JP2013528435A - 凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作する装置およびこうした装置の使用 - Google Patents

Abstract

本装置は、生体物質を装填する装填部（２ａ）と、インサイチュでの加温のために、内部に加温液を導通させるとともに前記装填部（２ａ）に装填されている前記生体物質に加温液を付与するように配置された流路（Ｃ）とを備える。本使用は、加温液を導通させかつ装置装填部に装填された生体物質に付与することにより、装置装填部に装填された凍結保存された生体物質を同時に加温し移送することを含む。
【選択図】図７

Description

本発明は、概して、第１態様では、凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作する装置に関し、より詳細には、流路を備えた装置であって、その流路が、インサイチュ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）での加温のために、前記装置に装填されている生体物質に加温液を付与する、装置に関する。

本発明の第２態様は、凍結保存された生体物質を同時に加温しかつ移送することを含む、凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作する装置の使用に関する。

生体物質、特に胚の凍結保存は、動物遺伝資源の普及および保存に対して非常に重要な段階である。緩慢凍結技法によって胚を凍結する有効な方法の開発により、胚移植がはるかに効率的な技術となり、それはもはや、新鮮胚移植に関して好適なレシピエントが即座に入手可能であることに頼らない。ウシ種では、胚を凍結することは現在一般的であり、妊娠率は、新鮮胚で達成される率よりわずかに低いのみである（Ｌｅｉｂｏ ａｎｄ Ｍａｐｌｅｔｏｆｔ、１９９８）。この手法では、０．２５ｍＬのプラスチックストローが、胚を緩慢凍結するためのもっとも普通の容器であり、それは、胚の解凍が、精液に非常に類似する水浴において直接行われ、その中身が、人工授精（ＡＩ）で行われるように、レシピエントの雌の子宮内に直接置かれるためである。顕微鏡または複雑な希釈処置が不要である。凍結保護物質が、浸透ストレスをもたらすことなく子宮内に胚を残す。これらの胚を移植するために必要な技能のレベルは、従来のＡＩに対して必要なレベルと同じであり、解凍時にエンブリオロジストは不要である。したがって、ますます多くの直接移植胚が、現在、ＡＩの経験のある技術者によって移植されている。しかしながら、緩慢凍結処置は、時間がかかり、かつ生物学的凍結装置の使用が必要である。この理由で、複雑な胚凍結処置は、ガラス化と呼ばれる比較的簡単な処置に取って代わられている。

ガラス化は、従来の手法に対する実現性がありかつ有望な代替法となっており、それは、緩慢凍結処置で使用される高価なプログラム可能な細胞凍結装置が不要であり、平衡化および後続する凍結保存が、胚の場合、より容易でありかつ時間がかからないためである。ガラス化の物理的な定義は、氷結晶化によるのではなく、１５，０００℃／分から３０，０００℃／分の高冷却速度を用いる、粘度の極端な上昇による、溶液のガラス転移温度未満の温度での溶液の固化である（Ｍａｒｔｉｎｏら、１９９６、Ｖａｊｔａら、１９９８）。しかしながら、ガラス化技法には２つの主な欠点がある。すなわち、（１）高濃度の凍結保護物質が必要であり、それは、卵母細胞および胚に対して毒性である可能性があり、（２）冷却速度が十分に早くない場合、細胞間氷晶および低温障害が発生する可能性がある。これらの問題を克服するために、非常に小さいサンプル体積が使用されるいくつかの方法が考案された。たとえば、サンプル体積を０．１μＬ〜１μＬまで低減し、かつ最小容量の担体システムを使用することにより、熱がサンプルから出て伝導する速度が上昇し、したがって、サンプルは非常に高速で冷却する。種々のこれらの技法を文献に見ることができ（Ｃｈｅｎら、２００１、Ｉｓａｃｈｅｎｋｏら、２００３ｂ、Ｌａｎｅら、１９９９、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎら、２００２、Ｍａｒｔｉｎｏら、１９９６、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、２００１、Ｖａｊｔａら、１９９８）、人間を含むいくつかの哺乳類種においてさまざまな成功の度合いで適用されてきた。

