK)来分析细胞的弹性蛋白含量。简言之，在各培养基中培养之后，胰蛋白酶化细胞、沉淀并在(100℃)下用0.25M草酸处理2小时以将天然的疏水弹性蛋白转化为水溶性α-弹性蛋白。向标准品和样品两者(50μl)两者添加弹性蛋白沉淀试剂(试剂盒内容物)并在RT下孵育15分钟，然后在10000×g离心10分钟。小心地倒出管内容物并且添加1ml染料试剂(试剂盒内容物)并使用涡旋和机械摇动器混合90分钟。再次将内容物在10000×g离心10分钟并完全倒出上清液。然后通过添加250μl染料解离试剂(试剂盒内容物)来释放结合的弹性蛋白并且使用微板ELISA读数器(μQuant-BioTek，Winooski，VT)来进行分光光度法以测量在513nm处的吸光度并基于标准品的浓度来计算弹性蛋白浓度。

定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)

对于对照臂和治疗臂两者，均在0.1％明胶包被的T-25组织培养瓶(BD，Franklin Lakes，NJ)中以0.5×10⁶个细胞至1×10⁶个细胞的接种密度在基础(KOSR)培养基中培养皮肤成纤维细胞。在基础(KOSR)培养基中培养对照臂，而在37℃下在5％CO₂气氛中在hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL中来培养治疗臂72小时。使用RNeasy PLUS微型试剂盒(Qiagen，USA)来从细胞提取总RNA并进行qRT-PCR。

成功愈合的评估

使用数字照片和NIH图像分析程序通过伤口闭合所用时间来评估愈合率。收集伤口组织活检并使其经历使用伤口愈合模型进行的上皮再形成、血管供应、肉芽组织厚度、有丝分裂象的组织病理学(Yew等，CellTransplantation，20：693-706(2011)；Chen等，PLoS One，4：7119(2009))。

对于体外和体内实验两者，外科手术和糖尿病伤口愈合的比用皮肤成纤维细胞/角质形成细胞(或其CM/PCM/CL)治疗的伤口或未治疗的对照要快得多。与对照(用皮肤成纤维细胞/角质形成细胞(或其CM/PCM/CL)治疗或未治疗对照)相比，在暴露于hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL之后，伤口中的细胞增殖有所增加。与对照相比，在暴露于hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL之后，细胞到皮肤成纤维细胞划痕(伤口)的迁移增加。在用hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL治疗伤口之后，胶原蛋白的分泌增加超过50％并且弹性蛋白增加125％至150％。此外，使用qRT-PCR的基因表达示出伤口中的I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和纤连蛋白的增加。芦荟纳米筛的存在促进伤口愈合并且愈合时间比单独使用hWJSC、hWJSC-CM、hWJSC-PCM或hWJSC-CL更快。

在伤口组织活检上进行免疫组织化学以鉴定GFP/RFP标记的hWJSC和hWJSC来源的角质形成细胞标志物(例如，聚丝蛋白、内披蛋白、细胞角蛋白)的存活。

施加敷料的方法

以下提供了可将敷料施加到伤口的方式以及剂量的实例：

i.注射hWJSC(以在100μl PBS中约0.5×10⁶个细胞至10×10⁶个细胞或更多的剂量或者单次或多次周期性地注射到伤口的表皮和真皮中)。

ii.注射hWJSC-CM/hWJSC/PCM/hWJSC-CL(以约100μl的剂量单次或多次周期性地注射到伤口的表皮和真皮中。可将hWJSC-CM/hWJSC-PCM调节约24小时至72小时并且在约50％至100％的浓度下使用。hWJSC-CL中的蛋白质含量范围可为约15μg/L至30μg/L)。

iii.可以以气雾喷雾剂、凝胶剂、乳膏剂、面罩(masques)或新鲜/冷冻-解冻的溶液剂的形式将hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL施用到伤口。

iv.可将hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL浸渗到筛(例如，芦荟纳米筛)(湿和干敷料)中，然后施加至伤口或者可先将筛施加至伤口，然后将hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL浸渗到筛中。纳米筛的给药可以是一次或多次。筛可生物降解(例如，在约1周至4周)。

结果

对于体外和动物实验两者，外科手术和糖尿病伤口愈合的比用皮肤成纤维细胞/角质形成细胞(或其CM/PCM/CL)治疗的伤口或未治疗的对照要快得多。与对照(用皮肤成纤维细胞/角质形成细胞(或其CM/PCM/CL)治疗或未治疗对照)相比，在暴露于hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL之后，伤口中的细胞增殖有所增加。与对照相比，在暴露于hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL之后，细胞到皮肤成纤维细胞划痕(伤口)的迁移增加。在用hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL治疗伤口之后，胶原蛋白的分泌增加超过50％并且弹性蛋白增加125％至150％。此外，使用qRT-PCR的基因表达示出伤口中的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和纤连蛋白的增加。芦荟纳米筛的存在促进伤口愈合并且愈合时间比单独使用hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL更快。

讨论

1.敷料对于多种伤口类型例如(a)外科手术切口伤口(b)创伤伤口(c)糖尿病伤口和溃疡(d)烧伤(e)瘢痕瘤的抑制是有用的。

2.hWJSC分化为有助于愈合和伤口闭合的伤口中的角质形成细胞(新皮肤细胞)。这通过伤口组织活检中GFP标记的hWJSC的存在以及在伤口组织活检中GFP标记的细胞中角质形成细胞标志物(例如，聚丝蛋白、内披蛋白、细胞角蛋白)的增加所证实。

3.伤口中PGE2(来自i-DNA Biotechnology，Singapore的ELISA试剂盒)产生的增加是组织再生的指示。

4.与对照相比(皮肤成纤维细胞/角质形成细胞或其CM/PCM/CL和未治疗的伤口)，hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL降低了伤口炎症并且改善了重塑(re-modelling)。

5.扫描电子显微术示出芦荟纳米筛为hWJSC附着、增殖和分化成角质形成细胞提供了小环境。芦荟纳米筛为充当分子从浸渗的hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL到伤口所有部分的平均分布和缓慢释放的筛网以促进愈合。芦荟纳米筛在约1周至4周生物降解。

6.之前已经报道了hWJSC分泌微RNA和若干生物活性可溶分子，例如细胞因子、糖胺聚糖、胶原蛋白和透明质酸。hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL通过分泌多种刺激成纤维细胞增殖的细胞因子和生长因子来促进伤口愈合(Fong等，J Cell Biochem，113：658-668(2012)；Fong等，Stem Cell Rev and Rep，8：195-209(2012)；Gauthaman等，J Cell Biochem，113：2027-2039(2012))。

7.由hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL释放的胶原蛋白有助于伤口愈合、组织重构、成纤维细胞形成和组织重塑。

8.由hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL分泌的弹性蛋白为伤口提供了机械强度、弹性和复原(resilience)。

9.hWJSC是低免疫原性、非致瘤性的并且不会转化为肿瘤相关的成纤维细胞，因此其在伤口愈合中的使用是有利并且安全的。

10.可在用于人应用的cGMP条件下精制和制备芦荟纳米筛和hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL。hWJSC是非争议的并且可从废弃脐带大量获得。它们是高度增殖的并且可大量放大(scale up)。芦荟纳米筛生产成本低廉，因此最终的敷料是有成本效益的并且可大规模生产以应用。

11.浸渗有hWJSC/hWJSC-CM/hWJSC-PCM/hWJSC-CL的芦荟纳米筛可进一步用抗生素、银颗粒或任何其他有用的分子浸渗来治疗顽固伤口。

实施例2

人脐带沃顿胶质干细胞及其调节的培养基增强切除伤口和糖尿病伤口的愈合

差的伤口愈合是患者的一个挑战性问题并且目前的治疗仅取得有限的成功。由于人口老龄化以及糖尿病和肥胖的增加，该问题日益成为全世界性的。评估了使用从与胚胎和成人间充质干细胞共有独特性质的人脐带沃顿胶质分离的干细胞(hWJSC)对切除伤口和糖尿病伤口的治疗。hWJSC是非争议的、可大量获得的、低免疫原性、非致癌性、分化成角质形成细胞并且分泌用于组织修复的重要分子。与对照相比，当将常规划痕-伤口测定的人皮肤成纤维细胞(CCD)暴露于hWJSC调节的培养基(hWJSC-CM)时，伤口边缘的皮肤成纤维细胞显著更快地增殖并迁移到伤口空间并且示出胶原蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白分泌的增加。与对照相比，当将单独施加的绿色荧光蛋白(GFP)标记的hWJSC(GFP-hWJSC)或hWJSC-CM施用到全厚度的鼠切除伤口和糖尿病伤口时，愈合率和伤口闭合显著更快。在多个时间点收集的伤口组织活检示出绿色GFP-标记的hWJSC、阳性的人角质形成细胞标志物(细胞角蛋白、内披蛋白、聚丝蛋白)的存在以及ICAM-1，TIMP-1和VEGF-A的表达。在组织学上，与对照相比，GFP-hWJSC和hWJSC-CM治疗的伤口示出上皮细胞再形成、增加的血管供应和细胞密度以及增加的皮脂腺和毛囊数量。与CCD相比，hWJSC示出与伤口愈合相关的若干miRNA之表达的增加。本文的研究证明了hWJSC及其提取物通过分化成角质形成细胞和释放重要分子增强了切除伤口和糖尿病伤口的愈合。

本文所述的是使用常规的体外划痕-伤口迁移测定以及在免疫缺陷和糖尿病小鼠中建立的体内全厚度切除伤口和糖尿病伤口进行的hWJSC及其调节的培养基(hWJSC-CM)在伤口愈合中的评估。因为皮肤细胞更新是在MSC控制之下的，所以这是该研究的理论基础。

材料和方法

使用人细胞和动物的伦理批准

该研究使用人脐带的伦理批准以及患者知情同意书是由特定领域审查委员会(the Institutional Domain Specific Review Board，DSRB)，新加坡给出的。根据我们早期公开的方案[Bongso，A and Fong CY等.StemCell Reviews and Reports，9：226-240(2013)]来获取、繁殖和表征hWJSC。市售的皮肤成纤维细胞(CCD-1112sk)(缩写为CCD)购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC-Rockville，MD，USA)并且其使用的伦理批准由新加坡国立大学，审查委员会(theNational University of Singapore，Institutional Review Board，NUS-IRB)给出。所有动物操作均由新加坡国立大学动物护理和使用委员会(theNational University of Singapore Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC)批准。

细胞培养

将足月分娩的脐带收集在转运培养基(补充有抗生素-抗真菌溶液的汉克平衡盐溶液(Hank′s Balanced Salt Solution)，Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)中，于40℃储存并在收集之后12小时内处理。首先将每个带切成2cm的段，将每个这些段纵向切开并且以其内表面向下放置在含有酶促溶液的60mm培养皿中。所述酶促溶液包含在DMEM高葡萄糖培养基(lnvitrogen)中的2mg/ml的I型胶原酶、2mg/ml的IV型胶原酶和100IU/ml的透明质酸酶(Sigma，MO)。不移除脐带血管。然后，将平皿在37℃下孵育30分钟至45分钟以促进沃顿胶质分开和松开到培养基中。然后将胶状沃顿胶质收集到无菌注射器中，接着通过皮下注射针头注射凝胶块来从沃顿胶质分离hWJSC。使用包含补充有20％胎牛血清(FBS)、16ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(MilliporeBioscience Research agents，Temecula，CA)、1％非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1％胰岛素-转铁蛋白-硒和1％抗生素-抗真菌混合物[青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)和两性霉素B(0.25μg/ml](Invitrogen)的DMEM高葡萄糖培养基的hWJSC培养基在无菌组织培养瓶[Becton Dickinson(BD)Franklin Lanes，NJ]中培养分离的hWJSC。将市售的冷冻CCD解冻并培养在无菌组织培养瓶(BD)中之补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和抗生素-抗真菌混合物的DMEM高葡萄糖培养基中。在建立汇合单层之后，用胰蛋白酶-EDTA(TrypLETM Express，lnvitrogen)从塑料平皿分开hWJSC和CCD、解离、洗涤并接种在0.1％明胶包被的组织培养板上的基础培养基中，所述基础培养基不含蛋白质但包含DMEM高葡萄糖、10％knockout血清替代物(KOSR)、1％L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌混合物(KOSR培养基，Invitrogen)用于本研究的体外实验以及DMEM高葡萄糖、1％L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌混合物用于本研究的体内实验。可将不含蛋白质的基础培养基用于体外和体内研究两者以便利用由hWJSC和CCD所释放的多种蛋白质。

