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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft den Bereich der Verfahren zum Induzieren von
isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazellen zur Differenzierung
in Zellen mit einer nicht-mesenchymalen
Linie. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zum Induzieren
einer isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazelle zur Exprimierung
von mindestens einer phänotypischen
Eigenschaft einer Neuronalzelle bzw. neuronalen Zelle.
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Hintergrund der Erfindung
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Eine
Stammzelle muss die folgenden Kriterien erfüllen: (1) Ein Vermögen einer
klonalen Stammzellenpopulation zur Selbsterneuerung, (2) ein Vermögen einer
klonalen Stammzellenpopulation zur Erzeugung eines neuen, enddifferenzierten
Zelltyps in vitro, (3) ein Vermögen
einer klonalen Stammzellenpopulation zum Ersetzen einer fehlenden
enddifferenzierten Zellpopulation, wenn sie in ein Tier transplantiert
wird, das einen Mangel an eigenen natürlichen Zellen aufweist.
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Die
neonatale Periode in der menschlichen Entwicklung ist durch die
Gegenwart von „Stamm"-Zellen mit dem Potenzial
zur Entwicklung entlang vielfacher Differenzierungswege gekennzeichnet.
Die Enddifferenzierung dieser Zellen wird durch Cytokin und hormonelle
Signale festgelegt, welche die Organogenese und die Gewebearchitektur
koordinieren. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) von der Maus wurden
isoliert und in vitro und in vivo umfangreich untersucht. Unter
Verwendung von exogenen Reizen in vitro haben Forscher die ES-Zelldifferenzierung
entlang vielfacher Linienwege induziert. Diese Wege umfassen Neuro-nal-,
B-Linie-Lymphoid- und Fettzellen (Dani et al. (1997), J. Cell Sci.
110, 1279; Remoncourt et al. (1998), Mech. Dev. 79, 185; S. O'Shea (1999), Anat.
Rec. 257, 32, 1999). Die ES-Zellen
wurden in vivo durch homologe Rekombinationstechniken manipuliert,
um genspezifische Null- oder „Knock-out"-Mäuse zu erzeugen
(R. S. Johnson (1989), Science 245, 1234). Sobald ES-Zellklone,
denen ein spezifisches Gen fehlt, isoliert worden sind, werden sie
in eine befruchtete Mauszygote transplantiert. Die Nachkommenschaft dieser
isolierten ES-Zelle
kann sich in einer koordinierten Weise zu jedwedem Mausgewebe entwickeln.
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Multipotente
Stammzellen liegen in Geweben des erwachsenen Organismus vor. Das
am besten charakterisierte Beispiel für eine „Stammzelle" ist der hämatopoietische
Vorläufer,
der aus dem Knochenmark und peripherem Blut isoliert wird. In bahnbrechenden
Studien von Trentin und Kollegen (Trentin (1965), Cardiovasc. Res.
Cent. Bull. 4, 38; Till & McCulloch
(1961), Rad. Res. 14, 213) wurden letal bestrahlte Mäuse untersucht.
Ohne Behandlung starben diese Tiere, da sie ihre zirkulierenden
Blutzellen nicht ersetzen konnten; die Transplantation von Knochenmarkzellen
von Gen-identischen Spendertieren rettete das Wirtstier jedoch.
Die Spenderzellen waren für
die Repopulation aller zirkulierenden Blutzellen verantwortlich.
Eine Fülle
von eleganten Studien wurde durchgeführt, um zu zeigen, dass das
Spenden einer endlichen Anzahl von undifferenzierten hämatopoietischen
Stammzellen jede der acht oder mehr verschiedenen Blutzellenlinien
in einem Wirtstier regenerieren kann. Diese Arbeit hat die Grundlage
für eine
Knochenmarktransplantation gelegt, wobei es sich um ein weithin
akzeptiertes therapeutisches Verfahren für Krebs und angeborene Stoffwechseldefekte
handelt. Folglich verbleiben hämatopoietische Stammzellen
während
des ganzen Lebens in normalem menschlichen Knochenmark; sie sind
nicht auf die neonatale Periode beschränkt.
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Es
gibt hochinteressante neue Anzeichen dafür, dass hämatopoietische Vorläufer gegebenenfalls
nicht auf die Mikroumgebung des Knochenmarks beschränkt sind.
Forscher an der Universität von
Calgary haben neuronale Stammzellen untersucht, die sich routinemäßig entlang
neuronaler Zelllinienwege differenzieren. Wenn diese Zellen in letal bestrahlte
Wirte transplantiert wurden, haben die Forscher die Gegenwart von
Spenderzellenmarkern in neu erzeugten Myeloid- und Lymphoidzellen
nachgewiesen (Bjornson (1999), Science 283, 534). Forscher am Baylor
College of Medicine haben ähnliche Studien
unter Verwendung von Satellitenzellen durchgeführt, die vom Skelettmuskel
von Mäusen isoliert
worden sind (Jackson et al. (1999), PNAS 96, 14482). Wenn diese
von Muskeln stammenden Zellen in letal bestrahlte Wirte transplantiert
wurden, haben die Forscher die Gegenwart von Muskelgenmarkern in
allen Blutzellenlinien nachgewiesen. Zusammen zeigen diese Studien,
dass neuronales Gewebe und Muskelgewebe Stammzellen enthalten, die
zur hämatopoietischen
Differenzierung fähig
sind. Dies legt nahe, dass Stellen, die von dem Knochenmark verschieden
sind, eine erneuerbare Quelle von hämatopoietischen Vorläufern mit
einer potenziellen Anwendung auf die Therapie von Erkrankungen des Menschen
bereitstellen können
(Quesenberry et al. (1999), J. Neurotrauma 16, 661; Scheffler et
al. (1999), Trends Neurosci. 22, 348; Svendson & Smith (1999), Trends Neurosci. 22,
357).
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So
wie Neuronal- und Muskelzellen das bestrahlte Knochengewebe regenerieren
können,
sind von Knochenmark stammende Zellen fähig, bei anderen Organstellen
eine Repopulation zu bewirken. Wenn von Knochenmark stammende hämatopoietische
Zellen und Stromazellen in ein Tier mit einer verletzten Leber transplantiert
werden, können
sie Leberovalzellen in dem Wirtstier regenerieren (Peterse et al.
(1999), Science 284, 1168). Wenn markierte Knochenmarkstromazellen
in den lateralen Ventrikel einer neonatalen Maus implantiert wurden,
waren sie entsprechend zur Differenzierung in reife Astrocyten fähig (Kopen
et al. (1999) PNAS 96, 10711). Wenn Knochenmarkstromazellen intraperitoneal
in Mäuse transplantiert
werden, werden sie in den Organen des Wirtstiers nachgewiesen, einschließlich der
Milz, der Lunge, dem Knochenmark, den Knochen, in Knorpel und der
Haut (Pereira et al. (1998), PNAS 95, Seite 1142, 1998). Diese Studien
legen nahe, dass sich eine Knochenmarkstromazelle in Linien differenzieren
kann, die von deren ursprünglicher
mesodermaler Herkunft verschieden sind (Kopen et al. (1999), PNAS
96, 10711).
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Die
neuere Entwicklung gesamter Organismen aus einer einzelnen Spenderzelle
ist mit dieser Hypothese konsistent. Beispielsweise zeigte das „Dolly"-Experiment, dass
sich Zellen, die von einer Brustdrüse vom Schaf isoliert worden
sind, zu einem erwachsenen Schaf entwickeln können. In entsprechenden Studien
mit Mäusen
konnten sich Zellen, die vom Corpus luteum des Eierstocks stammten,
zu einer erwachsenen Maus entwickeln. Diese Studien legen nahe,
dass Stammzellen mit dem Vermögen
zur Differenzierung zu jedwedem Zelltyp im erwachsenen Organismus
weiterhin vorliegen. Folglich können „embyronale
Stammzellen" während des
ganzen Lebens eines Lebewesens bewahrt werden.
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Die
adulte Knochenmark-Mikroumgebung ist die potenzielle Quelle für diese
hypothetischen Stammzellen. Zellen, die von adultem Knochenmark isoliert
werden, werden verschiedenartig bezeichnet, einschließlich als
Stromazellen, Stromastammzellen, mesenchymale Stammzellen (MSC's), mesenchymale
Fibroblasten, retikuläre
Endothelzellen und Westen-Bainton-Zellen (Gimble et al. (1996), Bone 19,
421, 1996). In vitro-Studien haben gezeigt, dass sich diese Zellen
entlang mehrerer mesenchymaler oder mesodermaler Linien differenzieren
können,
die unter anderem Adipocyten (Fettzellen) (Gimble et al. (1990),
Eur. J. Immunol. 20, 379), Chondrocyten (Bruder et al. (1994), J.
