JP2020172536A - 創傷治癒のための幹細胞 - Google Patents

Abstract

【課題】創傷治癒のための幹細胞の提供。【解決手段】本発明は、本出願に記載される細胞を適用することによって、創傷を処置するための方法を提供する。一態様では、前記方法は、皮膚創傷のための処置を提供する。一般的な実施形態では、前記細胞は、送達ビヒクル中の官能化基材に結合されずに、創傷に送達される。本発明は、例えば、創傷治癒を促進するために十分な有効量および時間で細胞（Ｉ）を投与することによって、被験体における創傷治癒を促進する方法であって、該細胞（Ｉ）が官能化基材から送達されず、該細胞（Ｉ）が、ｏｃｔ４またはテロメラーゼを発現する非胚性非生殖細胞であり、形質転換されておらず、腫瘍原性ではなく、正常核型を有する、方法を提供する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、本出願に記載される細胞を適用することによって創傷を処置するための方法を提供する。一態様では、前記方法は、皮膚創傷の処置を提供する。一般的な実施形態では、細胞は、送達ビヒクル中の官能化基材に結合されずに、創傷に送達される。

発明の背景
皮膚は、傷害および微生物からの身体防御の最前線であり、身体機能において重要な役割を果たす。外傷性傷害、火傷および慢性潰瘍は、皮膚障壁の主な免疫機能に影響を及ぼす重度の皮膚損傷を引き起こし、全身リスクを伴い得る。

皮膚創傷の最適な治癒は、炎症、再上皮化、肉芽組織形成、血管新生、創傷収縮および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）再構築（これらは、外傷性傷害後の皮膚組織再生に寄与する）の過程を必要とする。

創傷治癒は、傷害後に皮膚組織がそれ自身修復する複雑な過程である。正常皮膚では、表皮（表層）および真皮（深層）は、外部環境に対する保護障壁を形成する。障壁が破壊されると、生化学的事象の組織的なカスケードが迅速に発動して損傷を修復する。この過程は、予測可能な期に分けられる：血液凝固（止血）、炎症、新たな組織の成長（増殖）および組織のリモデリング（成熟）。時には、血液凝固は、それ自体が段階ではなく炎症段階の一部であるとも考えられる。

・止血（血液凝固）：傷害の最初の数分以内に、血液中の血小板が傷害部位に粘着し始める。これは血小板を活性化し、いくつかのことを引き起こす。それらは、凝固により適切な非晶形に変化し、それらは、化学シグナルを放出して凝固を促進する。これは、フィブリン（これは、メッシュを形成し、「接着剤」として作用して、血小板を互いに結合する）の活性化をもたらす。これは、血管内の破壊を塞いでさらなる出血を遅延／防止するように機能する血餅を作る。

・炎症：この期では、細菌および他の病原体または残屑と共に、損傷細胞および死細胞が取り除かれる。これは、貪食によって白血球が残屑を「食べる」食作用の過程を介して起こる。血小板由来成長因子は創傷に放出され、増殖期に細胞の遊走および分裂を引き起こす。

・増殖（新たな組織の成長）：この期では、（リンパ）血管新生、コラーゲン沈着、肉芽組織形成、上皮化および創傷収縮が起こる。血管新生では、血管内皮細胞は新たな血管を形成するが、リンパ内皮細胞は新たなリンパ管の形成に寄与する。線維形成および肉芽組織形成では、線維芽細胞は成長し、コラーゲンおよびフィブロネクチンを排出することによって、新たな暫定細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を形成する。同時に、表皮の回復が起こり、上皮細胞が増殖し、創傷床の上を「徐々に動いて（crawl）」、新たな組織の被覆を提供する。創傷収縮では、筋線維芽細胞は、創傷縁部を保持し、平滑筋細胞に似た機構を使用して収縮することによって、創傷のサイズを減少させる。この細胞の役割がほぼ完了すると、不要な細胞はアポトーシスを受ける。

・成熟（リモデリング）：成熟およびリモデリング中、裂線に沿ってコラーゲンが再編成され、プログラム細胞死またはアポトーシスによって、もはや不要な細胞が除去される。

創傷治癒過程は複雑なだけではなく脆弱であり、非治癒性慢性創傷の形成をもたらす中断または不全の影響を受けやすい。非治癒性慢性創傷に寄与する因子は、糖尿病、静脈疾患または動脈疾患、感染および老年の代謝欠損である。

創傷は、例えば、外傷、疾患、微生物の作用および異物への曝露を含む様々な原因に起因し得る。創傷治癒は、創傷閉鎖を達成するために重要なだけではなく、組織機能を回復させ、感染に対する障壁機能を提供するためにも重要である。創傷治癒の遅延は、被験体の罹患率の重大な寄与因子である。いくつかの状況では、創傷治癒過程は機能不全であり、慢性創傷の発症をもたらす。慢性創傷は、罹患者の身体的および精神的な健康、生産性、罹患率、死亡率および医療のコストに対して大きな影響を有する。

慢性創傷は、３カ月後に治癒できない創傷として定義される。静脈うっ血性潰瘍、糖尿病性潰瘍、圧迫性潰瘍および虚血性潰瘍は、最も一般的な慢性創傷である。静脈うっ血性潰瘍を治癒しようとする包帯剤選択肢（dressing option）の多くは、古典的なペースト圧迫包帯であるＵｎｎａ’ｓ ｂｏｏｔのバリエーションである。これらの創傷は、頻繁な創面切除を必要とする大量の滲出物を有し得ることもある。この状況では、アルギナート、発泡体および他の吸収剤が使用され得る。慢性創傷は、急性創傷のものとはわずかに異なる機構によって治癒するので、成長因子を用いる実験が調査されている。Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）およびＰｒｏｃｕｒｅｎ（登録商標）（Ｃｕｒａｔｉｖｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，Ｎ．Ｙ．）は、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）によって承認された唯一の医薬品である。

創傷ケアは、浄化および再傷害または感染からの保護によって創傷治癒を刺激および加速する。各患者のニーズに応じて、それは、最も簡単な応急処置から看護専門領域全般、例えば創傷、オストミーならびに失禁看護および熱傷センター医療に及び得る。

毎年、１５０万を超える皮膚創傷が火傷によるものであり、１００万を超える皮膚創傷が皮膚がんによるものである。毎年、皮膚創傷は、約７５，０００件の患者症例および１２，０００件の死亡をもたらし、２００５年には約３３億ドルが創傷ケアに費やされた。

体内では、皮膚創傷治癒は、暫定マトリックスの線維芽細胞分泌（通常は、傷害７日後に始まる過程）を伴う。しかしながら、現在利用可能な組織工学皮膚代用品は、（例えば、糖尿病、血管炎、栄養失調、感染による）慢性皮膚創傷、急性皮膚創傷（例えば、火傷、皮膚がん）、皮膚奇形などの場合にヒトで使用される脱細胞化ヒト皮膚、例えばＡｌｌｏｄｅｒｍ（登録商標）である。このような脱細胞化皮膚代用品は、付属器構造（例えば、皮脂腺、毛包、メラノサイト）と、表皮真皮接合部における乳頭間隆起パターンと、創傷治癒を促進する他の重要な生体成分とを欠く。さらに、現在利用可能な皮膚代替品の異種移植では、高い感染リスクが依然として存在する。

瘢痕形成および感染がわずかである創傷治癒の成功のためには、真皮および表皮の両方の皮膚層の再生が重要であるので、「真の」皮膚代替品である新たなモデルが必要とされる。

創傷治癒を助けるために最も一般に使用される従来のモダリティは、創傷包帯剤の使用を伴う。創傷治癒を助けるために、様々な異なるタイプの包帯剤が使用される。いくつかの処置では、創傷治癒を助けるために、ミネラルおよびビタミンの供給を利用している。しかしながら、これらのタイプの処置モダリティは、ほとんど成功例がない。従って、創傷治癒を促進するために使用されている現在の臨床アプローチは、機械的外傷からの創傷床の保護と、抗生物質、防腐剤および他の抗菌化合物による表面微生物負荷の制御と、いくつかのタイプの成長因子の使用とを含む。しかしながら、これらのアプローチはすべて、種々の不利な点を有する。

創傷の治癒は、細胞の送達が治療潜在性を有する例である。創傷治癒過程の根底にある原則の理解の進歩にもかかわらず、創傷処置のための治療選択肢は依然として限られている。細胞送達戦略は、潜在的な治療手段を提供する。

細胞の送達は治療潜在性を有するが、いくつかの理由により、細胞送達の使用は依然として限られている。例えば、細胞の送達方法、基材の選択、細胞の付着、細胞移入の効率および／または治療特性を保持する細胞の能力などの検討事項が治療転帰に重要である。

皮膚欠損の再生および再構築を加速させるために、研究者らは、異なる供給源由来の幹細胞を使用して外傷性皮膚傷害を処置している（Ｙａｏｊｉｏｎｇら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５（１０）：２６４８−５９，２００７）。しかしながら、幹細胞療法には、幹細胞源が限られているなどの問題が依然として存在する。したがって、治療目的のために、新たな細胞および／または細胞送達手段を同定する継続的必要性がある。

当技術分野におけるこれらの進歩にもかかわらず、当技術分野では、病変における自然な創傷治癒過程を回復（この修復は、組織リモデリングおよび回復を必要とする）するための新たなより優れた方法およびデバイスの必要性が存在する。

Ｙａｏｊｉｏｎｇら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５（１０）：２６４８−５９，２００７

本発明は、創傷を治癒するために、本明細書に記載される特定の細胞を創傷に適用することによって、特定の創傷を処置するための方法を提供する。

送達経路としては、限定されないが、局所投与形態が挙げられる。局所投与形態の例としては、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、発泡体、エマルジョン、懸濁液、スプレー、エアロゾル、溶液、液体、粉末、半固体、ゲル、ゼリー；固体、ペースト、チンキ剤、塗布薬、分解可能なキャリア、薬学的に許容され得るキャリア、流体、リザーバー、液体、ゲル、埋め込み、例えばＰＶＡロードスポンジ（PVA-loaded sponge）、コラーゲンゲル溶液、膜調製物、例えば胎盤膜、羊膜、コラーゲンスポンジ、フィブリンまたは他のタンパク質接着剤、薬学的に許容され得るキャリア中の流体連結懸濁液、例えば食塩水、糖、例えばデキストロース、等張水性希釈剤溶液、粉末、皮膚代用品、例えばタンパク質、例えばフィブリンまたは膜調製物、脱細胞化組織調製物、例えば脱細胞化皮膚調製物、足場、例えばヒドロゲル、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ｓｐｏｎｇａｓｔａｎ、フィブロネクチン、ＰＬＧＡ、コラーゲンゲル、フィブリンスプレーまたは他のタンパク質スプレーまたは膜スプレーによる送達が挙げられる。

投与はまた、パッチ、包帯、ガーゼまたは包帯剤によるものであり得、包帯、パッチ、ガーゼまたは包帯剤は、細胞を付着させてそれらがそこから創傷に遊走する官能化基材、例えばアルキル基、例えばアルキルアミン基による化学的改変を含有しない。他の局所送達形態も企図される。

送達はまた、局所送達に関して上記で言及される形態のいずれかによる皮内または皮下であり得る。

細胞は、適切なキャリア、例えば局所投与に関して上記で言及されるもののいずれかで、局所注射によって創傷に送達され得る。

細胞は、適切な場合には、上記送達ビヒクルのいずれか、例えばＰＶＡロードスポンジで、創傷に埋め込まれ得る。

特定の実施形態では、細胞は、包帯、ガーゼ、パッチまたは包帯剤で送達されない。より具体的な実施形態では、細胞は、これらのビヒクルのいずれでも送達されず、ビヒクルは、官能化基材を含む。より具体的な実施形態では、ビヒクルは、官能化基材（これは、例えばアルキル基、例えばアルキルアミン基による化学的改変である）を含まない。

しかしながら、細胞は、アルキル基による化学的改変を含まない官能化基材によって送達され得る。したがって、細胞は、タンパク質、または組織に由来するかもしくは組織に見出されるものを模倣する他の生物学的材料、例えば限定されないが、羊膜を含む膜調製物で官能化された基材によって送達され得る。

除外される具体的な実施形態では、細胞は、アルキル基、特にアルキルアミン基で化学的に改変されたデバイス（例えば、包帯、ガーゼ、包帯剤またはパッチ）によって送達されない。

一態様では、細胞は創傷に送達されるが、細胞を含むパッチ、包帯または包帯剤で送達されない。具体的な実施形態では、細胞は、官能化基材に結合されない。

本明細書に記載される細胞は、薬学的に許容され得るキャリアで創傷に投与され得る。薬学的に許容され得るキャリアとしては、限定されないが、水、グルコース、グリセロール、食塩水、エタノール、液体油、例えばパルミテート、ポリエチレングリコール、ｔｗｅｅｎおよびＳＤＳなどが挙げられる。

特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与、エアロゾル化投与、非経口投与、埋め込み、皮下注射、関節内、直腸、鼻腔内、眼内、膣または経皮の１つまたはそれよりも多くによる被験体への送達に適切である。

特定の実施形態では、医薬組成物は、送達のための細胞の活性および／またはそれらの送達もしくは移入を増強、安定化または維持する他の化合物を含む。

特定の実施形態では、医薬組成物を（例えば、関節腔に直接）非経口投与または腹腔内投与することが望ましい場合がある。例えば、溶液または懸濁液は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合された水中で調製され得る。分散液もまた、油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中で調製され得る。

特定の実施形態では、注射によって組成物を投与することが望ましい場合がある。注射用途に適切な形態としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。

特定の実施形態では、組成物を静脈内投与することが望ましい場合がある。静脈内投与に適切な本明細書に記載される組成物を含有する組成物は、当業者によって製剤化され得る。

特定の実施形態では、組成物は、例えば発泡体またはペーストの細胞懸濁液として注射によって、すなわち、ポリマーまたは他の分子、メッシュまたはマイクロキャリアからなる３Ｄ支持体によって投与され得る。

一態様では、本発明は、皮膚の創傷を処置するための方法であって、幹細胞を含む組成物を皮膚創傷に投与することを含む方法を提供する。皮膚の創傷は、限定的または広範なものであり得る。それは表皮に限局され得るか、または真皮、脂肪層、筋肉およびさらに骨を含み得る。したがって、創傷は、皮膚組織および皮下組織に及び得る。

創傷は、裂傷、擦傷、火傷、切開、穿刺、放射体（projectile）によって引き起こされる創傷、および表皮創傷、皮膚創傷、慢性創傷、急性創傷、外部創傷、内部創傷、先天性創傷、潰瘍、圧迫性潰瘍、糖尿病性潰瘍、トンネル創傷、外科手術中にまたは外科手術に付随して引き起こされる創傷、静脈性皮膚潰瘍および阻血性壊死からなる群より選択され得る。

一実施形態では、創傷は、不十分な血液および／またはリンパ循環のために生じるクラスのものである。このクラス内では、種は、特に、この不十分な循環に起因する慢性創傷、例えば糖尿病性潰瘍、静脈性皮膚潰瘍および阻血性壊死を含む。特に、皮膚創傷は、本発明の方法によって処置され得る。しかしながら、これらの皮膚創傷は、特に慢性の場合には皮下層に影響を及ぼし得、実際には、より深い筋肉組織およびさらに骨組織を露出させ得ると理解される。これは、糖尿病性足潰瘍、静脈性下肢潰瘍および火傷による場合であり得る。

「創傷」という用語は、例えば、開放創、創傷治癒の遅延または困難、および慢性創傷を含む組織傷害を含む。創傷の例としては、開放創および閉鎖創の両方が挙げられ得る。「創傷」という用語はまた、例えば、皮膚および皮下組織の傷害、ならびに異なる方法で開始された様々な特徴の傷害を含む。

特定の実施形態では、創傷は、外部傷害を含む。特定の実施形態では、創傷は、開放創を含む。特定の実施形態では、創傷は、慢性創傷を含む。特定の実施形態では、創傷は、慢性創傷または潰瘍を含む。