用绿色荧光蛋白(GFP)标记hWJSC

用GFP的慢病毒载体感染hWJSC。简言之，通过瞬时转染Lenti-X^TM293T细胞(Clontec Laboratories Inc，Mountain View，CA)来产生慢病毒载体。在转染之前24小时，将hWJSC(5×10⁶个细胞/板)接种到10cm组织培养板中。使用磷酸钙沉淀法进行转染。在转染之后14小时至16小时时，为细胞更换新鲜培养基。经过0.45mm过滤器过滤上清液并且使用流式细胞术测定293T细胞的上清液的效价。在5至10的感染复数(MOI)下用未浓缩的慢病毒上清液来感染hWJSC。

调节的培养基

将第3代至第4代(P3至P4)的hWJSC和CCD在具有/不具有KOSR的基础培养基中生长至80％的汇合度并且在72小时之后将培养基分别分为hWJSC调节的培养基(hWJSC-CM)和CCD调节的培养基(CCD-CM)。在用于实验之前，使用0.22μm Millex-GP注射器式过滤器(Millipore，Billerica，MA)对调节的培养基进行过滤灭菌并且使培养基的pH和重量摩尔渗透压浓度标准化。hWJSC-CM和CCD-CM的平均±SEM pH和重量摩尔渗透压浓度分别为7.75±0.26和332.67±1.20以及7.88±0.18和332.33±0.88。将hWJSC-CM和CCD-CM两者均以1∶1v/v在具有/不具有KOSR的基础培养基中稀释并且以50％hWJSC-CM和50％CCD-CM用于所有实验。我们之前公开的关于hWJSC-CM组合物的工作示出其包含细胞因子、生长因子、糖胺聚糖和细胞粘附分子的家族[Gauthaman K等，Reprod BioMed Online，24：235-246(2012)；Fong CY等，J Cell Biochem，113：658-668(2012)]。

划痕-伤口测定

根据Cory的方法[Cory，G.，Meth Molec Biol，769：25-30(2011)]使用进行常规划痕-伤口测定的相同批CCD来准备若干平皿。简言之，在1％明胶包被的60mm培养皿(Nalgene NUNC International，Rochester，NY)上以0.5×10⁶个细胞的接种密度在KOSR培养基中培养CCD并在37℃下在5％CO₂空气气氛中孵育24小时以产生汇合单层。使用无菌移液管在汇合CCD单层的中线上从顶部到底部垂直地制造线性划痕(0.5mm宽)。然后将有划痕的平皿分为一个治疗臂(hWJSC-CM)和两个对照[CCD-CM和未调节的KOSR培养基(UCM)]。用2ml的hWJSC-CM、CCD-CM和UCM分别接种有划痕的平皿。然后将所有治疗和对照平皿在37℃下在5％CO₂空气气氛中孵育72小时。每次测定进行三次重复。使用倒置相衬光学(inverted phase contrast optics)每24小时有规律地监测CCD从划痕边缘到空白划痕内的迁移和最终的划痕闭合并且在划痕内的至少5个随机场采集数字化图像直到72小时或划痕完全闭合为止。将培养皿上的记号用作参照点以每24小时监测相同的场。使用图像软件程序从数字化图像计算在24小时、48小时和72小时处划痕闭合的平均±SEM百分比程度[26]。使用MTT测定来计算活的CDD数量以找出除了迁移之外各个治疗是否已经刺激了CDD增殖和存活。根据制造商的说明书使用MTT试剂试剂盒[3-(4，5--二甲基噻唑基-2-)-2，5-二苯基四氮唑鎓溴化物](Sigma，St.Louis，MO)进行MTT测定。使用微板ELISA读数器(μQuant-BioTek，Winooski，VT)以630nm的参比波长分光光度测量在570m处的吸光度。

Sircol(胶原蛋白)和Fastin(弹性蛋白)测定

根据制造商的说明书使用Sircol^TM(胶原蛋白测定)和Fastin^TM(弹性蛋白测定)试剂盒(Bioclour，Carrickfergus，UK)来评估和比较治疗臂和对照臂中的总胶原蛋白(I型至V型)和弹性蛋白水平。使用微板ELISA读数器(μQuant-BioTek，Winooski，VT)分光光度测量在555m处的吸光度并且基于标准品的浓度来计算胶原蛋白的浓度。

定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)

使暴露于治疗臂和对照臂的CCD进行qRT-PCR。使用TRIzol^TM试剂(Invitrogen)提取总RNA。使用Nanodrop^TM分光光度计(NanodropTechnologies，Wilmington，DW)测量RNA质量和数量并且在使用SuperScript^TM第一链合成系统(Invitrogen)采用随机六聚体合成第一cDNA链之前，用DNase-I处理所有样品。引物序列取自早期公开的研究并且在表1中给出。使用如之前所述的SYBR绿色用ABI PRISM 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行QRT-PCR分析并且使用比较CT(2-ΔΔCT)法进行相对定量。

在SCID和糖尿病小鼠中的全厚度伤口模型

为了评估hWJSC或hWJSC-CM对切除伤口的愈合，从动物资源中心，西澳大利亚州(the Animal ResoureesCentre，Western Australia)获得了总共45只5周龄至6周龄的雌性严重联合免疫缺陷(severelycombined immunodeficient)(SCID)小鼠。在使得小鼠适应一周之后，使用异氟烷将其麻醉，背部区域剃毛并且使用真皮穿孔器(AccusharpPunch，India)在左和右背侧制造两个8mm全厚度圆形伤口。将所有伤口用Tegaderm(3M)覆盖并用Dermabond^TM(Ethicon)密封边缘。Dermabond^TM有助于防止小鼠移动Tegaderm石膏并且是FDA批准的形成针对细菌之保护屏障的粘合剂。将45只小鼠(90个伤口)分为5个组(9个小鼠/组；18个伤口)并且如下治疗每组中的伤口[Gp 1(治疗)：GFP-hWJSC(在KOSR培养基中的1×10⁶个细胞)；Gp 2(治疗)：hWJSC-CM(100μl)；Gp 3(对照)：GFP-CCD(1×10⁶个细胞)；Gp 4(对照)：CCD-CM(100μl)和Gp 5(对照)：未调节的KOSR培养基(UCM)(100μl)]。使用25G皮下注射针头在伤口边缘若干部位皮内施用细胞和培养基。在12∶12小时明暗周期下，在SPF条件下单独饲养动物并且允许动物接近食物和饮用水。

对于糖尿病伤口评估，在从Jackson Laboratories，USA获得的市售糖尿病小鼠(品系BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J；货号：000642类似IIDM型)中产生的全厚度(6mm)伤口上进行如上的类似实验设计。为糖尿病伤口选择较小尺寸的伤口穿孔器以模拟其他公开的糖尿病鼠研究[Sullivan SR等，Plast Reconstr Surg，113：953-960(2004)；Wu，Y等，StemCells，25：2648-2659(2007)]。在实验之前、实验期间和实验之后测量葡萄糖水平以确认小鼠是糖尿病的。将总共36只小鼠(72个伤口)分为3个组(12只小鼠/组；24个伤口)，并且如下治疗每组中的糖尿病伤口：[Gp1(治疗)：GFP-hWJSC(1×10⁶个细胞)；Gp 2(治疗)：hWJSC-CM(100μl)；Gp 3(对照)：UCM(100μl)]。使用25G皮下注射针头在伤口边缘若干部位皮内施用注射剂。每日观察监测并记录伤口愈合。由相同的操作者在第0天、第7天和第14天对切除伤口采集数字照片。将完全的伤口闭合定义为100％的上皮细胞再形成而没有残留的痂形成。由对治疗不知情的两个独立的观察者使用NIH推荐的公式和图像软件从数字化图像计算愈合率。所用的公式如下：(最初伤口面积-新伤口面积)/最初伤口面积×100[Chen，L等PLOS One，4：e7119(2009)]。在特定的时间点收集伤口组织活检并(i)冷冻进行恒冷箱切片以用于荧光显微术和免疫组织化学；(ii)在10％缓冲福尔马林和4％缓冲低聚甲醛中固定以分别用于组织学和荧光显微术；以及(iii)在液氮中急冻以用于基因组和分子分析。由在这些领域有经验的人员在其各自的实验室以盲检方式(blinded fashion)进行每个这些分析。就组织学而言，对于在治疗和对照组中的每个臂检查至少4个至7个不同的切片。将来自SCID和糖尿病小鼠的正常鼠皮肤样品用作阳性对照以进行比较。

伤口样品中GFP信号和角质形成细胞标志物的鉴定

将在4％缓冲的低聚甲醛中固定的为荧光显微术而收集的伤口样品在PBS中洗涤24小时并且在18％蔗糖中灌注24小时。然后将所述样品封在OCT化合物(Sakura Finetek USA Inc.，CA)中并在-80℃下储存。使用恒冷箱(CM1650；Leica，Germany)切割冷冻切片(5μm)并将其封在包被有多聚赖氨酸(polysine)的玻璃载玻片上(Thermo Scientific)。将切片暴露于10％正常的山羊血清的封闭溶液中，然后与小鼠单克隆抗人聚丝蛋白(Abcam，Cambridge，UK)、抗人内披蛋白(Genway，SanDiego，MO，USA)和抗人细胞角蛋白(克隆AE1/AE3)(Dako，Carpinteria，CA，USA)孵育过夜。然后将所述样品在PBS中洗涤三次(每次10分钟)并暴露于Cy3缀合的第二抗体(Abcam)1小时。最后，将所述样品在PBS中洗涤三次并用Fluoroshield^TM和DAPI(Sigma，St Louis，MO，USA)与盖玻片一起封片。在安装有蓝色(DAPI)、绿色(GFP)和红色(Cy3)滤镜的荧光显微镜(Nikon Eclipse，Ti-S，Nikon Corporation，Tokyo，Japan)下检查切片并用数字照相机拍照。

伤口样品中的基因表达分析

通过定量实时PCR TaqMan方法分析了伤口组织活检中的VEGF-A、TIMP-1和ICAM-1的鼠基因表达。简言之，从治疗和对照伤口样品(n＝3每个臂)分离总RNA，使用TissueLyser LT(Qiagen)和Universal Tissues EZI试剂盒进行均质化并用作使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)之逆转录的底物(1μg)。将TaqMan FastAdvance Mastermix(Applied Biosystems)用于快速实时PCR。用靶VEGF基因(Mm01281449_m1)的TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems)进行VEGF-A表达的定量。使用定量实时PCR进行细胞因子释放(TIMP-1和ICAM-1)的定量。将TaqMan基因表达测定(AppliedBiosystems)用于靶基因TIMP-1(Mm00441818_m1)和ICAM-1(Mm00516023_m1)。将GAPDH的内源参照基因(Mm99999915_g1)用于定量实时PCR。

