WO2023127872A1 - 移植材料の製造方法、及び移植材料 - Google Patents

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WO2023127872A1
WO2023127872A1 PCT/JP2022/048145 JP2022048145W WO2023127872A1 WO 2023127872 A1 WO2023127872 A1 WO 2023127872A1 JP 2022048145 W JP2022048145 W JP 2022048145W WO 2023127872 A1 WO2023127872 A1 WO 2023127872A1
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organ
foreign substance
injection
injected
cells
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PCT/JP2022/048145
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比呂志 長嶋
ひとみ 松成
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株式会社ポル・メド・テック
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a transplant material containing an organ into which a foreign substance has been injected, which is suitable as a regenerative medicine product, and the transplant material.
  • it relates to a method for producing a xenograft material containing an organ into which a foreign substance has been injected, and the xenograft material.
  • Organ regeneration is actively developing in various organs.
  • kidney which has been considered complex and difficult to regenerate, foreign substances such as human mesenchymal stem cells are injected into the renal developmental region of animals in the developing stage, and a heterogeneous developmental program is borrowed for "embryonic organ complementation.” method” is being developed (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • a foreign substance e.g., human mesenchymal stem cells
  • an organ e.g., metanephro
  • the organ such as metanephro
  • it is difficult to puncture a needle-like member such as a glass capillary tube. Therefore, the animal body (fetal body, etc.) is dissected open to some extent, and the needle-like member is pierced into the organ (metnephros, etc.) attached to the animal body (fetal body, etc.) to inject the foreign substance.
  • a needle-like member such as a glass capillary tube
  • the above method has the following problems. 1) Since the injection work can only be performed in a state of being attached to an animal body such as a fetal body, the location and time of the injection work are greatly restricted. 2) Organs such as metanephros excised from animal bodies such as fetal bodies are extremely small (approximately 2 mm in major diameter x 1 mm in minor diameter) and flexible organs, so the needle-shaped member is gently grasped so as not to damage the organ. is difficult to puncture.
  • the injection target area in the organ such as the metanephros is on the unexposed side of the cut open animal body (fetal body, etc.)
  • a needle-like member such as a capillary is punctured from the exposed side of the organ. Then, the foreign matter must be injected by penetrating to the injection target region. This leaves the graft material with a large amount of damage in the injection pathway.
  • the present invention has been made in view of the problems of the prior art as described above, and it is an object of the present invention to provide a method for producing a transplant material that allows a foreign substance to be easily injected into an organ removed from an animal body.
  • the first purpose A second object of the present invention is to provide a graft material in which damage is reduced even though a foreign substance has been injected.
  • the present inventors have found that by positioning at least a part of an organ extracted from the body of an animal in contact with a plastic member, a foreign object can be transported to a desired portion of the organ by the shortest route, and in a complicated manner. It was found that the injection can be easily performed without requiring any special work.
  • the present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention is as follows.
  • ⁇ 1> The organ into which the foreign substance has been injected, comprising the steps of positioning at least a part of an organ extracted from the body of an animal in contact with a plastic member, and injecting the foreign substance into the organ after positioning.
  • a method of making a graft material comprising: ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the injection is performed from the surface directly above or near the injection target region in the organ.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the animal body is a fetal body.
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the organ is an organ for xenotransplantation.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the organ is vitrified and frozen after the excision.
  • the plastic member is a plastic member covering the organ during vitrification and freezing.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein at least part of the organ is embedded in the plastic material.
  • ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the plastic member is gel.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein a needle-like member is used for the injection.
  • ⁇ 10> The method according to ⁇ 9>, wherein the path through which the needle-like member passes has a dense structure impermeable to liquid.
  • the foreign substance is a non-animal-derived cell of the animal body.
  • the organ is the kidney, and the injection target region is the renal cortical formation region of metanephros.
  • Transplantation comprising an organ removed from an animal and a foreign substance injected into the organ, wherein an injection scar is formed in the organ directly above or near the region into which the foreign substance was injected material.
  • ⁇ 14> The material according to ⁇ 13>, wherein the foreign substance is a cell derived from a site other than the organ.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY it is possible to provide a method for producing a transplant material that allows a foreign substance to be easily injected into an organ removed from an animal body. Moreover, according to the present invention, it is possible to provide a transplant material with reduced damage despite the fact that a foreign substance has been injected. Moreover, according to the present invention, it is possible to reduce restrictions on the location and time of the injection work.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating one preferred embodiment of the present invention
  • FIG. FIG. 2 shows photomicrographs of metanephros positioned by semi-embedding in gelatin gel.
  • FIG. 3 is a micrograph showing the results of injecting a foreign substance (GFP-expressing cells) into one of the renal cortex-forming regions under the renal capsule.
  • FIG. 10 is a diagram showing micrographs showing the results of injecting foreign substances (GFP-expressing cells) into two locations in the renal cortex-forming region under the renal capsule.
  • FIG. 10 is a diagram showing micrographs showing the results of extensive injection of a foreign substance (GFP-expressing cells) into the metanephric mesenchymal region.
  • FIG. 10 is a micrograph showing the injection results of Example 3; 4 is a diagram showing a micrograph showing the injection results of Comparative Example 1.
  • FIG. 10 shows the pancreatic tissue of a pig deficient in ⁇ cells due to the expression of the Pdx1-Hes1 gene in Example 4.
  • FIG. 9 shows a human iPS cell-derived pancreatic progenitor cell cluster injected into one of the pancreatic tissue fragments shown in FIG.
  • a first aspect of the present invention is the outpatient, comprising the steps of positioning at least a portion of an organ extracted from an animal body by contacting a plastic member, and injecting a foreign substance into the organ after positioning.
  • a method for producing a graft material containing an organ into which an object has been injected in the first aspect, by positioning at least a part of the organ extracted from the animal body in contact with the plastic member, the foreign substance can be easily injected into the organ extracted from the animal body without complicated work. can do.
  • the injection target region 3 of the organ 1 can be easily injected with a foreign substance by any means ( Preferably, it can be injected accurately).
  • the plastic member 2 is preferably brought into contact with (placed, fixed, etc.) on the substrate 4 .
  • animals that provide the animal body include pigs, cows, horses, sheep, goats, primates (e.g., humans, apes (chimpanzees, monkeys, etc.)), rodents (e.g., mice, rats), and the like. mammals.
  • the animals are preferably mammals whose physique and other characteristics are closer to humans than rodents, more preferably pigs, sheep, goats, and primates (e.g., humans, apes), and pigs (that is, the organs are organ of origin) is more preferred.
  • the animal body may be a fetal body, a juvenile body, or an adult body, but from the viewpoint of low immunogenicity, the animal body is preferably a fetal body.
  • the organ is an organ for xenotransplantation, it is preferably a fetal body.
  • the organ is preferably an organ for transplantation, more preferably an organ for xenotransplantation.
  • organs include internal organs (e.g., pancreas, kidney, ureter, bladder, liver, heart, stomach, intestine, etc.), reproductive organs (e.g., ovary, testis), fertilized eggs, embryos, fetuses, bone marrow (e.g., , hematopoietic organs), brain, eyes, nose, mouth, skin, nerves, or tissues derived therefrom, or artificial tissues (cell sheets such as chondrocyte sheets, organoids, etc.).
  • internal organs e.g., pancreas, kidney, ureter, bladder, liver, heart, stomach, intestine, etc.
  • reproductive organs e.g., ovary, testis
  • fertilized eggs embryos, fetuses
  • bone marrow e.g., , hematopoietic organs
  • brain eyes, nose
  • the above organs are preferably internal organs, reproductive organs, fertilized eggs, embryos, and fetuses, more preferably internal organs and reproductive organs, and include pancreas (e.g., pancreatic islets), kidneys (e.g., metanephros, particularly metanephros, ureters, and bladder). Urology) is more preferred.
  • pancreas e.g., pancreatic islets
  • kidneys e.g., metanephros, particularly metanephros, ureters, and bladder.
  • Urology is more preferred.
  • the organ may or may not be a genetically modified organ (recombinant organ or genome edited organ).
  • preparation of genetically modified organs include (1) preparation of genetically modified animal cells, and (2) preparation of the organ from the cells prepared above by somatic cell cloning technology.
  • the preparation of the cells may or may not be introduction of the desired transgene by gene editing technology such as CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas nuclease.
  • the somatic cell cloning technology involves the use of cells of an animal to be cloned (preferably genetically modified animal cells) is cultured as a donor cell, and the donor cell is nuclear-transplanted into a recipient enucleated egg (oocyte) by a fusion method such as cell fusion.
  • oocyte recipient enucleated egg
  • somatic cell cloning technique genetically modified animals can be cloned, and the genetically modified organ can be prepared by extracting the target organ from the animal.
  • the organ may or may not be a secondary organ.
  • the term "secondary organ” refers to an organ-like tissue formed by nurturing and growing an animal in a part of the body where an organ whose formation is inhibited (e.g. pancreas) is originally formed (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2019-62929).
  • the secondary organ may or may not be the genetically modified organ. That is, the above-described inhibition of organogenesis can be achieved by genetic modification that modifies the genes of the organ-bearing animal.
  • the Pdx1-Hes1 gene in which the Hes1 gene is linked to the promoter of the Pdx1 gene, can be used, that is, the Hes1 gene can be overexpressed under the control of the Pdx1 promoter (Matsunari et al. , PNAS 110: 4557-4562 (2013); Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-62929).
  • the secondary organ may be formed by inhibiting organogenesis by administering a drug.
  • the secondary organ may have 100% of the function as the original organ, or may have only a part of it.
  • Preferred secondary organs include secondary organs lacking specific functional cells.
  • the term "functional cells" refers to cells that are contained in an organ and have some function.
  • Examples include ⁇ -cells, ⁇ -cells, and ⁇ -cells in the pancreas, and nephron progenitor cells, metanephric mesenchymal cells, ureteroblasts, and the like in the kidney.