外部傷害の場合、典型的には、これらの創傷は、創傷の深さに応じて、４つのグレードの１つに分類される：ｉ）グレードＩ創傷は、上皮に限定される；ｉｉ）グレードＩＩ創傷は、真皮に及ぶ；ｉｉｉ）グレードＩＩＩ創傷は、皮下組織に及ぶ；およびｉｖ）骨が露出したグレードＩＶ（または全層創傷）創傷。

本発明は、皮膚創傷治癒を促進する方法であって、有効量の幹細胞を患者に投与し、それにより、未処置対照と比べて創傷閉鎖の加速、迅速な再上皮化、（リンパ）血管新生の改善および組織リモデリングの改善の少なくとも１つをもたらすことを含む方法を対象とする。

創傷治癒のポジティブな結果としては、限定されないが、上皮化、肉芽組織形成および血管新生の増強、創傷閉鎖の加速、肉芽組織の沈着、コラーゲン含量の増加による創傷破裂強度の増加、創傷引張強度の増加、瘢痕の減少ならびに創傷サイズの減少が挙げられる。

創傷としては、皮膚創傷が挙げられる。それらとしては、皮下層および脂肪層、すなわち下層組織も含むすべての真皮層に到達する創傷も挙げられる。本発明は、慢性創傷、肥満または糖尿病に起因する創傷、非治癒性糖尿病性創傷、糖尿病性創傷全般、糖尿病性足潰瘍、火傷、神経障害性足潰瘍、糖尿病性神経障害性潰瘍および慢性皮膚潰瘍に適用される。創傷は、根本的な原因、例えば十分な血液循環またはリンパ循環の欠如によって、皮膚組織および皮下組織をもたらし得る。したがって、本発明の方法および本発明の組成物は、完全または部分的にかかわらず、再上皮化、すなわち創傷閉鎖を促進する。

本発明のさらなる態様によれば、被験体における創傷治癒を促進する方法が提供される。前記方法は、被験体における創傷治癒を促進するために有効な量で、幹細胞を被験体に投与することを含む。一実施形態では、被験体は、ヒトである。しかしながら、本発明は、獣医学的被験体（例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウマなど）を含む。

出血および凝固、急性炎症、細胞遊走、増殖、分化、血管新生、再上皮化、ならびに細胞外マトリックスの合成およびリモデリングを含む正常創傷治癒の３つの期がある。これらの事象はすべて、３つの重複する期（具体的には、炎症性、増殖性およびリモデリング）で起こる。本出願における細胞は、これらの期の１つまたはそれよりも多くにおいて使用され得る。それらは、使用される必要はないが、これら３つの期すべてにおいて使用され得る。

慢性創傷は、３つの正常な治癒段階を介して進行することができないものである。これは、典型的な時間内に修復されない組織傷害をもたらす。これらは、限定されないが、糖尿病、圧迫、血管機能不全、火傷および血管炎を含む様々な基礎障害に起因し得る（Ｂｏｒｕｅら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２００４）１６５：１７６７−１７７２）。本出願における細胞は、これらの段階の１つまたはそれよりも多くにおいて使用され得る。

幹細胞は、動物における創傷治癒を促進するために有効な量で、動物に投与される。動物は哺乳動物であり得、哺乳動物は、ヒトおよび非ヒト霊長類を含む霊長類であり得る。一般に、幹細胞は、細胞約１×１０^５個／ｋｇ〜細胞約１×１０^７個／ｋｇ、好ましくは細胞約１×１０^６個／ｋｇ〜細胞約５×１０^６個／ｋｇの量で投与される。具体的な実施形態では、細胞２〜４×１０^７個／ｋｇが投与される。投与すべき幹細胞の正確な量は、患者の年齢、体重および性別、ならびに処置される創傷の程度および重症度を含む様々な要因に依存する。

幹細胞は、許容され得る医薬キャリアと併せて投与され得る。幹細胞は、全身投与され得る。幹細胞は、幹細胞を含有する流体またはリザーバー、例えばＰＢＳ、緩衝塩、細胞培地、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅで創傷に直接投与され得る。

いくつかの実施形態では、細胞は、さらなる因子と共に送達される。これらとしては、限定されないが、デフェンシン、Ｎ−Ｇａｌ、ＩＬ−１ＲＡ、血管新生因子、例えばＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、上皮細胞刺激タンパク質（ＫＧＦおよびＥＧＦを含む）ならびに抗瘢痕タンパク質ＴＧＦβ３、ＩＦＮα２およびＨＧＦを含む抗炎症因子および抗菌因子の１つまたはそれよりも多くが挙げられる。

本発明が対象とする細胞は、多能性マーカー、例えばｏｃｔ４を発現し得る。それらはまた、長期にわたる複製能力に関連するマーカー、例えばテロメラーゼを発現し得る。多能性の他の特徴は、１つを超える胚葉、例えば外胚葉の、内胚葉の、および中胚葉の胚性胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒｓ）の２または３つの細胞型に分化する能力を含み得る。このような細胞は、培養中に不死化もしくは形質転換されていてもよいし、または不死化もしくは形質転換されていなくてもよい。細胞は、形質転換されずに高度に増殖され得、正常核型も維持し得る。例えば、一実施形態では、非胚性幹非生殖細胞（non-embryonic stem, non-germ cell）は、培養中に少なくとも１０〜４０回、例えば５０回、６０回またはそれを超える細胞倍加を受け得、細胞は形質転換されておらず、正常核型を有する。細胞は、内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統の２つのそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得、３つすべてへの分化を含み得る。さらに、細胞は、非腫瘍原性であり得、例えば、奇形腫を生成し得ない。細胞が形質転換されているかまたは腫瘍原性であり、それらを注入に使用することが望まれる場合、このような細胞は、腫瘍への細胞増殖を予防する処理によって、インビボで腫瘍を形成し得ないように無能化され得る。このような処理は、当技術分野で周知である。

細胞としては、限定されないが、ナンバリングされた以下の実施形態が挙げられる。

１．単離され増殖された非胚性幹非生殖細胞であって、培養中に少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を受けており、ｏｃｔ４を発現し、形質転換されておらず、正常核型を有する、非胚性幹非生殖細胞。

２．テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くをさらに発現する、上記１の非胚性幹非生殖細胞。

３．内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統の少なくとも２つのうちの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記１の非胚性幹非生殖細胞。

４．テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くをさらに発現する、上記３の非胚性幹非生殖細胞。

５．内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記３の非胚性幹非生殖細胞。

６．テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くをさらに発現する、上記５の非胚性幹非生殖細胞。

７．非胚性非生殖組織の培養によって得られる単離され増殖された非胚性幹非生殖細胞であって、培養中に少なくとも４０回の細胞倍加を受けており、形質転換されておらず、正常核型を有する、非胚性幹非生殖細胞。

８．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くを発現する、上記７の非胚性幹非生殖細胞。

９．内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統の少なくとも２つのうちの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記７の非胚性幹非生殖細胞。

１０．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くを発現する、上記９の非胚性幹非生殖細胞。

１１．内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記９の非胚性幹非生殖細胞。

１２．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くを発現する、上記１１の非胚性幹非生殖細胞。

１３．単離され増殖された非胚性幹非生殖細胞であって、培養中に少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を受けており、テロメラーゼを発現し、形質転換されておらず、正常核型を有する、非胚性幹非生殖細胞。

１４．ｏｃｔ４、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くをさらに発現する、上記１３の非胚性幹非生殖細胞。

１５．内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統の少なくとも２つのうちの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記１３の非胚性幹非生殖細胞。

１６．ｏｃｔ４、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くをさらに発現する、上記１５の非胚性幹非生殖細胞。

１７．内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記１５の非胚性幹非生殖細胞。

１８．ｏｃｔ４、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くをさらに発現する、上記１７の非胚性幹非生殖細胞。

１９．内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統の少なくとも２つのうちの少なくとも１つの細胞型に分化し得る単離され増殖された非胚性幹非生殖細胞であって、培養中に少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を受けている、非胚性幹非生殖細胞。

２０．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くを発現する、上記１９の非胚性幹非生殖細胞。

２１．内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記１９の非胚性幹非生殖細胞。

２２．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１またはｓｏｘ−２の１つまたはそれよりも多くを発現する、上記２１の非胚性幹非生殖細胞。

上記細胞は、限定されないが、骨髄、臍帯血、臍帯マトリックス、末梢血、胎盤、胎盤血、筋肉、脳、腎臓および他の固形臓器を含む任意の所望の組織源から調製され得る。細胞はまた、排泄液、例えば尿および月経血に由来し得る。

一実施形態では、細胞は、ヒト組織に由来する。

具体的な実施形態では、創傷は、上皮損傷を含有する。

特定の実施形態では、細胞それ自体が送達される必要はない。治療効果は、細胞によって分泌される因子によって達成され得る。例えば、細胞が培養される場合、有益な因子が細胞培養培地に分泌され得る。したがって、培地それ自体が、本出願に開示される様々な実施形態において使用され得る。あるいは、馴化培地の抽出物が使用され得、抽出物は有益な因子を含有し、それにより、細胞は、本出願に記載される創傷治癒において治療結果を提供する。したがって、細胞が送達され得る場合には、馴化培地またはその抽出物が代用または追加され得る。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
創傷治癒を促進するために十分な有効量および時間で細胞（Ｉ）を投与することによって、被験体における創傷治癒を促進する方法であって、該細胞（Ｉ）が官能化基材から送達されず、該細胞（Ｉ）が、ｏｃｔ４またはテロメラーゼを発現する非胚性非生殖細胞であり、形質転換されておらず、腫瘍原性ではなく、正常核型を有する、方法。
（項目２）
前記細胞（Ｉ）が、ｒｅｘ１、ｒｏｘ１またはｓｏｘ２の１つまたはそれよりも多くをさらに発現する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞（Ｉ）が、内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統の少なくとも２つのうちの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記細胞（Ｉ）が、内胚葉性胚系統、外胚葉性胚系統および中胚葉性胚系統のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記創傷が、皮膚および下層組織の創傷である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記創傷が潰瘍である、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記潰瘍が、足、手、下肢または腕に見られる皮膚潰瘍および静脈性下肢潰瘍からなる群より選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記皮膚潰瘍が、糖尿病および鎌状赤血球貧血からなる群より選択される疾患によって引き起こされる、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記細胞（Ｉ）が遺伝子操作されていない、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記細胞（Ｉ）が骨髄に由来する、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記細胞（Ｉ）がヒトに由来する、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記被験体がヒトである、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記創傷が、末梢血またはリンパ系の不十分な循環によって引き起こされる、項目６に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞（Ｉ）を前記創傷に局所投与する、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記細胞（Ｉ）を皮下送達する、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
注射によって前記細胞（Ｉ）を前記創傷に投与する、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
液体細胞懸濁液で前記細胞（Ｉ）を投与する、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
リザーバーを使用して前記細胞（Ｉ）を前記創傷に投与する、項目１または２のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記細胞（Ｉ）が同種のものである、項目１または２のいずれかに記載の方法。

図１Ａおよび１Ｂ；未分化ｍＭＡＰＣにおけるユニバーサルマウスＲＮＡに対する（Ａ）、または未分化ｈＭＡＰＣにおけるユニバーサルヒトＲＮＡに対する（０日目（ｄ０）、白色）、分化の１４日目（ｄ１４、灰色）および２１日目（ｄ２１、黒色）における％として示される一般（右）およびリンパ特異的（左）内皮細胞（ＥＣ）マーカーの発現を表す図。データは、５〜６回の独立した分化の平均±ＳＥＭを表す。＊クラスカル・ワリス検定とダン事後検定によって、０日目に対してＰ＜０．０５。図１Ｃ；１４日目のｍＭＡＰＣにおける，アイソタイプ対照（破線）に対するＬＹＶＥ１タンパク質発現（実線）を示すＦＡＣＳヒストグラム（ｎ＝３の代表）。ＡＰＣ：アロフィコシアニン。図１Ｄ；未分化ｈＭＡＰＣ（０日目、白色）に対する、９日目の、ＶＥＧＦ−Ａ（淡灰色）、ＶＥＧＦ−Ｃ（暗灰色）もしくは組み合わせ（黒色）の存在下のｈＭＡＰＣの増加倍率として示されるＬＹＶＥ１発現を表す図。データは、ｎ＝３の平均±ＳＥＭを表す。＊一元配置ＡＮＯＶＡとテューキー事後検定によって、０日目に対してＰ＜０．０５。図１Ｅ〜Ｇ；ＬＥＣ培地（Ｅ；「Ｌ」）またはｍＭＡＰＣ由来馴化培地（「ｍＣＭ」；Ｆ）に曝露したヒトリンパＥＣ（ｈＬＥＣ）スフェロイドの代表的な画像および対応する定量（Ｇ；データは、ｎ＝４の平均±ＳＥＭを表す；＊マン・ホイットニーＵ検定によって、「Ｌ」に対してＰ＜０．０５）。図１Ｈ；ＬＥＣ培地に対する％として表される、ＬＥＣ増殖に対するマウス（「ｍＣＭ」）またはヒト（「ｈＣＭ」）ＭＡＰＣ−ＣＭの効果を表す図。データは、ｎ＝３〜６の平均±ＳＥＭを表す。＊マン・ホイットニーＵ検定によって、「ＬＥＣ」に対してＰ＜０．０５。図１Ｉ〜Ｍ；非馴化ｍＭＡＰＣ培地（ＮＣＭ；Ｊ）、ｍＭＡＰＣ−ＣＭ（Ｋ）、非馴化ｈＭＡＰＣ培地（ＮＣＭ；Ｌ）またはｈＭＡＰＣ−ＣＭ（Ｍ）の存在下で（ライト・ギムザ染色によって明らかにされた）トランスウェルの膜を越えて遊走したＬＥＣの代表的な画像および対応する定量（Ｉ；データは、ｎ＝４の平均±ＳＥＭを表す；＊マン・ホイットニーＵ検定によって、対応するＮＣＭ条件に対してＰ＜０．０５）。スケールバー：５０μｍ（Ｅ、Ｆ）；１００μｍ（Ｊ〜Ｍ）。

図２Ａ；ＰＢＳ（白丸）またはｍＭＡＰＣ（黒丸）で処置したマウスにおける創傷幅。データは、平均±ＳＥＭを表す。ｎ＝５；＊反復測定ＡＮＯＶＡおよびフィッシャー事後検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５。図２Ｂ；４日前に（４ｄ ｅａｒｌｉｅｒ）ｅＧＦＰ^＋ｍＭＡＰＣを移植したマウスの（矢印によって示される）創傷領域の明視野／蛍光画像の重ね合わせ。ｍＭＡＰＣは、創傷床につながる（矢頭によって示される）血管に近いことに留意する。図２ＣおよびＤ；ＰＢＳ（Ｃ）またはｍＭＡＰＣ（Ｄ）で処置したマウス由来の１０日齢創傷のＣＤ３１染色（褐色）横断切片（cross-section）の代表的な写真。図２Ｅ〜Ｇ；ＰＢＳ（Ｅ）またはｍＭＡＰＣ（Ｆ）で処置したマウス由来の１０日齢創傷のＬＹＶＥ１染色（赤色）横断切片の代表的な写真および対応する定量（Ｇ；データは、平均±ＳＥＭを表す。＊マン・ホイットニーＵ検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５；ｎ＝４〜５）。図２Ｈ；１０日前にｅＧＦＰ^＋ｍＭＡＰＣを移植したマウスの横断切片の共焦点画像は、ｅＧＦＰとＬＹＶＥ１（赤色）との偶発的な共局在（矢頭）を示す。図２ＩおよびＪ；５日前にＰＢＳ（Ｉ）またはｈＭＡＰＣ（Ｊ）で処置し、パンサイトケラチンについて染色した創傷の横断切片の代表的な画像（ＰＣＫ；褐色；矢頭は創傷境界を示し、水平線は、表皮によって覆われた距離を示す）。図２ＫおよびＬ；１０日前にＰＢＳ（Ｋ）またはｈＭＡＰＣ（Ｌ）で処置した創傷のＣＤ３１染色（褐色）横断切片の代表的な画像。図２Ｍ〜Ｏ；ＰＢＳ（Ｍ）またはｈＭＡＰＣ（Ｎ）で処置したマウス由来の１０日齢創傷のＬＹＶＥ１染色（赤色）横断切片の代表的な写真および対応する定量（Ｏ；データは、平均±ＳＥＭを表す。＊対応のないスチューデントｔ検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５；ｎ＝６〜８）。図２Ｐ；１０日前にｈＭＡＰＣを移植したマウスの創傷横断切片の画像は、ｈビメンチン（緑色）とＬＹＶＥ１（赤色）との偶発的な共局在（矢頭）を示す。ヘマトキシリンおよびＤＡＰＩを使用して、それぞれＣ、Ｄ、Ｉ〜ＬおよびＥ、Ｆ、Ｍ、Ｎの核を明らかにした。スケールバー：１０μｍ（Ｈ、Ｐ）；１００μｍ（Ｅ、Ｆ）；１５０μｍ（Ｋ、Ｌ）；４００μｍ（Ｃ、Ｄ、Ｉ、Ｊ、Ｍ、Ｎ）；２ｍｍ（Ｂ）。