Cell Biochem. 56, 283), hämatopoietische
Trägerzellen
(Pietrangeli et al. (1988), Eur. J. Immunol. 18, 863), Skelettmuskelmyocyten
(Prockop (1998), J. Cell Biochem. Suppl. 30–31, 284–5), Myocyten der glatten Muskulatur (Charbord)
und Osteoblasten (Beresford et al. (1992), J. Cell Sci. 99, 131;
Dorheim et al. (1993), J. Cell Physiol. 154, 317) umfassen. Darüber hinaus zeigen
Stromazellen des Knochenmarks das Vermögen zur Differenzierung zu
Astrocyten (Kopen et al. (1999), PNAS 96, 10711) und Leberovaizellen
(Petersen et al. (1999), Science 284, 1168). Auf der Basis dieser
Erkenntnisse wurde das Knochenmark als eine Quelle von Stromastammzellen
zur Regeneration von Knochen, Knorpel, Muskeln, Fettgewebe, Leber-,
Neuronal- und anderen Geweben vorgeschlagen. Die Extraktion von
Knochenmark-Stromazellen bedeutet für den Patienten jedoch ein
hohes Risiko und ein hohes Maß an
Unannehmlichkeiten.
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Im
Gegensatz dazu stellen Stromazellen, die von adultem menschlichen
extramedullären
Fettgewebe stammen, eine Stromastammzellenquelle dar, die mit einem
minimalen Risiko oder minimalen Unannehmlichkeiten für den Patienten
gewonnen werden kann. Pathologische Beweise legen nahe, dass Stromazellen,
die von Fettgewebe stammen, zur Differenzierung entlang mehrerer
Linienwege fähig sind.
Die häufigsten
Weichgewebetumore, Liposarkome, entwickeln sich aus Adipocyten-artigen
Zellen. Weichgewebetumore gemischter Herkunft sind relativ häufig. Diese
Tumore können
Elemente von Fettgewebe, Muskeln (glatt oder Skelett), Knorpel und/oder
Knochen umfassen. In Patienten mit einem seltenen Zustand, der als
progressive Knochenheteroplasie bekannt ist, bilden subkutane Adipocyten aus
unbekannten Gründen
Knochen.
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Neuere
Studien haben das spezifische Vermögen von Stromazellen, die von
Knochenmark stammen, gezeigt, in vitro einer neuronalen Differenzierung
zu unterliegen (Woodbury et al. (2000), J. Neuroscience Research
61, 364; Sanchez-Ramos et al. (2000), Exp. Neurology 164, 247).
In diesen Untersuchungen induzierte eine Behandlung von Knochenmark-Stromazellen mit
Antioxidationsmitteln, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) oder von
Gehirn stammendem neurotrophen Faktor (BDNF) Zellen dahingehend,
morphologischen Veränderungen zu
unterliegen, die mit einer neuronalen Differenzierung konsistent
sind, d. h. der Verlängerung
von langen Zellfortsätzen,
die mit dem Wachstum von Kegeln und Filopoden enden (Woodbury et
al. (2000), J. Neuroscience Research 61, 364; Sanchez-Ramos et al.
(2000), Exp. Neurology 164, 247). Darüber hinaus induzierten diese
Mittel die Expression von neuronal-spezifischem Protein, einschließlich Nestin,
Neuron-spezifischer Enolase (NSE), Neurofilament M (NF-M), NeuN,
und des Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors trkA (Woodbury et al. (2000),
J. Neuroscience Research 61, 364; Sanchez-Ramos et al. (2000), Exp.
Neurology 164, 247).
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Das
US-Patent Nr. 5,486,359 (Osiris)
betrifft eine isolierte, homogene Population von menschlichen mesenchymalen
Stammzellen, die sich zu Zellen von mehr als einem Bindegewebstyp
differenzieren können.
Das Patent beschreibt ein Verfahren zum Isolieren, Reinigen und
starkem Replizieren dieser Zellen in einer Kultur, d. h. in vitro.
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Das
US-Patent Nr. 5,942,225 (Case
Western und Osiris) beschreibt eine Zusammensetzung zum Induzieren
einer Linien-gerichteten Differenzierung von isolierten menschlichen
mesenchymalen Stammzellen zu einer einzelnen speziellen mesenchymalen
Linie, die menschliche mesenchymale Stammzellen und einen oder mehrere
bioaktive Faktor(en) zum Induzieren der Differenzierung der mesenchymalen
Stammzellen zu einer einzelnen speziellen Linie umfasst.
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Das
US-Patent Nr. 5,736,396 (Case
Western) beschreibt ein Verfahren zum Induzieren einer ex vivo-Linien-gerichteten
Differenzierung von isolierten menschlichen mesenchymalen Stammzellen, welches
das Inkontaktbringen der mesenchymalen Stammzellen mit einem bioaktiven
Faktor umfasst, so dass dadurch deren ex vivo-Differenzierung zu
einer einzelnen speziellen mesenchymalen Linie induziert wird. Das
Patent beschreibt auch ein Verfahren zum Behandeln eines Lebewesens,
das mesenchymaler Zellen einer speziellen mesenchymalen Linie bedarf,
welches das Verabreichen an ein Lebewesen, das deren bedarf, einer
Zusammensetzung umfasst, die isolierte menschliche mesenchymale Stammzellen
umfasst, die induziert worden sind, sich ex vivo durch einen Kontakt
mit einem bioaktiven Faktor zu differenzieren, so dass dadurch eine
ex vivo-Differenzierung von solchen Zellen zu einer einzelnen speziellen
mesenchymalen Linie induziert wird.
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Das
US-Patent Nr. 5,908,784 (Case
Western) beschreibt eine Zusammensetzung für die in vitro-Chondrogenese
von menschlichen mesenchymalen Vorläuferzellen und die in vitro-Bildung von menschlichen
Chondrocyten davon, wobei die Zusammensetzung isolierte menschliche
mesenchymale Stammzellen, die als eng aneinander dichtgepacktes
Zellpellet vorliegen, und mindestens ein chondroinduktives Mittel
in Kontakt damit umfasst. Das Patent beschreibt auch ein Verfahren
zum Induzieren einer Chondrogenese in mesenchymalen Stammzellen durch
Inkontaktbringen von mesenchymalen Stammzellen mit einem chondroinduktiven
Mittel in vitro, wobei die Stammzellen als eng aneinander dichtgepacktes
Zellpellet vorliegen.
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Das
US-Patent Nr. 5,902,741 (Advanced
Tissue Sciences, Inc.) beschreibt ein lebendes Knorpelgewebe, das
in vitro hergestellt worden ist, das Knorpel-erzeugende Stromazellen
und Bindegewebsproteine umfasst, die in natürlicher Weise durch die Stromazellen
sekretiert werden, die an ein dreidimensionales Netzwerk gebunden
sind und dieses im Wesentlichen einhüllen, wobei das dreidimensionale Netzwerk
aus biologisch verträglichem,
nicht-lebenden Material
zusammengesetzt ist, das zu einer dreidimensionalen Struktur ausgebildet
ist, die Zwischenräume
aufweist, die durch die Stromazellen überbrückt werden. Das Patent beschreibt
auch eine Zusammensetzung zum Wachsenlassen von neuem Knorpel, die
mesenchymale Stammzellen in einem polymeren Träger umfasst, der für eine Proliferation und
Differenzierung der Zellen zu Knorpel geeignet ist.
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Das
US-Patent Nr. 5,863,531 (Advanced
Tissue Sciences, Inc.) beschreibt ein in vitro hergestelltes schlauchförmiges Stromagewebe,
das Stromazellen und Bindegewebsproteine umfasst, die in natürlicher
Weise durch die Stromazellen sekretiert werden, die an ein dreidimensionales
Netzwerk gebunden sind und dieses im Wesentlichen einhüllen, wobei
das dreidimensionale Netzwerk aus biologisch verträglichem,
nicht-lebenden Material zusammengesetzt ist, das Zwischenräume aufweist,
die durch die Stromazellen überbrückt werden.
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Das
US-Patent Nr. 5,811,094 (Osiris)
beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Bindegewebes, welches
das Erzeugen von Bindegewebe in einem Lebewesen, dass dessen Bedarf,
durch Verabreichen an das Lebewesen eines Zellpräparats umfasst, das menschliche
mesenchymale Stammzellen enthält,
welches aus menschlichem Knochenmark gewonnen worden ist und im
Wesentlichen frei von Blutzellen ist.
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Das
US-Patent Nr. 6,030,836 beschreibt
ein Verfahren zum Aufrechterhalten von menschlichen hämatopoietischen
Stammzellen in vitro, umfassend das gemeinsame Kultivieren von menschlichen
mesenchymalen Stammzellen mit den hämatopoietischen Stammzellen
derart, dass mindestens einige der hämatopoietischen Stammzellen
deren Stammzellenphänotyp
aufrechterhalten.
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Das
US-Patent Nr. 6,103,522 beschreibt eine
bestrahlte immortalisierte menschliche Stromazelllinie in einer
kombinierten in vitro-Kultur mit menschlichen hämatopoietischen Vorläuferzellen.
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WO 96/02662 A1 und
das
US-Patent Nr. 5,879,940 beschreiben
menschliche Knochenmark-Stromazelllinien,
welche die Hämatopoiese aufrechterhalten.
