CN105338989B - 改进用于移植的器官 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了改进器官移植成功率的方法和组合物。所述方法和组合物涉及在移植之前、之中和/或之后将所需器官暴露于干细胞。在一个实施方案中，所述干细胞降低局部缺血对被指定摘取用于移植或已经被摘取用于移植的器官的有害作用。在另一个实施方案中——其中对被指定用于移植的器官进行离体灌注，所述方法包括通过使用包含干细胞的基质灌注所述器官来降低局部缺血性再灌注损伤。

Description

改进用于移植的器官
序列表
本申请包含已经以ASCII格式通过电子提交的、并且以引用的方式全部纳入本文的序列表。所述ASCII副本创建于2014年4月8日，其被命名为ATH-022234USORD_SL.txt，大小为7,517字节。
技术领域
本发明的技术领域是器官移植并提供改进器官移植成功率的方法和组合物。所述方法和组合物涉及将所需器官在移植之前或移植过程中暴露于干细胞。在一个实施方案中，所述干细胞降低局部缺血对被指定摘取用于移植或已经被摘取用于移植的器官的有害效果。在另一个实施方案中，所述器官是肺。在其他实施方案中——其中对被指定用于移植的器官进行离体灌注，所述方法包括通过使用包含干细胞的基质灌注所述器官来降低局部缺血性再灌注损伤。
背景技术
器官移植表示从供体或供体部位(如果供体和受体相同)制备和摘取器官，并且在所捐赠的器官的受体中或通过其植入、维持和/或使用所述器官。估计在主要的医疗保健市场(例如美国、欧洲和日本)每年进行的器官移植超过50,000次，并且有超过170,000名患者在器官移植的等候名单上。对健康器官的需求显著超过供给。
器官移植的重大挑战是移植排斥，其可导致器官功能的显著的并发症或导致移植失败。通常，通过将具有高度相似血清型的供体和受体匹配，并通过使用免疫抑制药物控制移植排斥下的免疫反应来克服所述挑战。
另一重大挑战是在移植前或移植过程中器官生存力的保存。器官的取出、储存和移植可严重影响器官的内部结构和功能，并可显著地影响移植完成后正常器官功能的恢复被延迟或阻止的程度。这样的器官损伤主要由局部缺血和体温过低引起，但也可能与器官在离体情况下或在植入过程中的再灌注有关。器官保存的技术(包括离体灌注)，使这种损害最小化以促进最佳的移植物存活和移植物功能。但是，即使使用这些技术，器官健康状况在许多情况下仍会下降，影响了移植结果，并且在一些情况下，所述下降是如此显著以至于所捐赠的器官在移植前因无活力而被排斥。
克服器官移植中的这些重大挑战的技术应该对患者的生活质量和存活、对移植相关并发症的治疗具有实质的影响。
发明内容
本发明提供了一种方法，其包括移植已经在移植之前、之中和/或之后暴露于外源干细胞的器官。暴露于干细胞可改进器官移植成功的可能性。因此，本发明涉及以下实施方案。
在一个实施方案中，所述方法可包括通过将器官在移植之前、之中和/或之后与外源干细胞接触来耐受(tolerize)器官。通过耐受器官，该器官被更好地制备以被受体接受而无显著的免疫干扰。例如，可通过诱导器官中的T-调节细胞实现耐受(参见，例如，Eggenhofer et al.,Stem Cells Translation Medicine 2013；2:000-000)。
在一个实施方案中，本发明涉及通过在移植之前、之中和/或之后将器官与包含外源干细胞的基质接触来降低离体器官损伤的方法。
在一个实施方案中，所述损伤是由局部缺血性再灌注损伤引起的。
在一个实施方案中，所述方法涉及降低待移植的器官中总体的组织或细胞退化。这可由包括但不限于局部缺血、体温过低和再灌注的因素导致。因此，在一个实施方案中，本发明涉及降低由这些事件中的一个或多个造成的损伤。这些事件可能至少部分是由以下的一种或其组合造成：(1)TH1 T-细胞至TH2 T-细胞的免疫调节；(2)M1巨噬细胞至M2巨噬细胞的免疫调节(例如导致从促炎反应向抗炎反应的转变)；(3)抑制中性粒细胞的浸润(例如通过降低细胞表面受体)；(4)使中性粒细胞从具有促炎性向具有抗炎性转变；以及(5)由外源干细胞产生的细胞保护或抗凋亡效果。
本文所述的事件可能导致炎症、其他免疫反应、细胞因子产生、细胞凋亡以及影响器官生存力和移植适用性的其他事件。因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过向器官给予外源干细胞来降低这些事件的有害效果，所述器官正遭受这些事件或者这些事件已在其中发生。
可导致炎症、其他免疫反应、细胞因子产生、细胞凋亡的事件以及影响器官生存力和移植适用性的其他事件的实例可包括但不限于与内皮反应、活性氧类、补体和白细胞相关的那些事件。与内皮反应相关的事件可包括但不限于某些促炎基因产物(例如白细胞黏附分子、细胞因子)和/或生物活性剂(例如内皮素、血栓素A2)的表达，和/或其他“保护性”基因产物(例如组成型一氧化氮合酶、血栓调节蛋白)和/或生物活性剂(例如前环列素、一氧化氮)的抑制。与活性氧类(例如(O2-)、(OH-)、(HOCl)、(H2O2)，以及一氧化氮衍生的过氧硝酸盐)相关的事件可包括但不限于通过脂质过氧化对细胞膜的直接损害、通过激活质膜磷脂酶A2以形成花生四烯酸(血栓素A2和白三烯B4)来刺激白细胞激活和趋化、和/或在局部缺血性再灌注后增强白细胞激活、趋化和白细胞-内皮黏附。与补体激活(如C3a、C5a、iC3b、C5b9(C5a最有效))相关的事件可包括但不限于改变血管内平衡的若干促炎介质的形成，例如通过改变血管内平衡和增强白细胞-内皮黏附而减少到局部缺血器官的血流量。与白细胞相关的事件可包括但不限于白细胞激活、趋化、白细胞-内皮细胞黏附和迁移，这可进一步导致机械性梗阻，因为白细胞释放毒性ROS、蛋白酶和弹性蛋白酶，导致了增加的微血管渗透性、水肿、血栓形成和实质细胞死亡。
在一个实施方案中，所述器官选自包括但不限于以下组成的组：肺、肾脏、心脏、肝脏、胰腺、胸腺、胃肠道和复合的同种异体移植物(如四肢、面部等)，以及组织，其包括但不限于角膜、皮肤、静脉、动脉、骨骼、肌腱和瓣膜(如心脏瓣膜等)。
在一个实施方案中，所述干细胞降低器官中的炎症。例如，可以足够降低器官中炎症的剂量和时间将器官暴露于干细胞。
在一个实施方案中，所述干细胞降低器官中炎症细胞的发生。例如，可以以足够降低器官中炎症细胞发生的剂量和时间将器官暴露于干细胞。
在一个实施方案中，所述干细胞降低器官中的炎性细胞因子。例如，可以以足够降低器官中炎性细胞因子的剂量和时间将器官暴露于干细胞。
在一个实施方案中，所述干细胞降低肺水肿的发生。例如，可以以足够降低肺水肿发生的剂量和时间将器官暴露于干细胞。
在一个实施方案中，所述干细胞增加肺组织中IL-10表达(蛋白质和/或mRNA)的发生。例如，可以以足够增加肺组织中IL-10表达发生的剂量和时间将器官暴露于干细胞。
在一个实施方案中，损伤是由器官中缺氧导致的。
在一个实施方案中，所述干细胞降低器官中缺氧的影响。
在一个实施方案中，在从供体取出器官到向受体移植之间的任意时间给予所述干细胞。
在一个实施方案中，将所述干细胞在移植操作过程中暴露于器官。
在一个实施方案中，在器官仍完整存在供体内但在从供体取出器官之前可将器官暴露于干细胞。
在一个实施方案中，可将器官暴露于干细胞持续一个时间段。所述时间段可取决于具体的器官。例如，所述时间段可为约1-2小时、约2-3小时、约3-4小时、约4-5小时、约5-6小时、约7-8小时、约8-9小时、约9-10小时或约10小时或更多个小时。合适的时间段的一个实例记载于Zhao et al.,BMC Medicine 2012,10:3——其以引用的方式纳入本文用于教导离体操作，包括合适的时间段，用于静脉内离体细胞处理。
在一个实施方案中，暴露于器官的干细胞的浓度可取决于具体的器官。例如，暴露于器官的细胞的浓度可为约0.01×107至约5×107个细胞/ml、约1×105个细胞/ml至约5×107个细胞/ml、或约10×106个细胞/ml。
在另一个实施方案中，暴露于器官的干细胞的浓度可为约1×105个细胞/kg器官至约5×105个细胞/kg器官、约5×105个细胞/kg器官至1×106个细胞/kg器官至5×106个细胞/kg器官、约5×106个细胞/kg器官至1×107个细胞/kg器官、约1×107个细胞/kg器官至1.5×107个细胞/kg器官、或约1×107个细胞/kg器官至2×108个细胞/kg器官。
在其他实施方案中，所述干细胞包含于用于向器官灌注的液体中或包含于用于器官内(如支气管内)给予的载体中。
在另一个实施方案中，所述干细胞包含于在移植前使器官在其中接触的基质中，如使器官在其中浸泡而非灌注的基质。
本发明人考虑在本发明的方法中使用任何需要的干细胞。这些干细胞包括但不限于非胚胎多能干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、诱导多能干细胞等。在一个实施方案中，所述干细胞可以是非-HLA匹配的同种异体细胞。
细胞包括但不限于这样的细胞：其不是胚胎干细胞，不是生殖细胞，其具有胚胎干细胞的一些特征，但来源于非胚胎的组织并提供本申请中所述的效果。所述细胞可天然地实现这些效果(即没有经过遗传修饰或药学修饰)。然而，天然的表达子可被遗传修饰或药学修饰以增强效力。
所述细胞可表达多能性标记物，例如oct4。它们也可表达与长期复制能力相关的标记物，如端粒酶。多能性的其他特征可包括分化为超过一种的胚层(如外胚层、内胚层和中胚层中的两种或三种)的细胞类型的能力。这样的细胞在培养中可以是或不是无限增殖的或转化的。所述细胞可以被高度扩增而不被转化并仍维持正常的核型。在一个实施方案中，所述非胚胎干细胞、非生殖细胞可已经在培养中经历所需数量的细胞倍增。例如，非胚胎干细胞、非生殖细胞可已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增，如30-35次细胞倍增，其中所述细胞未被转化并具有正常的核型。所述细胞可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚胎细胞谱系中的两种的各自的至少一种细胞类型，并可包括分化为所有的三种谱系的细胞类型。此外，所述细胞可以是不致瘤的，例如不产生畸胎瘤。如果细胞是转化的或致瘤的，并且需要使用它们用于输注，这样的细胞可以是有缺陷的，因此它们不能在体内形成肿瘤，如通过防止细胞增殖为肿瘤的处理。这样的处理在本领域中是熟知的。
细胞包括但不限于以下编号的实施方案：
1.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，所述细胞已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增，其中所述细胞表达otc4，是未被转化的并具有正常的核型。
2.上述1的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
3.上述1的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚胎细胞谱系的至少两种中的至少一种细胞类型。