図３Ａ；皮膚弁モデルを示す画像。Ｒ１／Ｒ２は、パネルＢ〜Ｄの画像が示されている領域を示す。矢印／「Ｘ」は、それぞれリンパ管造影またはＭＡＰＣ／ＰＢＳの蛍光標識デキストランの注射スポットを示し、矢頭は、皮膚弁への血液供給が保持される領域を示す。図３Ｂ〜Ｄ；２週間前にＰＢＳ（Ｂ）、ｍＭＡＰＣ（Ｃ）またはｈＭＡＰＣ（Ｄ）を注射したマウスの領域Ｒ１（左；および対応する挿入図の拡大画像（ｉ；中央））およびＲ２（右）のデキストラン（ＦＩＴＣ標識（Ｂ、Ｄ）またはローダミン−Ｂ標識（Ｃ））の注射１５分後の明視野／蛍光画像の代表的な重ね合わせ写真。矢頭は、充満した輸入リンパ管を示す。ＬＮ：リンパ節。Ｒ１／Ｒ２の破線は、それぞれ開放皮膚の境界または弁の境界を示す。スケールバー：１００μｍ（Ｂ；ｉ１、Ｃ；ｉ２＋Ｒ２、Ｄ；ｉ３）；２５０μｍ（Ｂ；Ｒ１＋Ｒ２、Ｃ；Ｒ１、Ｄ；Ｒ１＋Ｒ２）；および５００μｍ（Ａ）。

図４Ａ〜４Ｄ；ＰＢＳ（Ａ）、ｍＭＡＰＣ（「ｍＭ」；Ｂ）またはｈＭＡＰＣ（「ｈＭ」；Ｃ）で処置したマウス由来のＦｌｔ４染色（褐色）皮膚創傷横断切片（デキストラン注射位置の周辺）の代表的な写真および対応する定量（Ｄ；データは、平均±ＳＥＭを表す。＊クラスカル・ワリスとダン事後検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５；ｎ＝６）。図４Ｅ〜４Ｈ；ＰＢＳ（Ｅ）、ｍＭＡＰＣ（「ｍＭ」；Ｆ）またはｈＭＡＰＣ（「ｈＭ」；Ｇ）で処置したマウス由来の皮膚創傷横断切片（デキストラン注射位置の周辺）の代表的な写真は、細胞処置マウスにおける機能的（デキストラン灌流）リンパ管（緑色または赤色）、および対応する定量（Ｈ；データは、平均±ＳＥＭを表す。＊クラスカル・ワリスとダン事後検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５；ｎ＝５〜１０）を示す。Ｅの挿入図（ｉ１）は、Ｐｒｏｘ１（赤色）について染色した対応する領域を示す。Ｅの拡散蛍光シグナルは、リンパ管によって取り込まれなかったＦＩＴＣ−デキストランを表すことに留意する。図４Ｉ；２週間前にｅＧＦＰ^＋ｍＭＡＰＣを移植したマウスの創傷領域の明視野／蛍光画像の重ね合わせ（注射スポットは矢頭によって示される）。図４Ｊ；４週間前にｅＧＦＰ^＋ｍＭＡＰＣ（矢印）を移植したマウスの創傷領域の緑色／赤色蛍光画像の重ね合わせ。移植細胞付近におけるローダミン−デキストラン充満リンパ管（赤色；矢頭）に留意する。図４Ｋ；創傷周辺の領域の横断切片は、機能的（ローダミン−デキストラン充満、赤色；内腔はアスタリスクによって示される）リンパ管に隣接する移植ｅＧＦＰ^＋ｍＭＡＰＣを示す。図４Ｌ；２週間前にｅＧＦＰ^＋ｍＭＡＰＣを移植した創傷領域の高倍率は、偶発的に、これらの細胞が機能的（ローダミン−デキストラン充満、赤色）リンパ管の内膜（矢頭）の一部になることを示す。ヘマトキシリンおよびＤＡＰＩを使用して、それぞれＡ〜ＣおよびＥ〜Ｇ、Ｋの核を明らかにした。スケールバー：２５μｍ（Ｌ）；５０μｍ（Ｅ〜Ｇ）；１００μｍ（Ａ〜Ｃ、Ｊ、Ｋ）；５００μｍ（Ｉ）。

図５Ａ；１６週間（１６ｗ）前にｅＧＦＰ^＋リンパ節（ＬＮ；矢頭）を移植し、ｈＭＡＰＣを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスの右腋窩部の明視野／蛍光画像の重ね合わせ。固化Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で覆われた領域および開放皮膚境界は、それぞれ破線および白色実線によって示されている。図５Ｂ；ＬＮ移植４週間後または１６週間後にＰＢＳまたはｈＭＡＰＣを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスにおける（ＭＲＩによって決定され、ＡＵ単位で右／左の比として示される）右上肢における浮腫の程度を表す図。＊対応のないスチューデントｔ検定によって、４週（ｗ４）に対してＰ＜０．０５（ｎ＝４〜９）。図５ＣおよびＤ；ＬＮ移植１６週間後に記録された、ＰＢＳ（Ｃ）またはｈＭＡＰＣ（Ｄ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスの前腕部の代表的なＴ_２強調ＭＲ画像。高倍率領域（矢印）は、浮腫による流体の蓄積を示す。Ｌ：左；Ｒ：右。図５ＥおよびＦ；１６週間前にｅＧＦＰ^＋ＬＮ（矢頭）を移植し、ＰＢＳ（Ｅ）またはｈＭＡＰＣ（Ｆ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスの右腋窩部の明視野／蛍光画像の重ね合わせ。挿入図（ｉ１）は、Ｆの囲み枠領域を拡大したものである。ｈＭＡＰＣ処置マウスにおけるローダミン標識レクチン（赤色）の有意に改善された排出は、注射１５分後に記録されたことに留意する（注射スポットは矢印によって示される）。開放皮膚の境界は、白色の線によって示される。図５Ｇ；１６週間前にｈＭＡＰＣを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスに移植したｅＧＦＰ^＋ＬＮ（緑色）を拡大した明視野／蛍光画像の重ね合わせは、ＬＮへのローダミン標識レクチン（赤色）の排出を示す。矢頭は、輸入リンパ管を示す。スケールバー：２００μｍ（Ｇ）；３ｍｍ（Ａ、Ｅ、Ｆ）。

図６Ａ〜６Ｃ；１６週間前にＰＢＳ（Ａ）またはｈＭＡＰＣ（「ｈＭ」；Ｂ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスの移植リンパ節（ＬＮ）に至る血管ネットワークの明視野画像および対応する定量（Ｃ；データは、平均±ＳＥＭを表す；＊マン・ホイットニーＵ検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５；ｎ＝６）。図６Ｄ；１６週間前にｈＭＡＰＣを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスに移植したｅＧＦＰ^＋ＬＮの明視野／蛍光画像の重ね合わせは、多数の血管によってＬＮが洗浄されることを示す。図６ＥおよびＦ；８週間前にｈＭＡＰＣを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスに移植したＤｓＲｅｄ^＋ＬＮを拡大した明視野／蛍光画像の重ね合わせは、広範に分岐するＬＮ血管ネットワークを示す。挿入図（ｉ１）は、Ｆの囲み枠領域に対応する。図６Ｇ；１６週間前にＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）＋ｈＭＡＰＣで処置したマウスにおけるＰｒｏｘ１／ｅＧＦＰ染色切片のＩＦ画像の重ね合わせは、分岐の一部がリンパ管（Ｐｒｏｘ１^＋、矢頭）であることを示す。挿入図（ｉ２）は、Ｇの囲み枠領域に対応する。図６Ｈ〜Ｊ；ＬＮ移植８週間後におけるＰＢＳ（Ｈ）またはｈＭＡＰＣ処置（「ｈＭ」；Ｉ）マウスの縫合糸周辺領域のＬＹＶＥ１染色（赤色）横断切片および対応する定量（Ｊ；データは、平均±ＳＥＭを表す。＊スチューデントｔ検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５；ｎ＝５〜８）。図６Ｋ〜Ｍ；移植ｅＧＦＰ^＋ＬＮ周辺領域の蛍光画像（Ｋにおいて破線によって囲まれる；Ｐｒｏｘ１について染色した隣接切片（緑色）はＬに示されている；Ｐｒｏｘ１／平滑筋αアクチン（αＳＭＡ、赤色は矢頭によって示されている；Ｍにおいて二重染色は、Ｋ、Ｌの囲み枠領域の拡大したものである；および図６Ｎは、ＬＹＶＥ１について染色した隣接横断切片（赤色）上の同じ領域を表す）は、１６週間前にｈＭＡＰＣを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスにおけるＰｒｏｘ１^＋αＳＭＡ^＋ＬＹＶＥ１⁻流入領域リンパ集合管を示す。Ｌ〜Ｎのアスタリスクはリンパ（これは、チラミドベースの増幅に曝露されると人工的に蛍光を発する）を示す。Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｌの白色の矢印は、移植ＬＮを固定するために使用した縫合糸を示す。スケールバー：２０μｍ（Ｍ、Ｎ）；５０μｍ（Ｇ、Ｋ、Ｌ）；１００μｍ（Ｄ）；１５０μｍ（Ｆ；ｉ１）；２００μｍ（Ｅ、Ｈ、Ｉ）；５００μｍ（Ｆ）；１ｍｍ（Ａ、Ｂ）。

図７Ａ；創傷１０日後までＰＢＳ（ｎ＝５：白丸）またはｍＭＡＰＣ（ｎ＝５；黒丸）で処置したマウスにおける創傷長（ｍｍ単位）を表す図。データは、平均±ＳＥＭを表す。＊反復測定ＡＮＯＶＡとフィッシャー事後検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５。図７ＢおよびＣ；創傷１０日後にＰＢＳ（Ｂ）またはマウス（ｍ）ＭＡＰＣ（Ｃ）で処置したマウスの背部の線状創傷の代表的な明視野写真。図７ＤおよびＥ；ＰＢＳ（Ｄ）またはｍＭＡＰＣ（Ｅ）で処置したマウス由来の１０日齢創傷の横断切片をＨ＆Ｅで染色した代表的な写真。ｍＭＡＰＣ処置マウスでは、創傷間隙（wound gap）（その縁は矢頭によって示される）が有意に小さいことに留意する。図７Ｆ；創傷横断切片の赤色および緑色蛍光画像の重ね合わせ写真は、ＣＤ４５（緑色）とＬＹＶＥ１（赤色）との非共局在を示す。図７Ｇ；ｅＧＦＰ標識ｈＭＡＰＣを播種した２４時間後の創傷床の明視野／蛍光画像の重ね合わせ写真は、創傷領域全体でｅＧＦＰ＋ｈＭＡＰＣの分布が均一であることを示す。図７Ｈ；１０日前にｈＭＡＰＣを移植したマウスのビメンチン染色（緑色）創傷横断切片の画像は、創傷床全体に均一に分布したｈＭＡＰＣの大きなパッチの持続性を示す。真皮−表皮接合部は、破線によって示されている。Ｈでは、核対比染色としてＤＡＰＩを使用した。スケールバー：２０μｍ（Ｆ）；１００μｍ（Ｈ）；３００μｍ（Ｄ、Ｅ）；１ｍｍ（Ｇ）；および２ｍｍ（Ｂ、Ｃ）。

図８Ａ〜Ｄ；ＰＢＳ（Ａ）、ｍＭＡＰＣ（「ｍＭ」；Ｂ）またはｈＭＡＰＣ（「ｈＭ」；Ｃ）で処置したマウス由来の（図３Ａの「Ｘ」によって示される移植部位周辺の）皮膚創傷の横断切片をＣＤ３１（褐色）について染色した代表的な写真および対応する定量（Ｄ；データは、平均±ＳＥＭを表す。＊クラスカル・ワリス検定とダン事後検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５；ｎ＝５）。図８Ｅ〜８Ｈ；ＰＢＳ（Ｅ）、ｍＭＡＰＣ（「ｍＭ」；Ｆ）またはｈＭＡＰＣ（「ｈＭ」；Ｇ）で処置したマウス由来の（図３Ａの矢印によって示されるデキストラン注射部位周辺の）皮膚創傷の横断切片をＬＹＶＥ１（Ｅ、Ｇの赤色；Ｆの緑色）について染色した代表的な写真および対応する定量（Ｈ；データは、平均±ＳＥＭを表す。＊クラスカル・ワリス検定とダン事後検定によって、ＰＢＳに対してＰ＜０．０５；ｎ＝６）。図８Ｉ；２週間前にｈＭＡＰＣを移植したマウスの（図３Ａの「Ｘ」によって示される移植部位周辺の）創傷領域の緑色（ＦＩＴＣ標識デキストラン）、赤色（Ｐｒｏｘ１）および遠赤色（平滑筋細胞−α−アクチン；αＳＭＡ）蛍光顕微鏡画像の重ね合わせ写真は、２つの小さな機能的Ｐｒｏｘ１^＋／αＳＭＡ⁻リンパ毛細管（白色破線によって囲まれる）に加えて、機能的αＳＭＡ被覆（矢頭）Ｐｒｏｘ１^＋リンパ（プレ）集合管を示す。筋膜の自己蛍光筋細胞は、赤色破線によって囲まれる。スケールバー：１０μｍ（Ｉ）；および１００μｍ（Ａ〜Ｃ、Ｅ〜Ｇ）。

図９ＡおよびＢ；ＬＮ移植１６週間後に記録された、ＰＢＳ（Ａ）またはｈＭＡＰＣ（Ｂ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスの前腕部の図５Ｃ、Ｄに示されているＴ_２強調ＭＲ画像に対応するＴ_２マップ。Ｌ：左；Ｒ：右。図９Ｃ；８週間前にＤｓＲｅｄ^＋ＬＮを移植し、ｈＭＡＰＣを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスの右腋窩部の緑色および赤色蛍光顕微鏡像の重ね合わせ写真。矢頭によって示される、ＦＩＴＣ標識レクチン（緑色）が充満した輸入リンパ管に留意する。図９ＤおよびＥ；１６週間前にｅＧＦＰ^＋ＬＮを移植し、ＰＢＳ（Ｄ）またはｈＭＡＰＣ（Ｅ）を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスの右腋窩部の明視野および緑色蛍光画像の重ね合わせ写真は、ｈＭＡＰＣ処置マウスの移植ＬＮを洗浄するより精巧な血管ネットワークを示す。図９Ｆ；１６週間前にｅＧＦＰ^＋ＬＮを移植し、ｈＭＡＰＣで処置したマウスの右腋窩部の横断切片の赤色および緑色蛍光画像の重ね合わせ写真は、移植ＬＮ周囲の持続するビメンチン染色（赤色）ｈＭＡＰＣを示す。図９Ｇ；４週間前にｅＧＦＰ^＋ＬＮを移植し、ｈＭＡＰＣを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスの右腋窩部の明視野および緑色蛍光画像の重ね合わせ写真は、外側に向かって分岐する（リンパ）脈管ネットワークを示す。図９Ｈ；１６週間前にｅＧＦＰ^＋ＬＮを移植し、ｈＭＡＰＣを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で処置したマウスの右腋窩部のｅＧＦＰ染色横断切片の重ね合わせ写真は、外側に向かって分岐する（リンパ）脈管ネットワークを示す。Ｃ〜Ｅでは、移植ＬＮを固定する永久縫合糸は、矢印によって示されている。Ｆ〜Ｈでは、ＬＮ本体は、白色破線によって囲まれている。Ｆ、Ｈでは、ＤＡＰＩを使用して核を明らかにした。スケールバー：２５μｍ（Ｆ）；１００μｍ（Ｈ）；１５０μｍ（Ｇ）；および２５０μｍ（Ｃ〜Ｅ）。