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Das
US-Patent Nr. 5,827,735 (Morphogen) beschreibt
gereinigte pluripotente mesenchymale Stammzellen, die im Wesentlichen
frei von mehrkernigen, myogenen Linien-festgelegten Zellen sind, und
die vorwiegend sternförmig
sind, wobei die mesenchymalen Stammzellen vorwiegend fibroblastische
Zellen bilden, wenn sie mit Muskel-morphogenem Protein in einem
Gewebekulturmedium, das 10% fetales Kälberserum enthält, in Kontakt
gebracht werden, und vorwiegend verzweigte mehrkernige Strukturen
bilden, die kontrahieren, wenn sie mit Muskel-morphogenem Protein
und Narben-inhibierendem Faktor in einer Gewebekultur mit einem
Medium, das 10% fetales Kälberserum
enthält,
in Kontakt gebracht werden.
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WO 99/94328 beschreibt
die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen zur Behandlung des
Zentralnervensystems und ein Verfahren des Ausrichtens der Differenzierung
von Knochenmark-Stromazellen.
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WO 98/20731 (Osiris) beschreibt
eine mesenchymale Megakaryocyten-Vorläuferzusammensetzung
und ein Verfahren zum Isolieren von MSC's, die mit isolierten Megakayrocyten
bei der Isolierung von Megakaryocyten einhergehen.
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WO 99/61587 (Osiris) beschreibt
menschliche(s) CD45 und/oder Fibroblasten und mesenchymale Stammzellen.
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WO 00/53795 (University
of Pittsburgh und The Regents of the University of California) beschreibt
von Fettgewebe stammende Stammzellen und Netzwerke, die im Wesentlichen
frei von Adipocyten und roten Blutzellen und klonalen Populationen von
Bindegewebsstammzellen sind. Die Zellen können allein oder innerhalb
biologisch verträglicher
Zusammensetzungen eingesetzt werden, um differenzierte Gewebe und
Strukturen sowohl in vivo als auch in vitro zu erzeugen. Zusätzlich können die
Zellen vermehrt und kultiviert werden, um Hormone zu erzeugen und
konditionierte Kulturmedien zur Unterstützung des Wachstums und der
Vermehrung anderer Zellpopulationen bereitzustellen. In einem anderen
Aspekt betrifft
WO 00/53795 ein
von Fettgewebe stammendes Netzwerk, das im Wesentlichen frei von Zellen
ist, welches extrazelluläres
Matrixmaterial von Fettgewebe umfasst. Das Netzwerk kann als Substrat
zum Erleichtern des Wachstums und der Differenzierung von Zellen
in vivo und in vitro zu reifem Gewebe oder reifen Strukturen verwendet
werden.
WO 00/53795 beschreibt
keine von Fettgewebe stammende Stromazellen, die induziert worden
sind, mindestens eine phänotypische
Eigenschaft einer Neuronal-, Astroglia-, hämatopoietischen Vorläufer- oder Leberzelle
in dessen Prioritätsdokument,
noch beschreibt sie eine isolierte, von Fettgewebe stammende Stromazelle,
die dedifferenziert worden ist, so dass Adipocytenphänotypenmarker
fehlen.
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WO 99/28444 beschreibt
Verfahren und Zusammensetzungen zum Differenzieren von Stromazellen
von Fettgewebe zu Zellen mit osteoblastischen Eigenschaften sowie
Verfahren zur Verbesserung der Knochenstruktur eines Lebewesens.
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WO 00/44882 beschreibt
ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Induzieren von Stromazellen,
die von Fettgewebe stammen, zu Adipocyten.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verfahren zur
zellulären
Herstellung von gewünschten
Materialien bereitzustellen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zum Differenzieren
einer isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazelle in eine
Zelle mit den Eigenschaften einer neuronalen Zelle, wobei das Verfahren
das Inkontaktbringen der Stromazelle mit einem Antioxidationsmittel
umfasst, um dadurch die Differenzierung der Stromazelle in eine
Neuronalzelle in vitro zu induzieren.
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Folglich
wird die isolierte, von Fettgewebe stammende Stromazelle induziert,
mindestens eine Eigenschaft einer Neuronalzelle zu exprimieren.
Diese Zellen können
therapeutisch, um autolog oder allogen einen Wirt zu behandeln,
der einer solchen Behandlung bedarf, oder für diagnostische Zwecke verwendet
werden. Die Zellen können
z. B. in jedwedem pharmazeutisch verträglichen Träger, einschließlich Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung,
an den Zielbereich verabreicht werden. Alternativ können die Zellen
in einer Matrix, einem Netzwerk oder anderen Materialien, die zu
zwei- oder dreidimensionalen Strukturen zur Bildung eines strukturierten
Depots führen,
z. B. einem Implantat oder Transplantat, verabreicht werden. Das
dreidimensionale System kann biologisch abbaubar oder nicht biologisch
abbaubar sein. Beispiele für
biologisch abbaubare Materialien zur Verwendung bei der Verabreichung
dieser Zellen umfassen Alginat, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polylactid-Coglycolid,
Proteine, wie z. B. Proteoglykane, Glykoproteine, Hyaluronine, Fibronektine
und Kollagene. Die Zellen können
gegebenenfalls in einer Kombination mit einem anderen Mittel verabreicht
werden, wie z. B. einem Cytokin, Wachstumsfaktor, chemischen Induktionsmittel,
biologischen Mittel, Chemotherapeutikum, Hormon oder einer anderen
Zelle, einem Protein, Kohlenhydrat, Peptid oder einer Nukleinsäure.
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Die
induzierten, von Fettgewebe stammenden Zellen können therapeutisch (z. B. bei
der Gewebereparatur, -regeneration, -rekonstruktion oder -verstärkung, diagnostisch),
als Bioreaktoren zum Erzeugen gewünschter Substanzen und in der
Gentechnik und bei der Gewebeerzeugung verwendet werden.
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Die
Erfindung stellt Verfahren zur Differenzierung von adulten menschlichen
extramedullären, von
Fettgewebe stammenden Stromastammzellen entlang der nicht-mesenchymalen
Neuronalzelllinie bereit. Die adulten menschlichen extramedullären, von
Fettgewebe stam menden Stromastammzellen können als pluripotente Stammzellen
für die
Behandlung einer Anzahl von menschlichen und tierischen Zuständen und
Krankheiten verwendet werden.
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Es
wird ein Verfahren zum Induzieren von Stromastammzellen, die von
Fettgewebe stammen, zum Exprimieren von mindestens einer Eigenschaft einer
nicht von Fettgewebe stammenden Zelle bereitgestellt, wobei es sich
um eine Neuronalzelle handelt, umfassend: Kultivieren von isolierten,
von Fettgewebe stammenden Stromazellen in einem chemisch definierten
Kulturmedium, das ein Antioxidationsmittel umfasst. Das Kulturmedium
kann gegebenenfalls Serum und geeignete Wachstumsfaktoren, Hormone,
Cytokine, Serumfaktoren, embryonale Extrakte, vorzugsweise einen
nicht-menschlichen embryonalen Extrakt, und/oder chemische Verbindungen
zum Induzieren einer spezifischen Liniendifferenzierung enthalten.
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Die
Verfahren der Erfindung können
zum Erhalten von Zellen für
eine autologe und allogene Transplantation für die Behandlung menschlicher
Zustände
verwendet werden, einschließlich
unter anderem Blutdyskrasie, Krebs, Erkrankungen des Zentralnervensystems
und Trauma, Erkrankungen der peripheren Nerven und Trauma, Lebererkrankungen
und Trauma.
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Darüber hinaus
können
die Zellen, die durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden,
genetisch so modifiziert werden, dass sie ein therapeutisches Genprodukt
exprimieren. Die von Fettgewebe stammenden Zellen können genetisch modifiziert
werden, so dass sie z. B. exogene Gene exprimieren oder die Expression
von endogenen Genen hemmen. Gemäß dieser
Ausführungsform
wird die Zelle einem Gentransfervektor ausgesetzt, der eine Nukleinsäure umfasst,
die ein Transgen umfasst, so dass die Nukleinsäure in die Zelle unter Bedingungen
eingeführt
wird, die für
die Exprimierung des Transgens innerhalb der Zelle geeignet sind.
Das Transgen ist üblicherweise
eine Expressionskassette, die ein kodierendes Polynukleotid umfasst,
das funktionell mit einem geeigneten Promotor verknüpft ist.
Das kodierende Polynukleotid kann ein Protein kodieren oder es kann
eine biologisch aktive RNA, wie z. B. Antisense-RNA, oder ein Ribozym,
kodieren.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Differenzierung einer
isolierten, von Fettgewebe stammenden Stromazelle in eine Zelle
bereit, die mindestens eine Eigenschaft einer Neuronalzelle exprimiert.
Die mit den Verfahren der Erfindung erzeugten Zellen können eine
Quelle von partiell oder vollständig
differenzierten funktionellen Zellen mit Eigenschaften von mehreren
Gewebelinien für
die Forschung, zur Transplantation und zur Entwicklung von Gewebe erzeugungsprodukten
zur Behandlung einer tierischen Erkrankung, vorzugsweise einer menschlichen
Erkrankung, und zur Gewebereparatur oder -verbesserung bereitstellen.
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Fettgewebe
bietet eine potenzielle Alternative zu Knochenmark als eine Quelle
für multipotente Stromastammzellen.