  • Preferred functional cells include beta cells in the pancreas and nephron progenitor cells in the kidney.
  • Preferred organs deficient in specific functional cells include pancreas deficient in ⁇ cells, kidney deficient in nephron progenitor cells, kidney deficient in metanephric mesenchymal cells, and the like.
  • the kidney e.g., metanephros, particularly urinary organs including metanephros, ureters, and bladder
  • the kidney after formation of metanephros (renal primordium) at the tip of the ureter is preferable.
  • the kidneys eg metanephros, particularly the urinary system including metanephros, ureters and bladder
  • the kidneys which correspond to the elongation phase of the ureteric buds that are the main components of nephron formation.
  • kidneys of 25 days to 45 days of gestational age corresponding to the elongation period are preferred, and kidneys of 30 days to 40 days of gestational age.
  • kidneys of 30 days to 40 days of gestational age are more preferred.
  • the organ As a mode for bringing at least a portion of the organ into contact with the plastic member, the organ is placed on the plastic member, and at least a portion of the organ does not slide under, sideways, or above the plastic adhesive member. Adhesion by embedding or the like can be mentioned. In any of the above aspects, it is preferable that at least part of the organ is buried in the plastic member. A part of the organ may be buried in the plastic member, and a part of the organ may be exposed, or the organ may be completely buried in the plastic member (completely covered with the plastic member). may be used.).
  • the plastic member when the plastic member is a gel described later, in a liquid (preferably hydrosol) containing a sol (the sol before gelation of the gel) , gelation after immersing the organ, gelation after applying the liquid containing the sol to the organ, or the like.
  • Gelation of the sol can be performed by any method such as addition of polyvalent metal ions such as calcium ions and barium ions, cooling, and the like.
  • positioning refers to maintaining the positional relationship of the organ with respect to the plastic member by suppressing movement of the organ due to slippage or the like.
  • the plastic member is not particularly limited as long as it has plasticity (deformability or flexibility) that can adhere to the organ to the extent that movement of the organ due to slipping or the like can be suppressed, and the object of the present invention can be achieved.
  • a member containing any plastic material can be mentioned.
  • a member containing a plastic material having a coefficient of friction to the extent that the movement of the organ can be suppressed is preferable.
  • the member may or may not contain a plastic adhesive material or the like. Any pharmacologically acceptable plasticity from the viewpoint that there is no actual harm even if the plastic material is not completely removed and a small amount remains, and that the plastic material can be implanted while being coated without removing the plastic material.
  • a member comprising material is preferred.
  • the gel has plasticity (deformability or flexibility) that allows the organ to adhere to the extent that the movement of the organ can be suppressed, and has an appropriate coefficient of friction due to hydrogen bonding, intermolecular force, etc.
  • Preferred are any pharmacologically acceptable gels (non-toxic pharmaceutically acceptable gels), more preferred are hydrogels.
  • the gel is a gel in which the sol-gel phase transition occurs due to ionic cross-linking, or a temperature (for example, a phase transition temperature of 5 to 40 ° C., preferably 5 ⁇ 10 ° C, 10 ⁇ 15 ° C, 15 ⁇ 20 ° C, 20 ⁇ 25 ° C, 25 ° C ⁇ 30 ° C, 30 ° C ⁇ 35 ° C or 35 ° C ⁇ 40 ° C phase transition temperature) by the sol-gel phase transition Temperature-sensitive gels in which .
  • a temperature for example, a phase transition temperature of 5 to 40 ° C., preferably 5 ⁇ 10 ° C, 10 ⁇ 15 ° C, 15 ⁇ 20 ° C, 20 ⁇ 25 ° C, 25 ° C ⁇ 30 ° C, 30 ° C ⁇ 35 ° C or 35 ° C ⁇ 40 ° C phase transition temperature
  • a gel that undergoes a sol-gel phase transition due to the above ionic cross-linking is, for example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylenediaminetetraacetic acid disodium ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA.2Na).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • EDTA.2Na ethylenediaminetetraacetic acid disodium ethylenediaminetetraacetic acid
  • hydrogel examples include alginic acid and salts thereof (e.g., polyvalent metal salts such as calcium alginate and barium alginate, and monovalent metal salts such as sodium alginate and potassium alginate. From the viewpoint of achieving gelation more reliably. , calcium alginate, and polyvalent metal salts of barium alginate are preferred.), gelatin, carrageenan, agar (agarose gel), pectin, chitosan, silicone hydrogel, konjac, and other polysaccharides.
  • a hydrogel in which a sol-gel phase transition occurs due to temperature or a temperature-sensitive hydrogel in which a sol-gel phase transition occurs due to temperature is preferred.
  • Alginic acid or its salts are examples of hydrogels in which the sol-gel phase transition occurs due to ionic cross-linking.
  • Gelatin, carrageenan, agar (agarose gel), pectin and the like are examples of temperature-sensitive hydrogels in which a sol-gel phase transition occurs due to temperature.
  • Gelatin is preferred because it can be sol-formed at a relatively low temperature (for example, 35° C. or lower) and causes less damage to the above-mentioned organs and the like.
  • 5-25% (w/v) gelatin solutions can be used.
  • a 7-20% (w/v) gelatin solution is preferred, and a 10-15% (w/v) gelatin solution is more preferred.
  • the size of the plastic member can be appropriately set by those skilled in the art according to the size of the organ.
  • a sheet-like member having long sides and short sides that are 0.25 to 3 times as large as that of the sheet can be formed.
  • a sheet-like member having long and short sides 0.35 to 2 times the long and short axes of the organ is preferable, and 0.5 to 1.5 times the long and short axes of the organ.
  • a sheet-like member having five times the long side and the short side is more preferable. More specifically, a sheet-shaped member having a long side of 10 to 200 mm and a short side of 5 to 100 mm can be used.
  • the thickness can be, for example, 0.1 mm to 5 mm (preferably 0.5 mm to 2 mm).
  • the method of injecting the foreign substance is not particularly limited as long as the foreign substance can be injected into the organ.
  • a method of injecting by any method and the like can be mentioned.
  • a method of puncturing the surface of the organ with a hollow needle-like member and injecting the foreign matter by any method (eg, capillary action, injection) is preferred.
  • the pore diameter (eg, average diameter) of the pores is not particularly limited, and is, for example, 0.05 mm to 3 mm, preferably 0.1 mm to 2 mm, and more preferably 0.5 mm to 1.5 mm.
  • Examples of the needle-like member include capillaries with sharp tips.
  • the work of injecting a foreign substance may or may not be done freehand (for example, freehand under a microscope by an expert), but from the viewpoint of more accurate execution, it should be done using a micromanipulator. is preferred.
  • the above-mentioned foreign substance means a substance derived from other than the above-mentioned organ, and the above-mentioned foreign substances include substances derived from the same animal species as the recipient (transplantation recipient individual), and the same animal as the donor (transplantation source individual). Substances derived from an individual whose species is different from the donor, substances derived from an animal species different from both the recipient and the donor, drugs (eg, pharmaceuticals), and the like.
  • a substance derived from an animal species a substance derived from the same animal species as the recipient is preferable from the viewpoint of low immunogenicity.
  • Substances include, for example, cells, growth factors, hormones, cytokines, etc. Among them, cells are preferred.
  • the cells may or may not be artificial cells (eg, genetically modified cells, ES cells, iPS cells).
  • the above-mentioned “cells derived from the same animal species as the recipient” include “human-derived cells”.
  • the injection is performed from a surface directly above or near the injection target area in the organ.
  • the “near surface” refers to the surface of the organ that exists on the same side as the injection target area with respect to the center of the organ. A surface of the organ comprising a point on an extension line connecting the center and any point in the injection target area is preferred.
  • the “directly above surface” refers to the surface of the organ that is closest to the injection target region.
  • said “near surface” is the region of the surface that includes said "immediately overlying surface”.
  • the injection target region includes any region within the organ.
  • the injection target region includes the nephrogenic zone of the metanephros, the mesenchymal region of the metanephros, and the like.
  • the substrate 4 is not particularly limited, but includes plates (made of plastic, metal, etc.), wells, glass substrates, plates (for example, dishes), and the like. At least part of the injection scar formed in the organ may or may not be covered with the plastic member. "Injection marks" will be described in detail later.
  • the organ may or may not have undergone vitrification freezing after the extraction.
  • Organs that have been vitrified and frozen include organs that have been vitrified and cryopreserved (for example, stored for a long period of time).
  • the organ may be covered with a plastic member during the vitrification freezing.
  • the plastic member that covers the organ during the vitrification freezing may be the same as or different from the plastic member (member that functions as a positioning jig) in the first aspect. From the viewpoint of process simplification, it is preferable to use the plastic member that covers the organ during vitrification and freezing as it is as the plastic member (member that functions as a positioning jig) in the first aspect.
  • the animal body (fetal body, etc.) is cut open to some extent and disassembled, and the needle-like member is pierced into the organ (metanephrine, etc.) attached to the animal body (fetal body, etc.).
  • Injection of a foreign substance has been performed by using an injection method (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • the renal parenchyma is penetrated (by puncturing the needle member) from important vessels such as the renal artery, renal vein, and ureter, and the renal hilum, which has many spaces such as the renal pelvis. I had to inject a foreign substance.
  • the renal hilum has a large number of vessels and spaces, there is a problem that the above-mentioned foreign substances after injection leak out.
  • the renal hilum is an important tissue where important vessels such as the renal artery, renal vein, and ureter converge during kidney development. Although damage to the renal tissue should be avoided as much as possible, the conventional method of injecting a foreign substance from the renal hilum has the problem of being highly invasive to the renal tissue.
  • the injection scar formed in the organ may or may not be covered with the plastic member. Even without coating as described above, according to the present invention, it is possible to avoid injection of a foreign substance from the direction of the above-mentioned vessels such as the renal hilum and the direction with many cavities. Therefore, it is possible to suppress the leakage of the foreign matter in the vitrification freezing. In addition, according to the present invention, damage to the renal hilum can be avoided, and thus the invasiveness is lower than that of the conventional method.