発明の詳細な説明
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬などに限定されず、従って、変化し得ると理解すべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、開示される本発明の範囲（これは、特許請求の範囲によってのみ規定される）を限定することを意図しない。

セクションの見出しは、本明細書では編成目的のためにのみ使用され、記載される主題を限定すると決して解釈されるべきでない。

本出願の方法および技術は、一般に、特に指示がない限り、当技術分野で周知の従来の方法にしたがって、ならびに本明細書を通して引用および議論される様々な一般的およびより的確な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと。
定義

「ａ」または「ａｎ」は、本明細書では、１つまたは１つを超える；少なくとも１つを意味する。複数形が本明細書で使用される場合、それは、一般に単数形を含む。

本出願で使用される場合、「包帯」という用語は「包帯剤」または「パッチ」という用語と同義である。なぜなら、それらの用語は、細胞を付着させた官能化基材を指すからである。これらのデバイスは、細胞を含む包帯、細胞を含むパッチ、および細胞を含む包帯剤と称されている。これらの実施形態では、基材に付着させた細胞は、創傷に操作可能に近接して適用される場合、パッチ、包帯剤または包帯を離れて創傷に遊走する。いくつかの場合では、これらの包帯／パッチは、プラズマポリマーのコーティングから構成され得る。前述のように、これは、細胞を付着させた官能化基材から構成され得る。

「臨床的に関連する」数の細胞は、臨床応答（すなわち、被験体における望ましくない状態の予防、軽減、改善など）をもたらすため十分な細胞数を指す。特定の実施形態は、マスター細胞バンクを作り出すために十分な細胞数に関連する。

「共投与」は、２つまたはそれを超える薬剤（agent）の同時投与または逐次投与を含む、互いに共同して、一緒に、協調して投与することを意味する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、限定されないが、その他の含まれ得るものに対するいかなる制限または排除も伴わずに指示対象を必ず含むことを意味する。例えば、「ｘおよびｙを含む組成物」は、他の成分が組成物中に存在し得るとしても、ｘおよびｙを含有する任意の組成物を包含する。同様に、「ｘのステップを含む方法」は、どれ程多くの他のステップが存在し得るとしても、およびそれらと比較してｘがどれ程単純または複雑であるとしても、ｘが方法の唯一のステップであるか、またはそれが複数のステップの１つに過ぎないかにかかわらず、ｘを行う任意の方法を包含する。「構成される」および「含む」という語源の単語を使用する同様の語句は、本明細書では「含む」の同義語として使用され、同じ意味を有する。

「構成される」は、「含む」の同義語である（上記を参照のこと）。

「馴化細胞培養培地」は、当技術分野で周知の用語であり、細胞を成長させた培地を指す。本明細書では、これは、本出願に記載される結果のいずれかを達成するために有効な因子を分泌するために十分な時間にわたって細胞を成長させることを意味する。

馴化細胞培養培地は、因子を培地中に分泌するように細胞を培養した培地を指す。本発明の目的のために、培地がこの効果を有するように、有効量のこのような因子を産生するために十分な数の細胞分裂によって、細胞を成長させ得る。細胞は、限定されないが、遠心分離、ろ過、免疫枯渇（例えば、タグ付抗体および磁気カラムによる）およびＦＡＣＳソーティングを含む当技術分野で公知の方法のいずれかによって、培地から取り出される。

「有効量」は、一般に、所望の局所効果または全身効果を提供する量を意味する。例えば、有効量は、有益なまたは所望の臨床結果を達成するために十分な量である。有効量は、単回投与で一度に全てが提供され得るか、または複数回投与で有効量を提供する分割量で提供され得る。有効量と考えられる量の正確な決定は、被験体のサイズ、年齢、傷害および／または処置される疾患もしくは傷害、ならびに傷害が発生してからのまたは疾患が開始してからの時間量を含む各被験体に固有の要因に基づき得る。当業者であれば、当技術分野でルーチンなこれらの検討事項に基づいて、所定の被験体のための有効量を決定することができる。本明細書で使用される場合、「有効用量」は、「有効量」と同じものを意味する。

「有効経路」は、一般に、所望の区画、系または場所への薬剤の送達を提供する経路を意味する。例えば、有効経路は、薬剤を投与して、有益なまたは所望の臨床結果を達成するために十分な量の薬剤を所望の作用部位に提供し得るものである。

「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語の使用は、限定することを意図するものではない。

「増加させる」または「増加させること」は、既存の存在がない場合には完全に誘導すること、またはその程度を増加させることを意味する。

「単離された」という用語は、インビボで１つまたは複数の細胞に結合している１つもしくはそれを超える細胞または１つもしくはそれを超える細胞成分に結合していない１つまたは複数の細胞を指す。「富化集団」は、インビボまたは初代培養における１つまたはそれを超える他の細胞型と比べた、所望の細胞の数の相対的な増加を意味する。

しかしながら、本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、幹細胞のみの存在を示さない。むしろ、「単離された」という用語は、細胞がそれらの天然組織環境から取り出され、正常な組織環境と比較して高い濃度で存在することを示す。したがって、「単離された」細胞集団は、幹細胞に加えて、細胞型をさらに含み得、さらなる組織成分を含み得る。これはまた、例えば、細胞倍加に関して表され得る。細胞は、インビボまたはその元の組織環境（例えば、骨髄、末梢血、脂肪組織など）におけるその元の数と比較して富化されるように、インビトロまたはエクスビボで１０回、２０回、３０回、４０回またはそれを超える倍加を受け得る。

「ＭＡＰＣ」は、「複能性成体前駆細胞」の頭字語である。それは、胚性幹細胞または生殖細胞ではないがこれらのいくつかの特徴を有する細胞を指す。ＭＡＰＣは、多くの代替記述（これらはそれぞれ、細胞が発見されたときに、新規性をそれらの細胞に付与した）で特性評価され得る。したがって、それらは、それらの記述の１つまたはそれよりも多くによって特性評価され得る。第１に、それらは、培養において、形質転換（腫瘍原性）されることなく、かつ正常核型を有して、長期にわたる複製能力を有する。第２に、それらは、分化により、１つを超える胚葉、例えば２つまたは３つすべての胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）の子孫の細胞を生じさせ得る。第３に、それらは、胚性幹細胞または生殖細胞ではないが、ＭＡＰＣがＯｃｔ３／４（別名Ｏｃｔ３ＡまたはＯｃｔ４）、ｒｅｘ−１およびｒｏｘ−１の１つまたはそれよりも多くを発現し得るように、それらは、これらの原始細胞型のマーカーを発現し得る。それらはまた、ｓｏｘ−２およびＳＳＥＡ−４の１つまたはそれよりも多くを発現し得る。第４に、幹細胞と同様に、それらは自己再生し得る（すなわち、形質転換されずに、長期にわたる複製能力を有する）。これは、これらの細胞がテロメラーゼを発現する（すなわち、テロメラーゼ活性を有する）ことを意味する。したがって、「ＭＡＰＣ」と命名された細胞型は、その新規特性のいくつかのによって細胞を説明する代替的な基本的特徴を特徴とし得る。

ＭＡＰＣにおける「成体」という用語は、非限定的である。それは、非胚性体細胞を指す。ＭＡＰＣは核型的に正常であり、インビボで奇形腫または他の腫瘍を形成しない。この頭字語は、骨髄から単離された多能性細胞を説明するために、米国特許第７，０１５，０３７号で最初に使用された。しかしながら、多能性マーカーおよび／または分化潜在能を有する細胞がその後発見されており、本発明の目的では、最初に「ＭＡＰＣ」と命名された細胞と同等であり得る。ＭＡＰＣタイプの細胞の説明は、上記発明の概要に提供されている。

ＭＡＰＣは、ＭＳＣよりも原始の前駆細胞集団を表す（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，Ｃ．Ｍ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：５０２−８（２００２）、Ｊａｈａｇｉｒｄａｒ，Ｂ．Ｎら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，２９：５４３−５６（２００１）；Ｒｅｙｅｓ，Ｍ．ａｎｄ Ｃ．Ｍ．Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，９３８：２３１−２３３（２００１）；Ｊｉａｎｇ，Ｙら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，３０８９６−９０４（２００２）；およびＪｉａｎｇ，Ｙら、Ｎａｔｕｒｅ，４１８：４１−９．（２００２）。

「前駆細胞（progenitor cell）」は、幹細胞の分化中に産生される細胞であって、それらの最終分化子孫の特徴のすべてではないがいくつかを有する細胞である。所定の前駆細胞、例えば「心臓前駆細胞」は系統にコミットされるが、特異的なまたは最終分化細胞型にはコミットされない。「ＭＡＰＣ」という頭字語で使用される場合の「前駆」という用語は、これらの細胞を特定の系統に限定しない。前駆細胞は、前駆細胞よりも高度に分化した子孫細胞を形成し得る。

選択は、組織中の細胞からであり得る。例えば、この場合、細胞は、所望の組織から単離され、培養において増殖され、所望の特徴について選択され、選択細胞はさらに増殖される。

「自己再生」は、それから複製娘幹細胞が生じた細胞と同一の分化潜在能を有する複製娘幹細胞を産生する能力を指す。この文脈で使用される類似の用語は、「増殖」である。

「無血清培地」は、血清が存在しない培地、または存在する場合には、血清の成分が細胞の成長もしくは生存能力に対して効果を有しないレベルで血清が存在する（すなわち、実際には不要であり、例えば、残存量または微量である）培地を指す。

「幹細胞」は、自己再生（すなわち、同じ分化潜在能を有する子孫）を行い得る細胞であって、分化潜在能がより制限された子孫細胞を産生し得る細胞を意味する。

「被験体」は、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒトを意味する。哺乳動物としては、限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシおよびブタが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「創傷」という用語は、急性外傷または病理学的根本原因によって引き起こされ得る組織（例えば、皮膚）の完全性の破損、例えば本出願に記載されている皮膚創傷および皮下創傷を意味する。

創傷は、限定されないが、自己免疫疾患、移植器官の拒絶、火傷、切傷、裂傷および潰瘍形成（皮膚潰瘍形成および糖尿病性潰瘍形成を含む）を含む原因に由来し得る。

火傷、切傷、裂傷および潰瘍形成（限定されないが、皮膚潰瘍形成および糖尿病性潰瘍形成を含む）によって引き起こされる上皮損傷を修復するために、幹細胞は、動物に投与され得る。

創傷の例としては、開放創および閉鎖創の両方が挙げられ得る。特定の実施形態では、創傷は、外部創傷を含む。特定の実施形態では、創傷は、開放創を含む。特定の実施形態では、創傷は、慢性創傷を含む。特定の実施形態では、創傷は、慢性創傷または潰瘍を含む。

特定の実施形態では、組成物は、被験体への局所適用、局所投与または局所送達に適切である。局所製剤は、本明細書に記載されるとおりである。他の細胞送達形態が企図される。

局所投与の用量および頻度は、当業者によって決定され得る。

局所投与のための形態の例としては、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、発泡体、エマルジョン、懸濁液、スプレー、エアロゾル、溶液、液体、粉末、半固体、ゲル、ゼリー、座薬；固体、軟膏、ペースト、チンキ剤、塗布薬、パッチによる送達、または包帯、ガーゼもしくは包帯剤からの放出が挙げられる。他の局所送達形態が企図される。

局所放出のための製品に基材を組み込むための方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｂｏａｔｅｎｇ Ｊ．Ｓら、（２００８）“Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ”Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（８）：２８９２−２９２３および“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（２００５）ｂｙ Ｍｅｙｅｒ Ｒｏｓｅｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｗｉｌｌｉａｍ Ａｎｄｒｅｗ Ｉｎｃ，Ｎｏｒｗｉｃｈ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。

特定の実施形態では、組成物は、静脈内投与、エアロゾル化投与、非経口投与、埋め込み、皮下注射、関節内、直腸、鼻腔内、眼内、膣または経皮の１つまたはそれよりも多くによる被験体への送達に適切である。

特定の実施形態では、組成物は、送達のための細胞の活性および／または細胞の送達もしくは移入を増強、安定化または維持する他の化合物を含む。

特定の実施形態では、注射によって組成物を投与することが望ましい場合がある。注射用途に適切な形態としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。

特定の実施形態では、組成物を静脈内投与することが望ましい場合がある。静脈内投与に適切な本明細書に記載される組成物を含有する組成物は、当業者によって製剤化され得る。

特定の実施形態では、被験体は、ヒトまたは動物被験体である。特定の実施形態では、被験体は、ヒト被験体である。

特定の実施形態では、被験体は、哺乳動物被験体、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ）、家庭動物（例えば、イヌまたはネコ）および他のタイプの動物、例えばサル、ウサギ、マウス、実験動物、鳥類および魚類である。他のタイプの動物が企図される。本開示の獣医学的適用が企図される。動物モデルとして上記動物のいずれかを使用することも企図される。

本開示は、創傷を治癒または処置する方法であって、本明細書に記載される製品または組成物を使用して、細胞を創傷に送達することを含む方法を提供する。
ＭＡＰＣ

ヒトＭＡＰＣは、米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている。ＭＡＰＣは、他の哺乳動物において同定された。マウスＭＡＰＣもまた、例えば、米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている。ラットＭＡＰＣもまた、米国特許第７，８３８，２８９号に記載されている。これらの参考文献は、ＭＡＰＣ、それらの表現型および培養の記載について、参照により組み込まれる。
ＭＡＰＣの単離および成長

ＭＡＰＣの単離方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第７，０１５，０３７号を参照し、これらの方法は、ＭＡＰＣの特性評価（表現型）と一緒に参照により本明細書に組み込まれる。ＭＡＰＣは、限定されないが、骨髄、胎盤、臍帯および臍帯血、筋肉、脳、肝臓、脊髄、血液または皮膚を含む複数の供給源から単離され得る。したがって、骨髄吸引物、脳または肝臓生検および他の臓器を取得し、これらの細胞において発現される（または発現されない）遺伝子に依拠して、当業者に利用可能なポジティブ選択技術またはネガティブ選択技術を使用して（例えば、上記で参照されている出願（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものなどの機能的または形態学的なアッセイによって）、前記細胞を単離することが可能である。

齧歯類ＭＡＰＣはまた、Ｂｒｅｙｅｒら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３４：１５９６−１６０１（２００６）およびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｓ．Ｄｉｎｇ（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６３６：５５−７８（２０１０）（これらは、これらの方法について参照により組み込まれる）に記載されている改良方法によって得られた。ヒトＭＡＰＣは、Ｒｏｏｂｒｏｕｃｋら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２９：８７１−８８２（２０１１）（これは、これらの方法について参照により組み込まれる）に記載されている改良方法によって得られた。
米国特許第７，０１５，０３７号に記載されているヒト骨髄由来のＭＡＰＣ