Fettgewebe ist in vielen Lebewesen leicht zugänglich und liegt reichlich
vor. Fettsucht ist ein Zustand mit epidemischen Ausmaßen in den
Vereinigten Staaten, wo über
50% der Erwachsenen den empfohlenen „Body-mass-index" (BMI) auf der Basis
ihrer Größe und ihres
Gewichts überschreiten.
Adipocyten können
durch Fettabsaugen auf einer ambulanten Basis gewonnen werden. Das Fettabsaugen
ist ein relativ nicht-invasives
Verfahren mit kosmetischen Effekten, die für den größten Teil der Patienten akzeptabel
sind. Es ist gut dokumentiert, dass es sich bei Adipocyten um eine
erneuerbare Zellpopulation handelt. Selbst nach einer chirurgischen
Entfernung durch Fettabsaugen oder andere Verfahren ist es üblich, dass
in einem Lebewesen im Zeitverlauf an der gleichen Stelle ein Wiederauftreten von
Adipocyten festgestellt wird. Dies legt nahe, dass Fettgewebe Zellen
enthält,
die neue Fettzellen erzeugen können.
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Das
Verfahren wird verwendet, um eine von Fettgewebe stammende Stromazelle
zu induzieren, mindestens eine phänotypische Eigenschaft einer Neuronalzelle
zu exprimieren. Phänotypische
Marker der gewünschten
Zellen sind dem Fachmann bekannt und reichlich in der Literatur
veröffentlicht.
Zusätzliche
phänotypische
Marker werden laufend beschrieben oder können ohne übermäßiges Experimentieren identifiziert
werden. Jedweder dieser Marker kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass die
Fettzelle zu einem differenzierten Zustand induziert worden ist.
Linien-spezifische phänotypische
Eigenschaften können
Zelloberflächenproteine,
Cytoskelettproteine, die Zellmorphologie und sekretorische Produkte
umfassen. Neuronale Eigenschaften umfassen die Expression von neuronalen
Markern, wie z. B. NeuN, NF-M, NSE, Nestin und trkA. Blutspezifische
Marker können
die Gegenwart von CD4, CD8, CD7, CD19, CD45, CD33, CD34, TCR, usw., umfassen.
Dem Fachmann ist klar, dass bekannte kalorimetrische Verfahren,
Fluoreszenzverfahren, immunchemische Verfahren, eine Polymerasekettenreaktion,
chemische oder radiochemische Verfahren die Gegenwart oder Abwesenheit
eines Linien-spezifischen Markers leicht ermitteln können.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird die Zelle in der Abwesenheit von Serum, jedoch in der Gegenwart
eines chemischen Mittels, wie z. B. eines Oxidationsmittels, wie
z. B. 2-Mercaptoethanol,
differenziert.
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Differenzierte
Zellen, die gemäß den Verfahren
der Erfindung erzeugt werden, sind bei autologen und allogenen Transplantationen
geeignet.
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Beispielsweise
ist die Stelle das Zentralnervensystemgewebe und die gewünschte Eigenschaft oder
der Phänotyp
ist neuronal. Vorzugsweise ist das Lebewesen ein Säuger, mehr
bevorzugt ist das Lebewesen ein Mensch.
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Die
Zellen, die gemäß einem
Verfahren der Erfindung erhalten werden, können in einem Verfahren zur
Verbesserung der Hämatopoiese
in einem Patienten verwendet werden, umfassend die Transplantation
der Zellen der Erfindung in den Patienten. Vorzugsweise findet die
Transplantation mittels intravenöser
Infusion statt. In einer Ausführungsform
wird die Zelle vorübergehend
oder stabil mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz transfiziert. Ein
virales Vehikel oder ein anderes Vehikel, das mindestens eine gewünschte Nukleinsäuresequenz
umfasst, die in die Zelle eingeführt
werden soll, kann die Transfektion vermitteln.
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Die
von Fettgewebe stammenden Stromazellen, die in den Verfahren der
Erfindung geeignet sind, können
mit verschiedenen, dem Fachmann bekannten Verfahren isoliert werden.
Beispielsweise sind solche Verfahren im
US-Patent Nr. 6,153,432 beschrieben.
In einem bevorzugten Verfahren wird Fettgewebe von einem Säugerlebewesen,
vorzugsweise einem Menschen, isoliert. Eine bevorzugte Quelle für Fettgewebe
ist Bauchfett. Beim Menschen wird das Fett typischerweise durch
Fettabsaugen isoliert. Wenn die durch ein Verfahren der Erfindung
erhaltenen Zellen in einen Menschen transplantiert werden sollen,
ist es bevorzugt, dass das Fettgewebe von dem gleichen Menschen
isoliert wird, um ein autologes Transplantat bereitzustellen. Alternativ kann
das verabreichte Gewebe allogen sein.
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In
einem Verfahren der Isolierung von Stromazellen, die von Fettgewebe
stammen, wird das Fettgewebe mit Kollagenase bei Konzentrationen zwischen
0,01 bis 0,5%, vorzugsweise 0,04 bis 0,2%, insbesondere etwa 0,1%,
Trypsin bei Konzentrationen zwischen 0,01 bis 0,5%, vorzugsweise
0,04%, insbesondere etwa 0,2%, und/oder Dispase bei Konzentrationen
von 0,5 ng/ml bis 10 ng/ml und/oder effektiven Konzentrationen von
Hyaluronidase oder Dnase und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
bei Konzentrationen von etwa 0,01 bis 2,0 mM, vorzugsweise bei etwa
0,1 bis etwa 1,0 mM, insbesondere bei 0,53 mM bei Temperaturen zwischen
25 bis 50°C, vorzugsweise
zwischen 33°C
bis 40°C,
insbesondere bei 37°C,
für Zeiträume zwischen
10 min und 3 Stunden, vorzugsweise zwischen 30 mm bis 1 Stunde, insbesondere
für 45
mm behandelt. Die Zeilen werden durch einen Nylonnetz- oder Seihtuchnetzfilter zwischen
20 Mikrometer bis 800 Mikrometer, mehr bevorzugt zwischen 40 bis
400 Mikrometer, insbesondere mit 70 Mikrometer geschickt. Die Zellen
werden dann direkt in Medien oder über einen Ficoll- oder Percoll-Gradienten
oder einen anderen speziellen Gradienten einer Differenzialzentrifugation
unterzogen. Zellen werden mit Geschwindigkeiten zwischen 100 bis
3000 × g,
mehr bevorzugt von 200 bis 1500 × g, insbesondere von 500 × g für Zeiträume zwischen
1 min bis 1 Stunde, mehr bevorzugt von 2 bis 15 min, insbesondere
von 5 min, bei Temperaturen zwischen 4 bis 50°C, vorzugsweise zwischen 20 bis
40°C, insbesondere
bei etwa 25°C
zentrifugiert.
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Die
Erfindung umfasst die Behandlung der von Fettgewebe stammenden Stromazellen,
um diese zur Bildung von Neuronallinien von Zellen zu induzieren.
Während
die Erfindung nicht an eine Theorie bezüglich der Funktion gebunden
ist, wird davon ausgegangen, dass die Behandlung der Präadipocyten mit
einem Medium, das ein Antioxidationsmittel und gegebenenfalls eine
Kombination von Serum, embryonalen Extrakten, vorzugsweise eines
nicht-menschlichen
embryonalen Extrakts, gereinigten oder rekombinanten Wachstumsfaktoren,
Cytokinen, Hormonen und/oder chemischen Mitteln enthält, in einer 2-dimensionalen
oder 3-dimensionalen
Mikroumgebung eine Differenzierung induzieren wird.
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Nicht-beschränkende Beispiele
für Basismedien,
die in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, umfassen unter
anderem Minimum Essential Medium Eagle, ADC-1, LPM (Rinderserum,
albuminfrei), F10 (HAM) F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ
Medium (mit und ohne Fitton-Jackson-Modifizierung), Basal Medium
Eagle (BME – mit der
Zugabe von Earle's
Salzbasis), Dulbecco's
Modified Eagle Medium (DMEM – ohne
Serum), Yamane, IMEM-20, Glasgow Modification Eagle Medium (GMEM),
Leibovitz L-15 Medium, McCoy's
5A Medium, Medium M199 (M199E – mit
Earle's Salzbasis), Medium
M199 (M199H – mit
Hank's Salzbasis),
Minimum Essential Medium Eagle (MEM-E – mit Earle's Salzbasis), Minimum Essential Medium
Eagle (MEM-H – mit
Hank's Salzbasis)
und Minimum Essential Medium Eagle (MEM-NAA – mit nicht-essentiellen Aminosäuren), einschließlich Medium
199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713,
DM 145, Williams' G,
Neuman & Tytell,
Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MCDB
153. Ein bevorzugtes Medium zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
ist DMEM. Diese und andere geeignete Medien sind unter anderem von
GIBCO, Grand Island, N. Y., USA, und Biological Industries, Bet
HaEmek, Israel, erhältlich.
Eine Anzahl dieser Medien ist in Methods of Enzymology, Band LVIII, „Cell Culture", Seiten 62–72, herausgegeben
von William B. Jakoby und Ira H. Pastan, veröffentlicht von Academic Press,
Inc., zusammengefasst.