  • the path through which the needle-shaped member passes through the organ has a dense structure.
  • the dense structure includes a structure with fewer tubes, voids, etc. than the lumen of an organ (e.g., a hollow organ), an orifice, etc., or a structure without tubes, voids, etc. (e.g., a solid portion of an organ (solid organ , solid organs, etc.).
  • a dense structure that is impermeable to a liquid is preferable to a lumen of an organ (e.g., a hollow organ), a portal, etc., and a tissue (e.g., connective tissue) or More preferred is a densely packed structure of cells (eg, mesenchymal cells).
  • organ e.g., a hollow organ
  • tissue e.g., connective tissue
  • a densely packed structure of cells eg, mesenchymal cells.
  • metanephric mesenchymal cells such as the metanephric mesenchymal region, the renal cortex-forming region, and the cap mesenchyme, have a substantial structure.
  • vitrification freezing means that the above organs are brought into contact with a refrigerant for vitrification freezing such as liquid nitrogen (boiling point -196°C), liquid helium (boiling point -269°C), or liquid ethane (boiling point -175°C).
  • a refrigerant for vitrification freezing such as liquid nitrogen (boiling point -196°C), liquid helium (boiling point -269°C), or liquid ethane (boiling point -175°C).
  • the method of contact with the vitrification-freezing refrigerant is not particularly limited, but includes immersion or application (flash) of liquid, spraying of vapor, and the like.
  • Contact with the vitrification cryocoolant is vitrification such as a support for vitrification freezing, a cryotop, a straw (for example, a straw for transplantation, a straw with a sharp tip, etc.), a capillary pipette, etc., which can support a plurality of organs at the same time. It may or may not be carried out using a freezing support, but it is preferably carried out using the above support.
  • the support for vitrification and freezing which can support a plurality of organs at the same time, is more preferable from the viewpoint that a plurality of organs can be frozen at once and the production efficiency of the transplant material can be improved.
  • the support for vitrification and freezing that can simultaneously support a plurality of organs has, for example, a plurality of depressions on a glass plate, a metal plate, a plastic plate, etc., and can simultaneously support the plurality of organs in the depressions. chips or plates, A mesh net, a non-woven fabric, or the like may be used as a supporting tool capable of simultaneously supporting a plurality of organs.
  • CRYOTOP registered trademark; manufactured by Kitasato Biopharma
  • CRYOTOP registered trademark; manufactured by Kitasato Biopharma
  • the organs Prior to the vitrification and freezing, the organs are preferably brought into contact (immersion, coating, etc.) with any vitrification solution.
  • the vitrification solution is not particularly limited, but cell-permeable cryoprotectants such as dimethylsulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propanediol, and glycerin, and sucrose (sucrose), trehalose, sorbitol, and dextran saccharides, carboxylated polylysine, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, antifreeze protein and other cell impermeant cryoprotective agents (preferably aqueous solutions).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • EG ethylene glycol
  • propanediol propanediol
  • glycerin sucrose
  • sucrose sucrose
  • trehalose trehalose
  • sorbitol and dextran saccharides
  • carboxylated polylysine carboxylated polylysine
  • the organ after vitrification freezing (preferably after vitrification cryopreservation) may or may not be brought into contact (immersion, coating, etc.) with an arbitrary thawing solution. After contacting with the melt, it may or may not be contacted with any diluent (immersion, coating, etc.).
  • the above-treated organ may or may not be cultured in the above basal medium or basal medium solution before transplantation (preferably xenotransplantation).
  • the organ when used as a regenerative medicine product, it is required that the foreign substance (e.g., cells derived from the same animal species as the recipient) be injected into the organ and then vitrified and frozen for storage. there may be cases.
  • the foreign substance e.g., cells derived from the same animal species as the recipient
  • the foreign matter is removed from the foreign matter by the osmotic pressure gradient between the inside of the organ and the external solution (for example, the vitrification solution, the equilibrium solution, etc.).
  • the external solution for example, the vitrification solution, the equilibrium solution, etc.
  • the organ may or may not be covered with a plastic member during vitrification freezing.
  • the plastic member the member used as the positioning jig in the first aspect may be used as it is. Regardless of whether the injection scar is covered or not, according to the present invention, it is possible to avoid injection of the foreign substance from the direction of the above-mentioned vessels such as the renal hilum and the direction with many voids. leakage can be suppressed.
  • the path through which the needle-like member passes through the organ is a liquid-impermeable path.
  • the path in which a communicating hole described later is formed is a liquid-impermeable path.
  • the organ has a foreign substance injected therein and an injection scar
  • the plastic member covers at least a part of the injection scar.
  • the “injection scar” means a hole formed for artificially injecting the foreign substance into the organ. It means a communicating hole leading to.
  • the "injection scar” may be formed by, for example, a needle-like member or the like.
  • at least a part of the injection marks made up of the holes and the communication holes on the surface and the holes on the surface may be covered with the gel.
  • the method may or may not include a removing step of removing the plastic member covering the surface of the organ.
  • the removal step can be included in the coated plastic member.
  • the gel can be removed by heating the plastic member to a sol-forming temperature, arbitrary sol-forming such as the chelate treatment, or physical pressure. Furthermore, it may or may not be washed with any washing liquid such as any aqueous solution or phosphate buffer (running water).
  • the removal step may or may not be performed multiple times (eg, stepwise).
  • a second aspect of the present invention includes an organ isolated from an animal and a foreign substance injected into the organ, wherein the organ has an injection scar immediately above or near the region into which the foreign substance was injected. is the graft material in which is formed.
  • the organ has a foreign substance injected therein and an injection scar, and the gel covers at least a part of the injection scar, and the gel covers the entire injection scar. More preferably, the gel covers the entire surface of the organ.
  • Specific examples and preferred examples of the foreign matter are as described above.
  • the injection marks are as described above.
  • a capillary tube with a sharply polished tip that expresses green fluorescent protein (GFP) and into which GFP-expressing human mesenchymal stem cells that emit green fluorescence were aspirated was prepared.
  • GFP green fluorescent protein
  • gelatin powder manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • HEPES-buffered TCM199 medium of pH 7.2 was dissolved in HEPES-buffered TCM199 medium of pH 7.2 to prepare a gelatin solution with a concentration of 10-15% (w/v).
  • Example 1 Metanephros excised from pig fetuses obtained by caesarean section from DPF-controlled wild-type sows are placed in the gelatin solution to expose the surface immediately above and near the nephrogenic zone.
  • the metanephros were semi-embedded in the gelatin gel as described above (that is, there were portions of the metanephros that were not in contact with the gel, while portions of the metanephros that were in contact with the gel were embedded).
  • FIG. 2 shows photomicrographs of metanephros positioned by semi-embedding in gelatin gel.
  • the metanephroi semi-embedded in the gelatin gel was placed on a 35 mm dish (manufactured by Iwaki) so that the surface immediately above and near the renal cortical formation area was exposed (the above positioned to face the top side away from the dish).
  • GFP-expressing human mesenchymal stem cells were aspirated into one or two locations on the surface of the semi-embedded metanephros subcapsular renal corticogenesis region directly above or near the renal corticogenesis region; Puncture was performed to the shortest distance, and the human mesenchymal stem cells were injected as a foreign object into the renal cortical formation region.
  • the capillaries are widely spread over the mesenchymal region.
  • the human mesenchymal stem cells were injected into a wide range of the mesenchymal region by puncturing the shortest distance to the tip of the capillary tube and moving the tip of the capillary tube.
  • FIG. 3 is a photomicrograph showing the results of injecting GFP-expressing cells into one of the renal corticogenic regions under the capsule of the semi-embedded metanephros.
  • FIG. 4 shows photomicrographs showing the results of injection of GFP-expressing cells into two sites in the subcapsular renal corticogenic region of the semi-embedded metanephros.
  • FIG. 5 is a photomicrograph showing the results of extensive injection of GFP-expressing cells into the metanephric mesenchymal region. As is clear from the results shown in FIGS.
  • the foreign substance (GFP-expressing cells) could be easily injected into the desired injection target region of the organ excised from the animal body.
  • it can be said that it is possible to provide a transplant material into which a foreign substance is injected, in which damage is reduced by injecting the foreign substance at the shortest distance from the surface immediately above and near the injection target region.
  • Example 2 Metanephros excised from pig fetuses obtained by caesarean section from DPF-controlled wild-type sows were put into the above-mentioned gelatin solution, and the whole metanephros were coated with gelatin gel. The metanephros completely covered with the gelatin gel were immersed in 4.5 ml of an equilibrium solution containing 7.5% by weight EG and 7.5% by weight DMSO as cryoprotectants at room temperature (25 to 27°C) for 25 minutes. processed.
  • the metanephros after the pretreatment were immersed in a vitrification solution containing 15% by mass EG, 15% by mass DMSO, and 0.5M sucrose, which is twice the amount of the above, for 30 minutes at room temperature.
  • the metanephros were placed on a support "Cryotop" (manufactured by Kitasato Biopharma), placed in liquid nitrogen, cooled very rapidly, and vitrified and frozen.
  • the metanephros after vitrification freezing were transferred to a vitrified cryopreservation container, frozen in liquid nitrogen for 10 days, and then thawed by immersion in a 37° C. thawing solution containing 1M sucrose for 1 minute.
  • the plate was washed twice with a diluent containing 0.5 M sucrose for 3 minutes at room temperature and twice with a washing solution for 5 minutes to dilute and remove the cryoprotectant.
  • the capillaries into which GFP-expressing human mesenchymal stem cells were aspirated at one or two points on the surface directly above or near the subcapsular renal cortical formation area of the fully covered metanephros were inserted into the renal cortical formation area.
  • the human mesenchymal stem cells were injected into the renal cortical formation region as foreign substances.
  • the capillaries are widely spread to the mesenchymal region with the shortest distance.