4.上述3的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
5.上述3的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚胎细胞谱系中的每一种的至少一种细胞类型。
6.上述5的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
7.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其通过培养非胚胎、非生殖组织而获得，所述细胞已经在培养中经历至少40次细胞倍增，其中所述细胞是未被转化的并具有正常的核型。
8.上述7的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
9.上述7的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚胎细胞谱系中的至少两种的至少一种细胞类型。
10.上述9的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
11.上述9的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚胎细胞谱系中的每一种的至少一种细胞类型。
12.上述11的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
13.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，所述细胞已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增，其中所述细胞表达端粒酶，是未被转化的并具有正常的核型。
14.上述13的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
15.上述13的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚胎细胞谱系中的至少两种的至少一种细胞类型。
16.上述15的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
17.上述15的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚胎细胞谱系中的每一种的至少一种细胞类型。
18.上述17的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
19.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚胎细胞谱系中的至少两种的至少一种细胞类型，所述细胞已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增。
20.上述19的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
21.上述19的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚胎细胞谱系中的每一种的至少一种细胞类型。
22.上述21的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
在一个实施方案中，使用条件培养基代替干细胞。
在一个实施方案中，所述器官来自人类。
鉴于细胞实现所需效果的性质，可建立包含针对具有实现所述效果的所需效力(能力水平)而选择的细胞的细胞库。因此，本发明涵盖测定细胞的能力。所述库可提供一种来源，其用于制备药物组合物以给予至器官。可从所述库中直接使用细胞或在使用之前对细胞进行扩增。特别是在对细胞进行进一步扩增的情况下，扩增之后需要验证所述细胞仍具有所需的效力。库允许“现成(off the shelf)”使用对器官供体和受体而言为同种异体的细胞。
因此，本发明还涉及在将干细胞暴露于器官之前进行的诊断操作。所述操作包括评估细胞实现本申请中所述的效果的效力。细胞可取自细胞库并直接使用或在给予之前扩增。在任何一种情况下，可评估细胞的所需效力。特别是在对细胞进行进一步扩增的情况下，扩增之后需要验证所述细胞仍具有所需的效力。
尽管在选择操作中必须测定所选细胞的效果，但是在给予受试者用于治疗之前再次测定细胞以确认细胞仍实现所需水平的效果可能是优选的和谨慎的。这在细胞已经——例如在细胞库中——被储存任意时间长度(其中，细胞在储存期间最可能被冷冻)的情况下是特别优选的。
在细胞的最初分离和给予至器官之间，可以有多次(即，连续的)效果测定。这是为了确认细胞在发生在此时间范围内的操作之后仍可实现所需水平的效果。例如，可在细胞的每次扩增之后进行测定。如果细胞被储存在细胞库中，可在其从储库释放后对其进行测定。如果细胞被冷冻，可在解冻后对其进行测定。如果对来自细胞库的细胞进行扩增，可在扩增后对其进行测定。优选地，可对最终的细胞产物的一部分(通过物理方法给予至器官)进行测定。
由于干细胞可通过分泌分子的方式提供本文所述的效果，本文所述的给予干细胞的多个实施方案可通过给予一种或多种(如可能在条件培养基中的)分泌分子完成。
本发明还涉及包含具有实现所需效果的所需效力的细胞群体的组合物。这样的群体可作为适于给予至器官的药物组合物而被发现和/或存在于其中细胞可被直接用于给药或细胞可在给药前扩增的细胞库中。在一个实施方案中，和以前的(亲本)细胞群体相比，所述细胞具有增强的(增加的)效力。亲本细胞如本文所定义。可通过天然表达子的选择或通过作用于细胞的外部因素来增强。
可通过本文所述的分离和培养条件制备所述细胞。在一个具体的实施方案中，通过本文所述的培养条件制备细胞，所述培养条件包括较低的氧浓度以及较高的血清，如用于制备名为
Figure GDA0002952359210000081
的细胞的那些培养条件。
附图说明
图1.研究设计的示意图。
图2.再灌注后肺2的右下叶(RLL)和左下叶(LLL)的代表性大体外观。MSC处理的LLL表现正常而赋形物处理的RLL表现为水肿和红肿。
图3.半定量计分证明在5个肺中的4个肺中以及在总计5个肺中，相比于赋形物处理的RLL，在MSC处理的LLL中总体炎症显著降低。描述了3位不知情的观察者的合并观察值的平均值±SD。
图4A-B.肺1的代表性显微照片证明相对于肺泡隔膜增厚、水肿、以及血管周围和支气管周围的炎性细胞浸润物，MSC处理的LLL中的最低至无显著炎症。Original Mag200X。
图5A-C.肺3-5中MSC处理的LLL中的总BAL液细胞计数降低(图5A)。没有评估肺1或2的总细胞计数。MSC灌输也导致所有5个肺中BAL液总的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的提高数目显著降低(图5B-C)。数据代表3位不知情的观察者的合并观察值的平均值±SD。
图6.肺4的代表性BAL液细胞因子分析证明MSC处理的LLL中IL-10显著增加但iNOS、STC-1或TSG-6没有显著变化。数据代表每个LLL或RLL样品的三次测定的平均值+标准偏差。
图7.肺组织的细胞因子分析。在t＝0、2和/或4小时时在收集自肺2-5的LLL和RLL的肺组织样品中进行qPCR分析。倍数表达代表相比于t＝0值的靶基因水平。将所有数据标准化至看家基因GAPDH。数据代表来自肺2-5的LLL或RLL样品的平均值+标准偏差。
具体实施方式
应理解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述具体的实施方案的目的，不意欲限制所公开的发明的范围，所述范围仅由权利要求书限定。
本文使用的部分标题仅出于组织的目的，不应被解释为以任何方式限制所述主题。
除非另有说明，本申请的方法和技术通常依据本领域熟知的常规方法和如本说明书全文中引用和讨论的多种一般性和更具体的参考文献所述进行。参见，例如，Sambrooket al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)和Ausubel et al.、CurrentProtocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992),以及Harlow and Lane、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。
定义
“一”或“一个”在本文意指一个或多于一个；至少一个。当本文使用复数形式时，其通常包括单数形式。
“细胞库”是被培养和储存以用于将来使用的细胞的工业命名。可以各等份储存细胞。可直接从储库中使用细胞或可在储存后扩增细胞。这很方便以至有可用的“现成”细胞用于给药。所述细胞可以是已储存在可药用的赋形剂中，因此可直接给药，或在所述细胞从储库中释放时可与合适的赋形剂混合。细胞可以是冷冻的或以保持生存力的形式储存。在本发明的一个实施方案中，创建细胞库，其中已经针对增强的实现本申请所述的效果的效力而对细胞进行了选择。从储库释放后，在给药之前，可优选再次测定细胞的效力。这可使用本申请所述的或本领域已知的任何直接的或间接的测定来完成。然后，可随后给予具有所需效力的细胞。可使用自体细胞(来自器官供体或受体)来建库。或者，库可包含用于同种异体用途的细胞。
“共给予”意指彼此结合、一起、配合地给予，包括同时或依次给予两种以上的试剂。
“包含”意指，在没有其他限制的情况下，必须包括所述指示物，而对其他可包含的指示物没有任何限制或排除。例如，“包含x和y的组合物”涵盖含有x和y的任何组合物，而不管所述组合物中可存在何种其他组分。同样地，“包含步骤x的方法”涵盖在其中进行x(不管x是所述方法中的唯一步骤或仅是步骤之一)的任何方法，不管可能存在多少其他步骤，也不管x与它们相比多么简单或复杂。“包括(comprised of)以及使用词根“含(comprise)”的类似短语”在本文用作“包含(comprising)”的同义词，并具有相同的含义。
“包括”是“包含”的同义词(参见上文)。
当用于干细胞和待移植的器官时，术语“接触”可意指在暴露于器官时，所述干细胞物理上接触所述器官。在这种情况下，干细胞与器官直接接触。在其他情况下，干细胞可间接接触器官，其中一种或多种结构(例如，另一种细胞)和/或流体(例如，血液)物理上插入干细胞和器官之间。
“EC细胞”发现于对称为畸胎瘤的癌症类型的分析。1964年，研究者注意到畸胎瘤中的单个细胞可被分离并在培养中保持不分化。这种类型的干细胞被称为胚胎癌细胞(EC细胞)。
“有效量”通常意指提供所需的局部或全身效果(包括实现本申请所述的具体的所需效果)的量，例如有效改善炎症的不良作用的量。例如，有效量是足以实现有益的或需要的临床结果的量。所述有效量可在单次给药中一次全部提供，或以在若干次给药中提供所述有效量的分份量形式提供。对何种用量会被认为是有效量的精确确定可基于各器官的个体因素，包括器官的类型、要治疗的疾病或损伤、已经处理器官的方式、收集后的时间长度等。本领域技术人员基于本领域中常规的这些考虑将能够确定给定器官的有效量。本文使用的“有效剂量”与“有效量”的含义相同。