体外和体内研究的统计学分析

就体外研究而言，使用学生t-检验来比较和分析在治疗组与对照组之间观察到的差异。对于单个测定，将结果表示为来自三次不同重复的平均值±SEM并且认为p＜0.05的值是统计学显著的。就体内研究而言，将结果表示为平均值±SEM并通过ANOVA和具有最小显著差异(LSD)的事后检验进行分析。使用SPSS软件，版本13.0(SPSS，Chicago)确定统计学显著性并且认为P值＜0.05是统计学显著的。

总RNA提取和微阵列

根据制造商的方案使用TRIzol试剂(Invitrogen，Life Technologies，USA)通过单步法从hWJSC和CCD提取总RNA(+miRNA)。使用总RNA(1ug)进行miRNA阵列[Karolina，DS等，PLoS ONE，6：e22839(2011)]，使用miRCURY LNA^TM Power Labeling试剂盒(Exiqon，Denmark)用Hy3染料标记所述总NRA的3’末端并且使用杂交系统在miRCURY LNA^TM阵列(MirBase版本16)上杂交16小时至18小时。然后洗涤微阵列芯片，使用InnoScan700，微阵列扫描仪(Innopsys，Carbonne，France)进行扫描并在Ver4.5软件上分析。

使用6.6Genomics Suite软件(Copyright，Partek Inc.，StLouis，MO)进行微阵列数据的第一阶段分析。简言之，将miRNA的扣除背景的中值信号强度用于分析。针对每个芯片的内源对照组和峰对照(spike-in control)进行第一阶段归一化以避免hWJSC和CCD miRNA谱的技术和实验变化。对归一化的数据进行单因素ANOVA并且根据Benjamini-Hochberg错误发现率(FDR)校正选择差别调节的miRNA。使用由6.6 Genomics Suite软件提供的统计学工具进行所有统计学分析。

结果

hWJSC和CCD的生长和表征

在其使用之前，成功地建立和表征了内部来源(in-house derived)的hWJSC和市售皮肤成纤维细胞(CCD1112sk)(缩写为CCD)细胞系。当将绿色荧光蛋白(GFP)标记的hWJSC和CCD在具有knockout血清替代物(KOSR培养基)之不含蛋白质的基础培养基中培养时，其很好地粘附于塑料，保持其典型的成纤维细胞形态并变为汇合的。GFP-hWJSC对于CD特征标志物(CD10、CD13、CD29、CD44、CD90))为阳性并且满足MSC的标准[Dominici，M等Cytotherapy，8：315-317(2006)]。它们还具有低水平表达的OCT4、NANOG和SOX2。

划痕-伤口测定

与对照[CCD调节的培养基(CCD-CM)和未调节的KOSR培养基(UCM)]相比，当暴露于hWJSC-CM治疗臂时，划痕-伤口测定中的皮肤成纤维细胞早在6小时至8小时就开始从划痕(“伤口”)边缘向伤口空间迁移，然后经过2天(48小时)完全覆盖所述空间(图3A)。与对照相比，hWJSC-CM臂中的平均±SEM百分比伤口闭合率显著更高(p＜0.05)(图3B)。由两个独立的观察者测定迁移到伤口区域中的平均±SEM细胞数分别为：在24小时，60±04(hWJSC-CM)、53±06(CCD-CM)和48±04(UCM)；在48小时，159±13(hWJSC-CM)、88±05(CCD-CM)和92±07(UCM)；以及在72小时，276±17(hWJSC-CM)、142±09(CCD-CM)和163±12(UCM)。治疗臂(hWJSC-CM)的CCD生存力(MTT测定)显著高于对照(图3C)。

胶原蛋白和弹性蛋白(Sircol和Fastin测定)

与对照相比，治疗臂(hWJSC-CM)中，划痕-伤口测定中的胶原蛋白和弹性蛋白浓度是显著更高的(p＜0.05)(图4A和4B)。

I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和纤连蛋白(qRT-PCR)

与对照(CCD-CM和UCM)相比，暴露于治疗臂(hWJSC-CM)的划痕-伤口测定中皮肤成纤维细胞的QRT-PCR示出显著更高的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和纤连蛋白的表达(p＜0.05)。与CCD-CM臂之纤连蛋白的基因表达增加40倍相比，hWJSC-CM臂之纤连蛋白的基因表达增加300倍。与CCD-CM臂的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白增加3倍至4倍相比，hWJSC-CM臂的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白增加17至20倍(图4C、4D和4E)。

小鼠中切除伤口和糖尿病伤口的愈合率和组织学

在施加GFP-hWJSC和hWJSC-CM(治疗臂)以及CCD-CM和UCM(对照)之前和之后，圆形全厚度鼠切除伤口之愈合的宏观数字化图像示出，与对照相比，经过14天，治疗臂中的伤口闭合迅速且完全(图5A)。在数字图像上使用NIH推荐的伤口愈合公式的伤口闭合率示出，与所有对照组(GFP-CCD、CCD-CM和UCM)相比，在第7天GFP-hWJSC和hWJSC-CM治疗组表现出显著更快的伤口闭合。到第14天，GFP-hWJSC治疗的伤口已经愈合并且是最快的(p＜0.05)(图5B)。在第7天和第14天的切除伤口组织活检的组织学分析证实了宏观的和伤口闭合率观察。在第7天，与对照相比，在治疗组(GFP-hWJSC和hWJSC-CM)中之伤口区域的表皮和真皮层示出增加的上皮细胞再形成、细胞构成和脉管系统以及增加的皮脂腺和毛囊数量。在第14天，与对照相比，GFP-hWJSC和hWJSC-CM治疗的伤口具有较厚的表皮以及更多的皮脂腺和毛囊(图5C)。宏观观察、伤口闭合率和组织学证实了，与对照相比，经过28天周期，在GFP-hWJSC和hWJSC-CM治疗小鼠中的糖尿病伤口愈合也是明显增加的(图6A、6B和6C)。

在鼠切除伤口和糖尿病伤口中GFP-hWJSC存活并分化为角质形成细胞

通过免疫荧光显微术由绿色信号证实了于第7天、第14天和第28天在切除伤口和糖尿病伤口中GFP-hWJSC的植入和存活(图7)。与施加到伤口的最初数量相比，伤口组织活检中的GFP-hWJSC数量随着伤口闭合逐渐减少。在第14天和第28天的切除鼠伤口组织活检和糖尿病鼠伤口组织活检的免疫组织化学示出阳性人角质形成细胞标志物(细胞角蛋白、内披蛋白和聚丝蛋白)的存在(图7)。

在切除伤口和糖尿病伤口中的差别基因表达

在伤口开始之后第3天，在用GFP-hWJSC治疗之小鼠的切除伤口中的ICAM-1 mRNA水平显著高于CCD-CM和GFP-CCD臂(p＜0.05)(图8A)。与对照相比，在第3天，在GFP-hWJSC治疗臂中，切除伤口中的TIMP-1表达也是显著上调的(P＜0.05)(图8A)。令人感兴趣的是，当将切除伤口暴露于hWJSC-CM时，在第3天vEGF-A mRNA表达示出6倍的增加(p＜0.05)(图8A)。在第7天，在切除伤口中，与对照相比，GFP-hWJSC和hWJSC-CM治疗的两个臂示出显著更高的ICAM-1、TIMP-l和VEGF-A表达水平(p＜0.05)。在第14天，各组之间切除伤口的ICAM-1的mRNA表达水平没有明显不同，然而，与对照相比，在GFP-hWJSC和hWJSC-CM治疗臂中的VEGF-A水平仍然显著更高(p＜0.05)(图8A)。对于糖尿病伤口，与对照相比，hWJSC-CM治疗臂示出在第7天和第14天显著更高水平的TIMP-1以及在第7天和第28天显著更高水平的VEGF-A。在第28天，糖尿病伤口中GFP-hWJSC臂的VEGF-A水平显著高于对照(p＜0.05)(图8B)。

hWJSC中的miRNA谱

在发现于hWJSC和CCD之间差别调节的487个miRNA之中，82个miRNA在hWJSC中以显著更高的水平表达(FDR，p＜0.1)。在它们之中，发现在hWJSC中仅hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-98、hsa-miR-181a、hsa-miR-196a-3p、hsa-miR-374a、hsa-miR-601、hsa-miR-622、hsa-miR-920、hsa-miR-3915和hsa-miR-3924是上调的。与CCD相比，在hWJSC中剩余的72个miRNA是下调的。然而，在hWJSC中，涉及内皮功能和包括伤口愈合的增殖过程的若干miRNA是高表达的(表2)。

讨论

在本研究中，与对照相比，GFP-hWJSC和hWJSC-CM臂示出显著更多的伤口愈合，表明伤口愈合的直接和间接机制是通过GFP-hWJSC到角质形成细胞的直接分化以及间接地通过释放起始和促进针对组织修复的宿主反应之重要的生物活性分子来发生的。因为伤口组织活检示出绿色GFP-hWJSC信号的存活以及人角质形成细胞标志物(细胞角蛋白、内披蛋白和聚丝蛋白)的物种特异性上调，所以，GFP-hWJSC分化成新的角质形成细胞可能有助于切除伤口和糖尿病伤口中的上皮细胞再形成。本文的结果示出，通过hWJSC-CM将可溶性生物活性分子引入伤口以及通过植入的GFP-hWJSC分泌相同分子为天然皮肤MSC和祖细胞到伤口部位的募集建立了小环境以促进愈合。

在本研究中，在伤口组织活检上的QRT-PCR和物种特异性表面标志物分析有助于鼠细胞和人细胞的存在之间的区分。基于ICAM-1、TIMP-1和VEGF-A的上调，可能的是，hWJSC和hWJSC-CM两者调节伤口中的差别基因表达，造成在伤口愈合期间的细胞粘附、增加的血管生成和上皮形成。由于其在伤口愈合级联反应(例如血管生成、上皮形成和胶原蛋白沉淀)上的多重效应，VEGF-A是独特的[Bao P，等，J Surg Res，153：347-358(2009)]。ICAM-1是在人和小鼠中的伤口愈合期间调节炎性过程的中枢[Yukami，T等，J Lec Biol，82：519-531(2007)；Gay，AN等，JSurg Res，171(1)：e1-e7(2011)]，因为在ICAM-1敲除小鼠模型中，存在对伤口愈合的延迟反应[Nagaoka，T等，Am J Path，157：237-247(2000)]。由我们实验室的细胞因子蛋白质阵列分析示出，与对照相比，通过在72小时hWJSC-CM中的hWJSC以高浓度分泌重要的细胞因子，例如ICAM-1、IL-6、IL-8和TIMP-1[Fong，CY等，113：658-668(2012)]。因此，在hWJSC-CM中的这些细胞因子在早期阶段对加速伤口愈合起着重要作用。hWJSC分泌蛋白体(secrectome)可有助于发动伤口愈合过程以及对内源小鼠细胞因子或生长因子分泌上的后续旁分泌作用。qRT-PCR的结果证明hWJSC对伤口的治疗示出早在第3天的增加的小鼠ICAM-1和TIMP-1表达。此外，在第14天的ICAM-1 mRNA数据与观察到的体内伤口闭合密切相关并且所述数据表明hWJSC产生在伤口愈合的早期阶段期间加速伤口闭合的粘附分子。在CCD-CM治疗的伤口中，在第14天观察到的TIMP-l mRNA表达的增加表明在CCD-CM治疗的小鼠中观察到的伤口愈合延迟可能是由于TIMP-l晚的转录上调。若干公开的报道也已经示出在慢性伤口床中的高水平基质金属蛋白酶(MMP)和低水平MMP的组织抑制剂(TIMP)表明伤口愈合受损[Stevens，LJ，Molec Biol ofthe Cell，23：1068-1079(2012)；Liu，Y，等，DiabCare，32：117-119(2009)]。MMP在伤口愈合中起着主要作用，因为其能破裂分解所有胞外基质(ECM)的组分[Stevens，LJ，Molec Biol of the Cell，23：1068-1079(2012)]。在糖尿病伤口中，存在MMP的上升和TIMP的下降。高水平的MMP-1对于伤口愈合至关重要，而提高水平的MMP-8和MMP-9是有害的。认为MMP-1/TIMP-1比是糖尿病伤口愈合的良好预测[Muller M，等，DiabMed，25：419-426(2008)]。令人感兴趣地注意到，在本研究中，在72小时，hWJSC-CM中过量水平的分泌TIMP-1是明显的并且其在转录水平上与纤连蛋白、胶原蛋白I和胶原蛋白III的基因表达的显著增加相一致，这表明hWJSC分泌影响ECM重塑的内源蛋白质。