  • the human mesenchymal stem cells were injected into a wide range of the mesenchymal region by moving the tip of the capillary tube.
  • Example 3 Metanephros excised from 35-day-old fetal pigs obtained by caesarean section from DPF-controlled wild-type sows were put into the gelatin solution, and in the same manner as in Example 1, the nephrogenic zone was formed.
  • the metanephros are semi-embedded in the gelatin gel so that the surfaces immediately above and near the metanephros are exposed (i.e., there is a portion of the metanephros that is not in contact with the gel, while the metanephros is in contact with the gel. The part where it is embedded).
  • the metanephroi semi-embedded in the gelatin gel was placed on a 35 mm dish (manufactured by Iwaki) so that the surface immediately above and near the renal cortical formation area was exposed (the dish positioned so that it faces the upper side opposite to the 0.1 ⁇ L of the edible green dye solution was aspirated to one point on the surface of the semi-embedded metanephroid subcapsular renal corticogenesis area directly above or near the renal corticogenesis area. 0.1 ⁇ L of the edible green dye solution was injected as a foreign substance into the renal cortex formation region.
  • Example 4 The present inventors have previously demonstrated that embryos (host embryos) derived from pigs that have the Pdx1-Hes1 gene and in which pancreatic formation is inhibited (deficiency of ⁇ cells in the pancreas) were transformed into embryonic cells derived from normal pigs (donor embryonic cells). ) and allowed to grow in foster mothers to create chimeric pigs with donor-derived pancreases (Matsunari et al., PNAS 110:4557-4562 (2013)). By naturally mating male chimeric pigs with wild-type female pigs, it is possible to obtain neonates in which pancreatic formation is inhibited ( ⁇ cells are deficient in the pancreas) at a constant rate.
  • Newborn pigs with inhibited pancreas formation ( ⁇ -cell deficiency in the pancreas) used in Example 4 were obtained by natural mating with such chimeric pigs (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-62929).
  • FIG. 8 is a diagram showing pancreatic tissue after laparotomy of the above-mentioned neonatal swine in which pancreatic formation was inhibited ( ⁇ cells are absent in the pancreas).
  • the scale bar is 1 cm.
  • a plurality of fragmentary pancreatic tissues are formed.
  • the pancreatic tissue is very small, it is difficult to inject a foreign substance through a capillary tube while attached to the pig body.
  • pancreatic tissue fragments (arrowheads) were cut out, semi-embedded in gelatin gel in the same manner as in Example 1, and positioned on a 35 mm dish (manufactured by Iwaki).
  • Each of the plurality of semi-embedded pancreatic tissues was punctured with a capillary tube into which human iPS cell-derived pancreatic progenitor cells were aspirated, and the human iPS cell-derived pancreatic progenitor cells were injected as a foreign substance.
  • FIG. 9 is a diagram showing a human iPS cell-derived pancreatic progenitor cell mass injected into one of the plurality of pancreatic tissue fragments shown in FIG.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 9a is a diagram showing the positions of cell nuclei in the entire tissue and the results of fluorescent immunostaining of amylase by DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) staining.
  • DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
  • FIG. 9b shows the results of fluorescence immunostaining of a PDX1-expressing green fluorescence-labeled secondary antibody.
  • FIG. 9c is a figure which shows the result of fluorescent immunostaining of human cell nuclei expressing HNA (human nuclear antigen).
  • HNA human nuclear antigen
  • FIG. 9e is a diagram showing the confirmation results of pancreatic cell structure and pancreatic tissue structure by HE (hematoxylin and eosin) staining.
  • HE hematoxylin and eosin

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Abstract

動物体躯から摘出した臓器に対して外来物を簡易に注入することができる移植材料の製造方法を提供すること。また、外来物が注入されているにもかかわらず、損傷が低減された移植材料を提供すること。　動物体躯から摘出した臓器の少なくとも一部を可塑性部材に接触させて位置決めする工程、及び、前記位置決め後の前記臓器中に外来物を注入する工程を含む、前記外来物が注入された臓器を含む移植材料の製造方法。

Description

移植材料の製造方法、及び移植材料
　本発明は、再生医療等製品として好適な、外来物が注入された臓器を含む移植材料の製造方法、及び移植材料に関する。特に、外来物が注入された臓器を含む異種移植材料の製造方法、及び異種移植材料に関する。
　臓器再生は様々な臓器において活発に発展を遂げている。例えば、複雑で臓器再生困難と考えられてきた腎臓については、発生段階にある動物の腎発生領域にヒト間葉系幹細胞等の外来物を注入し、異種の発生プログラムを借りた「胎生臓器補完法」が開発されつつある（例えば、非特許文献１参照）。
　上記胎生臓器補完法に関し、例えば、動物体躯（胎仔体躯等）の臓器（後腎等）に外来物（例えば、ヒト間葉系幹細胞）を注入する場合、後腎等の臓器を胎仔体内から摘出した状態では、ガラス毛細管等の針状部材の穿刺が困難である。そこで、動物体躯（胎仔体躯等）をある程度切り開いて解体した状態で、動物体躯（胎仔体躯等）に付いた状態の臓器（後腎等）に上記針状部材を穿刺して外来物を注入することが行われている（例えば、非特許文献２参照）。また、上記臓器が後腎である場合、上記後腎が動物体躯（胎仔体躯等）に付着した状態であれば、腎皮質形成領域の位置の特定が容易であることも、その方法が採られている一因である。