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Zusätzliche,
nicht-beschränkende
Beispiele für
Medien, die in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, können fetales
Serum vom Rind oder anderen Arten in einer Konzentration von mindestens
1% bis etwa 30%, vorzugsweise von mindestens etwa 5% bis 15%, insbesondere
von etwa 10% enthalten. Ein embryonaler Extrakt von Hühnern oder
anderen Spe zies kann bei einer Konzentration von etwa 1% bis 30%,
vorzugsweise von mindestens etwa 5% bis 15%, insbesondere von etwa
10% vorliegen.
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Mit „Wachstumsfaktoren,
Cytokinen, Hormonen" sind
die folgenden spezifischen Faktoren gemeint, einschließlich unter
anderem Wachstumshormon, Erythropoietin, Thrombopoietin, Interleukin
3, Interleukin 6, Interleukin 7, Makrophagen-Kolonie-stimulierender
Faktor, c-kit Ligand/Stammzellenfaktor, Osteoprotegerinligand, insulin,
Insulin-artige Wachstumsfaktoren, epidermaler Wachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor,
Nervenwachstumsfaktor, ziliärneurotropher
Faktor, von Plättchen
stammender Wachstumsfaktor und morphogenetisches Knochenprotein,
und zwar bei Konzentrationen im Bereich zwischen Picogramm/ml bis
Milligramm/ml. Bei solchen Konzentrationen können die Wachstumsfaktoren,
Cytokine und Hormone, die in den Verfahren der Erfindung geeignet
sind, bis zu 100% der Bildung von Blutzellen (lymphoide, erythroide,
myeloide oder Plättchen-Linien)
aus Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, in Tests bezüglich einer
Kolonie-bildenden Einheit (CFU) induzieren. (Moore et al. (1973),
J. Natl. Cancer Inst. 50, 603–623;
Lee et al. (1989), J. Immunol. 142, 3875–3883; Medina et al. (2993),
J. Exp. Med. 178, 1507–1515).
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Es
sollte ferner beachtet werden, dass dem Kulturmedium zusätzliche
Komponenten zugesetzt werden können.
Solche Komponenten können
Antibiotika, Antimykotika, Albumin, Aminosäuren und andere Komponenten
sein, die in dem Fachgebiet für die
Kultivierung von Zellen bekannt sind. Zusätzlich können Komponenten zur Verstärkung des
Differenzierungsvorgangs zugesetzt werden.
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Mit „chemischen
Mitteln" sollen
unter anderem Antioxidationsverbindungen, wie z. B. butyliertes Hydroxyanisol
(BHA) oder 2-Mercaptoethanol, Steroide, Retinoide und andere chemische
Verbindungen oder Mittel gemeint sein, welche die Differenzierung von
Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, induzieren.
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Mit „Charakterisierung" der resultierenden differenzierten
Zellen ist die Identifizierung von Oberflächen- und intrazellulären Proteinen,
Genen und/oder anderen Markern gemeint, welche die Linienfestlegung
der Stromazellen auf einen bestimmten enddifferenzierten Zustand
anzeigen. Diese Verfahren umfassen unter anderem (a) den Nachweis
von Zelloberflächenproteinen
durch Immunfluoreszenzverfahren unter Verwendung von Protein-spezifischen
monoklonalen Antikörpern,
die unter Verwendung eines sekundären Fluoreszenzmarkers verknüpft sind,
einschließlich
die Verwendung von durchflusscytometrischen Verfahren, (b) den Nachweis
von intrazellulären
Proteinen durch Immunfluoreszenzverfahren unter Verwendung von Protein-spezifischen
monoklonalen Antikörpern,
die unter Verwendung eines sekundären Fluoreszenzmarkers verknüpft sind,
einschließlich
die Verwendung von durchflusscytometrischen Verfahren, (c) den Nachweis
von Zellgenen durch eine Polymerasekettenreaktion, eine in situ-Hybridisierung
und/oder eine Northern Blot-Analyse.
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Partiell
differenzierte oder enddifferenzierte Zellen können durch die Identifizierung
von Oberflächen-
und intrazellulären
Proteinen, Genen und/oder anderen Markern, welche die Linienfestlegung
der Stromazellen auf einen bestimmten enddifferenzierten Zustand
anzeigen, charakterisiert werden. Diese Verfahren umfassen unter
anderem (a) den Nachweis von Zelloberflächenproteinen durch Immunfluoreszenztests,
wie z. B. einer Durchflusscytometrie oder einer in situ-Immunfärbung von
Oberflächenproteinen
von Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, wie z. B. alkalischer
Phosphatase, CD44, CD146, Integrin beta 1 oder Osteopontin (Gronthos et
al. (1994), Blood 84, 4164–4173),
(b) den Nachweis von intrazellulären
Proteinen durch Immunfluoreszenzverfahren, wie z. B. einer Durchflusscytometrie
oder einer in situ-Immunfärbung
von Stromazellen, die von Fettgewebe stammen, unter Verwendung spezifischer
monoklonaler Antikörper,
die gegen Peroxisomproliferator-aktivierte Rezeptoren, Retinoid
X-Rezeptoren, Vitamin D-Rezeptoren oder Cbfa1 gerichtet sind, (c)
den Nachweis der Expression von Linien-selektiven mRNA's, wie z. B. Osteocalcin,
PPAR gamma, Leptin, Cbfa1, Interleukin 7, Osteoprotegerinligand
und/oder Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor, Leukocytenmarker
und Wachstumsfaktor durch eine Polymerasekettenreaktion, eine in
situ-Hybridisierung und/oder eine andere Blot-Analyse (vgl. Gimble
et al. (1989), Blood 74, 303–311).
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Die
Zellen können
einem Wirt auf vielen verschiedenen Wegen verabreicht werden. Bevorzugte Verabreichungsarten
sind eine parenterale, intraperitoneale, intravenöse, intradermale,
epidurale, intraspinale, intrasternale, intraartikuläre, intrasynoviale, intrathecale,
intraarterielle, intrakardiale, intramuskuläre, intranasale, subkutane,
intraorbitale, intrakapsuläre,
lokale Verabreichung, eine Verabreichung mittels Transdermalpflaster,
eine rektale, vaginale oder urethrale Verabreichung, einschließlich mittels Zäpfchen,
perkutan, mittels Nasenspray, chirurgische Implantierung, internes
chirurgisches Aufbringen, Infusionspumpe oder mittels eines Katheters. Das
Mittel und der Träger
können
z. B. in einer Formulierung mit langsamer Freisetzung, wie z. B.
einer direkten Gewebeinjektion oder mittels eines Bolus, einem Implantat,
einem Mikroteilchen, einem Mikrokügelchen, einem Nanoteilchen
oder einem Nanokügelchen
verabreicht werden.
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Die
Gegenwart der differenzierten Zellen, die durch ein Verfahren der
Erfindung erhalten worden sind, kann in einem Lebewesen mit verschiedenen Techniken
nachgewiesen werden, einschließlich
unter anderem mittels Durchflusscytometrie, immunhistochemisch,
in situ- Hybridisierung
und/oder einer anderen histologischen oder zellbiologischen Technik. Vgl.
z. B. Kopen et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 10711–10716.
-
Krankheiten
oder pathologische Zustände umfassen
neurodegenerative Erkrankungen, hepatodegenerative Erkrankungen,
nephrodegenerative Erkrankungen, Rückenmarksverletzungen, Kopftrauma oder
-chirurgie, virale Infektionen, die zu einer Gewebe-, Organ- oder
Drüsendegeneration
führen,
und dergleichen. Solche neurodegenerativen Erkrankungen umfassen
unter anderem AIDS-Demenz-Komplex, Entmarkungskrankheiten, wie z.
B. multiple Sklerose und akute Transferasemyelitis, extrapyramidale
und zerebelläre
Störungen,
wie z. B. Läsionen des
Kortikospinalsystems, Störungen
der basalen Ganglien oder Kleinhirnstörungen, hyperkinetische Bewegungsstörungen,
wie z. B. Chores Huntington und senile Chores, Arzneistoff-induzierte
Bewegungsstörungen,
wie z. B. solche, die durch Arzneistoffe induziert werden, welche
die CNS-Dopaminrezeptoren blockieren, hypokinetische Bewegungsstörungen,
wie z. B. Parkinson-Krankheit, progressive Supranukleoplasie, strukturelle
Läsionen
des Kleinhirns, spinozerebelläre
Degenerationen, wie z. B. spinale Ataxie, Friedreich-Ataxie, zerebelläre kortikale
Degenerationen, multiple Systemdegenerationen (Mencel, Dejerine
Thomas, Shi-Drager und Machado-Joseph), systemische Störungen,
wie z. B. Refsum-Krankheit, Abetalipoproteinämie, Ataxie, Teleangiektasie
sowie mitochondrielle Mehrfachsystemstörungen, Entmarkungsstörungen,
wie z. B. multiple Sklerose, akute Querschnittsmyelitis, und jedwede Störungen der
motorischen Einheit, wie z. B. neurogene muskuläre Atrophien (Zelldegeneration
des Vorderhorns des Seitenventrikels, wie z. B. amyotrophe Lateralsklerose,
infantile Rückenmuskelatrophie und
juvenile Rückenmuskelatrophie),
Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom im mittleren Alter, diffuse Lewykörper-Krankheit,
senile Demenz des Lewykörpertyps,
Wernicke-Korsakoff-Syndrom, chronischer Alkoholismus, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, subakute
sklerosierende Panenzephalitis-Hallervorden-Spatz-Krankheit, und Boxerenzephalopathie. Vgl.
z. B. Berkow et al. (Hrsg.) (1987), The Merck Manual (15.) (Hrsg.)