“有效途径”通常意指提供用于将试剂递送至所需区室、全身或局部的途径。例如，有效途径是试剂通过其可被给予以在所需的作用位点提供足够实现有益的或所需的临床结果(在本文情况下，为有效的移植)的试剂的量的途径。
当与干细胞相关使用时，术语“外源”通常是指在器官之外并已经通过有效途径暴露于(例如，接触)旨在用于移植的器官的干细胞。外源干细胞可来自相同受试者或不同受试者。在一个实施方案中，外源干细胞可包括已经从受试者中摘取、分离、离体扩增，然后通过有效途径暴露于旨在用于移植的器官的干细胞。
术语“暴露”可包括将一种或多种干细胞给予至旨在用于移植的器官的行为。给予至器官可离体或在体内完成(例如通过灌注至受试者)。
术语“包括”的使用不意欲为限制性的。
“增加”意指完全地诱导生物事件或增加事件的程度。
“诱导的多能干细胞(IPSC或IPS细胞)”是已经被再编程的体细胞，例如通过引入赋予所述体细胞低分化的表型的外源基因进行再编程的体细胞。然后，这些细胞可被诱导分化为低分化的子代。使用最初于2006年发现的方法的改进方法衍生的IPS细胞(Yamanaka,S.et al.,Cell Stem Cell,1:39-49(2007))。例如，在一个实例中，为创建IPS细胞，科学家从皮肤细胞开始，然后通过使用逆转录病毒将基因插入到细胞DNA中的标准实验技术对所述皮肤细胞进行了改良。在一个实例中，所插入的基因是Oct4、Sox2、Lif4和c-myc，这些基因已知作为天然调节因子一起作用以使细胞保持在类似胚胎干细胞的状态。文献中已对这些细胞进行了描述。参见，例如，Wernig et al.,PNAS,105:5856-5861(2008)；Jaenisch et al.,Cell,132:567-582(2008)；Hanna et al.,Cell,133:250-264(2008)；和Brambrink et al.,Cell Stem Cell,2:151-159(2008)。这些参考文献以引用的方式纳入用于教导IPSC和产生它们的方法。也可通过特定的培养条件(暴露于特定试剂)创建这样的细胞。
术语“局部缺血性再灌注损伤”是工业中所理解的，并被记载于例如http://emedicine.medscape.com/article/431140-overview#aw2aab6b3(关于器官保存)以及Groot,H.et al.,Transplant Proc.39(2):481-4(Mar.2007)——它们以引用的方式纳入本文用于教导局部缺血性再灌注损伤和其机理的详细内容。
“局部缺血”分两个阶段发生。第一阶段被称为暖局部缺血阶段并包括从供体取出器官且循环中断的时间至将器官与低温保存液一起给予的时间。当在移植和受体内正常再循环之前将器官以低温状态保存时发生冷局部缺血阶段。
术语“分离的”是指与一种或多种细胞不相关的细胞，或与一种或多种在体内与所述细胞相关的一种或多种细胞组分不相关的细胞。“富集的群体”意指需要的细胞相对于体内或原代培养物中一种或多种其他细胞类型的数量上的相对增加。
然而，本文使用的术语“分离的”不表示仅本发明的细胞的存在情况。更确切地说，术语“分离的”表示将本发明的细胞从其天然组织环境中取出并以相对正常组织环境更高的浓度存在。因此，“分离的”细胞群体可进一步包括除本发明细胞外的细胞类型并可包括额外的组织组分。例如，这也可以细胞倍增来表示。细胞可在体内或离体经历10、20、30、40次或更多次的倍增，以使其相对其在体内或其原始组织环境(例如骨髓、外周血、胎盘、脐带、脐带血、脂肪组织等)中的原始数量被富集。
“MAPC”是“多能成体祖细胞”的首字母缩略词。它是指非胚胎干细胞或非生殖细胞、但具有这两种细胞的某些特征的细胞。MAPC可以许多替代的描述来表征，每一个描述在被发现时均赋予所述细胞以新性质。因此，它们可以用这些描述中的一个或多个来表征。第一，它们在培养中具有长期复制能力而不被转化(致瘤的)并具有正常的核型。第二，它们在分化时可以生成超过一种的胚层(如两种或所有三种胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)的细胞子代。第三，尽管它们不是胚胎干细胞或生殖细胞，但它们可表达这些原始细胞类型的标记物以使MAPC可表达Oct 3/4(即Oct 3A)、rex-1和rox-1中的一种或多种。它们还可表达sox-2和SSEA-4中的一种或多种。第四，像干细胞一样，它们可自我更新，即具有长期复制能力而不被转化。这意指这些细胞表达端粒酶(即具有端粒酶活性)。因此，名为“MAPC”的细胞类型可由通过其某些新性质描述该细胞的替代的基本特征来表征。
MAPC中的术语“成体”是非限制性的。它是指非胚胎体细胞。MAPC核型正常并在体内不形成畸胎瘤。美国专利No.7,015,037中第一次使用该首字母缩略词来描述从骨髓中分离的多能细胞。但是，随后发现了具有多能性标记物和/或分化潜能的细胞，出于本发明的目的，这些细胞可以等价于那些首次被命名为“MAPC”的那些细胞。上文发明内容中提供了细胞的MAPC类型的基本描述。
MAPC代表比MSC更原始的祖细胞群体(Verfaillie,C.M.,Trends Cell Biol 12:502-8(2002)；Jahagirdar,B.N.,et al.,Exp Hematol,29:543-56(2001)；Reyes,M.andC.M.Verfaillie,Ann N Y Acad Sci,938:231-233(2001)；Jiang,Y.et al.,Exp Hematol,30896-904(2002)；和Jiang,Y.et al.,Nature,418:41-9.(2002))。
术语
Figure GDA0002952359210000131
是基于美国专利No.7,015,037的MAPC的细胞制品的商业名称，即上文所述的非胚胎干细胞、非生殖细胞。根据该专利申请公开的细胞培养方法(特别是较低的氧气和较高的血清)制备
Figure GDA0002952359210000132
Figure GDA0002952359210000133
是高度可扩增的、核型正常的并在体内不形成畸胎瘤。它可分化为多于一种胚层的细胞谱系并可表达端粒酶、oct3/4、rex-1、rox-1、sox-2和SSEA4中的一种或多种。
可根据其在工业上的常规和所理解的含义将术语“器官”用作整个完整的器官，所述器官已从供体取出用于移植或意欲从供体取出用于移植到受体。尽管本申请强调术语“器官”，所述方法适用于可不组成整个器官的组织。即，适用于器官的部分，例如本申请别处公开的那些。因此，在适当情况下，术语“组织”可适当地代替术语“器官”。
“可药用的载体”是用于本发明中使用的细胞的任何可药用的基质。这样的基质可保持等渗性、细胞代谢、pH等。其适合给予至器官，因此可被用于细胞递送和治疗。
术语“效力”是指细胞实现本申请所述效果的能力。因此，效力是指各种水平的效果，其包括但不限于提高成功移植的可能性、减缓移植前器官的退化、降低器官中的炎症活性、提供对器官的免疫耐受、增加器官中抗炎细胞因子的产生、增加器官中神经保护性T-细胞的存在、降低器官中反应性T-细胞的存在、降低器官中促炎细胞因子的水平、降低器官中的低氧效应、逆转器官中水肿的水平、以及降低器官中的低温作用。在恢复、保存和移植过程中持续的损伤主要是由局部缺血和体温过低造成的。它们可以各种方式影响器官。这些被记载于上文引用的Medscape参考文献并且本申请给出了链接。根据该参考文献，组织损伤的机制包括细胞结构的完整性的丧失、细胞离子组成的破坏、ATP产生的破坏，并且，由于再灌注，损伤可在再灌注过程中通过有毒的氧自由基的累积而发生。
对于细胞结构的完整性，完整性可通过细胞膜中结构完整性的丧失而破坏。维持细胞膜的完整性取决于对温度、pH、渗透压(osmolarity)的控制。器官局部缺血和保存破坏所有这些参数。
“原生胚胎生殖细胞”(PG或EG细胞)可被培养或刺激以产生许多低分化的细胞类型。
“祖细胞”是干细胞分化过程中产生的细胞，其具有它们的终末分化的子代的一些特征而非全部特征。明确的祖细胞，例如“心脏祖细胞”，形成谱系，而非具体的或终末分化的细胞类型。首字母缩略词“MAPC”中使用的术语“祖”并不将这些细胞限制于具体的谱系。祖细胞可形成比所述祖细胞分化程度更高的子代细胞。
本文使用的术语“降低”意指防止和降低。在器官处理的上下文中，“降低”是防止或改善器官排斥。这包括器官排斥的起因和症状。例如，这适用于潜在的排斥的生物学原因，例如改善炎症的有害作用。
“选择”具有所需效力水平的细胞可意指鉴定(如通过测定)、分离和扩增细胞。这可创建比从其中分离细胞的亲本细胞群体具有更高效力的群体。“亲本”细胞群体是指从其中分出所选细胞的亲本细胞。“亲本”是指实际的P1→F1关系(即，子代细胞)。所以，如果细胞X分离自细胞X和Y的混合群体，在所述混合群体中X是表达子而Y不是，人们不会将仅X的分离物分类为具有增强的表达。但是，如果X的子代细胞是更强的表达子，人们会将所述子代细胞分类为具有增强的表达。
选择实现所需效果的细胞将包括确定细胞能否实现所需效果的测定，并且还包括获得那些细胞。细胞可天然地实现所需效果，因为所述效果不是通过外源转基因/DNA实现。但是，可通过将其与增强效果的试剂孵育或暴露于所述试剂来改善有效的细胞。在进行测定之前，可能并不知道从其中选择所述有效细胞的细胞群体具有效力。在进行测定之前，可能并不知道所述细胞能实现所需效果。由于效果可取决于基因表达和/或分泌，人们也可基于产生效果的基因中的一种或多种来选择。
可从组织中的细胞进行选择。例如，在这种情况下，将细胞从所需的组织中分离、在培养中扩增、针对实现所需效果而对其进行选择，并将所选细胞进一步扩增。
选择也可来自离体细胞，例如培养中的细胞。在这种情况下，会测定培养中的一种或多种细胞以实现所需效果，并可将所获得的实现所需效果的细胞进一步扩增。
可也选择实现所需效果的能力增强的细胞。在这种情况下，从其中获得所述增强的细胞的细胞群体已经具有所需效果。增强的效果意指每个细胞的平均量比亲本群体中的更高。
从其中选择所述增强的细胞的亲本群体可以是基本同质的(相同的细胞类型)。从该群体获得这种增强的细胞的一种方式是创建单细胞或细胞库并测定那些细胞或细胞库以获得天然具有增强的(更大的)效果的克隆(相对于用诱导或增强效果的调节器处理所述细胞)，然后扩增那些天然增强的细胞。
然而，可将细胞用诱导或增强所述效果的一种或多种试剂处理。因此，可处理基本上同质的群体以增强效果。
如果所述群体不是基本上同质的，则优选待处理的亲本细胞群体包含至少100种效果增强的所需细胞类型，更优选至少1,000种细胞，仍更优选至少10,000种细胞。处理后，可通过已知的细胞选择技术从所述异源群体中回收这种亚群体，并且如果需要可进一步扩增。