ＭＡＰＣは、共通の白血球抗原ＣＤ４５または赤芽球特異的グリコホリン−Ａ（Ｇｌｙ−Ａ）を発現しない。細胞の混合集団をＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ分離に供した。次いで、抗ＣＤ４５抗体および抗Ｇｌｙ−Ａ抗体を使用するネガティブ選択に細胞を供し、ＣＤ４５^＋およびＧｌｙ−Ａ^＋細胞の集団を枯渇させ、次いで、残った約０．１％の骨髄単核細胞を回収した。また、細胞をフィブロネクチンコーティングウェルにプレーティングし、以下に記載されているように２〜４週間培養して、ＣＤ４５^＋およびＧｌｙ−Ａ^＋細胞を枯渇させ得る。接着性骨髄細胞の培養では、多くの接着性間質細胞は、約３０回の細胞倍加で複製老化を受け、より均一な細胞集団が増殖し続けて、長いテロメアを維持する。

あるいは、ポジティブ選択は、細胞特異的マーカーの組み合わせによって細胞を単離するために使用され得る。ポジティブ選択技術およびネガティブ選択技術は両方とも当業者に利用可能であり、ネガティブ選択目的に適切な多数のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体も当技術分野で利用可能であり（例えば、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｖ，Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎら、Ｅｄｓ．（１９９５）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、多くの供給業者から市販されている。

細胞集団の混合物から哺乳動物細胞を分離するための技術はまた、Ｓｃｈｗａｒｔｚら米国特許第５，７５９，７９３号（磁気分離）、Ｂａｓｃｈら、１９８３（イムノアフィニティークロマトグラフィー）およびＷｙｓｏｃｋｉ ａｎｄ Ｓａｔｏ，１９７８（蛍光活性化細胞選別）に記載されている。

細胞は、低血清または無血清培養培地中で培養され得る。ＭＡＰＣを培養するために使用される無血清培地は、米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている。一般に使用される成長因子としては、限定されないが、血小板由来成長因子および上皮成長因子が挙げられる。例えば、米国特許第７，１６９，６１０号；米国特許第７，１０９，０３２号；米国特許第７，０３７，７２１号；米国特許第６，６１７，１６１号；米国特許第６，６１７，１５９号；米国特許第６，３７２，２１０号；米国特許第６，２２４，８６０号；米国特許第６，０３７，１７４号；米国特許第５，９０８，７８２号；米国特許第５，７６６，９５１号；米国特許第５，３９７，７０６号；および米国特許第４，６５７，８６６号（これらはすべて、無血清培地における細胞の成長の教示について、参照により組み込まれる）を参照のこと。
さらなる培養方法

さらなる実験では、ＭＡＰＣを播種する密度は、細胞約１００個／ｃｍ^２または細胞約１５０個／ｃｍ^２〜細胞約１０，０００個／ｃｍ^２（細胞約２００個／ｃｍ^２〜細胞約１５００個／ｃｍ^２〜細胞約２０００個／ｃｍ^２を含む）で変動し得る。密度は、種間で変動し得る。加えて、最適な密度は、培養条件および細胞源に応じて変動し得る。所定の一連の培養条件のための最適な播種密度を決定することは当業者の技術範囲内である。

また、培養におけるＭＡＰＣの単離、成長および分化の間の任意の時点において、約１〜５％、特に３〜５％を含む約１０％未満の有効な大気中酸素濃度が使用され得る。

細胞は、様々な血清濃度、例えば約２〜２０％下で培養され得る。ウシ胎児血清が使用され得る。より高い血清は、より低い酸素圧と組み合わせて使用され得る（例えば、約１５〜２０％）。培養皿への接着前に、細胞が選択される必要はない。例えば、Ｆｉｃｏｌｌ勾配後に、細胞は、例えば、２５０，０００〜５００，０００個／ｃｍ^２で直接プレーティングされ得る。接着コロニーを採取し、場合によりプールして増殖させ得る。

一実施形態では、高血清（約１５〜２０％）および低酸素（約３〜５％）条件が細胞培養に使用される。例えば、コロニー由来の接着性細胞は、１８％血清および３％酸素（ＰＤＧＦおよびＥＧＦを含む）中で、細胞約１７００〜２３００個／ｃｍ^２の密度でプレーティングおよび継代され得る。

ＭＡＰＣに特異的な実施形態では、サプリメントは、１つを超える胚系統、例えば３つすべての系統の細胞型に分化する能力をＭＡＰＣが保持することを可能にする細胞因子または成分である。これは、未分化状態の特異的なマーカー、例えばＯｃｔ３／４（別名Ｏｃｔ４またはＯｃｔ３Ａ）および／または高発現能力のマーカー、例えばテロメラーゼの発現によって示され得る。

以下に列挙されているすべての成分については、米国特許第７，０１５，０３７号を参照のこと（これは、これらの成分の教示について、参照により組み込まれる）。

幹細胞は、多くの場合、固体支持体へのそれらの付着を促すさらなる因子、例えばフィブロネクチンを必要とする。本発明の一実施形態は、フィブロネクチンを利用する。例えば、Ｏｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１３：８８０−８８５（２００７）；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０５：３５０−３５４（２００８）；Ｋｉｒｏｕａｃら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：３６９−３８１（２００８）；Ｃｈｕａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２６：２５３７−２５４７（２００５）；Ｄｒｏｂｉｎｓｋａｙａら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２６：２２４５−２２５６（２００８）；Ｄｖｉｒ−Ｇｉｎｚｂｅｒｇら、ＦＡＳＥＢ Ｊ，２２：１４４０−１４４９（２００８）；Ｔｕｒｎｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ｐａｒｔ Ｂ：Ａｐｐｌ Ｂｉｏｍａｔｅｒ，８２Ｂ：１５６−１６８（２００７）；およびＭｉｙａｚａｗａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２２：１９５９−１９６４（２００７））を参照のこと。

培養が完了したら、細胞をそのまま使用し得るか、または例えば２０％〜４０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭを使用して凍結ストックとして凍結および保存し得る。一実施形態では、２０％ＦＣＳが使用される。培養細胞のための凍結ストックを調製するための他の方法も当業者に利用可能である。

本出願の目的のために、さらなる培養方法および他の培養方法はまた、上記培地成分および条件に関して、バイオリアクター方法に適用される。一例として、例示的な実施形態では、酸素濃度は５％であり、血清は約１９％であり、ＥＧＦおよびＰＤＧＦは両方とも培地に追加される。
医薬製剤

米国特許第７，０１５，０３７号は、医薬製剤の教示について、参照により組み込まれる。特定の実施形態では、細胞集団は、送達に適合された組成物であって、送達に適切な（すなわち、生理学的に適合性の）組成物内に存在する。

いくつかの実施形態では、被験体への投与のための細胞の純度（または馴化培地）は、約１００％（実質的に均一）である。他の実施形態では、それは、９５％〜１００％である。いくつかの実施形態では、それは、８５％〜９５％である。特に、他の細胞との混合物の場合、割合は、約１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％または９０％〜９５％であり得る。または、単離／純度は、細胞が、例えば１０〜２０回、２０〜３０回、３０〜４０回、４０〜５０回またはそれを超える細胞倍加を受けた細胞倍加に関して表され得る。

所定の用途のための細胞を投与するための製剤の選択は、様々な要因に依存する。これらのうち顕著なものは、被験体の種、処置される状態の性質、被験体におけるその状況および分布、投与される他の治療および薬剤の性質、最適な投与経路、前記経路を介した生存性、投与レジメン、ならびに当業者に明らかな他の要因である。例えば、適切なキャリアおよび他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形の性質に依存する。

細胞／培地の水性懸濁液の最終製剤は、典型的には、懸濁液のイオン強度を等張性（すなわち、約０．１〜０．２）および生理学的ｐＨ（すなわち、約ｐＨ６．８〜７．５）に調整することを伴う。最終製剤はまた、典型的には、流体潤滑剤を含有する。

いくつかの実施形態では、細胞／培地は、単位注射用剤形、例えば溶液、懸濁液またはエマルジョンで製剤化される。細胞／培地の注射に適切な医薬製剤は、典型的には、滅菌水溶液および分散液である。注射用製剤のためのキャリアは、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。

当業者であれば、本発明の方法において投与すべき組成物中の細胞ならびに任意選択の添加剤、ビヒクルおよび／またはキャリアの量を容易に決定し得る。典型的には、（細胞に加えて）任意の添加剤は、溶液、例えばリン酸緩衝食塩水中で０．００１〜５０ｗｔ％の量で存在する。有効成分は、マイクログラムからミリグラムほど、例えば約０．０００１〜約５ｗｔ％、好ましくは約０．０００１〜約１ｗｔ％、最も好ましくは約０．０００１〜約０．０５ｗｔ％または約０．００１〜約２０ｗｔ％、好ましくは約０．０１〜約１０ｗｔ％、最も好ましくは約０．０５〜約５ｗｔ％で存在する。

リンパ浮腫におけるＭＡＰＣ支援リンパ管成長
ＭＡＰＣは、リンパ脈管形成潜在能およびリンパ脈管新生潜在能を有する
本発明者らは、ＭＡＰＣが、ＬＥＣを生じさせる固有能力を有するかを調査した。最初に、本発明者らは、ＶＥＧＦ−Ａ曝露により、ＭＡＰＣが一般的なＥＣマーカーの発現を獲得することを確認した（図１Ａ、Ｂ）。内皮分化の２週間（２ｗ）でＭＡＰＣでは、Ｐｒｏｘ１（リンパ管分化のマスタースイッチ）が有意に誘導され、その発現レベルは、１週間後まで依然として安定していた（図１Ａ、Ｂ）。Ｐｒｏｘ１誘導はまた、強制的なＰｒｏｘ１発現によってアップレギュレートされることが公知のさらなるリンパ系遺伝子（すなわち、ＰｄｐｎおよびＩｔｇ９ａ）（３６）の発現をトリガーした可能性がある。ＶＥＧＦ−Ａに曝露した一定割合（２１±６％）のＭＡＰＣはまた、ＬＹＶＥ１を発現した（ｍＭＡＰＣについては、タンパク質レベルで示されている；図１Ｃ）。特に、リンパ脈管新生ＧＦ ＶＥＧＦ−Ｃの存在下では、ｈＭＡＰＣにおけるリンパ系マーカー遺伝子発現の誘導はさらに改善されなかった（図１ＤにおいてＬＹＶＥ１について示されている；ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃまたは組み合わせに曝露すると、０日目に対するＰＲＯＸ１誘導倍率も同程度であった：それぞれ２６±１０、２６±１４および２６±１１；ｎ＝４）。ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ（ＥＣのリンパ能力（lymphatic competence）を共同決定する転写因子）（３６、３７）は、分化過程を通して比較的高い一定レベルで発現していた（示さず）。したがって、ＭＡＰＣは、ＬＥＣ分化プログラムを開始させる固有能力を有する。

ＭＡＰＣはＶＥＧＦ−Ａ（これは、ＬＥＣに対するＭＳＣの栄養効果に関与する）を分泌することが公知であるので、本発明者らは、ＭＡＰＣが、ＬＥＣとのクロストークによってリンパ脈管新生に対して効果を有し得ると推論した。７２時間のＭＡＰＣ上清は、ＬＥＣ発芽、増殖および遊走を有意に刺激した（図１Ｅ〜Ｍ）。したがって、ＭＡＰＣは、直接的効果と間接的効果との組み合わせによって、リンパ管の形成を支援し得る。
ＭＡＰＣは、創傷治癒中の生理学的リンパ脈管新生に寄与する

創傷治癒は、新たな血液およびリンパ管の成長を必要とする（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋら、２００７．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２００７）１７０：１１７８−１１９１）。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける線状背部皮膚切開の直後に強化（ｅ）ＧＦＰを遍在的に発現するマウス由来のｍＭＡＰＣの移植は、ＰＢＳ注射と比較して、創傷閉鎖の有意な加速（図２Ａおよび図７Ａ）およびより小さい瘢痕の発生（図７Ｂ〜Ｅ）をもたらした。すべてのｍＭＡＰＣ注射創傷は完全に再上皮化したが、ＰＢＳ処置創傷の６０％は、１０日において新表皮で部分的に覆われていたに過ぎなかった。インビボ蛍光イメージングにより、注射４日後において、ｅＧＦＰ^＋ｍＭＡＰＣは、創傷床に向かって成長する血管に近接して位置していたことが明らかになった（図２Ｂ）。したがって、ｍＭＡＰＣ移植は、創傷中心におけるＣＤ３１^＋血管のデノボ成長を２倍増強した（ＣＤ３１^＋血管の数／面積（ｍｍ^２）：ｍＭＡＰＣ処置マウスでは７６±４であるのに対して、ＰＢＳ注射マウスでは３６±１６；ｎ＝５、マン・ホイットニーＵ検定によって、Ｐ＜０．０５；図２Ｃ，Ｄ）。以前の肢虚血研究（Ａｒａｎｇｕｒｅｎ，Ｘ．Ｌら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００８）１１８：５０５−５１４）と一致して、この創傷治癒モデルでは、ＣＤ３１^＋ＥＣへの直接的な寄与はわずかであった。ｍＭＡＰＣはまた、ＬＹＶＥ１^＋リンパ毛細管成長を有意に３倍増加させ、分化ＬＥＣに寄与することもあった（図２Ｅ〜Ｈ）。ＬＹＶＥ１^＋細胞の大部分は、ＣＤ４５（汎白血球マーカー）と共局在しなかったので、マクロファージ中間体（これは、移植腎臓におけるリンパ管に寄与することが以前に示唆された（Ｋｅｒｊａｓｃｈｋｉ，Ｄら、Ｎａｔ Ｍｅｄ（２００６）１２：２３０−２３４））ではなく、リンパ内皮細胞（ＬＥＣ）であった（図７Ｆ）。

無胸腺ヌードマウスにおける円形創傷に適用したｈＭＡＰＣは、治癒を有意に促進した。ｈＭＡＰＣを移植してからの創傷領域のライブイメージングおよび横断切片により、創傷床におけるそれらの均一な分布が示された（図７Ｇ、Ｈ）。ｈＭＡＰＣは、上皮被覆を加速させた（５日（５ｄ）の％被覆：ｈＭＡＰＣ処置では４６±５であるのに対して、ビヒクル処置創傷では７±２；ｎ＝６、マン・ホイットニーＵ検定によって、Ｐ＜０．０５；図２Ｉ，Ｊ）。１０日目（ｄ１０）において、ｈＭＡＰＣ処置マウスでは、すべての創傷が完全に再上皮化したのに対して、ＰＢＳ処置マウスでは４６％のみであった。ｈＭＡＰＣ移植は、創傷血管化を約２倍改善した（５日の創傷境界および１０日の創傷全体における％ＣＤ３１^＋領域：ｈＭＡＰＣ処置創傷では１１±１および１３±１であるのに対して、ＰＢＳ注射創傷では６±１および６±１；ｎ＝６〜８、スチューデントｔ検定によって、Ｐ＜０．０５；図２Ｋ、Ｌ）。ＬＹＶＥ１^＋断片面積の３倍の増加によって証明されるように、ｈＭＡＰＣは、リンパ脈管新生を有意に増強した（図２Ｍ〜Ｏ）。Ｐｒｏｘ１および平滑筋α−アクチン（αＳＭＡ）の二重免疫蛍光（ＩＦ）染色により、この短期間創傷モデルでは、１０日の肉芽組織におけるリンパ管の大部分（９７±２％）は、αＳＭＡ被覆を欠く毛細管であったことが明らかになった。やはり、ｈＭＡＰＣ由来ビメンチンシグナルとＬＹＶＥ１染色との共局在によって示されるように、ｈＭＡＰＣのインサイチュＬＥＣ分化は、偶発的にのみ起こった（図２Ｐ）。したがって、ＭＡＰＣは、宿主ＬＥＣに対する栄養効果を介して主に間接的に毛細管リンパ脈管新生（capillary lymphangiogenesis）を増強することによって、創傷治癒を部分的に有意に加速させた。
ＭＡＰＣは、二次リンパ浮腫モデルにおけるリンパ管を再生する