長年、臨床の場では、幹細胞が使用されてきた。血液疾患および非血液疾患の両方の治療に対して、造血幹細胞が使用されてきたが、より最近では、骨髄から導出された間葉系幹細胞が、実験室での研究および初期臨床研究の両方の対象となっている。これらの細胞は、多能性および増殖可能性の両方を示すが、それにも関らず、培養において安定した細胞株を形成せず、それは、再生医療の分野におけるそれらの適用の幅を制限する可能性がある。ヒト胚幹細胞は、万能細胞であり、３つのすべての胚葉から細胞に分化する能力を保持する安定した細胞株を形成することができる。これにより、それら細胞は、研究に対してのみでなく、移植および組織再生のための無限の細胞源として臨床的応用にも重要となる（Ｗｏｂｕｓら、２００１）。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞もまた、胚幹細胞を取り囲む混乱を招く臨床的問題のいくつかをなくして、同様の有用性の幅を提供することができる。幹細胞の商業的応用および臨床的応用に対する本質的な必須条件は、長期保管に対する好適な凍結保存プロトコルである。

造血幹細胞および間葉系幹細胞に対しては、凍結保存および保管の有効な方法が開発されてきたが、胚細胞およびｉＰＳ細胞はより処理し難いことが分かった。ガラス化技術は、現在、幹細胞源物質のバンキングのための新たな方法を提案して、まず生存可能な胚幹細胞株を確立することなく、隔離された胚由来幹細胞を保存する新たな可能性を提供する。ガラス化プロトコルは、ヒト胚幹細胞株の凍結保存にもうまく使用されてきた（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、２００４、Ｌｉら、２０１０）。一方、上述したように、ガラス化法は、近年ますます普及してきており、それは主に、特に低温障害の影響を受けやすい細胞に対して、緩慢凍結の場合に比較して生存率が高いためである（Ａｂｄｅｌｈａｆｅｚら、２０１０）。

最小体積のガラス化に対する最新の手法は、桑山正成医師によって設計されたｃｒｙｏｔｏｐ装置（株式会社北里サプライ、富士宮市、日本）である。このシステムは、プラスチック製のハンドルに取り付けられかつカバーストローが備えられた微細で透明なポリプロピレン膜からなり、そこに、非常に小さい体積（＜０．１μＬ）で卵母細胞または胚を装填することができる（桑山ら、２００５）。ｃｒｙｏｔｏｐは、ヒト卵母細胞および胚（Ａｎｔｉｎｏｒｉら、２００７、Ｃｏｂｏら、２００７、Ｌｕｃｅｎａら、２００６、Ｓｔｅｈｌｉｋら、２００５）、ウマ未成熟卵母細胞またはウマ体外成熟卵母細胞（Ｂｏｇｌｉｏｌｏら、２００６）、ウシ、ヒツジおよびスイギュウの卵母細胞（Ｃｈｉａｎら、２００４、Ｇａｓｐａｒｒｉｎｉら、２００７、Ｓｕｃｃｕら、２００７）、ウサギ接合子（Ｈｏｃｈｉら、２００４）、ブタ体外生産胚（牛島ら、２００４）、単為発生誘起または脱脂された体外成熟卵母細胞からの体細胞核移植によって生成されたブタ胚盤（Ｄｕら、２００７）、ウシおよびスイギュウの胚（Ｌａｏｗｔａｍｍａｔｈｒｏｎら、２００５）とともに、ミンククジラ等の外来種の卵母細胞（岩山ら、２００４）を凍結保存するためうまく使用された。

株式会社北里サプライらによる国際公開第０２０８５１１０Ａ１号パンフレットは、前記ｃｒｙｏｔｏｐ装置のうちの１つを開示しており、特に、耐寒性材料から形成された本体部と、本体部の一端に取り付けられ、可撓性、透明性かつ液体窒素耐性材料によって形成された卵付着保持用ストリップと、卵付着保持用ストリップが着脱可能にかつ被包可能に本体部に取り付けられる一端が封鎖され、かつ耐寒性材料によって形成された筒状部材とを備えた、卵凍結保存用器具を記載している。