因此，需要的效果水平可以是高于给定的在前群体中的水平的那些。例如，通过培养条件将其从组织中进行初代培养并扩增和分离的细胞可提供亲本群体，所述培养条件没有被特别设计以产生所述效果。可对这样的亲本群体进行处理以增强每个细胞的平均效果或筛选所述群体中表达更大程度效果而无需专门处理的细胞。然后可对这样的细胞进行扩增以提供具有更高的(所需的)表达的群体。
干细胞的“自我更新”是指产生复制子代干细胞的能力，所述子代干细胞具有与产生其的那些细胞相同的分化潜能。本文使用的类似术语是“增殖”。
“干细胞”是指可进行自我更新(即，具有相同分化潜能的子代)并还可产生在分化潜能上更受限制的子代细胞的细胞。在本发明的上下文中，干细胞还将涵盖更高度分化的细胞——其已通过例如如下方式去分化：细胞核移植，与更原始的干细胞融合、引入特定的转录因子、或在特定条件下培养。参见，例如，Wilmut et al.,Nature,385:810-813(1997)；Ying et al.,Nature,416:545-548(2002)；Guan et al.,Nature,440:1199-1203(2006)；Takahashi et al.,Cell,126:663-676(2006)；Okita et al.,Nature,448:313-317(2007)；和Takahashi et al.,Cell,131:861-872(2007)。
也可通过给予某些化合物或在体外或体内暴露于会引起去分化的物理环境而引起去分化。干细胞也可来自异常组织，例如畸胎瘤。也可通过将与干细胞功能相关的基因引入非干细胞例如诱导的多能干细胞来产生干细胞。
“受试者”是指脊椎动物，例如哺乳动物，例如人类。哺乳动物包括但不限于人类、狗、猫、马、牛和猪。
术语“治疗有效量”是指在哺乳动物中产生任何治疗反应的确定的试剂的量。例如，有效的抗炎治疗剂可延长患者的生存能力、和/或抑制明显的临床症状。在本文使用的术语的含义内为治疗有效的治疗，包括改善受试者生活质量的治疗，即使其本身未改善疾病结果。本领域的技术人员可容易地确定这样的治疗有效量。因此，“治疗”意指递送这样的量。因此，治疗可防止或改善任何病理学症状。
术语“耐受(tolerization)”或“耐受(tolerize)”是指使用干细胞对移植前器官(移植物)进行处理以降低移植物的免疫原性以使得或促进受体对器官耐受的发生。该术语泛指降低移植器官的免疫原性——其使得或促进受体的耐受发生——的概念。因此，耐受器官使得器官被受体耐受。换言之，该术语可指使正常引起免疫反应的免疫系统不能引起对细胞或组织的免疫反应。这样的一个实例是T-调节细胞分泌抑制激活的T-细胞的因子以使其不再能分泌促炎细胞因子。
这可通过移植前离体治疗或甚至摘取前局部给药来完成。
本发明广泛使用“治疗”，其中每个这样的术语涵盖了防止、改善、抑制或治愈缺陷、功能紊乱、疾病或其他有害过程，包括干扰治疗和/或由治疗导致的那些。
“验证”意指确认。在本发明的上下文中，人们确认细胞是具有所需效力的表达子。这样使人们可随后(在治疗、建库、药物筛选中等)使用具有合理预期功效的细胞。因此，验证意指确认最初已被发现具有/已被建立为具有所需活性的细胞实际上保持了这一活性。因此，验证是在双事件过程中的验证事件，所述双事件过程包括最初的测定和随后的测定。第二事件在本文被称为“验证”。
干细胞
本发明可优选地使用脊椎动物物种(例如人类、非人灵长类动物、家养动物、家畜、和其他非人类哺乳动物)的干细胞实施。这些包括但不限于下文所述的那些细胞。
非胚胎干细胞
已在大部分组织中鉴定干细胞。可能最清楚表征的是造血干细胞(HSC)。HSC是中胚层衍生的细胞，其可使用细胞表面标记物和功能特性来纯化。它们已经从骨髓、外周血、脐带血、胎肝和卵黄囊中分离出。它们启动造血作用并产生许多造血谱系。当被移植到被致死性照射的动物中时，它们可再造红系嗜中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞库。它们也可被诱导进行一些自我更新的细胞分裂。参见，例如，美国专利No.5,635,387、5,460,964、5,677,136、5,750,397、5,681,599、和5,716,827。美国专利No.5,192,553报道了用于分离人类新生儿或胎儿造血干细胞或祖细胞的方法。美国专利No.5,716,827报道了作为Thy-1+祖细胞的人类造血细胞，以及在体外再生它们的合适生长培养基。美国专利No.5,635,387报道了一种用于培养人类造血细胞和其前体的方法和装置。美国专利No.6,015,554描述了一种重建人类淋巴和树突细胞的方法。因此，HSC以及分离和扩增它们的方法是本领域熟知的。
本领域熟知的另一种干细胞是神经干细胞(NSC)。这些细胞可在体内增殖并且连续地再生至少一些神经元细胞。当离体培养时，神经干细胞可被诱导增殖以及分化为不同类型的神经元和神经胶质细胞。当被移植至脑时，神经干细胞可植入并产生神经细胞和神经胶质细胞。参见，例如，Gage F.H.,Science,287:1433-1438(2000)、Svendsen S.N.etal.,Brain Pathology,9:499-513(1999)、和Okabe S.et al.,Mech Development,59:89-102(1996)。美国专利No.5,851,832报道了获自脑组织的多能神经干细胞。美国专利No.5,766,948报道了由新生儿大脑半球产生神经母细胞。美国专利No.5,564,183和5,849,553报道了哺乳动物神经嵴干细胞的用途。美国专利No.6,040,180报道了在体外由哺乳动物多能CNS干细胞的培养物产生分化的神经元。WO 98/50526和WO 99/01159报道了神经上皮干细胞、少突细胞-星形胶质细胞前体和谱系-受限的神经元前体的产生和分离。美国专利No.5,968,829报道了获自胚胎前脑的神经干细胞。因此，神经干细胞以及制备和扩增它们的方法是本领域熟知的。
在本领域中已被大量研究的另一种干细胞是间充质干细胞(MSC)。MSC衍生自胚胎中胚层，并可从许多来源分离，包括成体骨髓、外周血、脂肪、胎盘、和脐带血等。MSC可分化为许多中胚层组织，包括肌肉、骨骼、软骨、脂肪和腱。有关于这些细胞的大量文献。参见，例如，美国专利No.5,486,389；5,827,735；5,811,094；5,736,396；5,837,539；5,837,670；和5,827,740。还参见Pittenger,M.et al.,Science,284:143-147(1999)。
成体干细胞的另一个实例是脂肪衍生的成体干细胞(ADSC)，其通常已被通过以下方式从脂肪分离：脂肪术，之后使用胶原酶释放ADSC。ADSC在很多方面类似于衍生自骨髓的MSC，除了可从脂肪中分离更多细胞。已经报道这些细胞分化为骨骼、脂肪、肌肉、软骨和神经元。分离方法已经记载于美国专利公开文本No.2005/0153442A1中。
本领域已知的其他干细胞包括胃肠干细胞、表皮干细胞和肝干细胞，其也被称为“卵形细胞”(Potten,C.,et al.,Trans R Soc Lond B Biol Sci,353:821-830(1998)；Watt,F.,Trans R Soc Lond B Biol Sci,353:831(1997)；Alison et al.,Hepatology,29:678-683(1998))。
据报道能够分化为多于一种的胚胎胚层的细胞类型的其他非胚胎细胞包括但不限于来自脐带血的细胞(参见美国公开文本No.2002/0164794)、来自胎盘的细胞(参见美国公开文本No.2003/0181269)、来自脐带基质的细胞(Mitchell,K.E.et al.,Stem Cells,21:50-60(2003))、来自小胚胎样干细胞的细胞(Kucia,M.et al.,J Physiol Pharmacol,57Suppl 5:5-18(2006))、来自羊水干细胞的细胞(Atala,A.,J Tissue Regen Med,1:83-96(2007))、来自皮肤衍生的前体的细胞(Toma et al.,Nat Cell Biol,3:778-784(2001))、来自骨髓的细胞(参见美国专利公开文本No.2003/0059414和2006/0147246)、来自骨髓分离的成体多谱系可诱导(MIAMI)细胞的细胞(参见PCT/US2004/002580)和来自子宫内膜细胞的细胞(参见美国公开文本No.2013/0156726)，其各自以引用的方式纳入用于教导这些细胞。
重编程体细胞的策略
已经采用了若干不同策略，例如核移植、细胞融合和培养诱导的重编程，来诱导分化的细胞转化为胚胎状态。核移植包括将体细胞核注射入去核卵母细胞，其当被移植入代孕母亲时，可形成克隆(“生殖性克隆”)，或当在培养中移出时，可形成遗传匹配的胚胎干(ES)细胞(“体细胞核移植”，SCNT)。体细胞与ES细胞的细胞融合导致产生显示多能ES细胞的所有特征的杂合体。培养中的体细胞的移出选择出可能是多能的永生细胞系。目前，精原干细胞是可衍生自出生后动物的多能细胞的唯一来源。用限定的因子转导体细胞可启动重编程至多能状态。这些实验方法已被大量评论(Hochedlinger and Jaenisch,Nature,441:1061-1067(2006)和Yamanaka,S.,Cell Stem Cell,1:39-49(2007))。
核移植
核移植(NT)，也称为体细胞核移植(SCNT)，表示将来自供体体细胞的核引入去核卵母细胞以产生克隆动物，例如多莉羊(Wilmut et al.,Nature,385:810-813(1997))。通过NT产生活的动物证明了体细胞的表观遗传状态，包括终末分化的细胞的表观遗传状态，尽管稳定，未被不可逆地固定，但可重编程为能够指导新有机体发育的胚胎状态。除了提供用于阐明参与胚胎发育和疾病的基本表观遗传机制的令人兴奋的实验方法外，核克隆技术对于患者特异性的移植医学具有潜在的价值。
体细胞和胚胎干细胞的融合
将体细胞核表观遗传重编程为未分化的状态已经在通过胚胎细胞和体细胞的融合产生的小鼠杂合体中被证明。多种体细胞和胚胎癌细胞(Solter,D.,Nat Rev Genet,7:319-327(2006))、胚胎生殖细胞(EG)、或ES细胞(Zwaka and Thomson,Development,132:227-233(2005))之间的杂合体与亲本胚胎细胞共有很多特征，表明多能表型在这样的融合产物中是主要的。和小鼠一样(Tada et al.,Curr Biol,11:1553-1558(2001))，人类ES细胞具有在融合后重编程体细胞核的潜能(Cowan et al.,Science,309:1369-1373(2005))；Yu et al.,Science,318:1917-1920(2006))。沉默多能性标记物例如Oct4的活化或失活的体细胞X染色体的再活化为体细胞基因组在杂合细胞中的重编程提供了分子证据。已经提出DNA复制对于在融合后2天首次观察到的多能性标记物的活化是必要的(Do andScholer,Stem Cells,22:941-949(2004))，并且当与神经干细胞融合时，Nanog在ES细胞中的强制过表达促进多能性(Silva et al.,Nature,441:997-1001(2006))。