横尾隆ら、「医学のあゆみ」 Volume 279, Issue 7, 715 - 719 (2021) M Yamanaka et al., Nature Communications, 2017; p.12, Injection of NPCs into nephrogenic zone
　しかし、上記方法では下記の問題があった。
　１）胎仔体躯等の動物体躯に付いた状態でしか注入作業が行えないために、注入作業の場所及び時間の制約が大きい。
　２）胎仔体躯等の動物体躯から摘出した後腎等の臓器は、極小さな（長径２ｍｍｘ短径１ｍｍ程度）、かつ柔軟な臓器のため、臓器を損傷しないようにソフトに把持しながら針状部材を穿刺することが困難である。
　３）後腎等の臓器中の注入標的領域が動物体躯（胎仔体躯等）を切り開いて露出していない側に存在する場合には、上記臓器の露出面側から毛細管等の針状部材を穿刺して上記注入標的領域まで貫通させて外来物を注入せざるを得ない。これにより、注入経路における損傷が移植材料に大きく残存してしまう。
　本発明は、以上のような従来技術の問題に鑑みてなされたものであり、動物体躯から摘出した臓器に対して外来物を簡易に注入することができる移植材料の製造方法を提供することを第１の目的とする。
　また、本発明は、外来物が注入されているにもかかわらず、損傷が低減された移植材料を提供することを第２の目的とする。
　本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、動物体躯から摘出した臓器の少なくとも一部を可塑性部材に接触させて位置決めすることにより、外来物を臓器の所望の箇所に最短経路で、煩雑な作業を要することなく簡便に注入することができることを見出した。本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
　すなわち本発明は以下の通りである。
　＜１＞動物体躯から摘出した臓器の少なくとも一部を可塑性部材に接触させて位置決めする工程、及び
　前記位置決め後の前記臓器中に外来物を注入する工程を含む、前記外来物が注入された臓器を含む移植材料の製造方法。
　＜２＞前記臓器中の注入標的領域の直上又は近傍の表面から前記注入を行う、＜１＞に記載の方法。
　＜３＞前記動物体躯が胎仔体躯である、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
　＜４＞前記臓器が異種移植用臓器である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜５＞前記臓器が前記摘出後、ガラス化凍結を経た臓器である、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜６＞前記可塑性部材が、前記ガラス化凍結時に臓器を被覆した可塑性部材である、＜５＞に記載の方法。
　＜７＞前記臓器の少なくとも一部が前記可塑性材料に埋もれている、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜８＞前記可塑性部材がゲルである、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜９＞前記注入には針状部材を用いる、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜１０＞前記針状部材が通過する経路が、液体が難浸透性な緻密な構造を有する＜９＞に記載の方法。
　＜１１＞前記外来物が、前記動物体躯の動物以外に由来する細胞である、＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜１２＞前記臓器が腎臓であり、前記注入標的領域が後腎の腎皮質形成領域である、＜１＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の方法。
　＜１３＞動物から摘出された臓器と、前記臓器内に注入された外来物と、を含み、前記臓器には、外来物が注入された領域の直上又は近傍に注入痕が形成されている移植材料。
　＜１４＞前記外来物が、前記臓器以外に由来する細胞である、＜１３＞に記載の材料。
　本発明によれば、動物体躯から摘出した臓器に対して外来物を簡易に注入することができる移植材料の製造方法を提供することができる。
　また、本発明によれば、外来物が注入されているにもかかわらず、損傷が低減された移植材料を提供することができる。
　また、本発明によれば、注入作業の場所及び時間の制約を低減することができる。
本発明の好ましい１つの実施形態を示す概略図である。 図２は、ゼラチンゲルへの半包埋により位置決めされた後腎の顕微鏡写真を示す図である。 腎被膜下の腎皮質形成領域の１か所へ外来物（ＧＦＰ発現細胞）を注入した結果を示す顕微鏡写真を示す図である。 腎被膜下の腎皮質形成領域の２か所へ外来物（ＧＦＰ発現細胞）を注入した結果を示す顕微鏡写真を示す図である。 後腎間葉領域へ広範に外来物（ＧＦＰ発現細胞）を注入した結果を示す顕微鏡写真を示す図である。 実施例３の注入結果を示す顕微鏡写真を示す図である。 比較例１の注入結果を示す顕微鏡写真を示す図である。 実施例４におけるＰｄｘ１－Ｈｅｓ１遺伝子の発現によってβ細胞を欠損するブタの膵臓組織を示す図である。 図８に示した複数の膵組織断片のうちの１個に注入されたヒトｉＰＳ細胞由来膵前駆細胞塊の様子を示す図である。
　以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
≪外来物が注入された臓器を含む移植材料の製造方法≫
　本発明の第１の態様は、動物体躯から摘出した臓器の少なくとも一部を可塑性部材に接触させて位置決めする工程、及び
　上記位置決め後の前記臓器中に外来物を注入する工程を含む、前記外来物が注入された臓器を含む移植材料の製造方法である。
　第１の態様は、動物体躯から摘出した臓器の少なくとも一部を可塑性部材に接触させて位置決めすることにより、動物体躯から摘出した臓器に対して外来物を煩雑な作業を要することなく簡易に注入することができる。
　図１を参照して好ましい１つの実施形態を説明する。
　動物体躯から摘出した臓器１の少なくとも一部を可塑性部材２に接触（好ましくは、包埋）させて位置決めすることにより、上記臓器１の注入標的領域３に任意の手段により外来物を簡易に（好ましくは、精度よく）注入することができる。可塑性部材２は基板４に接触（設置、固定など）させることが好ましい。
　上記動物体躯を提供する動物としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、霊長類（例えば、ヒト、類人猿（チンパンジー、サル等））、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）等の任意の哺乳類が挙げられる。上記動物としては、げっ歯類よりも体格等の特徴がヒトに近い哺乳類が好ましく、ブタ、ヒツジ、ヤギ、霊長類（例えば、ヒト、類人猿）がより好ましく、ブタ（すなわち、上記臓器が、ブタ由来の臓器）が更に好ましい。
　上記動物体躯としては、胎仔体躯、幼体体躯、成体体躯のいずれであってもよいが、免疫原性が低い観点から、上記動物体躯が胎仔体躯であることが好ましい。特に、上記臓器が異種移植用臓器である場合には、胎仔体躯であることが好ましい。
　上記臓器は、移植用臓器が好ましく、異種移植用臓器がより好ましい。
　上記臓器として具体的には、内臓（例えば、膵臓、腎臓、尿管、膀胱、肝臓、心臓、胃、腸等）、生殖器（例えば、卵巣、精巣）、受精卵、胚、胎仔、骨髄（例えば、造血器官）、脳、眼、鼻、口、皮膚、神経、若しくは、それらに由来する組織、又は人工組織（軟骨細胞シート等の細胞シート、オルガノイド等）が挙げられる。上記臓器としては、内臓、生殖器、受精卵、胚、胎仔が好ましく、内臓、生殖器がより好ましく、膵臓（例えば、膵島）、腎臓（例えば、後腎、特に、後腎、尿管及び膀胱を含む泌尿器）がさらに好ましい。
　上記臓器は遺伝子改変された臓器（組み換え臓器又はゲノム編集臓器）であってもなくてもよい。
　遺伝子改変された臓器の調製は、例えば、（１）遺伝子改変された動物細胞の調製、及び、（２）上記調製された当該細胞から体細胞クローン技術により当該臓器を調製することが挙げられる。
　上記（１）遺伝子改変された動物細胞の調製としては、所望のトランス遺伝子又はゲノム編集ツールを含むベクターを動物受精卵に注入する方法及び動物精子を含む液と卵（好ましくは卵子、より好ましくは成熟卵子）との顕微授精（卵細胞質内精子注入；ＩＣＳＩともいう。）による、顕微授精を介した遺伝子導入（ICSI mediated gene transfer method）が挙げられる。
　また、当該細胞の調製は、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓヌクレアーゼ等の遺伝子編集技術による所望のトランス遺伝子の導入であってもなくてもよい。
　上記（２）調製された遺伝子改変された動物細胞から体細胞クローン技術による遺伝子改変された臓器の上記調製に関し、体細胞クローン技術は、クローンを作製したい動物の細胞（好ましくは遺伝子改変動物細胞）を培養してドナー細胞とし、このドナー細胞をレシピエント除核卵子（卵母細胞）に細胞融合等の融合法等により核移植したのち、培養後、仮親に移植及び受胎させクローンを作製する技術をいう。
　上記体細胞クローン技術により、遺伝子改変された動物をクローニングすることができ、当該動物から目的の臓器を摘出することにより遺伝子改変された臓器を調製することができる。
　上記臓器は二次臓器であってもなくてもよい。
　ここで「二次臓器」とは、形成が阻害された臓器（例えば膵臓）が本来形成される体内の部位に、動物を育成し成長させることによって形成された臓器様の組織をいう（特開２０１９－６２９２９号公報）。
　上記二次臓器は、上記遺伝子改変された臓器であってもなくてもよい。つまり、臓器形成の上記阻害を、臓器を有する動物の遺伝子を改変する遺伝子改変により行うことができる。例えば、膵臓の形成を阻害する場合は、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターにＨｅｓ１遺伝子を連結したＰｄｘ１－Ｈｅｓ１遺伝子を用いる、すなわちＰｄｘ１プロモーター制御下でＨｅｓ１遺伝子を過剰発現させて行うことができる（Ｍａｔｓｕｎａｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ　１１０：４５５７－４５６２（２０１３）；特開２０１９－６２９２９号公報）。
　また、薬剤の投与によって、臓器形成を阻害して上記二次臓器を形成してもよい。
　腎臓の形成を阻害する場合は、Ｓｉｘ２－Ｎｏｔｃｈ２遺伝子を過剰発現させる遺伝子改変（Ｆｕｊｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｎｅｐｈｒｏｌ，２１：８０３－８１０，２０１０）、Ｓａｌｌ１、Ｐａｘ２等腎臓発生を制御する遺伝子の発現阻害又は抑制することによって行うことができる。