前記ｃｒｙｏｔｏｐ装置のうちの別のものは、桑山正成らによる欧州特許第１６１９２４３Ａ１号明細書に開示されており、そのｃｒｙｏｔｏｐ装置は、国際公開第０２０８５１１０Ａ１号パンフレットに開示されているものの改良であり、耐液体窒素材料からなる卵凍結保存用チューブと、チューブを保護するための金属製筒状保護部材とを有する卵凍結保存用具の形態である。チューブは、本体部と、内径が０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの卵保存用細径部とを有している。チューブを、細径部の先端側においてかつ本体部においてヒートシールすることができる。筒状保護部材は、チューブの細径部の先端側を収納する管状部と、細径部の管状部に収納されない部分および本体部の先端部分を収納する半管状部とを有している。

ガラス化によって凍結保存される胚を、等張培地に移植する前に浸透している凍結保護物質を除去するために高張液に配置することによって加温しなければならない。多くの著者は、スクロースの濃度が異なる１つまたは複数の希釈段階の使用を報告しており、それは、凍結保護物質の除去中に膨張の程度を制御する（Ｉｓａｃｈｅｎｋｏら、１９９７、小林ら、１９９０、ＳｚｅｌｌおよびＳｈｅｌｔｏｎ、１９８６）。ガラス化技術を現手法に導入するためには、１回のＡＩと同レベルの困難さで、ガラス化された胚を、子宮に直接移植するためにストロー内希釈で加温することができることが必要である。このストロー内希釈および直接移植法により、適切な条件が可能ではない多くの農場において胚移植技術の応用に対する障害である機器および技術的技能に対する要件が低減する。比較的最近まで、胚のガラス化および現場での加温に対して、標準０．２５ｍＬ授精ストローが使用されていた。しかしながら、妊娠率は、緩慢凍結技法によって得られるものより低かった。

胚を包囲するガラス化溶液の体積を低減するとともに、処置に必要な時間を短縮することによって凍結保存のプロセスを容易にするために、精液ストローの代りにいくつかのタイプの胚容器が開発された。これらの新規な容器は、液体窒素への浸漬の後の氷晶形成なしに、ガラス化中の冷却速度を上昇させる。桑山ら（２００５）は、ｃｒｙｏｔｏｐ容器の使用により、解凍された胚および卵母細胞の生存率が上昇したことを報告している。

加温プロセス中、ナイロンメッシュ、金属メッシュ、ｃｒｙｏｌｏｏｐ、ｃｒｙｏｔｉｐおよびｃｒｙｏｔｏｐとしてのガラス化装置の大部分では、初期加温液に胚を投入するために、解剖顕微鏡を使用する必要がある。いくつかの報告は、現場状態でのガラス化した胚の解凍を記載している。Ｉｓａｃｈｅｎｋｏら（２００３ａ）は、装置としてオープンプルド（ｏｐｅｎ ｐｕｌｌｅｄ）ストローを用いて、ヒツジ胚の高速の顕微鏡を用いない解凍および直接移植を報告している。しかしながら、ＯＰＳシステムを用いる胚ガラス化の後の生存結果は、ｃｒｙｏｔｏｐ法を用いて得られるより不十分であることが文書に十分に示されている。

次に、凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作する種々の装置を開示しているいくつかの特許文献を列挙し、前記操作は、生体物質の加温段階を含む。

国際公開ＷＯ２００６／０６６３８５号パンフレットは、凍結保存のプロセスにおいて卵母細胞または胚のような発生細胞のサンプルを操作する器具を開示している。その器具は、一端に接続されたサンプル装填部分と他端における操作部分とを備えた細長いステムを含む。器具はまた、ステムにテレスコープ式に取り付けられたスリーブを含み、操作部分は、スリーブからその第１開放端の外に延出しており、装填部分は、スリーブから第２開放端の外に延出可能である。装填部分に装填されたサンプルを、使用者がスリーブを保持しながら操作部分を引くことによって、保護のためにスリーブ内に容易に引き込むことができる。ガラス化した発生細胞の加温は、サンプルを含む装填部分を解凍液内に浸漬することによって行われる。