Merck and Co., Rahway, NJ.
-
In
einer anderen Ausführungsform
können die
von Fettgewebe stammenden Zellen, die durch ein Verfahren der Erfindung
erhalten worden sind, genetisch modifiziert werden, z. B. um exogene
Gene zu exprimieren oder um die Exprimierung von endogenen Genen
zu unterdrücken.
Gemäß dieser
Ausführungsform
wird die Zelle einem Gentransfervektor ausgesetzt, der eine Nukleinsäure umfasst,
die ein Transgen umfasst, so dass die Nukleinsäure in die Zelle unter Bedingungen
eingeführt
wird, die für
eine Exprimierung des Transgens innerhalb der Zelle geeignet sind.
Das Transgen ist im Allgemeinen eine Expressionskassette, die ein
kodierendes Polynukleotid umfasst, das funktionell mit einem geeigneten Promotor
verknüpft
ist. Das kodierende Polynukleotid kann ein Protein kodieren oder
es kann biologisch aktive RNA, wie z. B. Antisense-RNA, oder ein
Ribozym kodieren. Folglich kann das kodierende Polynukleotid ein
Gen, das z. B. eine Beständigkeit
gegen ein Toxin verleiht, ein Hormon (wie z. B. Peptidwachstumshormone,
Hormonfreisetzungsfaktor, Sexualhormone, adrenokortikotrophe Hormone,
Cytokine, wie z. B. Interferone, Interleukine und Lymphokine), einen
an die Zelloberfläche
gebundenen intrazellulären
Signalgebungsrest, wie z. B. Zelladhäsionsmoleküle und Hormonrezeptoren, und
Faktoren, die eine gegebene Differenzierungslinie fördern, oder
jedwedes andere Transgen mit einer bekannten Sequenz kodieren.
-
Die
Expressionskassette, die das Transgen enthält, sollte in den genetischen
Vektor einbezogen werden, der zur Abgabe des Transgens an die Zelle geeignet
ist. Abhängig
von der gewünschten
Endanwendung kann jedweder derartige Vektor so eingesetzt werden,
dass er die Zellen genetisch modifiziert (z. B. Plasmide, nackte
DNA, Viren, wie z. B. Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus,
Lentivirus, Papillomavirus, Retroviren, usw.). Jedwedes Verfahren
zur Konstruktion der gewünschten
Expressionskassette innerhalb solcher Vektoren kann eingesetzt werden,
wobei viele davon bekannt sind, wie z. B. durch direktes Klonieren,
homologe Rekombination, usw. Der gewünschte Vektor wird größtenteils das
Verfahren bestimmen, das zum Einführen des Vektors in die Zellen
verwendet wird, welches allgemein bekannt ist. Geeignete Techniken
umfassen Protoplastenfusion, Calciumphosphatfällung, Genkanone, Elektroporation
und Infektion mit viralen Vektoren.
-
Die
Zellen, die durch ein Verfahren der Erfindung erhalten worden sind,
können
in einer Kombination mit jedweder bekannten Technik der Gewebeerzeugung
verwendet werden, einschließlich
unter anderem solchen Technologien, die in Patenten und Veröffentlichungen
beschrieben sind, die in „Hintergrund
der Erfindung" zitiert
sind (einschließlich
die
US-Patente Nr. 5,902,741 und
5,863,531 (Advanced Tissue
Sciences, Inc.)), sowie unter anderem:
US-Patent Nr. 6,139,574 , Vacanti et
al. (31.10.2000), „Vascularized
Tissue Regeneration Matrices Formed By Solid Free Form Fabrication
Techniques";
US-Patent Nr. 5,759,830 ,
Vacanti et al. (2.6.98) „Three-Dimensional
Fibrous Scaffold Containing Attached Cells For Producing Vascularized
Tissue In Vivo";
US-Patent Nr. 5,741,685 ,
Vacanti (21.4.98), „Parenchymal
Cells Packaged In Immunoprotective Tissue For Implantation";
US-Patent Nr. 5,736,372 , Vacanti et
al. (7.4.98), „Biodegradable
Synthetic Polymeric Fibrous Matrix Containing Chondrocyte For In
Vivo Production Of A Cartilaginous Structure";
US-Patent Nr.
5,804,178 , Vacanti et al. (8.9.98), „Implantation Of Cell-Matrix
Structure Adjacent Mesentery, Omentum Or Peritoneum Tissue";
US-Patent Nr. 5,770,417 , Vacanti et
al. (23.6.98), „Three-Dimensional Fibrous Scaffold
Containing Attached Cells For Producing Vascularized Tissue In Vivo";
US-Patent Nr. 5,770,193 , Vacanti et
al. (23.6.98), „Preparation
of Three-Dimensional
Fibrous Scaffold For Attaching Cells To Produce Vascularized Tissue
In Vivo";
US-Patent Nr. 5,709,854 ,
Griffith-Cima et al. (20.1.98), „Tissue Formation By Injecting
A Cell-Polymeric
Solution That Gels In Vivo";
US-Patent Nr. 5,516,532 ,
Atala et al. (14.5.98), „Injectable
Non-Immunogenic Cartilage And Bone Preparation",
US-Patent
Nr. 5,855,610 , Vacanti et al. (5.1.99), „Engineering
Of Strong, Pliable Tissues";
US-Patent Nr. 5,041,138 ,
Vacanti et al. (20.8.91), „Neomorphogenesis
Of Cartilage In Vivo From Cell Culture";
US-Patent
Nr. 6,027,744 , Vacanti et al. (22.2.00), „Guided Development
and Support Of Hydrogel-Cell Compositions";
US-Patent
Nr. 6,123,727 , Vacanti et al. (26.9.00), „Tissue
Engineered Tendons And Ligament";
US-Patent Nr. 5,536,656 ,
Kemp et al. (16.7.96), „Preparation
Of Tissue Equivalents By Contraction Of A Collagen Gel Layered On
A Collagen Gel";
US-Patent Nr. 5,144,016 ,
Skjak-Braek et al. (1.9.92), „Alginate
Gels";
US-Patent Nr. 5,944,754 , Vacanti (31.8.99), „Tissue
Re-Surfacing With Hydrogel-Cell Compositions";
US-Patent
Nr. 5,723,331 , Tubo et al. (3.3.98), „Methods And Compositions
For The Repair Of Articular Cartilage Defects In Mammals";
US-Patent Nr. 6,143,501 , Sittinger
et al. (7.1.00), „Artificial
Tissues, Methods For The Production And The Use Thereof'.
-
Beispiele
-
Die
Beispiele 1, 2 und 4 fallen nicht in den Schutzbereich der vorliegenden
Erfindung und sind lediglich für
Veranschaulichungszwecke einbezogen.
-
Beispiel 1 – Hämatopoietisches Festlegen durch
von Fettgewebe stammende Stromazellen
-
A.
Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe gemäß den Verfahren,
die in der US-Patentanmeldung 09/240,029, eingereicht am 29. Januar
1999, beschrieben sind, sowie unter Verwendung der Modifizierungen
des Wachstumsmediums, wie sie vorstehend beschrieben worden sind,
isoliert. Insbesondere wurden menschliche Präadipozyten aus Fettgewebe isoliert,
das durch eine Fettabsaugungschirurgie gemäß den Verfahren entfernt worden
ist, die bereits von Rodbell und Hauner beschrieben worden sind
(Rodbell (1967) und (1974); Hauner, vorstehend). Präadipozyten
aus der Stroms-vaskulären Fraktion
wurden in DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien, die 10% fetales Rinderserum,
5% Hühnerembryoextrakt
und Antibiotika enthielten, resuspendiert und mit 25000 Zellen/Well
in jeden der Wells einer 96 Well-Platte (150 μl/Well) plattiert. Die Zellen wurden
dann in einen 37%C 5% CO2-Inkubator eingebracht
und über
Nacht ansiedeln gelassen. Die Zellen werden als Primärkulturen
für einen
Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren kultiviert.
Zellen werden durch einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung
geerntet.
-
Menschliche,
von Fettgewebe stammende Stromazellen werden bezüglich der hämatopoietischen Differenzierung
auf der Basis eines Knochenmarkrepopulationstests getestet. Immunschwache SCID-
oder Nackt/Beige-Mäuse
werden mit 11 Gy γ-Strahlung
in einer aufgeteilten Dosis letal bestrahlt und mit einer Nahrung
aus angesäuertem
Wasser und autoklaviertem Futter versorgt. Hämatopoietische Zellen aus dem
Knochenmark der gleichen Tiere werden in Mengen von etwa 107 Zellen pro Transplantat isoliert. Hämatopoietische
Zellen von der Maus (107 von Knochenmark
stammende Zellen) oder Stromazellen menschlicher Herkunft (106 von Fettgewebe stammende Zellen) werden
in die Mäuse 16
Stunden nach der letalen Bestrahlung durch eine Injektion in die
Schwanzvene oder in die Retroorbitalvene eingeführt. Alternativ werden die
menschlichen Stromazellen mit den hämatopoietischen Zellen der Mäuse in einem
Verhältnis
von etwa 1:10 vor der Transplantation in ein subletal bestrahltes
Wirtstier gemischt, um einen kompetitiven Repopulationstest festzulegen.