培养诱导的重编程
以下多能细胞，与它们的供体细胞/组织一起，描述如下：单性生殖ES细胞(parthogenetic ES cell)来自小鼠卵母细胞(Narasimha et al.,Curr Biol,7:881-884(1997))；胚胎生殖细胞和胚胎癌细胞来自原始生殖细胞(Matsui et al.,Cell,70:841-847(1992))；GMCS、maSSC和MASC来自精原干细胞(Guan et al.,Nature,440:1199-1203(2006)；Kanatsu-Shinohara et al.,Cell,119:1001-1012(2004)；和Seandel et al.,Nature,449:346-350(2007))；EpiSC细胞来自外胚层(Brons et al.,Nature,448:191-195(2007)；Tesar et al.,Nature,448:196-199(2007))；单性生殖ES细胞来自人卵母细胞(Cibelli et al.,Science,295L819(2002)；Revazova et al.,Cloning Stem Cells,9:432-449(2007))；MAPC来自骨髓(Jiang et al.,Nature,418:41-49(2002)；Phinney andProckop,Stem Cells,25:2896-2902(2007))；脐带血细胞(来自脐带血)(van de Ven etal.,Exp Hematol,35:1753-1765(2007))；神经球衍生的细胞来自神经细胞(Clarke etal.,Science,288:1660-1663(2000))。已知来自生殖细胞系的供体细胞例如PGC或精原干细胞在体内是单能性的，但是已证明多能ES-样细胞(Kanatsu-Shinohara et al.,Cell,119:1001-1012(2004))或maGSC(Guan et al.,Nature,440:1199-1203(2006))在体外长期培养后可被分离。尽管这些多能细胞类型的大部分能够在体外分化并形成畸胎瘤，但依据更严格的标准，只有ES、EG、EC和精原干细胞衍生的maGCS或ES-样细胞是多能的，因为它们能形成出生后嵌合体并促成生殖细胞系。最近，多能成体精原干细胞(MASC)从成体小鼠的睾丸精原干细胞中得到，并且这些细胞具有与ES细胞不同(Seandel et al.,Nature,449:346-350(2007))、但与EpiSC细胞相似的表达谱，所述EpiSC细胞来自小鼠胚胎移植后的外胚层(Brons et al.,Nature,448:191-195(2007)；Tesar et al.,Nature,448:196-199(2007))。
通过限定的转录因子进行重编程
Takahashi和Yamanaka已经报道了将体细胞重编程回ES-样状态(Takahashi andYamanaka,Cell,126:663-676(2006))。在将四种转录因子Oct4、Sox2、c-myc、和Klf4进行病毒介导的转导，然后针对Oct4靶基因Fbx15的活化进行选择之后，他们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和成体纤维母细胞重编程为多能ES-样细胞。将具有活化的Fbx15的细胞构建为iPS(诱导性多能干)细胞并通过它们形成畸胎瘤的能力而显示为多能的，尽管它们不能产生活的嵌合体。这种多能状态取决于转导的Oct4和Sox2基因的连续病毒表达，而内源性Oct4和Nanog基因或者不表达，或者以比ES细胞中更低的水平表达，并且发现它们各自的启动子被大量甲基化。这与如下结论一致：Fbx15-iPS细胞与ES细胞不一致但可代表重编程的不完全状态。尽管遗传实验已经确定了Oct4和Sox2对多能性是必要的(Chambers andSmith,Oncogene,23:7150-7160(2004)；Ivanona et al.,Nature,442:5330538(2006)；Masui et al.,Nat Cell Biol,9:625-635(2007))，但是两种致癌基因c-myc和Klf4在重编程中的作用仍不太清楚。一些致癌基因实际上对于重编程可能是可省去的，因为在缺乏c-myc转导的情况下已经得到了小鼠和人类iPS细胞，尽管功效较低(Nakagawa et al.,NatBiotechnol,26:191-106(2008)；Werning et al.,Nature,448:318-324(2008)；Yu etal.,Science,318:1917-1920(2007))。
MAPC
人MAPC描述于美国专利7,015,037中。已经在其他哺乳动物中鉴定了MAPC。例如，鼠科动物MAPC也描述于美国专利7,015,037中。大鼠MAPC也描述于美国专利No.7,838,289中。
这些参考文献以引用的方式纳入用于描述通过Catherine Verfaillie首次分离的MAPC。
MAPC的分离和培养
MAPC分离方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利7,015,037，并且这些方法，与MAPC的表征(表型)一起，以引用的方式纳入本文。MAPC可从多种来源中分离，所述来源包括但不限于骨髓、胎盘、脐带和脐带血、肌肉、脑、肝脏、脊髓、血液或皮肤。因此，可获得骨髓抽吸物、脑或肝脏活检组织和其他器官，并使用本领域技术人员可获得的阳性或阴性选择技术，依赖这些细胞中表达(或不表达)的基因(例如，通过功能性或形态学测定，例如上述引用的申请中公开的那些，所述申请已以引用的方式纳入本文)分离所述细胞。
MAPC也通过在Breyer et al.,Experimental Hematology,34:1596-1601(2006)和Subramanian et al.,Cellular Programming and Reprogramming:Methods andProtocols；S.Ding(ed.),Methods in Molecular Biology,636:55-78(2010)中描述的改进方法获得，所述文献因为这些方法而以引用的方式纳入。
美国专利7,015,037中描述的来自人骨髓的MAPC
MAPC不表达共有的白细胞抗原CD45或有核红血球特异性血型糖蛋白-A(Gly-A)。将细胞的混合群体进行Ficoll Hypaque分离。然后使用抗-CD45和抗-Gly-A的抗体对细胞进行阴性选择，耗尽CD45+和Gly-A+细胞的群体，然后回收剩余的约0.1％的骨髓单核细胞。也可将细胞置于纤连蛋白包被的孔中并如下所述培养2-4周以耗尽CD45+和Gly-A+细胞。在附着的骨髓细胞的培养中，许多附着基质细胞在细胞倍增约30次时经历复制性衰老，并且更同质的细胞群体连续扩增并维持长的端粒。
或者，可通过细胞特异性标记物的组合使用阳性选择来分离细胞。阳性和阴性选择技术都是本领域技术人员可获得的，许多适于阴性选择目的的单克隆抗体和多克隆抗体也是本领域可获得的(参见，例如，Leukocyte Typing V,Schlossman,et al.,Eds.(1995)Oxford University Press)并且可从很多来源商购。
从细胞群体的混合物中分离哺乳动物细胞的技术也已经由Schwartz,et al.,在美国专利No.5,759,793(磁力分离)、Basch et al.,1983(免疫亲和层析)、和Wysocki andSato,1978(荧光激活的细胞分选)中记载。
可以在低血清或无血清的培养基中培养细胞。美国专利7,015,037描述了用于培养MAPC的无血清培养基。通常使用的生长因子包括但不限于血小板衍生的生长因子和表皮生长因子。参见，例如，美国专利No.7,169,610；7,109,032；7,037,721；6,617,161；6,617,159；6,372,210；6,224,860；6,037,174；5,908,782；5,766,951；5,397,706；和4,657,866；全部以引用的方式纳入用于教导在无血清培养基中培养细胞。
额外的培养方法
在额外的实验中，培养MAPC的密度可从约100个细胞/cm2或约150个细胞/cm2至约10,000个细胞/cm2变化，包括约200个细胞/cm2至约1500细胞/cm2至约2000细胞/cm2。所述密度可随物种的不同而变化。另外，最佳密度可根据培养条件和细胞来源而变化。普通技术人员能够确定给定的培养条件和细胞的组合的最佳密度。
同样，少于约10％，包括约1-5％，特别是3-5％的有效大气氧浓度可在培养中MAPC的分离、生长和分化过程中的任意时间使用。
可在各种血清浓度下(例如约2-20％)培养细胞。可使用胎牛血清。更高的血清可与更低的氧气张力结合使用，例如约15-20％。在附着至培养皿之前不需要对细胞进行选择。例如，在Ficoll梯度后，可将细胞以例如250,000-500,000/cm2直接铺板。可挑取附着克隆，可将其合并扩增。
在一个实施方案中，在实施例的实验过程中使用的高血清(约15-20％)和低氧气(约3-5％)条件被用于细胞培养。特别地，将来自克隆的附着细胞以约1700-2300个细胞/cm2的密度在18％血清和3％氧气(含PDGF和EGF)中进行铺板和传代。
在特异性针对MAPC的实施方案中，补充物是允许MAPC保持分化为多于一种的胚胎细胞谱系——例如所有三种谱系——的细胞类型的能力的细胞因子或组分。这可通过未分化状态的特定标记物(例如Oct 3/4(Oct 3A))的表达和/或具有高扩增能力的标记物(例如端粒酶)来指示。
细胞培养
对于下文所列的所有组分，参见美国7,015,037，其以引用的方式纳入用于教导这些组分。
通常，可在本领域可获得并熟知的培养基中维持并扩增用于本发明的细胞。还考虑含哺乳动物血清的细胞培养基的补充物。还可有利地使用额外的补充物来为细胞提供必需微量元素用于最佳生长和扩增。激素也可有利地用于细胞培养。脂质和脂质载体也可用于补充细胞培养基，这取决于细胞类型和分化细胞的命运。还考虑使用饲养细胞层。
可将培养中的细胞维持在悬浮液中或连接到固体支持物(例如细胞外基质组分)上。干细胞经常需要促进它们连接到固体支持物上的额外因子，例如I型和II型胶原、硫酸软骨素、纤连蛋白、“超纤连蛋白”和纤连蛋白-样聚合物、明胶、聚-D和聚-L-赖氨酸、血小板反应蛋白和玻连蛋白。本发明的一个实施方案使用纤连蛋白。参见，例如，Ohashi et al.,Nature Medicine,13:880-885(2007)；Matsumoto et al.,J Bioscience andBioengineering,105:350-354(2008)；Kirouac et al.,Cell Stem Cell,3:369-381(2008)；Chua et al.,Biomaterials,26:2537-2547(2005)；Drobinskaya et al.,StemCells,26:2245-2256(2008)；Dvir-Ginzberg et al.,FASEB J,22:1440-1449(2008)；Turner et al.,J Biomed Mater Res Part B:Appl Biomater,82B:156-168(2007)；和Miyazawa et al.,Journal of Gastroenterology and Hepatology,22:1959-1964(2007)。