米国特許第５１６０３１２号明細書は、胚の直接移植を可能にする凍結保護管状容器に関する。この容器は、そこに収納される胚を凍結するとともに、前記胚を解凍するためにも用いられ、その目的で、容器は、気泡によって分離される２つのチャンバを画定し、すなわち、一方のチャンバは胚を収納するためであり、別のチャンバは加温液を収納するためである。容器を振とうすることにより、２つのチャンバが連通し、それにより、現場に移植されるために、胚の解凍が達成される。

国際公開第０１９２４７８Ａ１号パンフレットは、胚をガラス化し移植するためのストローを開示しており、ガラス化した胚の加温は、胚を収納するストロー部分を湯煎鍋（ｂａｉｎ−ｍａｒｉｅ）に浸漬することによって行われる。

国際公開第２００９０６４７０８Ａ２号パンフレットは、形状記憶材料からなる、胚をガラス化する凍結容器に関し、それは、胚を管理するのに適している状態から急速に熱を伝達するのに適している状態まで移るために、熱に応じてその特性を変化させる。胚の加温については、それを温水浴内に浸漬することによって行われるとのみ記載されている。

米国特許出願公開第２００８２２０５０７Ａ１号明細書は、低温ガラス化によって保存されるある体積の物質を被包するアセンブリを開示しており、それは、好ましくは０．９５ｍｍと２．５５ｍｍとの間である所定内径と所定長とを有する細い管と、前記所定の物質体積を受け入れる領域を備えた支持体とを含む覆いを備え、前記支持体を、前記細い管内にその口を介して導入することができる。

物質をその凍結保存のためにガラス化するように低温液（たとえば液体窒素）に、保管を容易にするように垂直に浸漬されるために、前記覆いは、溶接によって前記口の反対側の端部が閉鎖されており、物質を含む支持体が覆いの内部に入ると、前記口の近くで第２の溶接が達成される。こうした覆いは、物質の汚染の危険を回避するために提供され、そのため、前記溶接の両方が、気体および液体の漏れおよび侵入から覆いを封止する。

米国特許出願公開第２００８２２０５０７Ａ１号明細書のアセンブリの支持体は中空管であるが、その内部流路の使用は、ガラス化する物質で部分的に占有されるか否かに関らず、物質を装填する作業のみに関連し、または図６に示す実施形態の場合、管の内部流路の反対側の端部に真空供給源を付与することにより、管の装填端部から物質を吸引するためである。それらの物質装填作業は、常に、支持体を覆い内に導入する前に行われる。

米国特許出願公開第２００８２２０５０７Ａ１号明細書には、管の内部流路に対する他の使用は開示されていない。

前記管の内部流路も覆いも、管がすでに覆い内にある間に前記管の内部流路の使用を可能にするように、配置されることも、寸法が決められることも、または構成されることもない。

引用した従来技術による提案のいずれも、凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作する装置であって、装置に装填された生体物質に加温液を、装置によって構成される流路に導通させることによって付与することができ、したがってそれ以上の機器を必要とすることなく現場状態において直接加温処置を可能にする、装置については記載していない。