　上記二次臓器は、本来の臓器としての機能を１００％有していてもよく、一部しか有していなくてもよい。好ましい二次臓器としては、特定の機能細胞を欠損する二次臓器を挙げることができる。
　ここで、「機能細胞」とは、臓器中に含まれる細胞で何らかの機能を持つ細胞を意味する。例えば、膵臓におけるα細胞、β細胞、γ細胞などが挙げられ、腎臓におけるネフロン前駆細胞、後腎間葉細胞、尿管芽細胞等が挙げられる。
　好ましい機能細胞としては、膵臓におけるβ細胞が挙げられ、腎臓におけるネフロン前駆細胞が挙げられる。
　特定の機能細胞を欠損する好ましい臓器としては、β細胞を欠損する膵臓、ネフロン前駆細胞を欠損する腎臓、後腎間葉細胞を欠損する腎臓等が挙げられる。
　上記臓器が腎臓（例えば、後腎、特に、後腎、尿管及び膀胱を含む泌尿器）である場合、尿管の先端に後腎（腎臓原基）が形成された後の腎臓が好ましく、後にネフロン形成の主要素となる尿管芽の伸長期に相当する腎臓（例えば、後腎、特に、後腎、尿管及び膀胱を含む泌尿器）がより好ましい。
　より具体的には、上記伸長期に相当する胎齢２５日～４５日の腎臓（例えば、後腎、特に、後腎、尿管及び膀胱を含む泌尿器）が好ましく、胎齢３０日～４０日の腎臓（例えば、後腎、特に、後腎、尿管及び膀胱を含む泌尿器）がより好ましい。
　上記臓器の少なくとも一部を上記可塑性部材に接触させる態様としては、上記臓器を上記可塑性部材上に置くこと、上記臓器の少なくとも一部を上記可塑性粘着部材の下、横又は上に滑らない程度に包埋等により密着させること等が挙げられる。上記いずれの態様においても、上記臓器の少なくとも一部が上記可塑性部材に埋もれていることが好ましい。上記臓器の一部が上記可塑性部材に埋もれて、上記臓器の一部が露出していてもよく、上記臓器が上記可塑性部材に完全に埋もれていてもよい（上記可塑性部材により完全に被覆されていてもよい。）。
　また、上記臓器の少なくとも一部を上記可塑性部材に接触させる態様に関し、上記可塑性部材が後述するゲルである場合、ゾル（上記ゲルのゲル化前のゾル）を含む液（好ましくはヒドロゾル）中に、上記臓器を浸漬した後にゲル化すること、上記臓器に上記ゾルを含む液を塗布した後にゲル化すること等であってもなくてもよい。
　上記ゾルのゲル化は、例えば、カルシウムイオン、バリウムイオン等の多価金属イオンの添加、冷却等の任意の方法により行い得る。
　ここで「位置決め」とは、滑り等による上記臓器の動きを抑制して上記可塑性部材に対する上記臓器の位置関係を保つことをいう。
　上記可塑性部材としては、滑り等による上記臓器の動きを抑制できる程度に上記臓器に密着し得る可塑性（変形性ないし柔軟性）を有し、本発明の目的を達成し得る限り特に制限はなく、任意の可塑性材料を含む部材が挙げられる。上記臓器の動きを抑制できる程度の摩擦係数を有する可塑性材料を含む部材が好ましく、例えば、可塑性粘着材料等を含む部材であってもなくてもよい。
　上記可塑性材料を除去しきれずに僅少量残存しても実害がないこと、及び、上記可塑性材料を除去せずに被覆されたまま移植に供し得る観点から、薬理学的に許容される任意の可塑性材料（薬学上許容される非毒性の可塑性材料）を含む部材が好ましい。
　なかでも、上記臓器の動きを抑制できる程度に上記臓器を密着し得る可塑性（変形性ないし柔軟性）を有し、かつ水素結合、分子間力等による適度な摩擦係数を有する観点から、ゲルが好ましく、薬理学的に許容される任意のゲル（薬学上許容される非毒性のゲル）がより好ましく、ハイドロゲルが更に好ましい。
　また、上記ゲルは、ゾル－ゲルの相転移の制御しやすさの観点から、イオン架橋によりゾル－ゲルの相転移が起こるゲル、又は、温度（例えば、５～４０℃の相転移温度、好ましくは５～１０℃、１０～１５℃、１５～２０℃、２０～２５℃、２５℃～３０℃、３０℃～３５℃又は３５℃～４０℃の相転移温度）によりゾル－ゲルの相転移が起こる温度感受性ゲルが好ましい。
　上記イオン架橋によりゾル－ゲルの相転移が起こるゲルは、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）等のキレート剤によるキレート処理により、上記イオン架橋を分解しゾル化し得る。
　上記ハイドロゲルとしては、アルギン酸ないしその塩（例えば、アルギン酸カルシウム、アルギン酸バリウム等の多価金属塩、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム等の一価金属塩が挙げられる。より確実にゲル化を達成する観点から、アルギン酸カルシウム、アルギン酸バリウムの多価金属塩が好ましい。）、ゼラチン、カラギーナン、寒天（アガロースゲル）、ペクチン、キトサン、シリコーンハイドロゲル、コンニャク、その他の多糖類等が挙げられ、中でも、上記イオン架橋によりゾル－ゲルの相転移が起こるハイドロゲル、又は、温度によりゾル－ゲルの相転移が起こる温度感受性ハイドロゲルが好ましい。上記イオン架橋によりゾル－ゲルの相転移が起こるハイドロゲルとしてはアルギン酸ないしその塩（好ましくは多価金属塩）が挙げられる。温度によりゾル－ゲルの相転移が起こる温度感受性ハイドロゲルとしては、ゼラチン、カラギーナン、寒天（アガロースゲル）、ペクチン等が挙げられる。比較的に低い温度（例えば、３５℃以下）でゾル化することができ、上記臓器等へのダメージが低いことからゼラチンが好ましい。
　例えば、５～２５％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液を使用することができる。７～２０％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液が好ましく、１０～１５％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液がより好ましい。
　上記可塑性部材の大きさとしては、上記臓器の大きさに応じて当業者が適宜設定し得るが、例えば、上記臓器の断面を楕円とみなしたときに、上記臓器の長軸及び短軸それぞれに対し０．２５倍～３倍の長辺及び短辺とするシート状部材とすることができる。上記臓器の長軸及び短軸それぞれに対し０．３５倍～２倍の長辺及び短辺とするシート状部材が好ましく、上記臓器の長軸及び短軸それぞれに対し０．５倍～１．５倍の長辺及び短辺とするシート状部材がより好ましい。より具体的には、長辺１０～２００ｍｍ、短辺５～１００ｍｍとするシート状部材が挙げられる。厚みとしては、例えば、０．１ｍｍ～５ｍｍ（好ましくは０．５ｍｍ～２ｍｍ）とすることができる。
　外来物を注入する方法としては、上記臓器に外来物を注入することができる限り特に制限はないが、針状部材を上記臓器表面に穿刺して孔を形成して上記孔から上記外来物を任意の方法により注入する方法等が挙げられる。中空の針状部材を上記臓器表面に穿刺して上記外来物を任意の方法（例えば、毛細管現象、注射）により注入する方法が好ましい。
　上記孔の孔径（例えば、平均直径）としては特に制限はなく、例えば、０．０５ｍｍ～３ｍｍが挙げられ、０．１ｍｍ～２ｍｍが好ましく、０．５ｍｍ～１．５ｍｍがより好ましい。
　上記針状部材としては、先端が鋭利な毛細管が挙げられる。
　外来物を注入する作業はフリーハンド（例えば、熟練者による顕微鏡下でのフリーハンド）で行っても行わなくてもよいが、より正確に実施する観点から、マイクロマニピュレーターを使用して実施することが好ましい。
　ここで、上記外来物は、上記臓器以外に由来する物質を意味し、上記外来物としては、レシピエント（移植先個体）と同じ動物種に由来する物質、ドナー（移植元個体）と同じ動物種だがドナーとは異なる個体に由来する物質、レシピエント及びドナーのいずれとも異なる動物種に由来する物質、薬物（例えば、医薬品）等が挙げられる。動物種に由来する物質としては、免疫原性が低い観点から、レシピエントと同じ動物種に由来する物質が好ましい。物質としては、例えば、細胞、成長因子、ホルモン、サイトカイン等が挙げられ、中でも細胞が好ましい。上記細胞は人工的な細胞（例えば、遺伝子組み換え細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）であってもなくてもよい。
　例えば、ブタ臓器をヒトに移植する異種移植である場合、上記「レシピエントと同じ動物種に由来する細胞」は「ヒトに由来する細胞」が挙げられる。
　上記臓器中の注入標的領域の直上又は近傍の表面から上記注入を行うことが好ましい。
　ここで、上記「近傍の表面」とは、上記臓器の中心に対して上記注入標的領域と同じ側に存在する上記臓器の表面をいう。上記中心と、上記注入標的領域中の任意の１点とを結ぶ延長線上の点を含む上記臓器の表面が好ましい。
　また、上記「直上の表面」とは、上記臓器の表面のうち、上記注入標的領域に最も近い表面をいう。上記「近傍の表面」は上記「直上の表面」を含む表面の領域であることが好ましい。
　上記注入標的領域としては、上記臓器中の任意の領域が挙げられる。例えば、上記臓器が腎臓である場合、上記注入標的領域としては、後腎の腎皮質形成領域（nephrogenic zone）、後腎間葉領域等が挙げられる。
　基板４として特に制限はないが、プレート（プラスチック製、金属製等）、ウェル、ガラス基板、皿（例えば、ディッシュ）等が挙げられる。
　上記臓器に形成された注入痕の少なくとも一部を上記可塑性部材により被覆していても、被覆していなくてもよい。「注入痕」については、後で詳述する。
　上記臓器は上記摘出後、ガラス化凍結を経た臓器であってもなくてもよい。本発明によれば、動物体躯からの臓器摘出と外来物注入との場所及び／又は時間を独立させることができることから、ガラス化凍結により品質を維持したまま搬送及び／又は保管された臓器を好ましく使用することができる。
　ガラス化凍結を経た臓器としては、ガラス化凍結保存（例えば、長期間保存）されていた臓器等が挙げられる。
　上記ガラス化凍結時に上記臓器を可塑性部材で被覆してもよい。
　この場合、上記ガラス化凍結時に臓器を被覆する上記可塑性部材は、第１の態様における上記可塑性部材（位置決め治具として機能する部材）と同一でも異なってもよい。上記ガラス化凍結時に臓器を被覆する可塑性部材をそのまま、第１の態様における上記可塑性部材（位置決め治具として機能する部材）として使用することが、工程簡素化の観点では好ましい。
　上述のように、従来は、動物体躯（胎仔体躯等）をある程度切り開いて解体した状態で、動物体躯（胎仔体躯等）に付いた状態の臓器（後腎等）に上記針状部材を穿刺して外来物を注入することが行われている（例えば、非特許文献２参照）。
　その結果、上記従来法では、腎動脈、腎静脈、尿管などの重要な脈管、腎盂などの空隙の多い腎門方向から腎実質を貫通して（上記針状部材を穿刺して）上記外来物を注入しなければならなかった。その結果、腎門は上記脈管、空隙が多いことから注入後の上記外来物が漏出するという問題があった。
　加えて、腎門は、腎臓の発生に伴い腎動脈、腎静脈、尿管などの重要な脈管が集合する重要な組織であることから、後腎への上記外来物注入の際に腎門部を損傷することは極力避けなくてはならないにもかかわらず、従来の上記腎門方向からの外来物注入法は、腎組織に対する侵襲性が大きいという問題もあった。