细胞也可在“3D”(聚合的)培养物中生长。一个实例是于2009年1月21日提交的PCT/US2009/31528。
一旦在培养中建立，细胞可被新鲜使用或使用例如含40％FCS和10％DMSO的DMEM冷冻并储存为冷冻储液。其他制备用于培养的细胞的冷冻储液的方法也是本领域技术人员可获得的。
药物制剂
美国7,015,037以引用的方式纳入用于教导药物制剂。在某些实施方案中，细胞群体存在于组合物中，所述组合物被改造为适合并且适于递送，即是生理学上相容的。
制剂将针对所需效果的程度，例如降低炎症，降低细胞凋亡、水肿等，上调某些因子等。
在一些实施方案中，用于给予至器官的细胞的纯度为约100％(基本上同质)。在其他实施方案中，纯度是95％至100％。在一些实施方案中，纯度为85％至95％。特别地，在与其他细胞的混合物的情况下，所述百分比可以为约10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、或90％-95％。或者分离/纯度可以细胞倍增的方式表示，其中所述细胞已经经历了例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多次的细胞倍增。
用于给予所述细胞的制剂的选择将取决于多种因素。其中主要的因素将是供体/受体的物种、被处理的器官的性质、被给予的其他疗法和试剂的性质、给予的最佳路径、经有效路径的存活力、剂量方案、以及对本领域技术人员来说显而易见的其他因素。例如，合适载体和其他添加剂的选择将取决于确切的给予路径和具体剂型的性质。
细胞/基质的水性悬浮液的最终制剂通常将包括将悬浮液的离子强度调节至等渗(即约0.1至0.2)并且至生理pH(即约pH 6.8至7.5)。最终制剂通常还将包括液体润滑剂。
技术人员可容易地确定本发明方法中待给予的组合物中细胞、任选的添加剂、赋形物和/或载体的量。通常，任何添加剂(除所述细胞外)在溶液中(例如在磷酸盐缓冲盐水中)以0.001至50重量％的量存在。活性成分以微克至毫克的量级存在，例如约0.0001至约5重量％，优选约0.0001至约1重量％，最优选约0.0001至约0.05重量％或约0.001至约20重量％，优选约0.01至约10重量％，最优选约0.05至约5重量％。
在某些实施方案中，将细胞包封用于给药，特别地，所述包封增强了效力或提供了操作和/或保质期方面的优势。可通过膜和胶囊将细胞包封。考虑可采用可获得的细胞包封的许多方法中的任一种。
在多个实施方案中可使用多种多样的材料用于细胞的微胶囊化。这样的材料包括，例如，聚合物胶囊、藻酸盐-聚-L-赖氨酸-藻酸盐微胶囊、聚-L-赖氨酸藻酸钡胶囊、藻酸钡胶囊、聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC)中空纤维、和聚醚砜(PES)中空纤维。
可用于给予细胞的细胞微胶囊化的技术是本领域技术人员已知的并且记载于，例如，Chang,P.,et al.,1999；Matthew,H.W.,et al.,1991；Yanagi,K.,et al.,1989；CaiZ.H.,et al.,1988；Chang,T.M.,1992和美国专利No.5,639,275(其，例如，描述了一种用于长期保存稳定表达生物活性分子的细胞的生物可相容的胶囊)中。其他的胶囊化方法在欧洲专利公开文本No.301,777和美国专利No.4,353,888；4,744,933；4,749,620；4,814,274；5,084,350；5,089,272；5,578,442；5,639,275；和5,676,943中。上述所有的与细胞胶囊化有关的部分都以引用的方式纳入本文。
某些实施方案将细胞纳入聚合物——例如生物聚合物或合成聚合物——中。生物聚合物的实例包括但不限于纤连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原、和蛋白聚糖。也可将其他因子(例如上文讨论的细胞因子)纳入聚合物中。在本发明的其他实施方案中，可将细胞纳入三维凝胶的间隙中。通常，将通过外科植入大聚合物或凝胶。可配制在足够小的颗粒或纤维中的聚合物或凝胶可通过其他常用的、更便利的非外科途径给予。
细胞的剂量可在很宽的范围内变化并将符合每个具体情况中的个体需求。细胞数目将根据器官的类型、重量和条件、给予的数量或频率、以及本领域技术人员已知的其他变量而变化。可通过适于组织或器官的途径给予细胞。合适的递送途径的实例可包括气管内递送(例如，对于肺)、静脉内递送、动脉内递送(例如，冠状动脉内)、直接注射入器官、以及淋巴系统内递送。
可将细胞以如下的浓度悬浮在合适的赋形剂中：约0.01至1×105细胞/ml、约1×105至10×106细胞/ml、或约10×106至5×107细胞/ml。合适的赋形剂是生理上和物理上与细胞或受体器官可相容的那些，例如缓冲盐溶液或其他合适的赋形剂。可根据符合合适的无菌性和稳定性的标准方法配制、生产和储存用于给药的组合物。
剂量
本领域技术人员可根据本公开内容、本文引用的文献和本领域中的常识确定用于人类或其他哺乳动物的剂量(即，细胞数目)而不需过多实验。根据本发明的多个实施方案待使用的最佳剂量将取决于很多因素，包括以下因素：被治疗的疾病及其阶段；供体的物种、其健康状况、性别、年龄、体重和代谢速率；供体的免疫能力；被给予的其他疗法；以及根据供体的病史或基因型预期的潜在的并发症。所述参数还可包括：细胞是否是同源的、自体的、同种异体的或异种的；它们的效力；必须靶向的位点和/或分布；以及位点的这类特征例如对细胞的可及性。其他参数包括与其他因子(例如生长因子和细胞因子)共给予。给定情况下的最佳剂量还将考虑配制细胞的方式、给予细胞的方式(例如灌注、器官内等)、以及给予后细胞将被定位在靶标位点的程度。
最终，将通过功效确定剂量水平、时机和频率。这将通过器官健康状况和存活力来测量，也可能通过器官功能和移植后临床量度来测量。这样的测量将根据器官的不同而不同。在一个实施方案中，它们可包括器官功能测量。人们可通过临床文献获取用于移植的器官存活力的测量。在另一个实施方案中，可测定(例如使用qPCR)某些标记物的水平或类型(例如组织mRNA水平、细胞因子水平和炎症细胞数目)以确定功效。例如，可通过qPCR测定肺组织的IL-10mRNA水平以确定功效。在另一个实施例中，人们可通过对以下的影响来评估肺中的剂量：细胞因子水平；液体中的其他炎症标记物(例如通过支气管肺泡灌洗获得的)；水肿水平；血液动力学和呼吸器测量；以及离体(再)灌注肺中气体交换的评估。
在多个实施方案中，细胞/基质可以初始剂量给予，然后通过进一步给予来维持。细胞最初可以一种方法给予，然后通过相同方法或一种或多种不同方法给予。可通过持续给予细胞/基质来维持水平。多个实施方案按最初给予细胞或给予细胞以在受试者中维持它们的水平或都通过静脉注射给予。在多个实施方案中，使用其他给予形式，这取决于器官的类型和条件以及在本文别处讨论的其他因素。
细胞/基质可以在很宽的时间范围内以许多频率给予。通常，处理的长度与收集和操作过程的长度、被应用的疗法的功效以及被处理的器官的条件和反应成正比。
在其他实施方案中，可在器官摘取之前将细胞给予(例如通过静脉内、动脉内、气管内、直接注射等)至供体。根据给予的途径，可将细胞给予持续一个合适的时间段(例如数分钟至约1-4小时、约4-8小时、约8-12小时、约12-16小时、约16-20小时、约20-24小时)。可在所述时间段后通过常规外科技术摘取器官。摘取后，细胞与器官接触(例如立即接触)持续一段时间(例如少于约1小时、约1-2小时、约2-3小时、约3-4小时)，该时间足以允许细胞分布在整个器官中。可通过灌注和/或将器官浸入到含细胞的浴中来使细胞与器官接触。然后，可将器官储存在冰上和/或连接至再灌注系统，随后所述器官被递送至移植位点。
在到达移植位点时，可将器官置于含有细胞的再灌注系统上(如果尚未这么做)。然后可将器官用细胞灌注持续一个时间段(例如少于约1小时、约1-2小时、约3-4小时)，这取决于所述器官和再灌注系统。在移植过程中，可通过灌注至受体(例如通过静脉)、直接注射入器官、和/或直接施用于器官表面将细胞与器官接触。例如，可在关闭进入和离开器官的血管之前进行灌注。在肝移植的过程中，例如，可在将血管连接至移植肝之前将细胞灌注入肝门静脉。另外地或替代地，可在移植后(例如在关闭进入和离开器官的血管之后)将细胞递送至器官持续一个合适的时间段(例如数分钟至约1-4小时、约4-8小时、约8-12小时、约12-16小时、约16-20小时、约20-24小时)，这取决于所述递送系统和器官。
组合物
本发明还涉及具有实现本文所述的任意效果的特定效力的细胞群体。如上所述，通过选择具有所需效力的细胞而建立这些群体。使用这些群体制备其他组合物，例如包括具有特定所需效力的群体的细胞库和包含具有特定所需效力的细胞群体的药物组合物。
实施例
方法
肺摘取和离体灌注
遵循由地方器官获取组织(Organ Procurement Agency)——LifeGift——获得的研究同意书，在休斯顿卫理公会(Houston Methodist)根据建立的IRB方案(IRB(2)1111-0205)获得了用于该研究的丢弃的捐赠的肺。使用顺行的Perfadex(Vitrolife AB，哥德堡，瑞典)60ml/Kg流量加逆行的Perfadex灌注肺静脉以标准方式获得了五位患者各自的肺。然后将肺储存在含有1升Perfadex的塑料袋中并在运输过程中保持在冰上。一旦肺到达休斯顿卫理公会，就将它们储存在4℃的冰箱中持续总共8小时的冷的静态储存以诱导冷局部缺血性损伤。