二次リンパ浮腫におけるリンパ流を回復させるＭＡＰＣの潜在能を試験するために、腹部における全層皮膚切開によって、腋窩リンパ節（ＬＮ）へのリンパ排液を断絶した（図３Ａ）（Ｓａａｒｉｓｔｏ，Ａら、ＦＡＳＥＢ Ｊ（２００４）１８：１７０７−１７０９）。皮膚切開２週間後、創傷境界を越える蛍光色素の欠如によって示されるように、これは、ＰＢＳ処置動物の大部分（７／１０）において、正常なリンパ排液を無効化した（図３Ｂ；表１）。創傷境界周辺のＭＡＰＣ移植は、この境界を越えるリンパ排液をほぼ完全に（それぞれｍＭＡＰＣ処置マウスまたはｈＭＡＰＣ処置マウスについて、５／６例および６／６例）回復させた（図３Ｃ、Ｄ；表１）。１／１０匹のＰＢＳ注射マウスにおいてのみ、腋窩ＬＮへの排液が得られたが、３／６匹のｍＭＡＰＣ注射マウスおよび６／６匹のｈＭＡＰＣ注射マウスが、２週間後にＬＮ排液を示した。ＰＢＳまたはｍＭＡＰＣを注射したマウスの第２のセットでは、５／５匹のＭＡＰＣ処置マウスにおいて蛍光色素が創傷境界を越え、４／５匹においてＬＮ排液が回復したが、皮膚切開４週間後において、ＰＢＳ注射マウスではいずれも、創傷境界を越えるおよび腋窩ＬＮへの排液は回復しなかった（表１）。移植部位周辺の皮膚創傷領域の組織学的分析により、ＣＤ３１^＋血管の１．８倍の拡張に加えて（図８Ａ〜Ｄ）、ＭＡＰＣ注射マウスは、皮膚切開２週間後において、創傷境界におけるＦｌｔ４^＋（ＶＥＧＦＲ３^＋）およびＬＹＶＥ１^＋断片面積の約２〜３倍の増加を有していた（それぞれ図４Ａ〜Ｄ＋８Ｅ〜Ｈ）ことが明らかになった。２週の切開部周辺において、蛍光標識デキストランが充満した横断切片当たりの機能的リンパ管の平均数は、ＭＡＰＣ注射によって有意に増加した（図４Ｅ〜Ｈ）。特に、いくつかのｍＭＡＰＣは２〜４週まで存続し、流入領域リンパ管付近に滞留し、それらの内膜の一部になることもあった（図４Ｉ〜Ｌ）。創傷治癒モデルと比較して、ここでは、深く（低密度に）αＳＭＡコーティングされたＰｒｏｘ１^＋（プレ）集合管（collector vessel
）がより頻繁に観察されたが（図８Ｉ）、皮膚リンパの大部分（６７±５％）は依然として、αＳＭＡコーティングを欠いていた。それにもかかわらず、ｈＭＡＰＣ移植は、排出（プレ）集合管（collector）の数を有意に３倍増加させた（表１）。したがって、ＭＡＰＣは、創傷境界を越えて既存のリンパネットワークのギャップを埋めることによって、二次リンパ浮腫におけるリンパ機能不全を回復させた。
ＭＡＰＣは、移植リンパ節を宿主リンパネットワークに再接続する

これまで、前記結果は、ＭＡＰＣ移植がリンパ脈管新生を増加させ、主にリンパ毛細管成長を増強することによって、リンパ排液を回復させることを示している。しかしながら、二次リンパ浮腫の根本的な問題は、ほとんどの場合、損傷ＬＮと、リンパ毛細管が通常接続するリンパ集合管とに関連する。したがって、適切な治療法は、リンパ毛細管の拡張だけではなく、リンパ集合管の回復を意味するものでなければならない。この領域に移植されたＬＮの排液が、リンパ集合管の回復および遠位リンパネットワークへのそれらの再接続に決定的に依存するように、腋窩ＬＮおよびそれらの周囲のリンパ（集合管）ネットワークを外科的に切除するストリンジェントなモデルを適用した（Ｔａｍｍｅｌａ，Ｔら、Ｎａｔ Ｍｅｄ（２００７）１３：１４５８−１４６６）。ｈＭＡＰＣの潜在能を試験するために、右腋窩腔においてｄｓＲｅｄまたはｅＧＦＰを遍在的に発現するマウス由来の移植ＬＮ周辺のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）にそれらを適用した（図５Ａ）。前脚へのカラシ油（炎症剤）のチャレンジによる手術４週間後および１６週間後に磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって測定した間質液の蓄積から明らかなように、ＬＮのみの移植（およびＰＢＳを含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）によってそれを被覆）は、右上肢における炎症誘発浮腫を解消することができなかった（図５Ｂ、Ｃ＋９Ａ）。１６週において、移植ＬＮ周辺へのｈＭＡＰＣの適用により、液体の蓄積は顕著に目立たなくなったが、これは、前脚から腋窩部へのリンパ排液の機能的回復を示唆している（図５Ｂ、Ｄ＋９Ｂ）。実際、リンパ管造影により、ｈＭＡＰＣ処置マウスでは、リンパ液の排液が有意に改善され、それぞれ移植８週間後および１６週間後のｈＭＡＰＣ処置マウスの約３５％および５０〜６０％では、注射した蛍光色素が移植ＬＮに達したことが明らかになり、この結果は、２種のｈＭＡＰＣクローンでは再現されたが、ＰＢＳ処置マウスでは全く再現されなかった（図５Ｅ〜Ｇ＋９Ｃ；表２）。これにより、ｈＭＡＰＣ移植は、移植ＬＮを遠位リンパネットワークに機能的に再接続することができたことが示唆された。特に、ｈＭＡＰＣと一緒に埋め込んだＬＮはすべて存続したが、１６週のＰＢＳ注射マウスの背部では、それらの半分を見出すことができず、これは、ＬＮ生存に対するｈＭＡＰＣ移植のポジティブな効果を示唆している（表２）。また、ｈＭＡＰＣ処置マウスとは異なり、ＰＢＳ処置マウスでは、移植ＬＮの平均サイズが減少した（表２）。移植ＬＮに至る皮膚領域の検査により、ｈＭＡＰＣ処置マウスでは、血管ネットワークが２倍超精巧であり（図６Ａ〜Ｃ）、ＰＢＳ注射マウスと比較して、ＬＮの極周囲の血管が有意に多いことが明らかになった（図６Ｄ＋９Ｄ、Ｅ）。一部のｈＭＡＰＣは１６週まで存続し、移植ＬＮの付近で見出された（図９Ｆ）。ｈＭＡＰＣ処置マウスにおける移植ＬＮはすべて、４週以降それらの内部（リンパ）脈管ネットワークの（外側に向かって）分岐するという徴候を示したが、ＰＢＳ処置マウスでは、これは決して観察されなかった（図６Ｅ〜Ｇ＋９Ｇ、Ｈ；表２）。８週において、ｈＭＡＰＣ移植は、ＰＢＳ処置と比較して、ＬＮ周囲の領域におけるＬＹＶＥ１^＋リンパ管の有意な４倍の拡張をもたらした（図６Ｈ〜Ｊ）。最後に、ｈＭＡＰＣの有益な効果がリンパ集合管の機能的再接続に関連するかを試験するために、移植ＬＮ周辺の領域から採取した横断切片に対してαＳＭＡ／Ｐｒｏｘ１ ＩＦ染色を実施したところ、リンパが充満したＰｒｏｘ１^＋αＳＭＡ^＋集合管を見出した（図６Ｋ〜Ｍ）。ＬＹＶＥ１の陰性染色によって、集合管の同一性を確認した（図６Ｎ）。まとめると、ｈＭＡＰＣは、ＬＮの生存および外側に向かう分岐形成を促進することによって、ならびに集合管を介して移植ＬＮを内因性血管ネットワークに再接続することによって、ＬＮ移植後のリンパ排液を回復させた。
方法
ＭＡＰＣの誘導および分化

遍在的なｅＧＦＰ発現を有する成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６−Ｔｇ−ｅＧＦＰ）のＢＭから、ｍＭＡＰＣクローンを誘導した。記載されているように（Ａｒａｎｇｕｒｅｎ，Ｘ．Ｌら、２００８．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００８）１１８：５０５−５１４．）、低Ｏ_２（５％）および低血清（２％）条件下で、ｍＭＡＰＣを誘導および維持した。以前に記載されている誘導および培養方法にしたがって、ｈＭＡＰＣクローンを樹立した（Ｒｏｏｂｒｏｕｃｋ， Ｖ．Ｄ．ら、 Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （２０１１） ２９：８７１−８８２）。マイコプラズマ汚染について、細胞培養物をルーチンに試験した。記載されているように（Ｒｏｏｂｒｏｕｃｋ，Ｖ．Ｄら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２０１１）２９：８７１−８８２）、組換（ｒ）ｈＶＥＧＦ−Ａ_１６５またはｒｈＶＥＧＦ−Ｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）への曝露によって、内皮分化を実施した。上記ＭＡＰＣ誘導について記載されている参考文献は、これらの方法について、参照により組み込まれる。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ Ｌｅｕｖｅｎの医学倫理委員会のガイドラインにしたがってインフォームドコンセントを得た後、整形外科手術を受けている子供（５〜１５歳）の骨格筋断片（大腿四頭筋）から単離された骨片（大腿骨）およびｈＭａｂからヒトＭＡＰＣを単離した。骨片をフラッシングし、２％Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｐｒｅｍｅ（Ｌｏｎｚａ ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ ｗｗｗ．Ｌｏｎｚａ．ｃｏｍ）およびヒト血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ｗｗｗ．ｍｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）およびヒトＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（両方とも１０ｎｇ／ｍｌ）と一緒に５０ｎＭデキサメタゾン、１０^−４Ｍ Ｌ−アスコルビン酸、１×セレン−インスリン−トランスフェリン（ＩＴＳ）、０．５×リノール酸−ウシ血清アルブミン（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した６０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、４０％ＭＣＤＢ−２０１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）からなる培地に細胞０．５×１０^６個／ｃｍ^２で全細胞画分をプレーティングすることによって、ｈＭＡＰＣを生成した。５．５％ＣＯ_２加湿インキュベーター中、低酸素条件（５％Ｏ_２）下で、ヒトＭＡＰＣ培養物を細胞４００個／ｃｍ^２の密度で維持し、２〜３日ごとに継代した。継代２および継代１２の間で、１ウェル当たり５個の細胞を９６ウェルまたは４８ウェルプレートにプレーティングすることによって、クローン集団を得た。

Ｒｅｙｅｓ，Ｍら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００２）１０９：３３７−３４６に以前に記載されているように、細胞の単離および培養も実施することができる。健常ドナーから、骨髄を得る。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって得た骨髄単核細胞から、マイクロ磁気ビーズによってＣＤ４５^＋およびグリコホリンＡ^＋細胞を枯渇させる。溶出した細胞は、ＣＤ４５およびｇｌｙＡの両方について９９．５％陰性である。細胞を細胞５×１０^３個／２００μｌの濃度で９６ウェルプレートにプレーティングする。上記と同じ培地中で、これを行う。細胞が約５０％コンフルエントになったら、それらをトリプシン処理し、２×１０^３〜８×１０^３個／ｃｍ^２の濃度でより大きなプレートに移し、さらに増殖させる。Ｒｅｙｅｓら、Ｂｌｏｏｄ ９８：２６１５−２６２５に以前に記載されているように、細胞の単離および培養を実施することもできる。ｇｌｙＡ⁻およびＣＤ４５⁻細胞である細胞を収集後、５〜１０×１０^３個／ｍｌの濃度でその細胞を９６ウェルプレートにプレーティングすることができる以外は、方法は、前記のものと本質的に同じである。これらの条件すべてにおいて、培地は同じである。これらの参考文献は、細胞の単離および培養のための方法の報告について、参照により組み込まれる。

遍在的なＧＦＰ発現を有するＣ５７ＢＬ／６マウスのＢＭから、マウス細胞を誘導した。低Ｏ_２（５％）および低血清（２％）条件（Ｕｌｌｏａ−Ｍｏｎｔｏｙａ，Ｆら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．（２００７）８：Ｒ１６３．）下で、ｍＭＡＰＣを誘導および維持した。Ｂｒｅｙｅｒら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３４：１５９６−１６０１（２００６）にしたがって、ｍＭＡＰＣを誘導することもできる。これらの参考文献は、細胞を誘導する方法の提供について、参照により組み込まれる。
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ調製、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリー

Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞溶解物から全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡを逆転写し、記載されているように（Ａｒａｎｇｕｒｅｎ，Ｘ．Ｌら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ（２０１３）１２６：１１６５−１１７５）、ｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ−ＧｒｅｅｎベースのｑＲＴ−ＰＣＲに関して、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ｃｙｃｌｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、４０回の増幅ラウンドを受けさせた。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用して、ｍＲＮＡレベルを正規化した。分化ｍＭＡＰＣの表面上のＬＹＶＥ１発現を分析するために、穏やかなトリプシン処理によって細胞を回収し、拡張された方法に記載されているようにＦＡＣＳによって分析した。
インビトロＬＥＣ機能アッセイ

細胞培養およびＣＭ収集。Ｌｏｎｚａ（Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）からヒト肺ＬＥＣを購入し、ＥＧＭ−２−ＭＶ ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を補充したＥＢＭ２中で培養した。ＣＭ収集のために、ＭＡＰＣを無血清基礎培地に高密度で播種し、７２時間後にＣＭを収集し、さらなる使用まで分割して−８０℃で凍結した。

ＬＥＣ増殖。ＬＥＣを、ゼラチンコーティング９６ウェルプレート上の通常ＬＥＣ成長培地に細胞２，０００個／ｃｍ^２で播種した。それらが付着した後、培地を、無血清ＬＥＣ培地とＭＡＰＣ−ＣＭとの１：１混合物または１００％無血清ＬＥＣ培地（基準条件として）で置き換えた。２４時間後、ＷＳＴ−１細胞増殖アッセイキット（Cayman Chemical）を用いて、細胞増殖を評価した。

ＬＥＣ遊走。トランスウェルインサート（孔径８μｍのポリカーボネートフィルタを含有する；Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）をゼラチンで一晩コーティングした。非馴化培地（ＮＣＭ）またはＭＡＰＣ−ＣＭを２４ウェルプレートの底部区画に充填した。再水和後、インサートを２４ウェルプレートに入れ、５×１０^４個のＬＥＣを含有するＥＧＭ−２−ＭＶ／０．５％ＦＢＳをそれぞれにロードした。３７℃／５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした後、メタノールで細胞を固定し、ライト・ギムザ染色溶液（Ｓｉｇｍａ ＷＧ３２）で染色した。インサートを取り出し、膜の上側の細胞を除去した。インサートの写真を撮影し、遊出細胞を手動で計数した。

ＬＥＣ発芽。（２０％メチルセルロース／ＥＧＭ−２−ＭＶ混合物中に１，０００個のＬＥＣを含有する）２５μｌの液滴を非付着プレート上に適用し、それらを逆さまにして３７℃／５％ＣＯ_２でインキュベートすることによって、ＬＥＣスフェロイドを形成させた。翌日、ＰＢＳ／２％ＦＢＳでスフェロイドを慎重に洗浄し、穏やかな遠心分離によって収集し、メチルセルロース／ＦＢＳ／コラーゲン（Ｐｕｒｅｃｏｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）に再懸濁し、２４ウェルプレートに播種した。３７℃／５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした後、ｍＭＡＰＣ−ＣＭ（無血清ＬＥＣ培地との１：１混合物）または１００％無血清ＬＥＣ培地（基準条件として）をコラーゲン／スフェロイドゲルの上部に添加した。２４時間後に写真を撮影し、手動計数によって、スフェロイド当たりの発芽数を決定した。
マウスモデル