　本発明において、上述の通り、上記臓器に形成された注入痕の少なくとも一部を上記可塑性部材により被覆しても、被覆しなくてもよい。上記のように被覆しなくても、本発明によれば、上記腎門方向等の上記脈管、空隙が多い方向からの外来物注入を回避することができることから、注入痕の被覆有無にかかわらず、上記ガラス化凍結における上記外来物の漏出を抑制することができる。また、本発明によれば、腎門部への損傷を回避することができることから、従来法よりも侵襲性が低い。
　本発明において、特に、上記注入が、上記針状部材により行われる場合、上記臓器内を上記針状部材が通過する経路（後述する連通孔が形成される経路）が、緻密な構造を有する場合、上記外来物の漏出を抑制することができる。上記経路が、組織若しくは細胞によりある程度埋め戻される等の理由からである。
　緻密な上記構造としては、臓器の管腔部（例えば、管腔臓器）、門部等よりも、管、空隙等が少ない若しくは管、空隙等がない構造（例えば、臓器の実質部（実質臓器、固形臓器等）が有する構造）が挙げられる。臓器の管腔部（例えば、管腔臓器）、門部等よりも、液体（好ましくは、上記外来物を含む液体）が難浸透性な緻密な構造が好ましく、組織（例えば、結合組織）若しくは細胞（例えば、間葉細胞）が緻密に充実した構造がより好ましい。上記臓器が後腎である場合、後腎間葉領域、腎皮質形成領域、Cap mesenchyme等の後腎間葉細胞が充実した構造を有することが好ましい。
　ここで、ガラス化凍結とは、上記臓器を液体窒素（沸点－１９６℃）、液体ヘリウム（沸点－２６９℃）、液体エタン（沸点－１７５℃）等のガラス化凍結用冷媒に接触させて水の結晶化（氷晶形成）を抑制して非晶質のガラス状態で凍結（好ましくは、いわゆる急速冷却による凍結、より好ましくは、いわゆる超急速冷却による凍結）することをいう。
　ガラス化凍結によれば、水の結晶化に伴う体積膨張を抑制し得るため、細胞膜が破れる等のダメージ（凍害）を抑制し得る。
　ガラス化凍結用冷媒との上記接触の方法としては特に制限はないが、液体の浸漬又は適用（フラッシュ）、蒸気の吹きかけ等が挙げられる。
　上記ガラス化凍結用冷媒と接触は、複数の上記臓器を同時に支持できるガラス化凍結用支持具、クライオトップ、ストロー（例えば、移植用ストロー、先端が鋭利なストロー等）、キャピラリーピペット等のガラス化凍結用支持具を用いて行われても、用いて行われなくてもよいが、上記支持具を用いて行われることが好ましい。
　上記支持具としては、複数の上記臓器を一度に一体として凍結し、移植材料の製造効率を高めることができる観点から、複数の上記臓器を同時に支持できる上記ガラス化凍結用支持具がより好ましい。
　複数の上記臓器を同時に支持できる上記ガラス化凍結用支持具として、例えば、ガラス板、金属板、プラスチック板等の上に複数のくぼみを有し、当該くぼみに、複数の上記臓器を同時に支持できるチップないしプレート、
　メッシュ状の網、不織布等に複数の上記臓器を同時に支持できる支持具等が挙げられる。
　また、市販の支持具としては、ＣＲＹＯＴＯＰ（登録商標；北里バイオファルマ製）等が挙げられる。
　上記ガラス化凍結の前に、上記臓器を任意のガラス化液に接触（浸漬、塗布等）させることが好ましい。
　上記ガラス化液としては特に制限はないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、プロパンジオール、グリセリン等の細胞浸透性凍害保護剤、及び、ショ糖（スクロース）、トレハロース、ソルビトール、デキストラン等の糖類、カルボキシル化ポリリジン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、不凍蛋白等の細胞非浸透性凍害保護剤を含有する溶液（好ましくは水溶液）が挙げられる。
　上記ガラス化液に接触させる前に、上記臓器を任意の平衡液に接触（浸漬、塗布等）させる前処理を行っても行わなくてもよい。
　上記凍結工程の後に、上記ガラス化凍結後（好ましくは、ガラス化凍結保存後）の上記臓器を任意の融解液に接触（浸漬、塗布等）させてもさせなくてもよい。
　上記融解液に接触させた後、任意の希釈液に接触（浸漬、塗布等）させてもさせなくてもよい。
　上記好ましい１つの実施形態において、上記浸透圧勾配による上記外来物の漏出を抑制する観点から、被覆工程の後に、上記臓器をガラス化液に接触させる工程を更に含むことが好ましい。
　以上処理後の臓器は、移植（好ましくは異種移植）前に上記基礎培地ないし基礎媒液で培養してもしなくてもよい。
　例えば、上記臓器を再生医療等製品として使用する場合、上記臓器に上記外来物（例えば、レシピエントと同じ動物種に由来する細胞）を注入した後に、ガラス化凍結して保存することが要求される場合があり得る。
　一方、後述する注入痕が存在すると、上記ガラス化凍結処理時に、上記臓器内部と、外部の溶液（例えば、上記ガラス化処理液、平衡液等）との浸透圧勾配により、上記外来物が上記臓器から漏出してしまうという従来技術の問題があった。
　また、ガラス化凍結用冷媒ないしガラス化処理液は、繰り返し使用したり、複数の試料に対して同時に併用することにより、汚染（例えば細胞汚染）のリスクを招き得る。
　そこで、上記外来物漏出低減、及び、上記汚染リスク低減の観点から、上記ガラス化凍結時に上記臓器を可塑性部材で被覆してもよいし、被覆しなくてもよい。
　上記ガラス化凍結時に上記臓器を被覆するために、第１の態様における上記可塑性部材（位置決め治具として使用した部材）をそのまま使用してもよい。
　注入痕の被覆有無にかかわらず、本発明によれば、上記腎門方向等の上記脈管、空隙が多い方向からの外来物注入を回避することができることから、上記ガラス化凍結における上記外来物の漏出を抑制することができる。
　本発明において、特に、上記注入が、上記針状部材により行われる場合、上記臓器内を上記針状部材が通過する経路（後述する連通孔が形成される経路）が、液が難浸透性な緻密な構造を有する場合、上記外来物の漏出を抑制することができる。
　また、上記問題に鑑み、上記臓器が、内部に注入された外来物と、注入痕とを有し、上記可塑性部材が上記注入痕の少なくとも一部を被覆していることも好ましい１つの実施形態として挙げられる。
　ここで、「注入痕」とは、上記臓器内部に上記外来物を人工的に注入するために形成された孔を意味し、上記臓器の表面の孔のみならず、上記臓器内部の注入標的領域まで至る連通孔を意味する。上記「注入痕」は、例えば、針状部材等により形成され得る。
　上記好ましい１つの実施形態によれば、上記表面の上記孔と、上記連通孔とからなる注入痕のうちの少なくとも一部、及び、上記表面の上記孔が上記ゲルにより被覆され得る。
　これにより、上記臓器内部と、外部の溶液（例えば、上記ガラス化液、上記平衡液等）との浸透圧勾配による、上記外来物の漏出を抑制することができる。
　前記凍結工程の後に、上記臓器の表面を被覆した上記可塑性部材を除去する除去工程を含んでいてもいなくてもよい。上記除去後の臓器を移植ドナーとして移植に使用し得る観点から、上記除去工程を含んでいることが好ましい。
　上記被覆した可塑性部材がゲルである場合、上記可塑性部材を、ゾル化温度への加熱、上記キレート処理等の任意のゾル化、又は、物理的圧力等により上記ゲルを除去することができる。
　更に、任意の水溶液ないしはリン酸緩衝液、（流水）等の任意の洗浄液によって洗浄してもしなくてもよい。
　上記除去工程は、複数回（例えば、段階的に）行っても行わなくてもよい。
≪移植材料≫
　本発明の第２の態様は、動物から摘出された臓器と、前記臓器内に注入された外来物と、を含み、前記臓器には、外来物が注入された領域の直上又は近傍に注入痕が形成されている移植材料である。
　上記臓器の具体例及び好ましい例としては上述の通りである。
　上記臓器が、内部に注入された外来物と、注入痕とを有し、上記ゲルが上記注入痕の少なくとも一部を被覆していることが好ましく、上記ゲルが上記注入痕の全てを被覆していることがより好ましく、上記ゲルが上記臓器の表面全てを被覆していることが更に好ましい。
　上記外来物の具体例及び好ましい例としては上述の通りである。
　上記注入痕については上述の通りである。
　以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
（材料）
　緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、緑色蛍光を発するＧＦＰ発現ヒト間葉系幹細胞を吸引した先端を鋭く研磨した毛細管を用意した。
　一方、ゼラチン粉末（富士フィルム和光純薬製）をｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝ＴＣＭ１９９培地に溶解し、濃度が１０～１５％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液を調製した。
＜実施例１＞
　ＤＰＦ管理された野生型母豚から帝王切開により得たブタ胎仔から摘出した後腎を上記ゼラチン溶液に後腎を投入して、腎皮質形成領域（nephrogenic zone）の直上及び近傍の表面が露出するように上記後腎を上記ゼラチンゲルに半包埋（すなわち、後腎の上記ゲルに接触していない部分が存在する一方、後腎の上記ゲルに接触している部分が包埋）した。
（位置決め工程）
　図２は、ゼラチンゲルへの半包埋により位置決めされた後腎の顕微鏡写真を示す図である。
　図２に示したように、上記ゼラチンゲルに半包埋されている後腎を３５ｍｍディッシュ（イワキ社製）上に置いて、腎皮質形成領域の直上及び近傍の表面が露出するように（上記ディッシュとは反対の上側を向くように）位置決めした。
（外来物注入工程）
　上記半包埋された後腎の被膜下の腎皮質形成領域の直上若しくは近傍の表面の１か所又は２か所にＧＦＰ発現ヒト間葉系幹細胞を吸引した上記毛細管を上記腎皮質形成領域へ最短の距離となるように穿刺し、外来物として上記ヒト間葉系幹細胞を上記腎皮質形成領域へ注入した。
　また、上記半包埋された後腎の間葉領域の直上及び近傍の表面が露出するように（上記ディッシュとは反対の上側を向くように）位置決め後、広範囲に上記毛細管を上記間葉領域へ最短の距離となるように穿刺し、上記毛細管の先端を動かすことにより上記間葉領域の広範囲に上記ヒト間葉系幹細胞を注入した。
（結果）
　結果を図３～５に示す。
　図３は、上記半包埋された後腎の被膜下の腎皮質形成領域の１か所にＧＦＰ発現細胞を注入した結果を示す顕微鏡写真を示す図である。
　図４は、上記半包埋された後腎の被膜下の腎皮質形成領域の２か所にＧＦＰ発現細胞を注入した結果を示す顕微鏡写真を示す図である。
　図５は、後腎間葉領域へ広範にＧＦＰ発現細胞を注入した結果を示す顕微鏡写真を示す図である。
　図３～５に示した結果から明らかなように、動物体躯から摘出した臓器の所望の注入標的領域へ簡易に、外来物（ＧＦＰ発現細胞）を注入できたことが分かる。
　また、注入標的領域の直上及び近傍の表面から最短の距離で外来物を注入したことにより損傷が低減された、外来物が注入されている移植材料を提供することができるといえる。