Tiere werden unter einer Methoxyfluoran-Anästhesie transfundiert. Sechs
bis zwölf
Wochen nach der Transplantation wird Blut von den Empfängertieren
gesammelt und einer durchflusscytometrischen Analyse mit spezifischen
monoklonalen Antikörpern
für menschliche
hämatopoietische
Zellmarker, einschließlich
unter anderem Thy 1 (T-Zellen-Marker), B220 (B-Zellen-Marker), Mac
1 (Makrophagenmarker) und HLA (H-2K, menschlicher Marker), unterzogen.
Der Prozentsatz der gesamten peripheren hämatopoietischen Zellen menschlicher Herkunft
gegen eine Herkunft von der Maus wird bestimmt. In entsprechenden
Studien werden Knochenmark und Milz von der Empfängermaus gewonnen und klonogenen
in vitro-Tests bezüglich
spezifischer hämatopoietischer
Linien unterzogen. Diese Studien nutzen Tests auf Methylcellulosekoloniebasis.
Zellen werden unter Verwendung vergleichbarer Immunfluoreszenzverfahren
bezüglich
einer spezifischen Linienfestlegung analysiert.
-
B.
Menschliches Fettgewebe von einem einzelnen menschlichen Patienten
wird durch Fettabsaugen isoliert und von Fettgewebe stammende Stromazellen
werden gemäß den Verfahren,
die vorstehend beschrieben sind, isoliert. Die Zellen werden als
Primärkulturen
für einen
Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem
Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien
zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt
und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch
einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
-
Zellen
werden sofort für
Patienten mit hämatopoietischen
Störungen
verwendet, wie z. B. Störungen
nach einer hochdosierten Chemotherapie, oder sie werden für eine zukünftige Verwendung
in dem Fall eines akuten Medikamentenbedarfs durch diesen Patienten
oder einen histokompatiblen Empfänger
kryokonserviert. Stromazellen werden in den Empfänger entweder als autologe
oder allogene Transplantation nach jedwedem Ereignis, wie z. B. einer Chemotherapie
oder einer Bestrahlung, das die Knochenmarksfunktion und die Immunkompetenz stark
beeinträchtigt,
infundiert. Stromastammzellen werden mit einem Fluoreszenzmarker
markiert, um es einem Arzt zu ermöglichen, deren Schicksal nach der
Transplantation zu verfolgen. Anzeichen für eine beschleunigte Knochenmarkserholung
werden auf der Basis des Nachweises von neu synthetisierten hämatopoietischen
Zellen (Lymphoidzellen, Myeloidzellen, Erythroidzellen und Plättchen)
in dem peripheren Blutstrom auf der Basis von durchflusscytometrischen
Verfahren überwacht.
-
Beispiel 2 – Astroglia-Festlegen durch
von menschlichem Fettgewebe stammende Stromazellen
-
A.
Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe gemäß den Verfahren,
die vorstehend beschrieben sind, isoliert. Die Zellen werden als
Primärkulturen
für einen
Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem
Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien
zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt
und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch
einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
-
Zellen
werden in das Zentralnervensystem von immunschwachen Mäusen oder
Ratten transplantiert. Nackt/Beige- oder SCID-Mäuse oder Nacktratten werden
in einer verschlossenen Kammer unter Verwendung von 3% Halothan
in Sauerstoff anästhesiert;
die Anästhesie
wird durch eine intramuskuläre Injektion
von 6 mg/kg Xylozin und 60 mg/kg Ketamin aufrechterhalten. Die Tiere
werden in einem sauberen Bereich in eine Stereotaxievorrichtung überführt. In
die Kopfhaut 2 mm lateral zum Vorderkopf wird ein 2 bis 5 mm Einschnitt
ausgeführt.
Mit einem Zahnbohrer wird in den Knochen 3 mm lateral zum Vorderkopf
ein Bohrloch eingebracht. Etwa 10 μl einer Zellsuspension (10000
Zellen pro μl)
werden langsam während
eines 30 min-Zeitraums in das Striatum in einer Tiefe von 4 bis
5 mm von der Oberfläche
des Gehirns injiziert. Die Wunde wird dicht vernäht und die Tiere wurden für einen
Zeitraum von bis zu 10 Wochen beobachtet. Tiere werden nach einer
tiefen Anästhesie
mittels Xylozin und Ketamin durch eine intrakardiale Perfusion unter
Verwendung von eiskaltem PBS, 3% gepuffertem Paraformaldehyd und dann
10% Saccharose getötet.
Die Gehirne werden mittels Immunhistochemie und einer in situ-Hybridisierung
bezüglich
der Gegenwart menschlicher Genmarker (Alu-Fragment) und der Exprimierung
von Zelllinien-spezifischen Marken untersucht. Durch diesen Ansatz
werden Hinweise auf ein Überleben,
eine Differenzierung und eine Wanderung von menschlichen Zellen
bestimmt. Modifizierungen unter Verwendung einer Zellmarkierung
mit Fluoreszenzfarbstoffen oder einer gentechnischen Behandlung
der Zellen vor dem Implantieren mit viralen Mitteln können in
Betracht gezogen werden.
-
B.
Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe eines einzelnen
Patienten gemäß den Verfahren,
die vorstehend beschrieben sind, für eine autologe oder allogene
Transplantation in einen histokompatiblen Empfänger isoliert. Die Zellen werden als
Primärkulturen
für einen
Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem
Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien
zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt
und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch
einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
-
Stromazellen
werden in das Zentralnervensystem eines Patienten nach einer lebensbedrohlichen
und/oder schwächenden
Zentralnervensystemstörung
oder -erkrankung, wie z. B. einem kraniovaskulären Zwischenfall (Schlaganfall),
Parkinson-Krankheit oder Alzheimer-Krankheit, eingeführt. Zellen werden in das Striatum
des betroffenen Bereichs des Gehirns unter Verwendung eines neurochirurgischen
Ansatzes eingeführt.
Wo immer dies möglich
ist, werden radiologisch geführte,
minimal invasive Verfahren eingesetzt. Die kognitive und metabolische
Funktion des Zentralnervensystems wird nach der Chirurgie verfolgt,
um Verbesserungen nach der Transplantation zu dokumentieren. Zellen, die
gentechnisch mit Genen versehen sind, die Enzyme kodieren, die so
gestaltet sind, dass sie die ZNS-Funktion verbessern, wie z. B.
Dopamin-metabolische Enzyme in dem Fall einer Parkinson-Krankheit,
werden je nach Eignung für
bestimmte Störungen
verwendet.
-
Beispiel 3 – Neuronales Festlegen durch
von menschlichem Fettgewebe stammende Stromazellen
-
Verbesserte Reparatur und funktionelle
Wiederherstellung bei einer traumatischen Verletzung des Nervensystems
-
Stromazellen
werden aus menschlichem Fettgewebe eines einzelnen Patienten gemäß den Verfahren,
die vorstehend beschrieben sind, für eine autologe oder allogene
Transplantation in einen histokompatiblen Empfänger isoliert. Die Zellen werden als
Primärkulturen
für einen
Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem
Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien
mit 1 mM Glutamin, jedoch ohne Pyruvat, zusammengesetzt war, die
10% fetales Rinderserum, 10% Serum vom neugeborenen Kalb, Nukleosidlösungen,
0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 1000 Einheiten/ml Leukämieinhibierenden Faktor und
Antibiotika enthielten, bei 37°C
kultiviert.
-
Zellen
werden durch einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung
geerntet. Zellen werden dann auf ein Gewebekulturkunststoffsubstrat
plattiert, das mit einer sterilen 0,1% Gelatinelösung beschichtet ist. Zellen
werden während
des Stadiums eines schnellen Wachstums durch einen Abbau mit 0,25%
Trypsin und 1 mM EDTA und Zerreiben vor der Differenzierung/Implantierung
geerntet. Zellen werden als Suspension in der Form von einzelnen
Zellen und Zellklumpen, die zusammen vorliegen, geerntet. Zellen
werden als Aliquots in bakteriologische (nicht-Gewebekultur)-Schalen
mit einem Durchmesser von 100 mm in einem Volumen von 10 ml Medium,
das aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien mit 1 mM Glutamin, jedoch
ohne Pyruvat, zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum,
10% Serum vom neugeborenen Kalb und Nukleosidlösungen (Kontrollmedium) enthielten,
eingebracht. Die Zellkulturen werden zwei Tage gehalten, wobei sich
während
dieser Zeit Zellaggregate bilden; zu diesem Zeitpunkt wird das Medium
durch das ursprüngliche
Kontrollmedium ersetzt. Nach weiteren zwei Tagen der Kultivierung (Tag
4 nach der Passage) werden die Zellen mit Kontrollmedium versorgt,
das mit all-trans-Retinsäure
bei Konzentrationen zwischen 10–9 M
bis 10–6 M,
insbesondere bei 5 × 10–7 M
ergänzt
ist. Die Zellen werden am Tag 6 in dem mit all-trans-Retinsäure ergänzten Medium
gehalten. Am Tag 8 nach der Passage sind die Zellen zur Bewertung
und Verwendung bei der Behandlung eines traumatischen Verletzungsmodells
des Rückenmarks
oder des peripheren Nervensystems bereit.