用CE-标记的Vivoline LS1(Vivoline Medical AB，隆德，瑞典)进行离体肺灌注(EVLP)(图1)(Wierup,P.et al.,Ann Thorac Surg 2006；81(2):460-6；Ingemansson,R.etal.,Ann Thorac Surg 2009；87(1):255-60；和Cypel,M.et al.,N Engl J Med 2011；364(15):1431-40)。用2.5L Steen Solution(XVIVO Perfusion)装填系统。避免使用洗涤的红血球或血液以降低可行性研究中的变量数目。向灌注液加入100mg美罗培南(Meropenem)(AstraZeneca AB，Sodertalje，瑞典)和10,000U肝素(LEO Pharmaceutical，哥本哈根，丹麦)。在将肺与EVLP单元连接之前，使用氨丁三醇(Addex-THAM，Fresenius Kabi AB，乌普萨拉，瑞典)将溶液中的pH校正至7.35-7.45。在也获得了心脏的情况下，将Dacron Graft缝合至分开的肺动脉分支以重建肺动脉(PA)的完整性并促进肺与EVLP通路的连接。将气管通过尺寸与气管直径匹配的硅胶管连接至机械呼吸器。将温度探针定位在左心房。最初，为了除去通路中的空气，将肺以0.5L/min的流速灌注。将流入插管上的用于除去空气的分流器保持开启直至器官达到32℃然后在其余时间关闭。然后将流量增加至对于特定肺集合的估计的心输出量的100％。然后将肺温热30分钟至36℃的目标温度，并且不允许肺血液流入和流出之间的温度差异超过8℃。然后，将流速逐渐增加至70mL/min/千克供体体重的目标水平，在此期间不断测量PA压力并将其限制在15mm Hg。在20-30分钟内实现复温。当灌注液温度达到32℃时，以气量控制的模式开始机械通风，初始潮流气量为3ml/千克供体体重，并且呼气末正压(PEEP)水平为5cm H2O，速率为7-10次呼吸/min以及FiO2为0.5。然后将潮流气量逐渐增加至最大7mL/千克供体体重。用于血气分析的灌注液样品取自系统的专用端口。
细胞
源自人类骨髓的MAPC(Human
Figure GDA0002952359210000291
Athersys Inc.，克利夫兰)分离自单一的骨髓抽吸物，在征得健康供体同意的情况下获得，并根据先前所述的方法处理(Penn,MS et al.,Circ Res 2012；110(2):304-11；Maziarz,RT et al.,Biology ofBlood and Marrow Transplantation 2012；18(2Sup):S264-S265；以及clinicaltrials.gov#NCT01436487,#NCT01240915和#NCT01841632)。简单地说，在5％CO2的潮湿的大气中在低氧张力下在纤连蛋白包被的塑料组织培养瓶中培养MAPC。在MAPC培养基(补充有FBS[Atlas Biologicals，科林斯堡，CO]、ITS液体培养基补充物[Sigma]、MCDB[Sigma]、血小板源生长因子(R&D Systems，明尼阿波利斯市，MN)、表皮生长因子(R&DSystems)、地塞米松([Sigma]、盘尼西林/链霉素[Life Technologies Invitrogen]、2-磷-L-抗坏血酸[Sigma，圣路易斯，MO]和亚油酸-白蛋白(Sigma)的低葡萄糖DMEM[LifeTechnologies Invitrogen])中培养细胞。细胞每3-4天进行传代，使用胰蛋白酶/EDTA(Life Technologies Invitrogen，卡尔斯巴德，CA)收集。细胞对CD49c和CD90呈阳性，对MHC II类和CD45呈阴性(所有抗体都来自BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)。随后将群体倍增30-35次的细胞冻结在液氮的气相中的冷冻管中，浓度为溶于1ml(PlasmaLyte，5％HAS和10％DMSO)的1-10×106。在使用之前，立即将MAPC解冻并直接使用。
细胞接种、肺孵育、和支气管肺泡灌洗(BAL)液体和组织分析
当由心房内探针测量的温度达到约32℃时，将MultiStem 1ml小瓶解冻，稀释为19ml的无菌盐水并通过气管镜给予至LLL支气管的近端部分。将类似体积的赋形物(20ml无菌盐水)类似地接种至RLL支气管的近端部分。递送MultiStem后五分钟，将肺连接至Hamilton-C2机械呼吸器。在Vivoline系统上灌注2或4小时后终止实验。终止灌注前五分钟，将之前已经用细胞或赋形物接种的RLL和LLL的相同亚节用60mL盐水灌洗。然后将回收的BAL液分成原BAL液的等份试样用于评估总细胞计数和细胞差异，或对其进行离心(4℃下1200g×10min)并将上清液收集在单独的管中、急速冷冻并储存于-70℃(Lathrop,MJ etal.,Stem Cells Translational Medicine(出版中)；以及Goodwin,M.et al.,Stem Cells2011:29(7):1137-48)。对于一个肺，在开始通风前，就在MSC或赋形物递送之前在复温阶段中也获得了BAL液样品。
使用
Figure GDA0002952359210000301
血液分析器(Siemens Diagnostics，约翰逊城，TN)测定总BAL液细胞数。使用5×104个细胞制备细胞离心涂片，所述细胞在预清洁、预处理的载玻片(Corning Incorporate，Corning，NY)上以800rpm离心8分钟、过夜干燥并用DiffQuick(Hema 3Stain Set，Fisher Scientific，匹兹堡，PA)染色。通过由三个单独个体进行的200个细胞的盲法手动计数确定细胞群体(Lathrop,MJ et al.,Stem Cells TranslationalMedicine(出版中)；和Goodwin,M.et al.,Stem Cells2011:29(7):1137-48)。通过Bradford测定(Bio-Rad，Hercules，CA)评估未稀释的BAL液中的蛋白质含量。使用人细胞因子检测试剂盒，A道(R&D Systems，Minneapolis，MN)检查以下物质的BAL液上清液：可溶性细胞因子、趋化因子和其他物质包括C5/Ca、CD40L、CD54、CXCL1、CXCL10、G-CSF、Gro-1α、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16、IL-23、IP-10、I-TAC、MCP-1、MIF、PAI-1、RANES、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1、sICAM、sTREM-1、TNFα，以及与在UVP生物成像系统(Upland，CA)上测定的内部对照相比的细胞因子的相对量。根据厂商的说明书对其他特定细胞因子进行酶联免疫吸附试验，例如IL-10(R&D Systems，明尼阿波里斯市，MN，Cat#：D1000B)、和STC1、TSG-6和iNOS(MyBioSource，San Diego，CA，Cat#s：MBS946255、MBS926793、MBS723617)。
组织学评估
在灌注期结束时的BAL之后，随后在室温下将肺用10％福尔马林重力固定1小时。将经固定的肺切开，在石蜡固定之前将细胞灌输的区域储存在10％福尔马林中。然后评估所产生的5μm切片的组织学表现。使用建立的半定量计分系统，使用如前所述的0-3范围和0.5刻度增量，基于与已知的阳性和阴性对照相比的支气管周围细胞浸润物的存在和浓度，通过三个个体以盲检的方式在10个气道/只动物上对肺炎计分(Lathrop,MJ et al.,StemCells Translational Medicine(出版中)；和Goodwin,M.et al.,Stem Cells 2011:29(7):1137-48)。
组织炎症标记物的qPCR分析
在细胞或赋形物灌注之前、在细胞或赋形物灌注后2和4小时以及在实验结束时，使用自动装订机(Covidien GIATM DST SeriesTM 80mm)从LLL和RLL周围获得肺2-5的肺活检样品。将样品急速冷冻并随后均化，通过qPCR测定炎症细胞因子mRNA的表达水平(参见下文详细说明)。
在RNA裂解缓冲液中将样品均化，并根据厂商的说明书使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Germantown，MD)提取RNA。使用无DNA的试剂盒(Life Technologies，卡尔斯巴德，CA)进行额外的DNA酶处理。通过NanoDrop 2000(Thermo Scientific，沃尔瑟姆，MA)测定RNA浓度，并使用M-MLV反转录酶(Promega，麦迪逊，WI)对1μg RNA进行反转录，然后使用RNace-it Cocktail(Agilent，圣克拉拉，CA)进行RNA酶处理。将反转录酶阴性样品和水作为对照。将5μl cDNA与SYBR绿色(Promega)和引物(IDT)混合，并在ABI 7500FAST系统(Applied Biosystems，福斯特市，CA)上运行。将样品标准化为GAPDH并表示为人类参照物(Agilent)+/-标准偏差的百分比。
引物序列如下：
VEGFA–F1(SEQ ID NO:1)；
VEGFA–R1(SEQ ID NO:2)；
IGF1–F4(SEQ ID NO:3)；
IGF1–R4(SEQ ID NO:4)；
EGF–F1(SEQ ID NO:5)；
EGF-R1(SEQ ID NO:6)；
IL-10–F2(SEQ ID NO:7)；
IL-10–R2(SEQ ID NO:8)；
FGF2–F1(SEQ ID NO:9)；
FGF2–R1(SEQ ID NO:10)；
HGF–F1(SEQ ID NO:11)；
HGF–R1(SEQ ID NO:12)；
CCL5–F1(SEQ ID NO:13)；
CCL5–R1(SEQ ID NO:14)；
TGFB1–F1(SEQ ID NO:15)；
TGFB1–R1(SEQ ID NO:16)；
CXCL10–F1(SEQ ID NO:17)；
CXCL10–R1(SEQ ID NO:18)；
NOS3–F2(SEQ ID NO:19)；
NOS3–R2(SEQ ID NO:20)；
STC1–F1(SEQ ID NO:21)；
STC1–R1(SEQ ID NO:22)；
GAPDH–F1(SEQ ID NO:23)；
GAPDH–R1(SEQ ID NO:24)；
ANGPT1–F2(SEQ ID NO:25)；
ANGPT1–R2(SEQ ID NO:26)；
NOS2–F1(SEQ ID NO:27)；
NOS2–R1(SEQ ID NO:28)；
TNFAIP6–F1(SEQ ID NO:29)；
TNFAIP6–R1(SEQ ID NO:30)；
FGF7–F1(SEQ ID NO:31)；以及
FGF7–R1(SEQ ID NO:32)。
统计学分析
使用具有测试后Fishers LSD的单因素或双因素ANOVA，或通过Student T-检验在两组之间直接分析来对各组进行比较，如果合适，使用针对不等方差的Welch校正(Lathrop,MJ et al.,Stem Cells Translational Medicine(出版中)；以及Goodwin,M.etal.,Stem Cells2011:29(7):1137-48)。
结果
供体肺的相关临床特征概括于表1中。
表1：供体肺的临床特征
Figure GDA0002952359210000331
Figure GDA0002952359210000341
CVA：脑血管意外；SH：蛛网膜下出血；IH：颅内出血；MVA：机动车事故。