胶原蛋白在伤口愈合的炎性阶段期间正常地产生并且由真皮成纤维细胞分泌的ECM有助于伤口重塑。Fathke等[Fathke，C等，Stem Cells，22：812-822(2004)]证明了MSC群产生I型胶原蛋白和III型胶原蛋白，其提供皮肤伤口的长期重构。还报道了在皮肤的早期愈合过程中表达III型胶原蛋白[Zhang，K，等，J Invest Dermatol，104：750-754(1995)]。在本研究中，在暴露于hWJSC-CM之后，通过CCD的胶原蛋白I和胶原蛋白III的上调还表明hWJSC-CM支持伤口愈合。在本研究中，hWJSC-CM还刺激纤连蛋白和弹性蛋白的增加。纤连蛋白是在伤口愈合的增殖阶段期间由真皮成纤维细胞分泌的另一个重要的ECM蛋白质[Bielefeld，KA，JBiol Chem，286：27687-27697(2011)]并且其在为伤口提供必需的机械强度中至关重要[Clark，RAF，J Invest Dermatol，94.128S-134S(1990)]。弹性蛋白为皮肤提供弹性和复原并且这些纤维在胶原蛋白束之间通常是相互编织的。弹性蛋白也涉及在伤口愈合过程中的细胞信号传导和迁移[Rnjak，J等，Tissue Engineering，Pat B，Reviews，17：81-91(2011)]。

已经提出，由凋亡细胞释放的生物活性分子刺激伤口中的内源天然MSC和植入的外源MSC以起始伤口愈合的再生过程[Li，F，等，Sci Signal，3(110)ral3(2010)]。从伤口中受损的凋亡细胞释放的胱天蛋白酶3/7和前列腺素E2(PGE2)刺激受损部位处的MSC以增殖、分化并且最终代替受损的组织(“凤凰涅槃”途径(‘Phoenix rising’pathway))[Li，F等，SciSignal，3(110)ral3(2010)]。缺乏这些胱天蛋白酶的小鼠在皮肤伤口愈合方面有缺陷[Li，F，等，Sci Signal，3(110)ral3(2010)]。更近的证据证实了这样的想法，死亡细胞信号存在于周围组织，并且这样做以引起通过干细胞或祖细胞的修复和再生，所述修复和再生补偿由细胞死亡所造成的任何功能损失[Jager and Fearnhead，Biochem Res Intl，doi：1155/2012/453838(2012)]。这些分子可能在刺激本研究中施加于伤口的hWJSC以增强愈合中起着重要作用。

特异性miRNA簇(miR-106a-363、miR-17-92、miR-106b-25、miR-302-367和miR-21)在hWJSC中高表达。过表达的miR-106a-363和miR-17-92簇涉及细胞增殖和生长，因此其可能在伤口愈合过程中起作用。在功能上，miR-106b-25通过抑制促凋亡基因(例如E2F1、Bim、Fas激活的激酶、CASP7和PTEN)来促进细胞周期进展和过度增殖。促凋亡基因的组合抑制还提供了具有存活和进展或增殖益处的miR-106b-25表达细胞。MiR-106b-25上调可导致对胶原蛋白之增强的结合，从而增加ECM结合。miR-302-367簇靶向TGFβ受体2以增加钙粘着蛋白表达并加速间充质向上皮的转变[Liao，B等，J Biol Chem，286：17359-17364(2011)]。在本研究中，该簇可涉及伤口中增强的上皮细胞再形成。在正常的伤口愈合过程中，miR-21在第8天是上调的并且在糖尿病伤口中是下调的[Madhyastha，R等，Intl Wound J，9：355-361(2012)]。MiR-21在血管平滑肌细胞(VSMC)上表现出双功能(增殖和抗凋亡)[Ji R，等，Circ Res.，100：1579-1588(2007)]。由Li等[Li，F，等，SciSignal，3(110)ral3(2010)]在其伤口愈合的“凤凰涅槃”机制中强调了凋亡的miRNA在促进伤口愈合中的组织再生的作用。与CCD和hBMMSC相比，在hWJSC中，VEGF诱导的miRNA(miR-191、miR-155、miR-31、miR-17-5p、miR-18a和miR-20a)[Suarez，Y等，PNAS，USA，105：14082-14087(2008)]也是显著上调的。VEGF在伤口愈合过程中起着重要作用[Bao，P等，J Surg Res，153：347-358(2009)]。基于本文所述的微阵列数据分析，除了已经发现的涉及增殖、伤口愈合和促凋亡过程的特异性miRNA之外(表1)，还发现在hWJSC中，属于上文所述簇的miRNA也是显著过表达的。因此，在hWJSC和hWJSC-CM存在下所观察到的增强的伤口愈合可能由为伤口愈合过程提供有益作用的若干miRNA所引导。

表1.ECM相关基因和用于qRT-PCR的引物序列

表2.在hWJSC和CCD中的miRNA表达的比较

从三个不同的hWJSC系提取总RNA，并使其进行miRNA微阵列分析。参考CCD计算miRNA表达的倍数变化(hWJSC相比于CCD)。从公开的数据提取各个miRNA的功能注释。

实施例3

浸渗有人脐带沃顿胶质干细胞或其调节的培养基的芦荟-聚己酸内酯纳米支架改善体外和体内的切除伤口和糖尿病伤口的愈合

本文所述的是相比于hBMMSC具有若干优点之来自人脐带沃顿胶质(hWJSC)的MSC的用途，所述优点包括无痛收获、大量获得、低免疫原性、非致瘤性、在体外延长的干性及其分化成角质形成细胞的能力。因为，如本文所示，纳米支架提供了模拟体内干细胞小环境的三维结构模式并且芦荟具有抗菌性，所以评估了浸渗有绿色荧光蛋白(GFP)标记的hWJSC(GFP-hWJSC+AV/PCL)或其调节的培养基(hWJSC-CM+AV/PCL)的芦荟-聚己酸内酯(AV/PCL)纳米支架用于愈合体外和体内的切除伤口和糖尿病伤口的用途。在划痕-伤口测定中，与对照相比，当暴露于GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL时，皮肤成纤维细胞从伤口边缘到伤口中的迁移显著更快，而且胶原蛋白I和胶原蛋白III、弹性蛋白、纤连蛋白、超氧化物歧化酶和金属蛋白酶-1(MMP-1)的分泌增加。与对照相比，随着GFP-hWJSC+AV/PCL或hWJSC-CM+AV/PCL的一种施加，鼠切除伤口和糖尿病伤口示出更快的伤口闭合、上皮细胞再形成、复层鳞状上皮的形成以及数量增加的皮脂腺和毛囊。与对照相比，暴露于GFP-hWJSC+AV/PCL或hWJSC-CM+AV/PCL的切除伤口和糖尿病伤口还示出阳性的角质形成细胞标志物(细胞角蛋白、内披蛋白、聚丝蛋白)以及ICAM-1、TIMP-1和VEGF-A的表达。本文描述的结果示出伤口愈合是通过由hWJSC分泌的生物活性可溶性分子进行的。AV/PCL纳米支架与hWJSC组合似乎具有对于伤口愈合的协同益处。

本文所述的是由浸渗有hWJSC或其调节的培养基(hWJSC-CM)的芦荟-PCL(AV/PCL)纳米支架制造的伤口敷料贴剂用于体外和动物研究中之切除伤口和糖尿病伤口愈合的评估。

材料和方法

细胞培养和调节的培养基的制备

该研究的使用废弃人脐带的伦理批准由特定领域审查委员会(DSRB)，新加坡给出。根据公开的方案[Fong Fong等，Reprod Biomedonline，15：708(2007)；Fong CY等，Reprod Biomed Online，21：391(2010)]来获取和表征hWJSC。人包皮成纤维细胞(CCD-112sk)(缩写为CCD)获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，MD)以作为对照并且其使用的伦理批准由新加坡国立大学，审查委员会(NUS-IRB)给出。使用用于细胞鉴定和追踪目的的绿色荧光蛋白的慢病毒载体来转染hWJSC和CCD(GFP-hWJSC、GFP-CCD)。将GFP-hWJSC和GFP-CCD(3代至4代)生长在补充有/没有血清替代物的无血清knockout基础培养基(KOSR培养基)中以避免血清蛋白质的污染。在72小时之后，分离调节的培养基(hWJSC-CM、CCD-CM)，用0.22μm过滤器(Millipore，Billerica，MA)灭菌并用具有/不具有KOSR的基础培养基稀释至50％。

AV/PCL纳米支架的制造和表征

通过搅拌24小时将聚己酸内酯(PCL)(MW：80,000)(Sigma-Aldrich，MO)和芦荟冻干粉(Zhang Peng International，Singapore)溶解(10％PCL∶5％芦荟)于氯仿∶甲醇(3∶1)(Sigma-Aldrich，MO)中。为了制备形态(topographically)随机化的纳米支架，在将芦荟-PCL混合物加入到连接到18G钝的不锈钢针头的3ml注射器中之后，使用注射泵以3.0ml/小时的流量和施加的25kV电压(Nanon，Mecc，Japan)对其进行电纺。收集纳米纤维并且在23℃以及45％的湿度下将其从旋转转鼓上展开到15mm的盖玻片上。使用扫描电子显微术(SEM)计算纳米纤维的平均±SEM直径。在使用之前，对纳米支架进行真空干燥和灭菌。

伤口敷料贴剂的制备

通过用GFP-hWJSC或GFP-CCD(5×10⁵个细胞)接种无菌纳米支架，接着在37℃下在5％CO₂空气气氛中孵育72小时来制备伤口敷料贴剂(图9)。然后将其在共聚焦显微术(Olympus FV 1000)下检查以确保细胞已经附着并迁移到纳米支架中。对贴剂进行拍照并编译z-叠加图像以提供3D图像。分别地，用hWJSC-CM或CCD-CM浸渗纳米支架72小时(图9)。

体外研究

划痕-伤口测定

采用用于伤口愈合的Cory(2011)常规划痕-伤口测定[Cory G，MethMol Biol，769：25(2011)]。首先，在37℃下，于5％CO₂空气气氛中，在0.1％明胶包被的60mm培养皿(Nalgene NUNC International，Rochester)的KOSR培养基中培养CCD 24小时以产生汇合单层。使用无菌移液管沿着汇合CCD单层的中线从顶部至底部垂直地制造线性划痕(0.5mm宽度)以模拟伤口。然后从培养皿中移除用完的KOSR培养基以及分开的CCD细胞。然后将预先浸泡hWJSC-CM或CCD-CM或未调节的KOSR培养基的纳米支架置于各个伤口上。然后用2ml如下的其各自的培养基填充培养皿：(i)hWJSC-CM+AV/PCL(治疗臂)；(ii)CCD-CM+AV/PCL(对照)和(iii)未调节的KOSR培养基(UCM)+AV/PCL(对照)。然后，将治疗平皿和对照平皿在37℃下在5％CO₂空气气氛中孵育72小时。每次测定进行三次重复。使用倒置相衬光学每24小时有规律地监测CCD从伤口边缘到空白区域内的迁移并且在伤口内的至少5个随机场采集数字化图像72小时或直到伤口完全闭合。将培养皿上的记号用作参照点以每24小时监测相同的场。使用图像软件程序从数字化图像计算在24小时、48小时和72小时处伤口闭合的平均±SEM百分比程度[Walter，MN等，Exp Cell Res，316：1271(2010)]。使用MTT测定来测量划痕伤口中活的CCD的数目以找出除了迁移之外，各个治疗是否已经刺激了CCD的增殖和存活。根据制造商的说明书使用MTT试剂试剂盒[3-(4，5-二甲基噻唑基-2-)-2，5-二苯基四氮唑鎓溴化物](Sigma，St.Louis，MO)进行MTT测定。使用微板ELISA读数器(μQuant-BioTek，Winooski，VT)以630nm的参比波长来分光光度测量在570m处的吸光度。