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Die
in vitro-Bewertung der Zellen wird durch Überführen der Zellen von der bakteriologischen
Kulturschale auf Standardgewebekulturschalen zur Bereitstellung
eines Substrats zum Binden durchgeführt. Zellen werden an den Kunststoff
anhaften gelassen und auf der Basis ihrer Morphologie im Einklang
mit ihrem neuronalen Differenzierungsprofil und ihrer Exprimierung
von neuronal assoziierten Proteinen, einschließlich unter anderem Klasse
III beta-Tubulin, der M-Untereinheit von Neurofilamenten, Tyrosinhydroxylase,
Glutamatrezeptor-Untereinheiten
der GluR1–4-
und GluR6-Klassen, gliales fibrilläres saures Protein, basisches
Myelinprotein und Gehirnfaktor 1 (Rain et al. (1995), Develop. Biol.
168, 342–357),
bewertet.
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Die
in vivo-Bewertung der Zellen wird durch Transplantieren der Zellaggregate
in die Fistel durchgeführt,
die sich um eine experimentell induzierte thorakale Rückenmarksläsion in
Ratten bildet (McDonald et al. (1999), Nature Med. 5(12), 1410–1412). Das
thorakale Rückenmarksverletzungsmodell (Brustwirbel
9 und 10) wird in Long-Evans-Ratten unter Verwendung eines 10 g-Stabs
mit einem Durchmesser von 2,5 mm, der 25 mm fällt, verursacht. Am neunten
Tag nach der Verletzung werden von Fettgewebe stammende Stromazellaggregate
(etwa 106 Zellen) durch Injektion unter
Verwendung eines Mikrostereotaxie-Injektionssystems in die Fistel
der thorakalen Rückenmarksverletzung
transplantiert. Scheinkontrollen werden mit einem äquivalenten
Volumen an Medien allein (keine Zellen) injiziert. Beginnend mit
dem Tag der Transplantation erhalten Ratten täglich Cyclosporin (10 mg/kg),
um eine Abstoßung
zu verhindern. Die motorische Hinterlauffunktion der Ratten wird
auf der Basis der Basso-Beattie-Breesnahan-Locomotor-Bewertungsskala
während
eines Zeitraums von 6 Wochen nach der Transplantation bewertet,
um einen funktionellen Vergleich der Wiederherstellung zwischen
transplantierten Stromazellen und Scheinkontrollen zu ermöglichen. Am
Ende der Studie (6 Wochen) werden die Tiere getötet und die Gewebe werden histologisch
bezüglich Anzeichen
von menschlichen Fett-Stromazellen auf der Basis eines in situ-Nachweises
der menschlichen Alu-DNA untersucht. Die Zelldifferenzierung wird durch
einen Antikörpernachweis
von Oligodendrocyten-spezifischen Markern, wie z. B. unter anderem des
adenomatösen
Polyposis Coli-Genprodukts APC CC-1, von Astrocyten-spezifischen
Markern, wie z. B. unter anderem glialem fibrillären sauren Protein, GFAP, und
neuronalem, wie z. B. unter anderem Neuron-spezifischem Kernprotein,
NeuN, bestimmt. Die Colokalisierung der Alu-DNA mit differenzierungsspezifischen
Markern wird als Anzeichen für eine
Stromazelldifferenzierung gewertet.
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Menschliche,
von Fettgewebe stammende Stromazellen werden bezüglich der neuronalen Differenzierung
auf der Basis von in vitro-Tests bewertet. Menschliche, von Fettgewebe
stammende Stromazellen werden bei Konzentrationen von 8000 Zellen/cm2 für
24 Stunden in DMEM, das mit 20% fetalem Rinderserum und Antibiotika
ergänzt
ist, kultiviert. Die Zellen werden dann mit Antioxidationsmitteln,
wie z. B. BHA, bei Konzentrationen von 20 μm bis 200 μm in DMEM mit 0% fetalem Rinderserum
für Zeiträume von
5 Stunden bis 5 Tagen behandelt. Zellen werden fixiert und bezüglich der
Exprimierung einer neuronalen Differenzierung durch (a) morphologische
Kriterien, (b) immunhistochemische Kriterien, Immunfluoreszenzkriterien
oder Durchflusszytometriekriterien, (c) Immunblotkriterien und/oder
eine Polymerasekettenreaktion oder eine Northernblot-Analyse von
ausgewählten
mRNA's untersucht.
Die Zellen werden bezüglich
ihrer Exprimierung eines Untersatzes der folgenden neuronalen Marker
bewertet: NeuN, NF-M, NSE, Nestin und trkA unter Verwendung von
Antikörper-
oder Oligonukleotidreagenzien. Morphologische Kriterien der Differenzierung
umfassen die Bildung eines zusammengezogenen multipolaren Zellkörpers mit
membranartigen, Fortsatzähnlichen
Zellverlängerungen,
die zum Wachstum von kegelartigen Enden und filopodialen Verlängerungen führen, das
Vermögen
von solchen Zellen, ein Aktionspotenzial zu erzeugen und aufrechtzuerhalten, das
mit einer neuronalen Signalübertragung
konsistent ist, und das Vermögen
zur Exprimierung von Rezeptoren und von Aufnahmesystemen für bekannte Neurotransmitter,
wie z. B. Glutamat.
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Beispiel 4 – Hepatocyten-Festlegen durch
von menschlichem Fettgewebe stammende Stromazellen
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A.
Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe gemäß den Verfahren,
die in „Methods and
Composition for the Differentiation of Human Preadipocytes into
Adipocytes", US-Patentanmeldung mit
der laufenden Nummer 09/240,029, eingereicht am 29. Januar 1999,
beschrieben sind, und unter Verwendung der vorstehend angegebenen
Modifizierungen isoliert. Die Zellen werden als Primärkulturen
für einen
Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem anfänglichen Plattieren in einem
Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien
zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt
und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch
einen Trypsin/EDTA-Abbau
vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
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Von
Fettgewebe stammende Stromazellen werden in immunschwache Nacktmäuse transplantiert,
die ein Transgen für
das Haupt-Harnprotein-Urokinase-Typ-Plasminogenaktivatorfusionsgen aufweisen
[T. C. Weglarz, J. L. Degen, E. P. Sandgren, „Hepatocyte transplantation
into diseased mouse liver: kinetics of parenchymal repopulation and
identification of the proliferative capacity of tetraploid and octaploid
hepatocytes", Am.
J. Pathol. 157, 1963–1974
(2000)]. Diese Tiere zeigen eine progressive Degeneration der Leber.
Die Stromazellen werden in das Tiermodell durch eine Transplantation
in die Milz, eine intraperitoneale und/oder intravenöse Infusion
eingeführt.
Repräsentative
Tiere von Kontroll- oder Experimentgruppen werden in Intervallen während eines
Zeitraums von 4 Monaten getötet.
Anzeichen einer Leberregeneration werden auf der Basis von histologischen
und molekularbiologischen Analysen des Lebergewebes bewertet. Immunhistochemische
und molekularbiologische (Alu-Färbung) Verfahren
werden die Gegenwart von menschlichen Zellen in der regenerierten
Leber dokumentieren.
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B.
Stromazellen werden aus menschlichem Fettgewebe eines einzelnen
Patienten für
eine autologe oder allogene Transplantation in einen histokompatiblen
Empfänger
gemäß den Verfahren,
die in „Methods
and Composition for the Differentiation of Human Preadipocytes into
Adipocytes", US-Patentanmeldung
mit der laufenden Nummer 09/240,029, eingereicht am 29. Januar 1999,
beschrieben sind, und unter Verwendung der vorstehend angegebenen Modifizierungen
isoliert. Die Zellen werden als Primärkulturen für einen Zeitraum von bis zu
5 Tagen nach dem anfänglichen
Plattieren in einem Medium, das unter anderem aus DMEM (hoher Glukosegehalt)-Medien
zusammengesetzt war, die 10% fetales Rinderserum, 5% Hühnerembryoextrakt
und Antibiotika enthielten, bei 37°C kultiviert. Zellen werden durch
einen Trypsin/EDTA-Abbau vor der Differenzierung/Implantierung geerntet.
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Stromazellen
werden in die Milz, den Kreislauf und/oder das Peritoneum eines
Patienten eingeführt,
der an degenerativen Lebererkrankungen jedweder Herkunft nach einer
viralen Infektion, einer Toxinaufnahme, oder an angeborenen metabolischen Defekten
leidet. Wo immer dies möglich
ist, werden zur Implantierung der Zellen radiologisch geführte, minimal
invasive Verfahren verwendet. Zellen, die gentechnisch mit Genen
versehen worden sind, die Enzyme kodieren, die zur Verbesserung
der Leberfunktion gestaltet sind, werden je nach Eignung für bestimmte
Störungen
verwendet.