＜実施例２＞
　ＤＰＦ管理された野生型母豚から帝王切開により得たブタ胎仔から摘出した後腎を上記ゼラチン溶液に後腎を投入して上記後腎全体をゼラチンゲルにより被覆した。上記ゼラチンゲルで全被覆された後腎について、７．５質量％ＥＧ及び７．５質量％ＤＭＳＯを凍害保護剤として含む平衡液４．５ｍｌに室温（２５～２７℃）２５分間浸漬して前処理を行った。
　ついで、前処理後の後腎について、上記の２倍量である１５質量％ＥＧ及び１５質量％ＤＭＳＯと０．５Ｍショ糖とを含むガラス化液に室温３０分間浸漬した。
　そして、上記ガラス化液に浸漬後の後腎について、支持具「クライオトップ」（北里バイオファルマ製）に乗せて液体窒素に投入して超急速に冷却し、ガラス化凍結した。
　上記ガラス化凍結後の後腎をガラス化凍結保存容器に移し１０日間の液体窒素内凍結保存後、融解は、１Ｍショ糖を含む３７℃の融解液に１分間浸漬して行った。ついで、０．５Ｍショ糖含有希釈液に室温３分間、洗浄液にて５分間ずつ２回洗浄し、凍害保護剤を希釈及び除去した。
（位置決め工程）
　上記ガラス化凍結及び融解を経た上記ゼラチンゲルにより全被覆されている後腎を３５ｍｍディッシュ（イワキ社製）上に置いて、腎皮質形成領域の直上及び近傍の表面が上記ディッシュとは反対の上側を向くように位置決めした。
（外来物注入工程）
　上記全被覆された後腎の被膜下の腎皮質形成領域の直上若しくは近傍の表面の１か所又は２か所にＧＦＰ発現ヒト間葉系幹細胞を吸引した上記毛細管を上記腎皮質形成領域へ最短の距離となるように穿刺し、外来物として上記ヒト間葉系幹細胞を上記腎皮質形成領域へ注入した。
　また、上記全被覆された後腎の間葉領域の直上及び近傍の表面が上記ディッシュとは反対側である上を向くように位置決め後、広範囲に上記毛細管を上記間葉領域へ最短の距離となるように穿刺し、上記毛細管の先端を動かすことにより上記間葉領域の広範囲に上記ヒト間葉系幹細胞を注入した。
（結果）
　実施例１と同様に、後腎の被膜下の腎皮質形成領域の１か所又は２か所にＧＦＰ発現細胞を注入した結果を示す顕微鏡写真が得られた。
　また、実施例１と同様に、後腎間葉領域へ広範にＧＦＰ発現細胞を注入した結果を示す顕微鏡写真が得られた。
　以上の結果から、動物体躯から摘出した臓器の所望の注入標的領域へ簡易に、外来物（ＧＦＰ発現細胞）を注入できたことが分かる。
　また、注入標的領域の直上及び近傍の表面から最短の距離で外来物を注入したことにより損傷が低減された、外来物が注入されている移植材料を提供することができるといえる。
＜実施例３及び比較例１＞
　（実施例３）
　ＤＰＦ管理された野生型母豚から帝王切開により得た３５日齢ブタ胎仔から摘出した後腎を上記ゼラチン溶液に後腎を投入して、実施例１と同様に、腎皮質形成領域（nephrogenic zone）の直上及び近傍の表面が露出するように上記後腎を上記ゼラチンゲルに半包埋（すなわち、後腎の上記ゲルに接触していない部分が存在する一方、後腎の上記ゲルに接触している部分が包埋）した。
　実施例１と同様に、上記ゼラチンゲルに半包埋されている後腎を３５ｍｍディッシュ（イワキ社製）上に置いて、腎皮質形成領域の直上及び近傍の表面が露出するように（上記ディッシュとは反対の上側を向くように）位置決めした。
　上記半包埋された後腎の被膜下の腎皮質形成領域の直上若しくは近傍の表面の１か所に食用緑色色素溶液０．１μＬを吸引した毛細管を上記腎皮質形成領域へ最短の距離となるように穿刺し、外来物として上記食用緑色色素溶液０．１μＬを上記腎皮質形成領域へ注入した。
　上記色素注入後の注入痕を有する後腎（上記注入痕は上記ゲルで被覆されていない）を生理食塩水中に静置し、注入１０分後に実体顕微鏡下で色素の漏出を観察した。結果を図６に示す（ｎ数＝３）。
　（比較例１）
　ＤＰＦ管理された野生型母豚から帝王切開により得たブタ３５日齢胎仔を断頭により死亡させた。非特許文献２に記載のように、両後肢の関節部を脊髄に沿って尾側から切り開いた。同様に、他の側面（背面）も切り裂いて、椎骨を体外に取り出した。体内に一対の腎臓（metanephros）が見えるようになった後、胎児をマイクロピンセットで固定した。その後、食用緑色色素溶液０．１μＬを吸引した毛細管を腎門から腎皮膜方向に刺して腎被膜を破裂させないように注意深く注入した。
　上記注入後の腎臓（metanephros）は、尿管及び膀胱がつながったまま、マイクロピンセットを使って胎児から切り離した。
　上記色素注入後の注入痕を有する後腎（上記注入痕は上記ゲルで被覆されていない）を生理食塩水中に静置し、注入１０分後に実体顕微鏡下で色素の漏出を観察した。結果を図７に示す（ｎ数＝３）。
　（結果）
　図６に示した結果から明らかなように、本発明の方法で外来物の注入を行った実施例３の臓器では臓器内に緑色色素が留まり、外来物（緑色色素）の漏出は起こらなかった（ｎ数＝３）。後腎間葉細胞細胞等が、上記注入痕をある程度埋め戻したためと予想される。
　非特許文献２に記載の従来法で外来物の注入を行った比較例１の臓器では、図７Ａに示した結果から明らかなように、注入孔からの外来物（緑色色素）の漏出が生じていることが分かる（ｎ数＝３）。
　図７Ｂに示した結果から明らかなように、外来物（緑色色素）の尿管への漏出も生じていることが分かる（ｎ数＝３）。
＜実施例４＞
　本発明者らは、以前に、Ｐｄｘ１－Ｈｅｓ１遺伝子を有し、膵臓形成が阻害（膵臓においてβ細胞が欠損）されたブタ由来の胚（ホスト胚）に正常ブタ由来の胚細胞（ドナー胚細胞）を注入した後、これを仮親の体内で成長させることにより、ドナー由来の膵臓を持つキメラブタを作出している（Ｍａｔｓｕｎａｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ　１１０：４５５７－４５６２（２０１３））。このキメラブタの雄を、野生型雌ブタと自然交配することにより、常に一定の割合で膵臓形成が阻害（膵臓においてβ細胞が欠損）された新生仔を得ることができる。
　本実施例４において使用する膵臓形成が阻害（膵臓においてβ細胞が欠損）されたブタ新生仔は、このようなキメラブタとの自然交配により取得した（特開２０１９－６２９２９号公報）。
　図８は、膵臓形成が阻害（膵臓においてβ細胞が欠損）された上記ブタ新生仔を開腹した後の膵臓組織を示す図である。図８中、スケールバーは１ｃｍである。
　図８から明らかなように、正常の膵臓と異なり、断片的な（長径数ミリ）複数個の膵臓組織（矢頭）が形成されていることがわかる。上記の通り、膵臓組織が非常に小さいことから、ブタ体躯に付いた状態で毛細管により外来物を注入することは困難であることがわかる。
　上記複数の膵組織断片（矢頭）を切り取り、実施例１と同様に、ゼラチンゲルに半包埋後、３５ｍｍディッシュ（イワキ社製）上に置いて位置決めした。
　半包埋された上記複数の膵臓組織各々にヒトｉＰＳ細胞由来膵前駆細胞を吸引した毛細管を穿刺し、外来物として上記ヒトｉＰＳ細胞由来膵前駆細胞を注入した。
　（結果）
　図９は図８に示した複数の膵組織断片のうちの１個に注入されたヒトｉＰＳ細胞由来膵前駆細胞塊の様子を示す図である。図９中、スケールバーは５０μｍである。
　図９ａは、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）染色による組織全体の細胞核の位置とアミラーゼの蛍光免疫染色結果を示す図である。
　図９ａから明らかなように、アミラーゼ陽性細胞が検出され、当該アミラーゼ陽性組織が上記ブタの膵臓組織であるといえる。
　また、図９ｂは、ＰＤＸ１発現の緑色蛍光標識二次抗体の蛍光免疫染色結果を示す図である。また、図９ｃは、ＨＮＡ（human nuclear antigen）発現するヒト細胞核の蛍光免疫染色結果を示す図である。図９ｂ及びｃから明らかなように、ＰＤＸ１及びＨＮＡ共陽性の細胞が検出され、前記共陽性であることから「ヒトｉＰＳ細胞由来膵前駆細胞」といえる。
　図９ｄは、上記各蛍光検出の合成（merge）した結果を示す図である。図９ｅは、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色による膵細胞構造及び膵組織構造の確認結果を示す図である。
　図９ｄ及びｅから明らかなように、細胞であって、β細胞が欠損したアミラーゼ陽性ブタ膵臓細胞組織中にヒトｉＰＳ細胞由来膵前駆細胞の特徴が検出され、上記組織中にヒトｉＰＳ細胞由来膵前駆細胞が注入されたといえる。
　以上の結果から、動物体躯から摘出した臓器の所望の注入標的領域（膵組織断片）へ簡易に、外来物（ヒトｉＰＳ細胞由来膵前駆細胞）を注入できたことが分かる。

 

Claims (14)

  1. 　動物体躯から摘出した臓器の少なくとも一部を可塑性部材に接触させて位置決めする工程、及び
    　前記位置決め後の前記臓器中に外来物を注入する工程を含む、前記外来物が注入された臓器を含む移植材料の製造方法。
  2. 　前記臓器中の注入標的領域の直上又は近傍の表面から前記注入を行う、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記動物体躯が胎仔体躯である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記臓器が異種移植用臓器である、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記臓器が前記摘出後、ガラス化凍結を経た臓器である、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記可塑性部材が、前記ガラス化凍結時に前記臓器を被覆した可塑性部材である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記臓器の少なくとも一部が前記可塑性部材に埋もれている、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 　前記可塑性材料がゲルである、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 　前記注入には針状部材を用いる、請求項１又は２に記載の方法。
  10. 　前記針状部材が通過する経路が、液体が難浸透性な緻密な構造を有する請求項９に記載の方法。
  11. 　前記外来物が、前記動物体躯の動物以外に由来する細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  12. 　前記臓器が腎臓であり、前記注入標的領域が後腎の腎皮質形成領域である、請求項１又は２に記載の方法。
  13. 　動物から摘出された臓器と、前記臓器内に注入された外来物と、を含み、前記臓器には、外来物が注入された領域の直上又は近傍に注入痕が形成されている移植材料。
  14. 　前記外来物が、前記臓器以外に由来する細胞である、請求項１３に記載の材料。
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