供体年龄范围为44-66，五个供体肺中的三个肺获自发生毁灭性神经病学事件的患者(一个来自窒息、一个来自机动车事故)。五个肺中的四个肺被认为不适于移植，因为功能状态很弱，包括在100％FiO2±10mmHg的呼气末正压下平均为184.75mmHg的低PaO2值。这些肺还具有影像学异常，不同地包括青肿、明显气肿、或对手术室中的肺复张无反应的叶衰竭。这些肺中的每一个还具有肺水肿的影像学征象，其中两个还有胸腔积液，注意到所有的肺在手术取出后都不同程度地水肿。肺#5在CXR上具有RLL衰竭，但是在去除和支气管镜去除粘液栓后扩大。一个肺(肺#4)在生理学上适于捐赠，其具有正常外观、清晰的CXR和在5mmHg呼气末正压上良好的氧化作用，但由于小的表面结节的存在而未被使用，随后经活组织检查发现该结节为良性。
各个肺的使用方案概述于表2中，同时也以示意形式示于图1中。
表2：实验方案概述
Figure GDA0002952359210000342
总的来说，在支气管镜给予细胞或赋形物后，所述肺具有相似的冷藏时间(8小时)和复温(25+2.2分钟)时间以及随后相似的再灌注时间(3.7±0.6小时)。在再灌注期结束时，各个肺都有一定程度的进一步发展的水肿，并且第4号肺还新发展了一定程度的水肿。然而，总的来说，MSC-处理(LLL)的叶相对赋形物-处理(RLL)的叶具有更少的可见水肿和炎症，即使是在肺#4中使用更低剂量的MAPC。代表性图像示于图2中。
再灌注期结束时的肺的组织学评估证明尽管在一些MAPC-处理的LLL中可发现炎症区域的斑点，但是5个肺中的4个肺的总体炎症显著降低，且全部5个肺的平均炎症也显著降低，如通过支气管周围水肿、血管周围水肿和肺泡隔膜水肿的半定量计分以及通过炎性细胞浸润物的存在而评估的(图3)。代表性的显微照片示于图4中。
获得接受更高细胞剂量的4个肺中的两个肺(肺3和5)的总BAL液细胞计数。在这两种情况下，MSC-处理的LLL相对赋形物-处理的RLL都具有显著的降低(图5A)。在接受较低MSC剂量的肺中也观察到总BAL液细胞计数降低的趋势(肺4，图5A)。在全部五个肺的BAL液样品上获得的细胞差异证明在赋形物-处理的RLL中的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的一致增加，所述增加在MSC-处理的LLL中得到改善(图5B)。BAL液总蛋白水平的测量值在各个肺之间是不同的，但是在全部5个肺中观察到在与赋形物-处理的RLL相比的MSC-处理的LLL中总蛋白的一致降低(图5C)。
观察到在与赋形物-处理的RLL相比的MSC-处理的LLL中IL-10水平的升高(图6)。然而，在肺损伤中MSC作用的临床前模型和其他模型中涉及的其他可溶性抗炎介质(如IL-1RA、STC、TGS-6和iNOS)在5个肺中的任一个肺的MSC-处理的LLL中都没有明确地升高(图6)。通过对在细胞或赋形物给予之前，然后在再灌注期的2或4小时之后获得的活组织检查样品进行qPCR分析，评估了5个肺中的4个肺(肺2-5)的组织mRNA水平。总的来说，组织mRNA水平的模式在所述4个肺之间更加一致。与IL-10蛋白的BAL液水平相当，如在2小时所评估的，与赋形物-处理的RLL中的仅1.6-倍的增加相比，MSC-处理的LLL中的组织IL-10mRNA的水平有3.5-倍的增加(图7)。在2小时还观察到在LLL和RLL中Angpt1和STC1的mRNA水平的类似的增加。令人感兴趣地是，对于LLL和RLL，TSG6从2至4小时的倍数表达具有很大的增加。
讨论
已经研究了大量不同的方法以改善供体肺的生存力并降低热或冷的局部缺血性炎症损伤。这些包括以顺行和逆行方式递送的具有细胞外特征的冲洗液以及使用在当前临床研究下用于运输供体肺的便携式离体保存系统(Machuca,TN et al.,Surg Clin NorthAm 2013；93(6):1373-94)。治疗干预的研究的不同领域旨在调节由局部缺血和再灌注引起的反应。例如，实验动物模型已经显示IL-10的基因治疗递送(Cypel,M.et al.,Sci TranslMed.2009；1(4):4-9)和腺苷受体激活(Fernandez,LG et al.,J Thorac Cardiovasc Surg2013；145(6):1654-9、和Mulloy,DP et al.,Ann Thorac Surg 2013；95(5):1762-7)的有益效果。然而，虽然实验数据令人鼓舞，但调节许多炎症通路中的一个通路未必可调节改变所包含的若干细胞机理的现象，这些机理例如先天和适应性免疫、补体级联的激活、内皮功能紊乱和细胞死亡的触发。相反，骨髓-衍生的MSC和MAPC对参与局部缺血/再灌注损伤的多种炎症通路具有独特的作用潜能。
最初，离体肺灌注(EVLP)被设计为评估心脏死亡(DCD)后捐赠的肺和其他不可接受的供体肺的质量的方法(Wierup,P.et al.,Ann Thorac Surg 2006；81(2):460-6、和Ingemansson,R.et al.,Ann Thorac Surg2009；87(1):255-60)。当前，这项技术处于临床试验中用于评估和修复在当前标准下被认为不适于移植的潜在的供体肺(Cypel,M.etal.,N Engl J Med 2011；364(15):1431-40)。EVLP还提供了在移植前通过气管内或血管内途径将MSC或MAPC直接给予至供体肺的机会。使用这个方法，与直接评估每个单独肺中的作用相比，本发明人选择首先评估MAPC直接气道给予至具有对侧肺的单个叶。将冷的局部缺血性储存(8小时的总冷储存)延长到超过实际时间，对于肺而言，该时间通常被接受以加强任何可发展的IRI并因此将MSC的潜在的抗炎作用最大化。本发明人还选择使用“现成”的非HLA匹配的MAPC作为可行性的证据。此外，本发明人证明MAPC的一致和有效的抗炎效果。特别地，细胞因子谱的改变，特别是IL-10的增加，可能对IRI特别有益。
从本发明的上述描述中，本领域技术人员会想到改进、变化和修改。这样的改进、变化和修改都在本领域技术人员的技能范围内并意欲由所附的权利要求涵盖。本文引用的所有专利、专利申请和出版物都以引用的方式全文纳入。
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Claims (32)

1.外源干细胞在制备用于降低用于移植的器官中的炎症的药物制剂中的用途，其中所述药物制剂包括外源干细胞，器官暴露于外源干细胞，其中所述干细胞是多能成体祖细胞(MAPC)，特征在于其是表达oct4、端粒酶、rex-1或rox-1中的一种或多种和/或能分化为内胚层、外胚层和中胚层中的至少两种的细胞类型的非胚胎、非生殖细胞。
2.外源干细胞在制备用于降低用于移植的器官中炎性细胞的发生的药物制剂中的用途，其中所述药物制剂包括外源干细胞，器官暴露于外源干细胞，其中所述干细胞是多能成体祖细胞(MAPC)，特征在于其是表达oct4、端粒酶、rex-1或rox-1中的一种或多种和/或能分化为内胚层、外胚层和中胚层中的至少两种的细胞类型的非胚胎、非生殖细胞。
3.外源干细胞在制备用于降低用于移植的器官中的炎性细胞因子的药物制剂中的用途，其中所述药物制剂包括外源干细胞，器官暴露于外源干细胞，其中所述干细胞是多能成体祖细胞(MAPC)，特征在于其是表达oct4、端粒酶、rex-1或rox-1中的一种或多种和/或能分化为内胚层、外胚层和中胚层中的至少两种的细胞类型的非胚胎、非生殖细胞。
4.外源干细胞在制备用于降低用于移植的器官中的局部缺血性-再灌注损伤的药物制剂中的用途，其中所述药物制剂包括外源干细胞，器官暴露于外源干细胞，其中所述干细胞是多能成体祖细胞(MAPC)，特征在于其是表达oct4、端粒酶、rex-1或rox-1中的一种或多种和/或能分化为内胚层、外胚层和中胚层中的至少两种的细胞类型的非胚胎、非生殖细胞。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述干细胞能分化为内胚层、外胚层和中胚层的细胞类型。
6.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述干细胞已经经历至少10-40次细胞倍增。
7.权利要求6的用途，其中所述干细胞已经经历至少30-35次细胞倍增。
8.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述干细胞是非HLA匹配的同种异体细胞。
9.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述器官在移植至受体之前暴露于所述干细胞。
10.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述器官在移植至受体的过程中暴露于所述干细胞。
11.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述器官在移植至受体之后暴露于所述干细胞。
12.权利要求9的用途，其中暴露于所述器官的干细胞的浓度为1×106细胞/ml至10×106细胞/ml。
13.权利要求9的用途，其中所述干细胞暴露于所述器官持续2-4小时。
14.权利要求9的用途，其中所述干细胞包含于用于向器官灌注的液体中或包含于用于器官内给予的载体中。
15.权利要求9的用途，其中所述干细胞包含于在移植前使器官在其中浸泡的基质中。
16.权利要求9的用途，其中所述器官选自肺、肾脏、心脏、肝脏、胰腺、胸腺、胃肠道和复合的同种异体移植物。
17.权利要求9的用途，其中所述干细胞衍生自骨髓。
18.权利要求17的用途，其中所述骨髓为人骨髓。
19.权利要求9的用途，其中所述器官来自人类。
20.一种方法，其包括将器官离体暴露于外源干细胞，其中所述干细胞是多能成体祖细胞(MAPC)，特征在于其是表达oct4、端粒酶、rex-1或rox-1和/或能分化为内胚层、外胚层和中胚层中的至少两种的细胞类型的非胚胎、非生殖细胞。
21.权利要求20的方法，其中所述干细胞能分化为内胚层、外胚层和中胚层的细胞类型。
22.权利要求20的方法，其中所述干细胞已经经历至少10-40次细胞倍增。
23.权利要求22的方法，其中所述干细胞已经经历至少30-35次细胞倍增。
24.权利要求20的方法，其中所述干细胞是非HLA匹配的同种异体细胞。
25.权利要求20的方法，其中暴露于所述器官的干细胞的浓度为1×106细胞/ml至10×106细胞/ml。
26.权利要求20的方法，其中所述干细胞暴露于所述器官持续2-4小时。
27.权利要求20的方法，其中所述干细胞包含于用于向器官灌注的液体中或包含于用于器官内给予的载体中。
28.权利要求20的方法，其中所述干细胞包含于在移植前使器官在其中浸泡的基质中。
29.权利要求20的方法，其中所述器官选自肺、肾脏、心脏、肝脏、胰腺、胸腺、胃肠道和复合的同种异体移植物。
30.权利要求20-29中任一项的方法，其中所述干细胞衍生自骨髓。
31.权利要求30的方法，其中所述骨髓为人骨髓。
32.权利要求20-29中任一项的方法，其中所述器官来自人类。
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