ＭＡＰＣはＭＨＣ−Ｉを発現せず、−その結果として−ＮＫ細胞媒介性クリアランスに感受性であるので、移植１〜２時間前およびその後１０日ごとに、抗アシアロＧＭ１ Ａｂ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）をすべてのマウスに腹腔内注射した。これらの抗体は、マクロファージまたはリンパ球の機能に影響を及ぼさずに、ＮＫ細胞を選択的に排除する（Ｓｅａｍａｎ，Ｗ．Ｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１３８：４５３９−４５４４）。

線状創傷モデル：０日目に、１２ｍｍの線状皮膚切開を１２週齢の麻酔したＣ５７Ｂｌ／６雄性マウスの背部に施した。創傷形成直後に、３つの等間隔の注射スポットにわたって分割して、１×１０^６個のｍＭＡＰＣ（ＰＢＳに再懸濁）またはＰＢＳのみをマウスの皮膚創傷下の筋膜に注射した。創傷感染を回避するために、床敷がないケージで、マウスを個別に収容した。デジタルキャリパー（ＶＷＲＩ８１９−００１２，ＶＷＲ）を使用して麻酔下で、創傷寸法を毎日測定した。４日目に創傷領域の明視野および蛍光写真を撮影し、１０日目にマウスを安楽死させ、残留皮膚創傷および下層筋肉組織を切開し、固定し、包埋のために調製した。

円形創傷モデル：０日目に、１２週齢の無胸腺ヌードＦｏｘｎ１雄性マウス（Ｈａｒｌａｎ）を麻酔し、滅菌および温度制御（３７℃）条件下で、０．５ｃｍ生検パンチャー（Ｓｔｉｅｆｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｆｆｅｎｂａｃｈ ａｍ Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、マウスの背部に標準化全層創傷（standardized full-thickness）を作った。シリコーンリングを創傷周辺に縫合し、ＰＢＳまたは５×１０^５個のｈＭＡＰＣで創傷を処置した。一部のマウスでは、移植前に、ｅＧＦＰをコードするレンチウイルスでｈＭＡＰＣを形質導入した。閉鎖包帯剤（Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標）、３Ｍ、Ｄｉｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して創傷を保湿し、１日おきに取り替えた。創傷後５日または１０日に、マウスを安楽死させ、皮膚創傷を切開し、リンスし、後固定した。固定後、創傷の正中において皮膚片を２等分し、包埋のために処理した。

皮膚弁モデル：０日目に、１２週齢の無胸腺ヌードＦｏｘｎ１雄性マウス（Ｈａｒｌａｎ）を麻酔し、記載されているように（Ｓａａｒｉｓｔｏ，Ａら、ＦＡＳＥＢ Ｊ（２００４）１８：１７０７−１７０９）、上腹部皮膚弁を持ち上げ、それを元の位置に戻して縫合することによって、腹部皮膚のリンパネットワークを切断した。血管茎を保持することによって、弁への連続的な血液供給を保証した（図３Ａ）。皮膚弁を再縫合した翌日、１×１０^６個のｍＭＡＰＣ、１×１０^６個のｈＭＡＰＣまたはＰＢＳ（４つの注射スポットにわたって分割；図３Ａ）を創傷縁部周辺に注射した。２週間後または４週間後、腋窩部を露出させ、創傷境界下で、ＦＩＴＣ−デキストラン（ＭＷ２，０００ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ｈＭＡＰＣ）またはローダミン−Ｂ−イソチオシアネート−デキストラン（ＭＷ７０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ｍＭＡＰＣ）の皮内注射後、微小リンパ管造影によって腋窩ＬＮ排液をモニタリングした（図３Ａ）。１５分の時点で明視野および蛍光写真を撮影し、続いて、マウスを安楽死させ、細胞生着／微小リンパ管造影領域周辺の皮膚創傷領域を切除し、固定し、包埋のために処理した。

ＬＮ移植モデル：０日目に、１２週齢の無胸腺ヌードＦｏｘｎ１雌性マウス（Ｈａｒｌａｎ）を麻酔し、ＬＮを視覚化するために、右腋窩部を露出させ、３％エバンスブルー溶液をマウスの右前脚の掌に注射し、その後、（周囲のリンパ（集合管）管と一緒に）ＬＮを摘出した。腋窩血管の直ぐ後ろのポケットを調製した。ＤｓＲｅｄ（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＤｓＲｅｄ＊ＭＳＴ）１Ｎａｇｙ／Ｊ；ｈＭＡＰＣまたはＰＢＳを投与し、４週間または８週間の経過観察したマウスの場合）または強化（ｅ）ＧＦＰ（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ／Ｊ；ｈＭＡＰＣまたはＰＢＳを投与し、４週間または１６週間の経過観察したマウスの場合）を遍在的に発現するマウスから、ドナーＬＮを切断し、門を介して２等分に切断した。続いて、切断したＬＮをレシピエントのポケットに埋め込み、永久縫合糸（Ｍｏｎｏｓｏｆ（商標））で所定位置に固定した。０．５×１０^６個のｈＭＡＰＣまたはＰＢＳと混合したＣｏｌｄ ＧＦ−ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をポケットに適用し、固化させた。続いて、皮膚を閉鎖し、Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標）包帯剤で創傷を覆った。４週間後、８週間後または１６週間後、マウスを麻酔し、右前脚の掌へのＦＩＴＣコンジュゲートＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＤｓＲｅｄ^＋ＬＮレシピエントにおける）またはテキサスレッドコンジュゲートＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン（ｅＧＦＰ^＋ＬＮレシピエントにおける）の注射後に、微小リンパ管造影に供した。埋め込んだＬＮの排液を１５分間モニタリングし、終了時に明視野および蛍光写真を撮影した。続いて、マウスを安楽死させ、移植ＬＮを含有する腋窩部を切除し、固定し、包埋のために処理した。拡張された方法に記載されているように、（血管超透過性（vascular hyperpermeability）を誘発して浮腫を悪化させるために）カラシ油の注射による炎症刺激後に、さらなる２組のマウスをインビボＭＲＩに供した。
組織学および形態計測

７μｍパラフィン切片、１０μｍ凍結切片または露出皮膚領域の明視野写真に対して、盲検の観察者が形態学的分析を実施した。マウス１匹当たり少なくとも１０個の無作為に選択した視野（７００μｍの距離をカバーする）について、リンパ管（ＬＹＶＥ１染色切片、Ｆｌｔ４染色切片またはＰｒｏｘ１／αＳＭＡ染色切片で決定）または血管（ＣＤ３１染色切片で決定）密度および上皮被覆（パンサイトケラチン染色切片で決定）をスコア化した。マウス１匹当たり８〜１０個の連続切片について、機能的リンパ（蛍光標識デキストランを注射したマウスの凍結切片で決定）を計数し、それにより、各切片上に見られる創傷領域全体をスキャンした。関心領域全体のデジタル再構築画像において、移植ＬＮに至る血管ネットワークの断片面積を決定した。パラフィン切片の染色のために、スライドを脱パラフィン処理および再水和し、染色手順前に、ＰＢＳ中で凍結切片を５分間インキュベートした。以前に記載されているように（Ａｒａｎｇｕｒｅｎ，Ｘ．Ｌら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００８）１１８：５０５−５１４）、Ｈ＆Ｅ染色を実施した。ＣＤ３１、Ｆｌｔ４、パンサイトケラチン、（ＣＤ４５またはビメンチンと組み合わせたまたは組み合わせていない）ＬＹＶＥ１、Ｐｒｏｘ１／αＳＭＡ、ビメンチンおよび（Ｐｒｏｘ１／）ｅＧＦＰのＩＦおよびＩＨＣ染色手順は補足資料に記載されており、一次Ａｂのリストは表４に提供されている。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１、またはＺｅｉｓｓ ＭＲｃ５カメラおよびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ４．８ソフトウェアを備えるＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡によって、すべての画像を記録した。
統計

結果のテキストおよび図／表の凡例におけるｎは、反復（すなわち、異なる継代の所定のＭＡＰＣクローンに対してそれぞれ実施した；インビトロ）または別個の動物（インビボ）の数を示す。シャピロ・ウイルク検定によって、データの正規性を検定した。正規分布の場合にはスチューデントｔ検定によって、またはデータが正規分布しないかもしくは正規性を仮定することができない場合にはマン・ホイットニーＵ検定によって、２群間の比較を実施した。１元配置ＡＮＯＶＡとテューキー事後検定（正規分布）またはクラスカル・ワリス検定とダン事後検定（非正規性仮定）によって、複数の群の比較を行った。反復測定ＡＮＯＶＡとそれに続くフィッシャー最小有意差検定によって、創傷サイズを評価した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０）を用いて、すべての分析を実施した。
拡張された方法
ＭＡＰＣの誘導および分化

遍在的なｅＧＦＰ発現を有する成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６−Ｔｇ−ｅＧＦＰ）のＢＭから、マウス（ｍ）ＭＡＰＣクローンを誘導した。以前に記載されているように（Ａｒａｎｇｕｒｅｎ，Ｘ．Ｌら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００８）１１８：５０５−５１４）、低Ｏ_２（５％）および低血清（２％）条件下で、ｍＭＡＰＣを誘導および維持した。以前に記載されている誘導および培養方法（Ｒｏｏｂｒｏｕｃｋ， Ｖ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （２０１１） ２９：８７１−８８２）にしたがって、ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔにおいてクローン１またはｈＭＡＰＣ１；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｌｅｕｖｅｎにおいてクローン２またはｈＭＡＰＣ２）において、ヒト（ｈ）ＭＡＰＣクローンを樹立した。マイコプラズマ汚染について、細胞培養物をルーチンに試験した。記載されているように（Ｒｏｏｂｒｏｕｃｋ，Ｖ．Ｄら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２０１１）２９：８７１−８８２）、組換（ｒ）ｈＶＥＧＦ−Ａ_１６５またはｒｈＶＥＧＦ−Ｃ（両方ともＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）への細胞の曝露によって、内皮分化を実施した。
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ調製、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリー

Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞溶解物から全ＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡを逆転写し、記載されているように（Ａｒａｎｇｕｒｅｎ，Ｘ．Ｌら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ（２０１３）１２６：１１６４−１１７５．）、ｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ−ＧｒｅｅｎベースのｑＲＴ−ＰＣＲに関して、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ｃｙｃｌｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、４０回の増幅ラウンドを受けさせた。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用して、ｍＲＮＡレベルを正規化した。分化ｍＭＡＰＣの表面上のＬＹＶＥ１発現を分析するために、穏やかなトリプシン処理によって細胞を回収し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＰＢＳ＋１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ＋２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ＋１％ＢＳＡ）で洗浄し、一次抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）または対応するウサギＩｇＧアイソタイプと共に暗所、室温で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞をビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体と共に暗所、室温で２０分間インキュベートした。次に、サンプルを洗浄し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ストレプトアビジンと共に暗所で２０分間インキュベートした。生細胞を選択するために、７−ＡＡＤを１０分間追加してから、分析のためにＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｉ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）においてサンプルをランした。
インビトロＬＥＣ機能アッセイ

細胞培養および馴化培地収集。Ｌｏｎｚａ（Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）からヒト肺ＬＥＣを購入し、ＥＧＭ−２−ＭＶ ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を補充したＥＢＭ２中で培養した。ＣＭ収集のために、ＭＡＰＣを無血清基礎培地に高密度で播種し、７２時間後にＣＭを収集し、さらなる使用まで分割して−８０℃で凍結した。

ＬＥＣ増殖。ＬＥＣ増殖に対するＭＡＰＣ−ＣＭの効果を試験するために、ＬＥＣを、ゼラチンコーティング９６ウェルプレート上の通常ＬＥＣ成長培地に細胞２，０００個／ｃｍ^２の密度で播種した。それらが付着した後、培地を、無血清ＬＥＣ培地とＭＡＰＣ−ＣＭとの１：１混合物または１００％無血清ＬＥＣ培地（基準条件として）で置き換えた。２４時間後、ＷＳＴ−１細胞増殖アッセイキットを用いて、細胞増殖を評価した。簡潔に言えば、１０μｌのＷＳＴ−１混合物を各ウェルに添加し、細胞を３７℃で２時間インキュベートし、Ｂｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレートリーダー（ＢＲＳ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって４５０ｎｍの波長で各ウェルの吸光度を測定した。

ＬＥＣ遊走。ＬＥＣ遊走に対するＭＡＰＣ−ＣＭの効果を評価するために、ボイデンチャンバーアッセイを実施した。簡潔に言えば、トランスウェルインサート（孔径８μｍのポリカーボネートフィルタを含有する；Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を０．２％ゼラチンで一晩コーティングした。０．３ｍｌのＮＣＭまたは０．３ｍｌのｍＭＡＰＣもしくはｈＭＡＰＣ−ＣＭを２４ウェルプレートの底部区画に充填した。脱イオン水で１時間再水和した後、インサートを２４ウェルプレートに入れ、５×１０^４個のＬＥＣを含有する０．３ｍｌのＥＧＭ−２−ＭＶ／０．５％ＦＢＳをそれぞれにロードした。３７℃／５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした後、メタノールで細胞を−２０℃で３０分間固定した。次に、ライト・ギムザ染色溶液（Ｓｉｇｍａ ＷＧ３２）で細胞を７分間染色し、脱イオン水で１０分間リンスした。インサートを取り出し、綿棒を使用して穏やかに擦ることによって、膜の上側の細胞を除去した。Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡に据えつけ、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ４．８ソフトウェアを備えるＺｅｉｓｓ ＭＲｃ５カメラを用いて、インサートの写真を撮影し、インサート当たり３つのランダム視野において倍率２０倍で遊出細胞を手動で計数した。

ＬＥＣ発芽。ＬＥＣ発芽に対するｍＭＡＰＣ−ＣＭの効果を試験するために、（２０％メチルセルロース／ＥＧＭ−２−ＭＶ混合物中に１，０００個のＬＥＣを含有する）２５μｌの液滴を非付着プレート上に適用し、それらを逆さまにして３７℃／５％ＣＯ_２でインキュベートすることによって、ＬＥＣスフェロイドを形成させた。翌日、ＰＢＳ／２％ＦＢＳでスフェロイドを慎重に洗浄し、穏やかな遠心分離によって収集し、メチルセルロース／ＦＢＳ／コラーゲン（Ｐｕｒｅｃｏｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）に慎重に再懸濁し、２４ウェルプレート（０．５ｍｌ／ウェル）に播種した。３７℃／５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした後、０．５ｍｌのｍＭＡＰＣ−ＣＭ（無血清ＬＥＣ培地との１：１混合物）または１００％無血清ＬＥＣ培地（基準条件として）をコラーゲン／スフェロイドゲルの上部に添加した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡にマウントしたＺｅｉｓｓ ＭＲｍカメラを用いて２４時間後に写真を撮影し、手動計数によって、スフェロイド当たりの発芽数を決定した。
マウスモデル

ＭＡＰＣはＭＨＣ−Ｉを発現せず、−その結果として−ＮＫ細胞媒介性クリアランスに感受性であるので、移植１〜２時間前およびその後１０日ごとに、２０μｌの抗アシアロＧＭ１ Ａｂ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ；ＰＢＳで２０倍希釈）をすべてのマウスに腹腔内注射した。これらの抗体は、マクロファージまたはリンパ球の機能に影響を及ぼさずに、ＮＫ細胞を選択的に排除する（Ｓｅａｍａｎ，Ｗ．Ｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１３８：４５３９−４５４４．）。