胶原蛋白、弹性蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)和qRT-PCR分析

根据制造商的说明书分别使用Sircol^TM、Fastin^TM(Biocolor，Carrickfergus)和SOD(Sigma)试剂盒来评估治疗平皿和对照平皿中的总胶原蛋、弹性蛋白和SOD水平。还使治疗平皿和对照平皿的CCD进行使用SYBR绿色和ABI PRISM 7500快速实时PCR系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)的常规qRT-PCR并且使用比较CT(2-ΔΔCT)法进行相对定量。引物序列从早期公开的研究中取得并在表3中示出。

动物研究

切除伤口和糖尿病伤口愈合模型

所有动物操作的批准均由新加坡国立大学动物护理和使用委员会(IACUC)给出。对于切除伤口研究，在异氟烷麻醉之后将雌性严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠(5周至6周)(动物资源中心，西澳大利亚州)剃毛并在左和右背部区域制造两个圆形穿孔组织活检(Accusharp punch，India)全厚度伤口(8mm直径)，将54只小鼠(108个伤口)分为6个组(每组9只小鼠(18个伤口))，并且如下治疗每组中的伤口[Gp1(治疗)：GFP-hWJSC(1×10⁶个细胞)+AV/PCL；Gp2(治疗)：hWJSC-CM(100μl)+AV/PCL；Gp3(对照)：GFP-CCD(1×10⁶个细胞)+AV/PCL；Gp4(对照)：CCD-CM(100μl)+AV/PCL；Gp5(对照)：PBS(100μl)+AV/PCL和Gp6(对照)：未治疗的(无AV/PCL)]。将所有6个组的伤口用Tegaderm(3M)覆盖并用Dermabond^TM(Ethicon)密封边缘以防止动物移动Tegaderm。在12∶12小时明暗周期下，于SPF条件下单独饲养动物。

对于糖尿病伤口研究，在糖尿病小鼠(品系BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J；货号：000642类似IIDM型)(The Jackson Laboratory，Bar Harbor)之剃毛的背部区域(左边和右边)上制造类似的全厚度(6mm直径)伤口。选择较小尺寸的伤口穿孔器以模拟其他公开的鼠糖尿病伤口研究[Wu，Y等，Stem Cells，25：2648(2007)；Sullivan SR等，Plast ReconstrSurg，113：953(2004)]。在实验之前和之后测量葡萄糖水平以确认小鼠是糖尿病的。将总共36只小鼠(72个伤口)分为3个组(每组12只小鼠(24个伤口))，并且如下治疗每组中的伤口：[Gp 1(治疗)：GFP-hWJSC(1×10⁶个细胞)+AV/PCL；Gp 2(治疗)：hWJSC-CM(100μl)+AV/PCL；Gp 3(对照)：UCM(100μl)+AV/PCL]。在第7天、第14天和第28天随机处死来自每个组的四只小鼠以用于伤口愈合分析。

对于切除伤口，在第0天、第7天和第14天采集数字化照片而对于糖尿病伤口，在第0天、第14天和第28天采集数字化照片。由对治疗不知情的两个独立的观察者使用NIH推荐的公式和图像软件(最初伤口面积-新伤口面积)/最初伤口面积×100)[Chen，L等.PLoS ONe，4：e7119(2009)]从数字化图像计算直到伤口闭合的愈合率。

在特定的时间点，收集伤口组织活检并冷冻以用于绿色标记的hWJSC或CCD之存在和存活的荧光显微术以及用于使用小鼠单克隆抗人聚丝蛋白(Abcam，Cambridge)、抗人内披蛋白(Genway，San Diego)和抗人细胞角蛋白(克隆AE1/AE3)(Dako，Carpinteria，CA)的人角质形成细胞标志物(聚丝蛋白、内披蛋白和细胞角蛋白)的免疫组织化学。还将组织活检固定在10％缓冲的福尔马林中以用于组织学并且在液氮中急冻以用于基因组和分子分析。

伤口组织活检的定量实时PCR

使用TaqMan qRT-PCR方案检查伤口组织活检中的ICAM-1、TIMP-1和VEGF-A的mRNA表达。简言之，使用TissueLyser LT(Qiagen，Valencia，CA)机器将伤口组织活检均质化。然后，使用EZ1RNA通用组织试剂盒(Qiagen)来提取总RNA并且使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Carlsbad，CA)来进行逆转录。将TaqMan FastAdvance Mastermix(Applied Biosystems)分别用于细胞因子释放和VEGF表达(TIMP-1：Mm00441818_m1，ICAM-1：Mm00516023_m1和VEGF-A：Mm01281449_m1)的定量。针对内源参照基因GAPDH：Mm99999915_g1进行所有TaqMan基因表达测定。

统计学分析

对于单个测定，将体外研究的结果表示为来自三次重复的平均值±SEM并且使用学生t-检验来比较治疗与对照之间的差异。对于体内分析，通过ANOVA和具有Tukey′s真实显著差异(Honestly SignificantDifference，HSD)的事后检验来分析伤口闭合的平均±SEM百分比。认为p值＜0.05是统计学显著的。使用SPSS软件，版本13.0(SPSS，Chicago，IL)确定统计学显著性。

结果

AV/PCL与hWJSC的相互作用

扫描电子显微术示出在我们实验室中，在旋转转鼓上的AV/PCL纳米纤维电纺丝产生了具有448±65nm之平均±SEM纤维直径、0.5mm的厚度以及90％孔隙度的随机化筛样形态(图10A、10B)。有足够的小环境来用于hWJSC的附着、迁移和生长(图10C)。通过共聚焦激光显微成像编译的z-叠加图像示出，48小时至72小时之后，在培养物中，GFP-hWJSC能够迁移到纳米支架内的51.3μm深度(图10D、10E)。可将纳米支架制造成不同形状以用于不同大小的伤口(图10F)。

划痕-伤口测定

在治疗平皿和对照平皿中，CCD早在6小时至8小时就开始从伤口边缘迁移到空白区域中(图11A)。与对照相比，在hWJSC-CM+AV/PCL治疗臂中，细胞迁移更加明显并且经过48小时至72小时伤口完全被覆盖(图11A)。与对照相比，在hWJSC-CM+AV/PCL治疗臂中，伤口闭合率(平均值±SEM％)显著更大(p＜0.05)(图11B)。由两个独立的观察者测定的hWJSC-CM+AV/PCL(治疗)、CCD-CM+AV/PCL(对照)和UCM+AV/PCL(对照)之迁移到划痕区域中的实际平均±SEM CCD数分另为(24小时)：22±02、19±02、17±02；(48小时)：58±05、32±02、33±03；(72小时)：322±04、255±04和158±05。来自hWJSC-CM+AV/PCL治疗臂的CCD生存力(MTT测定)显著高于对照(图11C)。

与对照相比，在治疗组(hWJSC-CM+AV/PCL)中，划痕-伤口测定中分泌的总胶原蛋白、弹性蛋白和SOD浓度水平是显著更高的(p＜0.05)(图11D、11E、11F)。

与对照相比，在治疗臂(hWJSC-CM+AV/PCL)中的划痕-伤口测定的CCD示出显著更高的胶原蛋白HI和纤连蛋白表达(p＜0.05)，分别具有90倍和31倍的增加(图11G、11H)。尽管hWJSC-CM+AV/PCL治疗臂的MMP-1表达是增加的，但是所述增加与对照没有显著差异(图11I)。

体内伤口愈合

在图12A中示出了治疗组与对照组之间的切除伤口的宏观数字化图像之比较。由两个独立的观察者密切监测的伤口闭合示出，与对照相比，在hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL臂中到第14天的迅速伤口闭合(图12A)。通过伤口愈合公式在数字化图像上测定的平均±SEM百分比伤口闭合率[Chen L，等，PLoS ONe，4：e7119(2009)]示出，在第7天，与对照相比，hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL治疗臂表现出更快的伤口闭合，其中hWJSCs+AV/PCL臂的闭合率是显著不同于对照的(p＜0.05)。在第14天，与所有其他臂相比，hWJSC+AV/PCL治疗臂中的伤口闭合率是显著更大的(图12B)。在第3天，治疗组的伤口组织活检的组织学检查证明增加的肉芽形成和上皮细胞再形成以及少量皮脂腺和毛囊的出现。在另一方面，对照的伤口组织活检示出断裂的上皮、真皮中白细胞、淋巴细胞和成纤维细胞的浸润并且伤口表面覆盖有血液、纤维蛋白和渗出物(图12C)。在第7天和第14天，与对照相比，在治疗臂(GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL)中，伤口表皮示出复层鳞状上皮的形成、增加数量的皮脂腺和毛囊以及更多的细胞构成和脉管系统(图12C)。

在图13A、13B中示出了治疗组与对照组之间的糖尿病伤口的宏观数字化图像和伤口闭合率之比较。到第28天，与UCM+AV/PCL(对照)相比，GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL治疗的小鼠示出糖尿病伤口的完全的伤口闭合(图13A)。在第7天，GFP-hWJSC+AV/PCL治疗臂之伤口闭合的平均±SEM百分比率显著大于对照并且在第14天，hWJSC-CM+AV/PCL治疗组的伤口闭合率显著大于对照(p＜0.05)(图13B)。在第7天，与对照相比，在治疗组中，糖尿病伤口组织活检的组织学检查示出上皮细胞再形成、少量皮脂腺和一些毛囊。在第14天和第28天，与对照相比，治疗组(GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL)示出复层鳞状上皮的形成、增加的细胞构成和脉管系统以及增加的皮脂腺和毛囊数量。在第28天，没有接受任何治疗的对照的糖尿病伤口没有复层鳞状上皮、仅有少量皮脂腺和毛囊，从而不展示出典型的正常皮肤表型(图13C)。在图13D中示出了为表皮分化之标志物的细胞角蛋白、内披蛋白和聚丝蛋白的免疫荧光染色[Kawachi Y等，Eur J Dermatol，21：1016(2011)]。在第14天和第28天，在db/db小鼠中存在细胞角蛋白的阳性染色(图13D，a、d：短箭头)。在第14天，内披蛋白(表皮晚期分化的标志物)变得明显(图13D，b：短箭头)并且在第28天，出现聚丝蛋白(终末分化的颗粒层角质形成细胞的标志物)(图13D，f：短箭头)。

在切除伤口和糖尿病伤口中的差别基因表达

在第7天，在用GFP-hWJSC+AV/PCL治疗之小鼠的切除伤口中的ICAM-1 mRNA水平显著高于对照，而在第14天，hWJSC-CM+AV/PCL组的TIMP-1和VEGF-A表达显著高于所有其他组(p＜0.05)(图14A)。对于糖尿病伤口，在第14天，与其他组相比，两个治疗组(GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL)的TIMP-1水平是显著更高的，然而在第14天，与其他组相比，仅GFP-hWJSC+AV/PCL治疗组的VEGF-A表达是显著更高的(p＜0.05)(图14B)。

讨论

本文示出的是浸渗有hWJSC或其调节的培养基之AV/PCL纳米支架作为新的干或湿的伤口敷料用于外科手术伤口和糖尿病伤口的益处。因为细胞在三维线索(cue)的存在下表现最好，所以在本研究的两个治疗组(hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL)中伤口愈合效率的增强有可能归因于干细胞与纳米支架的协同效应，其中纳米支架提供干细胞小环境以及hWJSC附着、分化的孔隙度并允许其分泌物渗透到伤口床中。

因为hWJSC及其调节的培养基两者均示出相比于对照显著更好的伤口愈合，所以细胞与细胞接触和非细胞接触机制(通过释放重要分子)有可能促进伤口愈合过程。

在初步研究中，观察到与hBMMSC相比，在hWJSC中，特异性miRNA簇(miR-106a-363、miR-17-92、miR-106b-25、miR-302-367和miR-21)是高表达的。miR-106a-363和miR-17-92簇涉及细胞增殖和生长，因此其在伤口愈合过程中起作用。MiR-106b-25上调导致与胶原蛋白和ECM的结合增加，而已知miR-302-367靶向TGFβ受体2以促进E-钙粘着蛋白表达并促进间充质向上皮的转变从而提高上皮细胞再形成[Liao B等，J Biol Chem，286：17359(2011)]。Madhyastha及同事[Madhyastha R等，Int Wound J，9：355(2012)]示出在正常伤口愈合过程中在第8天miR-21是上调的，并且Ji等证明其在血管平滑肌细胞上表现出增殖和抗凋亡性质，由此增加血管发生从而更好地愈合伤口[Ji R等，CircRes 100：1579(2007)]。在本研究中，伤口组织活检的基因表达谱示出VEGF-A的上调。令人感兴趣的是，先导性研究示出，与CCD和hBMMSC相比，在hWJSC中，VEGF诱导的miRNA(miR-191、miR-155、miR-31、miR-17-5p、miR-18a和miR-20a)是显著上调的。还公知的是，VEGF在伤口愈合过程中起着重要作用[Bao，P等，JSurg Res，153：347(2009)]。

ICAM-1是人和小鼠中伤口愈合期间炎性过程调节的中枢并且有助于ECM的细胞粘附。在慢性伤口床中，伤口愈合受损也与高水平的基质金属蛋白酶(MMP)以及低水平的MMP组织抑制剂(TIMP)相关[LiuY等，DiabCare，32：117(2009)；Stevens LJ等，Mol Biol Cell，23：1068(2012)]。令人感兴趣地注意到，在本研究中，hWJSC-CM中的高水平TIMP-1已经逆转了MMP/TIMP比从而有利于伤口愈合，这在转录水平上是协同的，而且纤连蛋白、胶原蛋白I和胶原蛋白III的基因表达的增加表明hWJSC释放影响ECM重塑的蛋白质。

伤口中的成纤维细胞通过产生ECM和细胞因子来调节成纤维细胞-角质形成细胞-内皮的相互作用[Jeon YK等，Wound Repair Reg，18：655(2010)]，并且本文示出的是hWJSC释放白介素家族的多种细胞因子[FongCY等，Stem cell rev，7：1(2011)]。ECM包含提供成纤维细胞迁移的纤连蛋白、以及提供组织强度和复原的胶原蛋白和弹性蛋白。在本研究中，以高浓度产生这三种蛋白质，这表明其有助于伤口愈合过程。

本文提供的结果示出WJSC(例如，hWJSC)及其提取物是用于伤口愈合的人骨髓间质干细胞(hBMMSC)的更好替代物，其给出本文所述的若干优点。此外，加入纳米支架作为伤口敷料为缓慢愈合以及难以愈合的慢性伤口提供了协同益处。

表3.用于定量逆转录PCR基因表达分析的引物序列

MMP：基质金属蛋白酶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

实施例4

人沃顿胶质干细胞及其提取物抑制人瘢痕瘤细胞的生长

瘢痕瘤是生长在人伤口边缘外的坚硬橡胶状肿块(growth)。其对于患者是社会精神的负担并且目前的治疗仅取得有限成功。对于其发病机制，已经提出良性肿瘤样间充质干细胞(MSC)表型驱动失控的细胞增殖。如本文所述，探究了hWJSC、其调节的培养基(hWJSC-CM)和裂解物(hWJSC-CL)在抑制体外和体内的瘢痕瘤细胞生长上的作用。瘢痕瘤细胞在贴壁培养和球体培养(sphere culture)下容易生长并且示出典型的MSC-CD标志物(CD29、CD44、CD73、CD90和CD105)的上调。当将它们暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL时，其在体外的生长和CD标志物水平显著下降，这表明干性的丧失。在划痕-伤口测定中，治疗的瘢痕瘤细胞还示出细胞生存力(MTT)的显著降低，膜联蛋白、V-FITC和TUNEL阳性细胞的增加，在亚-G1期的细胞周期中断以及迁移抑制。免疫组织化学示出肿瘤相关成纤维细胞(TAF)的显著减少和自噬相关标志物(BECLIN-1和LC3B)的增加。qRT-PCR示出抗凋亡相关基因(BCL2和SURVIVIN)的下调以及促凋亡和自噬相关基因(BAX、ATG5、ATG7和BECLIN-1)的上调。开发了成功的人异体移植瘢痕疙瘤小鼠模型并且皮下施用单剂量的hWJSC，其中在4只小鼠的所有8个注射部位中瘢痕瘤细胞和基质胶均未导致瘢痕瘤肿瘤。所述结果表明，hWJSC或由其分泌的分子在瘢痕瘤治疗中是有治疗价值的。

材料和方法

细胞培养

人沃顿胶质干细胞

对于使用来自知情同意之患者的人脐带的伦理批准由特定领域审查委员会(DSRB)，新加坡给出。根据我们公开的方案来获取和表征hWJSC(Fong等Reprod Biomed Online，21：391-401，2010)。将脐带收集在转运培养基(补充有抗生素-抗真菌溶液的汉克平衡盐溶液，Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)中，于40℃下储存并在收集之后12小时内处理。首先将每个带切成2cm的段，将这些段各自纵向切开并且以其内表面向下放置在含有酶促溶液的60mm培养皿中。所述酶促溶液包含在DMEM高葡萄糖培养基(lnvitrogen)中的2mg/ml的I型胶原酶、2mg/ml的IV型胶原酶和100IU/ml的透明质酸酶(Sigma，MO)。不移除脐带血管。然后，将平皿在37℃下孵育30分钟至45分钟以促进沃顿胶质分开和脱开到培养基中。然后将胶状沃顿胶质收集到无菌注射器中并通过皮下注射针头来回地通过以分离hWJSC。使用包含补充有20％胎牛血清(FBS)、16ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(Millipore BioscienceResearch agents，Temecula，CA)、1％非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1％胰岛素-转铁蛋白-硒和1％抗生素-抗真菌混合物[青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)和两性霉素B(0.25μg/ml](Invitrogen)的DMEM高葡萄糖培养基的hWJSC培养基在无菌组织培养瓶[Becton Dickinson(BD)Franklin Lanes，NJ]中培养分离的hWJSC。在建立汇合单层之后，用胰蛋白酶-EDTA(TrypLETM Express，lnvitrogen)从塑料平皿分开hWJSC、解离、洗涤并接种在0.1％明胶包被的组织培养板上的基础培养基中，所述基础培养基不含蛋白质但包含DMEM高葡萄糖、10％knockout血清替代物(KOSR)、1％L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌混合物(KOSR培养基，Invitrogen)用于本研究的所有实验。使用不含蛋白质的基础培养基以便利用由hWJSC所释放的多种蛋白质。

人瘢痕瘤细胞

对于使用来自知情同意之患者的瘢痕瘤组织的伦理批准也由特定领域审查委员会(DSRB)，新加坡给出。在HBSS(Invitrogen)中收集瘢痕瘤组织并且根据Zhang等(2009)的方法建立贴壁培养和球形培养。将样品切成2cm至3cm的段，用新鲜的HBSS洗涤，然后暴露于3mg/ml的分散酶(Invitrogen)在4℃下过夜。在孵育过夜之后，手工移除表皮并且将真皮切碎成小段(1mm³)。将所述段置于I型胶原酶(4mg/ml)(Sigma Chemical Co，MO)中并在37℃下在5％CO₂空气气氛中孵育2小时。在酶促消化之后，将细胞悬液在300×g下离心5分钟并将细胞沉淀重悬于补充有10％胎牛血清(FBS)(Biochrom AG，Berlin，Germany)的DMEM低葡萄糖(Invitrogen)中。然后，将细胞悬液经过70μm的细胞过滤器(strainer)[Becton Dickinson(BD)，USA]过滤，在300×g下离心5分钟，弃去上清液并将细胞培养在两个不同条件下(贴壁培养和球体培养)。

贴壁培养

将瘢痕瘤细胞重悬于补充有10％FBS、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、100mM非必需氨基酸(NEAA)、550μM 2-巯基乙醇的DMEM培养基(Invitrogen)中并接种到100mm塑料组织培养皿(BD)中。将平皿在37℃下在5％CO₂空气气氛中孵育并且当其附着到塑料平皿上时，在倒置相衬光学下每日监测其形态和生长并照相。

球体培养

将瘢痕瘤细胞重悬于DMEM低葡萄糖和Ham′s F12(MilliporeBioscience Research Agents，Temecula，CA)的等份(v/v)组合中，然后用40ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF-2)(Millipore)、20ng/ml表皮生长因子(EGF)(MiltenyI Biotech Asia Pacific Pte Ltd)、抗生素/抗真菌混合物(Invitrogen)补充，接着接种到无菌6孔板(BD)中。将所述板在37℃下在5％CO₂空气气氛中孵育并且当细胞开始产生球体时，在倒置相衬光学下监测其形态和生长并照相。

人包皮成纤维细胞

人包皮成纤维细胞(CCD-112sk)(缩写为CCD)获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，MD)以作为对照并且使用其的伦理批准由新加坡国立大学伦理审查委员会(National University of SingaporeInstitutional Review Board)(NUSIRB)给出。将市售的冷冻CCD解冻并培养在无菌组织培养瓶(BD)中之补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和抗生素-抗真菌混合物的DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen)中。

用绿色荧光蛋白(GFP)标记hWJSC

用绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体转染hWJSC。简言之，通过Lenti-X^TM 293T细胞(Clontec Laboratories Inc，Mountain View，CA)的瞬时转染来产生慢病毒载体。在转染之前24小时，将hWJSC(5×10⁶细胞/板)接种到10cm组织培养板中。使用磷酸钙沉淀法进行转染。在转染之后14小时至16小时，为细胞更换新鲜培养基。经过0.45mm过滤器过滤上清液并且使用流式细胞术测定293T细胞的上清液的效价。在5至10的感染复数(MOI)下用未浓缩的慢病毒上清液来感染hWJSC。

hWJSC和CCD调节的培养基和无细胞裂解物的制备

将第3代至第4代(P3至P4)的hWJSC和CCD在具有/不具有KOSR的基础培养基中生长至80％的汇合度并且在72小时之后将培养基各自分为hWJSC调节的培养基(hWJSC-CM)和CCD调节的培养基(CCD-CM)。在用于实验之前，使用0.22μm Millex-GP注射器式过滤器(Millipore，Billerica，MA)对调节的培养基进行过滤灭菌并且使培养基的pH和重量摩尔渗透压浓度标准化。将hWJSC-CM和CCDCM两者均以1∶1v/v在具有/不具有KOSR的基础培养基中稀释并且以50％hWJSC-CM和50％CCD-CM用于所有实验。