線状創傷モデル：０日目に、１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンの混合物で麻酔した後、１２ｍｍの線状皮膚切開を１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６雄性マウスの背部にメスで施した。創傷形成直後に、３つの等間隔の注射スポットにわたって分割して、１×１０^６個のｍＭＡＰＣ（ＰＢＳに再懸濁）またはＰＢＳのみをマウスの皮膚創傷下の筋膜に注射した。創傷感染を回避するために、床敷がないケージで、マウスを個別に収容した。デジタルキャリパー（ＶＷＲＩ８１９−００１２，ＶＷＲ）を使用してイソフルラン麻酔下で、創傷寸法を毎日測定した。４日目に、Ｚｅｉｓｓ Ｌｕｍａｒ顕微鏡にマウントしたＺｅｉｓｓ ＭＲｃ５カメラを用いて、創傷領域の明視野および蛍光写真を撮影した。１０日目に、マウスを安楽死させ、残留皮膚創傷および下層筋肉組織を切開し、亜鉛−パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンまたは最適切断温度（ＯＣＴ）包埋および切片化のために調製した。

円形創傷モデル：０日目に、ケタミン／キシラジンの腹腔内注射によって、１２週齢の無胸腺ヌードＦｏｘｎ１雄性マウス（Ｈａｒｌａｎ）を麻酔した。前投薬として、アトロピン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。滅菌および温度制御（３７℃）条件下で、０．５ｃｍ生検パンチャー（Ｓｔｉｅｆｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｆｆｅｎｂａｃｈ ａｍ Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、マウスの背部の中背領域（mid-dorsal region）において標準化全層創傷を作った。（Ｈｉｓｔｏａｃｒｙｌ ｔｉｓｓｕｅ ａｄｈｅｓｉｖｅ，Ｂｒａｕｎ，Ｄｉｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍを使用して）シリコーンリングを固定し、創傷周辺を縫合し、食塩水または５×１０^５個のｈＭＡＰＣで創傷を処置した。別の一部のマウスでは、移植前に、ｅＧＦＰをコードするレンチウイルスでｈＭＡＰＣを形質導入した。閉鎖包帯剤（Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標）、３Ｍ、Ｄｉｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して創傷を保湿した。争いを回避し、閉鎖創傷包帯剤が取れるのを防止するために、すべての創傷マウスを個別に収容した。１日おきに、イソフルラン麻酔下で閉鎖包帯剤を取り替えた。創傷形成後５日または１０日に、マウスを安楽死させ、円形創傷領域および正常皮膚の縁を含む正方形の皮膚片を切断し、ＰＢＳでリンスし、亜鉛−パラホルムアルデヒドを使用して４℃で一晩後固定した。固定後、創傷の正中において皮膚片を２等分し、パラフィンまたはＯＣＴ包埋および切片化のために処理した。

皮膚弁モデル：０日目に、ケタミン／キシラジンの腹腔内注射によって、１２週齢の無胸腺ヌードＦｏｘｎ１雄性マウス（Ｈａｒｌａｎ）を麻酔した。以前に記載されているように（Ｓａａｒｉｓｔｏ，Ａら、ＦＡＳＥＢ Ｊ（２００４）１８：１７０７−１７０９．）、上腹部皮膚弁を持ち上げ、それを元の位置に戻して縫合することによって、腹部皮膚のリンパネットワークを切断した。右下腹壁動脈および静脈を含む血管茎を保持することによって、弁への連続的な血液供給を保証した（図３Ａ）。皮膚弁を再縫合した翌日、１×１０^６個のｍＭＡＰＣ、１×１０^６個のｈＭＡＰＣまたはＰＢＳ（４つの注射スポットにわたって分割；図３Ａ）を創傷縁部周辺に注射した。２週間後または４週間後、腋窩部を露出させ、創傷境界下で、１０μｌのＦＩＴＣ−デキストラン（ＭＷ２，０００ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ｈＭＡＰＣ）または１０μｌのローダミン−Ｂ−イソチオシアネート−デキストラン（ＭＷ７０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；ｍＭＡＰＣ）の皮内注射後、微小リンパ管造影によって腋窩リンパ節排液を１５分間モニタリングした（図３Ａ）。１５分の時点で、Ｚｅｉｓｓ Ｌｕｍａｒ顕微鏡にマウントしたＺｅｉｓｓ ＭＲｃ５カメラを用いて明視野および蛍光写真を撮影した。続いて、マウスを安楽死させ、細胞生着／微小リンパ管造影領域周辺の皮膚創傷領域を切除し、固定し、パラフィンまたはＯＣＴ包埋および切片化のために処理した。

リンパ節移植モデル：ｄ０に、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、１２週齢の無胸腺ヌードＦｏｘｎ１雌性レシピエントマウス（Ｈａｒｌａｎ）を麻酔した。リンパ節を視覚化するために、右腋窩部を露出させ、３％エバンスブルー溶液をマウスの右前脚の掌に注射し、その後、周囲のリンパ（集合管）管と一緒にリンパ節を摘出した。外側腋窩脂肪体、大胸筋および広背筋に並んだ腋窩血管の直ぐ後ろのポケットを調製した。ＤｓＲｅｄ（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＤｓＲｅｄ＊ＭＳＴ）１Ｎａｇｙ／Ｊ；ｈＭＡＰＣまたはＰＢＳを投与し、４週間または８週間の経過観察したマウスの場合）または強化（ｅ）ＧＦＰ（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ／Ｊ；ｈＭＡＰＣまたはＰＢＳを投与し、４週間または１６週間の経過観察したマウスの場合）を遍在的に発現するマウスから、ドナーリンパ節を切断し、門を介して２等分に切断した。続いて、切断したリンパ節をレシピエントのポケット（内向きの門および上向きの切断面）に埋め込み、２本の永久縫合糸（９−０ナイロン非吸収性縫合糸を使用、Ｍｏｎｏｓｏｆ（商標））で所定位置に固定した。０．５×１０^６個のｈＭＡＰＣまたはＰＢＳと混合したＣｏｌｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（１００μｌ；Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をポケットに適用し、１０分間固化させた。続いて、皮膚を閉鎖し、Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標）包帯剤で創傷を覆った。４週間後、８週間後または１６週間後、ケタミン／キシラジン混合物でマウスを麻酔し、右前脚の掌への１０μｌのＦＩＴＣコンジュゲートＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ＤｓＲｅｄ^＋ドナーリンパ節のレシピエントにおける）または１０μｌのテキサスレッドコンジュゲートＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン（ｅＧＦＰ^＋リンパ節のレシピエントにおける）の注射後に、微小リンパ管造影に供した。埋め込んだリンパ節の排液を１５分間モニタリングし、終了時に、Ｚｅｉｓｓ Ｌｕｍａｒ顕微鏡にマウントしたＺｅｉｓｓ ＭＲｃ５カメラを用いて、明視野および蛍光写真を撮影した。続いて、マウスを安楽死させ、移植リンパ節を含有する腋窩部を切除し、固定し、パラフィンまたはＯＣＴ包埋および切片化のために処理した。リンパ節移植４週間後および１６週間後に、さらなる２組のマウスをインビボ磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ；（Ｔａｍｍｅｌａ，Ｔら、Ｎａｔ Ｍｅｄ（２００７）１３：１４５８−１４６６に記載されているとおり）に供した。簡潔に言えば、イソフルランでマウスを麻酔し、綿棒を用いてカラシ油（鉱油で１／５希釈）を両前肢に２×１５分間適用して、血管超透過性を誘発して浮腫を悪化させた。ＭＲＩ記録の前に、マウスをさらに３０分間回復させた。実験を通して温度および呼吸をモニタリングし、３７℃および１分当たりの呼吸数１００〜１２０回に維持した。送信用の７ｃｍ直線偏光共振器と、受信用のアクティブにデカップリングされた直径２ｃｍの専用表面コイル（Ｒａｐｉｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｒｉｍｐａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とを使用して、水平ボア磁石と、６００ｍＴ／ｍのアクティブシールドグラディエントセット（内径１１７ｍｍ）とを備える９．４Ｔ Ｂｉｏｓｐｅｃ ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ＭＲ ｓｃａｎｎｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ＭＲ画像を取得した。２Ｄローカライゼーションスキャンの取得後；３Ｄ Ｔ_２強調画像、２Ｄ Ｔ_２パラメータマップおよび２Ｄ拡散強調画像を取得して、浮腫のレベルを決定した。特定のパラメータは、リフォーカスエコーによる３Ｄ高速収集（ＲＡＲＥ）シーケンス、反復時間（ＴＲ）：１３００ｍｓ、有効なエコー時間（ＴＥ）：２２．９ｍｓ、レアファクター：６、マトリックスサイズ：２５６×４８×４８、視野（ＦＯＶ）：２．５×０．７×１．５ｃｍ、解像度：９８×１４６×３１２μｍ^３；２Ｄ Ｔ_２マップ：ＴＲ：３５００ｍｓ、１０ＴＥ間：１０〜１００ｍｓ、マトリックスサイズ：２５６×２５６、ＦＯＶ：２×２ｃｍ、スライス厚：０．３ｍｍおよびギャップ０．３ｍｍの１５個の横断スライス、面内解像度：７８μｍ^２；拡散強調ＭＲＩ：スピンエコーシーケンス；１５００ｓ ｍｍ^２のｂ値、ＴＲ：２５ｍｓ、ＴＥ：３，０００ｍｓ、マトリックスサイズ：１２８×１２８、ＦＯＶ：２×２ｃｍ、厚さ１ｍｍの８個の横断スライスであった。リンパ節埋め込み部位と対照部位との間の比として報告される、Ｍｅｖｉｓｌａｂ（Ｍｅｖｉｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で開発した自製ソフトウェアを使用して、共通の閾値を超えるシグナル強度を有するボリュームを決定することによって、３Ｄ Ｔ_２強調画像の処理を行った。Ｐａｒａｖｉｓｏｎ ５．１（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ）を使用して、手動で描出した前脚の浮腫（または、浮腫が存在しない場合には、同じ領域内にある同じサイズの部位）のＴ_２パラメータマップの計算を行った。
組織学および形態計測

７μｍパラフィン切片、１０μｍ凍結切片または露出皮膚領域の明視野写真に対して、盲検の観察者が形態計測分析を実施した。マウス１匹当たり少なくとも１０個の無作為に選択した視野（７００μｍの距離をカバーする）について、リンパ管（ＬＹＶＥ１、Ｆｌｔ４染色切片またはＰｒｏｘ１／αＳＭＡ染色切片で決定）または血管（ＣＤ３１染色切片で決定）密度および上皮被覆（パンサイトケラチン染色切片で決定）をスコア化した。マウス１匹当たり８〜１０個の連続切片について、機能的リンパ（蛍光標識デキストランを注射したマウスの凍結切片で決定）を計数し、それにより、各切片上に見られる創傷領域全体をスキャンした。関心領域全体のデジタル再構築画像において、移植リンパ節に至る血管ネットワークの断片面積を決定した。パラフィン切片の染色のために、スライドを脱パラフィン処理および再水和し、染色手順前に、ＰＢＳ中で凍結切片を５分間インキュベートした。以前に記載されているように（１）、Ｈ＆Ｅ染色を実施した。ＣＤ３１、Ｆｌｔ４またはパンサイトケラチンの免疫組織化学的染色のために、標的回復溶液ｓ１６９９（Ｓｉｇｍａ）中で煮沸することによって、抗原回復を実施した。ＴＢＳで冷却した後、メタノール中０．３％Ｈ_２Ｏ_２で内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。スライドを一次Ａｂと共に一晩インキュベートした。一次Ａｂのリストは、表４に提供されている。ＴＢＳで洗浄した後、スライドをビオチン化ウサギ抗ラット（ＣＤ３１およびＦｌｔ４）またはヤギ抗マウス（パンサイトケラチン）Ａｂと共に２時間インキュベートし、チラミドシグナル増幅システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＮＥＬ７００Ａ）を用いて、検出シグナルを増幅した。ヘマトキシリン対比染色によって核を明らかにし、ＤＰＸ封入剤（Ｓｉｇｍａ）をスライドにマウントした。ＬＹＶＥ１免疫蛍光（ＩＦ）染色のために、標的回復溶液ｓ１６９９（Ｓｉｇｍａ）中で煮沸することによって、抗原回復を実施した。ＴＢＳで冷却した後、メタノール中０．３％Ｈ_２Ｏ_２で内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチした。スライドを一次Ａｂと共に一晩インキュベートした。ＴＢＳで洗浄した後、スライドをビオチン化ヤギ抗ウサギＡｂと共に２時間インキュベートし、チラミド−Ｃｙ３またはチラミドフルオレセインシグナル増幅システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＮＥＬ７０４ＡまたはＮＥＬ７０１Ａ）を用いて、検出シグナルを増幅した。ＣＤ４５ ＩＦ染色と組み合わせる場合には、続いて、スライドを一次抗ＣＤ４５ Ａｂと共に一晩インキュベートし、続いて、ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ４８８と共に２時間インキュベートした。ＧＦＰまたはビメンチンＩＦ染色のために、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６）中で煮沸することによって、抗原回復を実施した。一次Ａｂと共に一晩インキュベートした後、スライドをＡｌｅｘａコンジュゲートロバ抗ニワトリ（ＧＦＰ）またはヤギ抗マウス（ビメンチン）Ａｂと共に１時間インキュベートした。ＬＹＶＥ１／ビメンチンＩＦ染色の組み合わせでは、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６）中で煮沸することによって抗原回復を実施し、Ｔｒｉｔｏｎ０．１％のＰＢＳ溶液中でインキュベートすることによって組織を透過処理した。一次Ａｂと共に一晩インキュベートした後、スライドをヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ５６８と共に１時間インキュベートした。Ｐｒｏｘ１／αＳＭＡ ＩＦ染色の組み合わせでは、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６）中で煮沸することによって抗原回復を実施し、Ｔｒｉｔｏｎ０．１％のＰＢＳ溶液中でインキュベートすることによって組織を透過処理した。Ｐｒｏｘ１一次Ａｂと共に一晩インキュベートした後、スライドをビオチンコンジュゲートヤギ抗ウサギＡｂと共に１時間インキュベートし、チラミド−Ｃｙ３またはチラミドフルオレセインシグナル増幅システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＮＥＬ７０４ＡまたはＮＥＬ７０１Ａ）を用いて、検出シグナルを増幅した。続いて、Ｃｙ３コンジュゲートαＳＭＡまたは非コンジュゲートＳＭＡでスライドを２時間染色し、続いて、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６６０で染色した。Ｐｒｏｘ１／ｅＧＦＰ ＩＦ染色の組み合わせでは、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６）中で煮沸することによって抗原回復を実施し、Ｔｒｉｔｏｎ０．１％のＰＢＳ溶液中でインキュベートすることによって組織を透過処理した。Ｐｒｏｘ１およびｅＧＦＰ一次Ａｂと共に一晩インキュベートした後、スライドをビオチンコンジュゲートヤギ抗ウサギおよびＡｌｅｘａ４８８コンジュゲートロバ抗ニワトリＡｂと共に１時間インキュベートし、チラミド−Ｃｙ３シグナル増幅システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰｒｏｘ１検出シグナルを増幅した。ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｐ３６９３１）を含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ、またはヘキスト染色によって核を明らかにする場合にはＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｐ３６９３１）を含まないＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔで、ＩＦ染色スライドをシーリングした。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１、またはＺｅｉｓｓ ＭＲｃ５カメラおよびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ４．８ソフトウェアを備えるＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡によって、すべての画像を記録した。
統計

結果のテキストおよび図／表の凡例におけるｎは、反復（すなわち、異なる継代の所定のＭＡＰＣクローンに対してそれぞれ実施した；インビトロ）または別個の動物（インビボ）の数を示す。シャピロ・ウイルク検定によって、データの正規性を検定した。正規分布の場合にはスチューデントｔ検定によって、またはデータが正規分布しないかもしくは正規性を仮定することができない場合にはマン・ホイットニーＵ検定によって、２群間の比較を実施した。１元配置ＡＮＯＶＡとテューキー事後検定（正規分布）またはクラスカル・ワリス検定とそれに続くダン事後検定（非正規性仮定）によって、複数の群の比較を行った。反復測定ＡＮＯＶＡとそれに続くフィッシャー最小有意差検定によって、創傷サイズを評価した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０）を用いて、すべての分析を実施した。
表

Claims (1)

1. 本願明細書に記載の発明。