使用含有蛋白酶抑制剂混合物和二硫苏糖醇的哺乳动物细胞提取试剂盒(BioVision，Mountain View，CA)从hWJSC和CCD的早期传代(P3至P4)制备hWJSC无细胞裂解物和CCD无细胞裂解物(hWJSC-CL；CCD-CL)。简言之，将培养的细胞用不含钙和镁的磷酸缓冲盐水(PBS(-))洗涤一次，用胰蛋白酶(TrypLETM Express，Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)解离并在500g离心5分钟以获得细胞沉淀。将所述沉淀重悬于100μl由试剂盒提供的细胞裂解缓冲液中并上下吹打数次，然后在冰中孵育15分钟。然后将内容物在12,000g离心5分钟(Eppendorf，Germany)并且分离澄清的上清液(无细胞裂解物)并将其储存在-80℃下直到使用。在KOSR培养基中稀释hWJSC-CL以获得使用Nanodrop^TM分光光度计(Nanodrop Technologies，Wilmington，DW)进行测量的15μg/ml的总蛋白质含量。

瘢痕瘤细胞与hWJSC、hWJSC-CM和hWJSC-CL的相互作用

实验设计

将瘢痕瘤细胞的贴壁培养物分别暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL(治疗)。对照为暴露于类似浓度的(i)CCD-CM，(ii)CCD-CL和(iii)KOSR培养基(未治疗对照)的瘢痕瘤培养物。每日监测所有平皿，持续72小时并且使细胞进行形态学变化的比较分析(倒置相衬光学)、生存力(MTT测定)、细胞周期行为(流式细胞术)、CD标志物(FACS)、细胞死亡(膜联蛋白V-PI)、TUNEL测定、划痕-伤口测定、角质形成细胞标志物和TAF标志物以及基因表达谱(qRT-PCR)。

使用Social Sciences的统计学程序包(SPSS 13)采用单因素ANOVA以及Bonferroni′s多重比较事后分析进行治疗臂与对照臂之间的统计学显著差异的所有评估。对于单个实验，将结果表示为来自三次不同重复的平均值±SEM并且认为p＜0.05的值是统计学显著的。

细胞形态学

使用倒置相衬光学(Nikon Instruments，Tokyo，Japan)每日监测暴露于治疗和对照的瘢痕瘤细胞的生长，持续三天(72小时)并且在低放大率和高放大率下捕获细胞死亡之形态学变化的图像。

CD标志物分析

用胰蛋白酶将治疗平皿和对照平皿的瘢痕瘤细胞解离为单个细胞，在PBS(-)中洗涤并且用10％普通山羊血清(NGS)(Invitrogen)封闭30分钟以防止非特异性结合。然后，将细胞与一系列CD标志物(即，CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105(Biolegend，SanDiego，CA))的第一抗体孵育1小时，接着与Alexa488(1∶750)第二抗体(Invitrogen)孵育30分钟。最后，将细胞在PBS(-)中洗涤，重悬于10％NGS中并且使用70μm尼龙过滤器(BD)过滤以移除任何细胞团(cell clump)，并通过荧光激活细胞分选(FACS)使用CyAn^TM ADP分析仪(Beckman Coulter，Fullerton，CA)进行分析。

细胞生存力

根据制造商的说明书使用MTT试剂试剂盒[3-(4，5-二甲基噻唑基-2-)-2，5-二苯基四氮唑鎓溴化物](Sigma，St.Louis，MO)来评估治疗平皿和对照平皿中瘢痕瘤细胞的生存力。简言之，将10μl MTT试剂(0.5mg/ml的最终浓度)添加至培养平皿并且孵育4小时直到看见紫色沉淀。分离上清液并且将100μl的洗涤试剂添加至细胞沉淀并在室温下在黑暗中孵育2小时。使用微板ELISA读数器(μQuant-BioTek，Winooski，VT)以630nm的参比波长来分光光度测量在570nm处的吸光度。

细胞周期分析

使用碘化丙啶(PI)染色的瘢痕瘤细胞的流式细胞术比较治疗与对照之间的细胞周期分析。简言之，将细胞用胰蛋白酶解离、洗涤并用冰冷的70％乙醇固定。用在含有0.1％TritonX-100和50μg/ml RNAse-A之PBS中的50μg/ml PI将固定的细胞染色，然后使用流式细胞仪(Epics-Altra，Beckman Coulter，USA)进行分析。

膜联蛋白V-FITC测定

在暴露于治疗和对照的瘢痕瘤细胞上进行膜联蛋白V-FITC测定以评估凋亡速率。简言之，将瘢痕瘤细胞用胰蛋白酶解离，用PBS(-)洗涤一次然后用膜联蛋白V结合缓冲液(1×)洗涤一次。在室温下，将细胞用5μl膜联蛋白V-FITC染色15分钟，用PI(1μg/mL)复染色并使用CyAn^TM ADP分析仪进行分析。

TUNEL测定

用检测TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)介导的dUDP缺口末端标记(TUNEL)阳性细胞之DeadEndTM Fluorometric TUNEL系统试剂盒(Promega Corp，WI，USA)来评估导致暴露于治疗和对照的瘢痕瘤细胞中导致凋亡的DNA断裂的程度。简言之，将瘢痕瘤细胞解离、洗涤并用4％无甲醇甲醛溶液在4℃下固定25分钟，接着添加Triton X-100溶液在4℃下固定5分钟。通过在37℃下在黑暗中于加湿的室中用二氢荧光素-12dUTP和TdT处理细胞1小时来进行DNA片段的标记。通过添加氯化钠-柠檬酸钠溶液来终止反应，将细胞洗涤三次，然后在室温下，在黑暗中，用在含有无DNase的RNase(250μg/ml)之PBS中的PI（1μg/ml)染色15分钟。在荧光显微镜下分析TUNEL阳性细胞。

划痕-伤口测定

在常规划痕-伤口测定(Cory，Meth in Molec Biol，769：25-30(2011))中将瘢痕瘤细胞单层暴露于hWJSC-CM以找出其细胞迁移和生长是否被抑制。首先，将瘢痕瘤细胞以0.5×10⁶个细胞的密度接种于60mm培养皿(Nalgene NUNC International，Rochester，NY)中并在24小时至48小时内建立单层。用2ml带刻度的血清移液管在中线上从顶部到底部垂直地在瘢痕瘤单层上制造均匀的线性划痕。用PBS轻轻洗去细胞碎片并将有划痕的平皿的培养基改变为治疗(hWJSC-CM)和对照(CCD-CM；未治疗)。将平皿在37℃下在5％CO₂空气气氛中孵育72小时并且在倒置相衬光学下有规律地监测细胞从划痕边缘的迁移并照相直到空白区域完全闭合。使用倒置相衬光学每24小时采集划痕内至少5个随机场的数字化图像直到72小时或划痕完全闭合。将培养皿上的记号用作参照点以每24小时监测相同的场。使用图像软件程序从数字化图像计算在24小时、48小时和72小时处划痕闭合的平均±SEM百分比程度(Walter，等，ExpCell Res，316：1271-1281(2010))。每次测定进行三次重复。

基因表达

使用免疫组织化学和定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)来评估在治疗平皿和对照平皿中角质形成细胞标志物和TAF标志物的变化以及凋亡基因和自噬基因的表达以了解暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的瘢痕瘤细胞的行为变化。

就免疫组织化学而言，使用其各自的第一单克隆抗体和多克隆抗体来分析瘢痕瘤细胞的角质形成细胞标志物(细胞角蛋白、内披蛋白、聚丝蛋白)、TAF标志物[成纤维细胞特异性蛋白质(FSP)、血小板反应蛋白(Tn-C)和VEGF]以及自噬标志物(Beclin-1、LC3B)。将瘢痕瘤细胞在PBS中洗涤并在室温下用4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；0.5μg/ml)(分子探针，Invitrogen)孵育5分钟，再次用PBS洗涤，然后使用荧光显微术进行分析。

就qRT-PCR分析而言，使用TRIzolTM试剂(Invitrogen)来提取治疗平皿和对照平皿中之瘢痕瘤细胞的总RNA。使用NanodropTM分光光度计(Nanodrop technologies，Wilmington，DW)来测量RNA质量与数量并且在使用SuperScriptTM第一链合成系统(Invitrogen)采用随机六聚体合成第一cDNA链之前，用DNase-I处理所有样品。引物序列取自早期公开的研究(Gauthaman等J Cell Biochem，113：2027-2039(2012b)；Subramanian等J Cell Biochem，113：1886-1895(2012))。使用SYBR绿色用ABI PRISM 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems，FosterCity，CA)进行qRT-PCR分析并且使用比较CT(2-ΔΔCT)法进行相对定量。

体内研究

使用人瘢痕瘤异体移植小鼠模型来评估通过hWJSC在体内的瘢痕瘤细胞抑制。在由新加坡国立大学动物护理和使用委员会(NUS-IACUC)批准之后，进行所有动物操作。将来自动物研究中心，新加坡(the AnimalResearch Centre，Singapore)的8只7周龄至8周龄的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠分为每组四只小鼠的两组：Gp1(治疗)：瘢痕瘤细胞(4×10⁶)+hWJSC(4×10⁶)+基质胶；Gp2(对照)：瘢痕瘤细胞(4×10⁶)+基质胶。以100μl基质胶的最终体积施用细胞。在每只小鼠中，将细胞和基质胶注射到两个后肢的皮下区域中。在研究末期(7周)使用过量吸入二氧化碳来处死动物。从皮下区域收集任意瘢痕瘤肿瘤样块以用于组织学分析。

结果

瘢痕瘤细胞表征

在暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL之前

未暴露于治疗(hWJSC-CM和hWJSC-CL)的未治疗瘢痕瘤细胞很好地附着于塑料并变为具有长纺锤形成纤维细胞形态的汇合单层(图15A)，并且在球体培养物中的未治疗瘢痕瘤细胞集簇在一起以形成若干不同大小的半透明球体(图15B)。在贴壁培养和球体培养中的瘢痕瘤细胞的流式细胞术分析示出间充质干细胞(MSC)CD标志物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105的高水平表达(贴壁培养：94.06±1.08％至98.38±1.31％；球体培养：81.01±1.17％至92.48±2.63％)以及CD14、CD34和CD45的低水平表达(贴壁培养：1.92±0.61％至23.11±0.89％；球体培养：11.33±0.74％至19.38±1.04％)(图15C、15D)。

在暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL之后

与对照相比，暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的贴壁培养的瘢痕瘤细胞示出减少的有丝分裂细胞数目(图16A)。与对照(CCD-CL：98.43±2.76％至99.79±0.18％；CCD-CM：96.88±2.07％至98.86±1.33％；未治疗的：94.06±1.08％至98.38±1.31％)相比，当将贴壁培养中的瘢痕瘤细胞暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL时，高表达的MSCCD标志物(CD29、CD44、CD73、CD90和CD105)分别显著降低到74.63±3.48％至86.66±1.97％和69.75±4.57％至78.22±3.97％(p＜0.05)(图16B)。

细胞生存力

与其各自的对照相比，暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的瘢痕瘤细胞的MTT测定在72小时处示出细胞生存力降低。对于未治疗的，细胞生存力的平均±SEM降低为0.46±0.03；对于CCD-CM，为0.58±0.02；对于CCDCL，为0.42±0.02；对于hWJSC-CM，为0.36±0.02以及对于hWJSC-CL，为0.26±0.19。治疗组与对照组之间的这些细胞生存力的平均降低是统计学显著的(图17A)。

细胞周期分析

在对照平皿中的瘢痕瘤细胞示出正常的细胞周期谱，而与其各自的对照相比，在治疗(hWJSC-CM和hWJSC-CL)中培养的细胞示出在亚G1和G2/M期中增加的峰。亚-G1期的百分比增加为hWJSC-CM：11.18±2.34％和hWJSC-CL：15.16±3.07％并且G2/M期的百分比增加为hWJSC-CM：17.80±1.94％和hWJSC-CL：18.09±2.74％(图17B至17F)。

膜联蛋白V-FITC测定

将用过氧化氢(10mM)处理2小时至3小时的瘢痕瘤细胞用作阳性对照，并且与未染色的阴性对照相比，它们示出对于膜联蛋白V-FITC的阳性染色具有直方图的横向位移。与对照相比，暴露于hWJSCCM和hWJSC-CL治疗之瘢痕瘤细胞的等值线图示出膜联蛋白V-FITC阳性细胞的显著更大的平均±SEM百分比(19.75±2.7至27.81±2.7相比于2.44±1.3至6.09±3.4)(p＜0.05)(图18A)。

TUNEL测定

用DNAse处理瘢痕瘤细胞以用作示出对于TUNEL测定阳性染色的阳性对照。与对照相比，暴露于治疗(hWJSC-CM和hWJSC-CL)的瘢痕瘤细胞示出阳性的TUNEL细胞(图18B)。

抓痕-伤口测定

对照(未治疗的和CCD-CM)的瘢痕瘤细胞从划痕的边缘迁移并在48小时内完全覆盖空白区域，而hWJSC-CM治疗的平皿的瘢痕瘤细胞迁移较慢并且减少，其在48小时之后未完全覆盖划痕区域(图19A)。

免疫组织化学

未治疗瘢痕瘤细胞的免疫组织化学示出阳性的人角质形成细胞相关标志物(细胞角蛋白、内披蛋白和聚丝蛋白)(图19B)以及TAF标志物(FSP、Tn-C和VEGF)(图19C)。然而，与对照相比，当用hWJSC-CM和hWJSC-CL治疗瘢痕瘤细胞72小时时，其示出弱阳性TAF标志物(Tn-C、FSP和VEGF)(图20A至20C)以及高度阳性的自噬相关标志物(BECLIN-1和LC3B)(图21A至21B)。

定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)

使用qRT-PCR的基因表达分析示出，与对照相比，在用hWJSC-CM和hWJSC-CL治疗72小时的瘢痕瘤细胞中，抗凋亡相关基因(BCL2和SURVTVTN)是下调的而促凋亡和自噬相关基因(BAX、ATG5、ATG7和BECLIN-1)是上调的(图22A)。抗凋亡相关基因表达水平的降低倍数范围为0.048至0.34，而促凋亡和自噬相关基因的增加倍数范围为0.74至6.47。每个基因的倍数差异与对照是统计学显著的(图22A)。

TAF相关基因的qRT-PCR证实了免疫组织化学结果。与对照相比，暴露于治疗(hWJSC-CM和hWJSC-CL)的瘢痕瘤细胞中的TAF基因(IL-6、a-SMA、Tn-C、FAP、FGF和VEGF)是下调的(图22B)。

体内瘢痕瘤抑制

在接受瘢痕瘤细胞+基质胶的Gp 2(对照)中，在3周至4周内，SCID小鼠在8分之6的注射部位的皮下区域中产生直径范围为0.76至0.98cm的圆形肿瘤(4只动物)(图23A a、b)，而接受瘢痕瘤细胞+hWJSC+基质胶的Gp 1(治疗)的那些小鼠在4只动物的所有8个注射部位均未产生任何肿瘤样块。在组织学上，对照的肿瘤样块示出瘢痕瘤的典型突出形态特征，其包括由Moshref and Mufti JKA U Med SCi，17：3-22(2010)所描述的纤维胶原蛋白、广泛的玻璃状胶原蛋白和基底细胞空泡变化(图23Da至f)。

Gp 2(对照A)(瘢痕瘤+基质胶)之肿瘤的重量和大小为1.12±0.13g和0.76cm至0.98cm(图22B、22C)。

讨论

与对照相比，在hWJSC-CM和hWJSC-CL的存在下，关键的瘢痕瘤CD标志物(CD29、CD44、CD73、CD90和CD105)的百分比表达降低的事实表明瘢痕瘤细胞的干性特征、自我更新和分化潜力被hWJSC-CM和hWJSC-CL中推定的抗肿瘤剂所改变。此外，在hWJSC-CM和hWJSC-CL治疗的瘢痕瘤细胞之细胞周期的亚G1期中观察到的高百分比细胞死亡表明细胞经历凋亡。基因表达谱示出，在暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的瘢痕瘤细胞中，抗凋亡相关基因(BCL2和SURVIVIN)是下调的而促凋亡和自噬相关基因(BAX、ATG5、ATG7和BECLIN-1)是上调的，这进一步证实了hWJSC通过凋亡和自噬机制诱导瘢痕瘤细胞死亡。

在接受hWJSC施用的异体移植小鼠中没有瘢痕瘤形成的事实表明hWJSC抑制瘢痕瘤细胞的生长并且因此具有在临床条件(clinical setting)中针对瘢痕瘤的治疗价值。

本研究的结果表明hWJSC和hWJSC-CM改变瘢痕瘤细胞的良性致瘤性性质，使得它们失去其瘤形成特征并变得非侵入性。如本文所示，特异性miRNA簇(miR-106a-363、miR-17-92、miR-106b-25、miR-302-367、miR-21、miR-34a和let-7家族)在hWJSC中是高表达的。miR-106a-363和miR-17-92簇涉及细胞增殖和生长，因此其有可能在伤口愈合过程中起作用并且miR-34a和let-7家族涉及抗癌过程。

还如本文所示，可从1cm人脐带中收获大约4.6×10⁶个新鲜的活hWJSC并且以24小时的短群体倍增时间(PDT)来增殖hWJSC(Fong等，Reprod Biomed Online，21：391-401(2010))。因此，可将其大量地放大以用于临床应用。此外，可使用常规方案在体外将其分化为角质形成细胞。因此，由于其相比于其他干细胞类型的独特优点(例如其可从废弃脐带大量获得、高增殖速率、多潜能性、低免疫原性、非致瘤性和抗致瘤性)，hWJSC在瘢痕瘤管理中具有巨大的临床应用。

本文所引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导均通过引用以其整体并入。

尽管已经参考其示例性实施方案特别地示出和描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解的是，其中可作出多种形式和细节的改变而不脱离由所附权利要求所涵盖的本发明的范围。

Claims (52)

1.在有此需要的个体中治疗伤口的方法，其包括将所述伤口与有效量的组合物接触，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于活皮肤细胞、濒死皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述伤口与支架接触，所述支架包含沃顿胶质干细胞(WJSC)，已经用WJSC调节的细胞培养基，WJSC的裂解物，已经用暴露于活皮肤细胞、濒死皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或其组合。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述支架是纳米纤维支架。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述支架是可生物降解的。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述支架包含聚己酸内酯(PCL)。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述支架还包含芦荟(aloe vera)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中PCL与芦荟的比值为约10：5。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述支架具有约0.5μm至10μm的孔隙度、约250nm至650nm的纤维直径、约250nm至650nm的纤维厚度或其组合。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WJSC是人WJSC。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WJSC获得自一个或更多个脐带。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述已经用WJSC调节的细胞培养基是通过在一种或更多种细胞培养基中培养WJSC约24小时至72小时来获得的。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WJSC的裂解物是通过将所述WJSC与裂解所述WJSC的裂解缓冲液接触来获得的。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(iv)的所述WJSC已经在常氧或低氧环境下暴露于活皮肤细胞、濒死皮肤细胞和瘢痕瘤细胞。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述伤口与所述组合物接触约24小时至约21天。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述伤口是外科手术切口、糖尿病伤口、创伤性损伤伤口、溃疡、烧伤、切除的瘢痕瘤伤口。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述伤口处于变为瘢痕或瘢痕瘤的风险之中。

17.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中将所述伤口与包含所述组合物的支架接触，或者将所述伤口与所述支架接触，然后将所述支架与所述组合物接触。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含一种或更多种抗生素、银、纤维蛋白或其组合。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体是人或动物。

20.在有此需要的个体中治疗瘢痕的方法，其包括将所述瘢痕与有效量的组合物接触，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于活皮肤细胞、濒死皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述瘢痕是瘢痕瘤。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中将所述瘢痕与支架接触，所述支架包含沃顿胶质干细胞(WJSC)，已经用WJSC调节的细胞培养基，WJSC的裂解物，已经用暴露于活皮肤细胞、濒死皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或其组合。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述支架是纳米纤维支架。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述支架是可生物降解的。

25.根据权利要求2至24中任一项所述的方法，其中所述支架包含聚己酸内酯(PCL)。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述支架还包含芦荟。

27.根据权利要求26所述的方法，其中PCL与芦荟的比值为约10：5。

28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述支架具有约0.5μm至10μm的孔隙度、约250nm至650nm的纤维直径、约250nm至650nm的纤维厚度或其组合。

29.根据权利要求20至28中任一项所述的方法，其中所述WJSC是人WJSC。

30.根据权利要求20至29中任一项所述的方法，其中所述WJSC获得自一个或更多个脐带。

31.根据权利要求20至30中任一项所述的方法，其中所述已经用WJSC调节的细胞培养基是通过在一种或更多种细胞培养基中培养WJSC约24小时至72小时来获得的。

32.根据权利要求20至31中任一项所述的方法，其中所述WJSC的裂解物是通过将所述WJSC与裂解所述WJSC的裂解缓冲液接触来获得的。

33.根据权利要求20至32中任一项所述的方法，其中(iv)的所述WJSC已经在常氧或低氧环境下暴露于活皮肤细胞、濒死皮肤细胞和瘢痕瘤细胞。

34.根据权利要求20至33中任一项所述的方法，其中将所述瘢痕与所述组合物接触约24小时至约21天。

35.根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中将所述瘢痕与包含所述组合物的支架接触，或者将所述瘢痕与所述支架接触，然后将所述支架与所述组合物接触。

36.根据权利要求20至35中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含一种或更多种抗生素、银、纤维蛋白或其组合。

37.根据权利要求20至36中任一项所述的方法，其中所述个体是人或动物。

38.一种医用敷料，其包含沃顿胶质干细胞(WJSC)，已经用WJSC调节的细胞培养基，WJSC的裂解物，已经用暴露于活皮肤细胞、濒死皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或其组合。

39.根据权利要求1所述的医用敷料，其中还包含支架，所述支架包含沃顿胶质干细胞(WJSC)，已经用WJSC调节的细胞培养基，WJSC的裂解物，已经用暴露于活皮肤细胞、濒死皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或其组合。

40.根据权利要求39所述的医用敷料，其中所述支架是纳米纤维支架。

41.根据权利要求39或40所述的医用敷料，其中所述支架是可生物降解的。

42.根据权利要求39至41中任一项所述的医用敷料，其中所述支架包含聚己酸内酯(PCL)。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的医用敷料，其中所述支架还包含芦荟。

44.根据权利要求43所述的医用敷料，其中PCL与芦荟的比值为约10：5。

45.根据权利要求39至43中任一项所述的医用敷料，其中所述支架具有约0.5μm至10μm的孔隙度、约250nm至650nm的纤维直径、约250nm至650nm的纤维厚度或其组合。

46.根据权利要求38至45中任一项所述的医用敷料，其中所述WJSC是人WJSC。

47.根据权利要求38至46中任一项所述的医用敷料，其中所述WJSC获得自一个或更多个脐带。

48.根据权利要求38至47中任一项所述的医用敷料，其中所述已经用WJSC调节的细胞培养基是通过在一种或更多种细胞培养基中培养WJSC约24小时至72小时来获得的。

49.根据权利要求38至48中任一项所述的医用敷料，其中所述WJSC的裂解物是通过将所述WJSC与裂解所述WJSC的裂解缓冲液接触来获得的。

50.根据权利要求38至49中任一项所述的医用敷料，其中(iv)的所述WJSC已经在常氧或低氧环境下暴露于活皮肤细胞、濒死皮肤细胞和瘢痕瘤细胞。

51.根据权利要求38至50中任一项所述的医用敷料，其还包含一种或更多种抗生素、银、纤维蛋白或其组合。

52.一种药物组合物，其包含根据权利要求38至51中任一项所述的医用敷料。