最先端技術に見られる欠陥をカバーし、こうした今まで未知の装置を提供する、最先端技術に対する代替物を提供する必要がある。

その目的で、本発明は、第１態様において、ガラス化等の凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作し、生体物質を装填する装填部を備える装置において、生体物質を操作する既知の装置とは反対に、
−長さに沿って、内部の少なくとも一部を通して流路が画定されており、前記流路が、インサイチュでの加温のために、内部に加温液を導通させ、かつ前記装填部に装填されている前記生体物質に前記加温液を付与するように配置されている、細長いハンドル部と、
−端部が閉鎖され、かつ口を有する容器であり、
−前記細長いハンドル部に、前記細長いハンドル部を前記容器口から導入することによって着脱可能に結合され、結合されると、内部の空気が前記口を介して逃げることができないように、少なくとも前記装填部を覆い、
−結合されると、内部空気が内部空気の逆圧によって前記加温液を前記容器口に向かって押すことなく、前記付与された加温液と、前記付与された加温液によって加温されかつ前記装填部から離れるように押し流される前記生体物質との両方を受け取る
ように配置され、寸法が決められ、かつ構成されている容器と、
をさらに備える装置を提供する。

実施形態では、前記容器は、気体に対して透過性であり液体に対して不透過性である多孔性材料からなる栓またはストッパによって前記端部が閉鎖されるカバーストローであり、それにより、前記加温液が容器内に導入されているとき、内部空気が前記栓を介して逃げて、前記内部空気の逆圧を生成しないように、加温液が内部空気の先の空間を占有することができるようにする。

前記栓はまた、実施形態では、前記加温液によって湿潤すると液体を浸透させない第２材料からなり、それにより、容器が前記細長いハンドル部から分離されると、摺動することによって容器の中身を前記口から押し出すことができるプランジャとなり、前記プランジャは、授精カテーテルによって提供されるもの等、外部作動手段によって押される。

前記カバーストローはまた、そこに装填される前記生体物質および装置を、その保管および操作中に機械的損傷から保護するためにも使用される。

好ましい実施形態では、前記カバーストローは精液ストローであり、そこでは、前記栓は芯および紛体栓（ｗｉｃｋ ａｎｄ ｐｏｗｄｅｒ ｐｌｕｇ）であり、それは、２つの多孔性パッド（たとえば綿からなる）に、ゲル化するとこうしたプランジャになるために水和によりゲル化可能な紛体を加えたものからなり、かつ前記付与された加温液と、前記付与された加温液により加温されるとともに前記装填部から離れるように押し流される、その中に懸濁している生体物質との両方を受け取るようにも構成されている。カバーストローは、好ましくは、内部空気が多孔性栓を介して逃げると、付与された加温液の体積のすべてを受け取りかつ保持するように寸法が決められている。

前記栓またはストッパの直径は、精液ストローの場合、垂直である間、すなわち多孔性パッドに液体、この場合は加温液が含浸している時、液体を含んで、およそ３ミリメートル以上である。

前記カバーストローを構成するチューブは、１本の直線状の全体として透明な管状外囲容器である。

概して、前記カバーストローはまた、前記ハンドル部から分離されると、加温液に懸濁している前記生体物質を、生体物質が胚である場合の動物の子宮、または生体物質が幹細胞あるいは卵母細胞である場合は組織培養等、最終標的内に直接移植するために、授精カテーテル内に取り付けられるようにも構成されている。

代替実施形態では、容器は多孔性材料からなるカバーストローであり、それにより、前記加温液が容器内に導入されると、内部空気がカバーストローの壁を介して逃げ、前記内部空気の逆圧を生成しないために、加温液が内部空気の先の空間を占有することができるようにすることができる。

別の実施形態では、容器は断面寸法の異なる２つの部分、すなわち、前記口を含む第１部分と断面寸法がより広い第２部分とを有し、前記２つの部分の断面寸法の間の寸法比により、前記加温液が滴ることにより容器に入り、第２部分の底部に沈殿し、前記細長いハンドル部を取り出しているときであっても、内部空気の逆圧によって容器口に向かって押し出されないことが可能になる。

本発明の第２態様は、凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作する装置の使用において、装置装填部に装填された凍結保存された生体物質を、加温液を導通させかつ前記装置装填部に装填された前記生体物質に付与することにより、同時に加温しかつ移送することを含むことを特徴とする使用に関する。

実施形態によれば、本使用は、前記装置の内部流路に前記加温液を導通させることを行うことを含む。

第２態様の使用は、実施形態では、前記内部流路を画定する前記容器のハンドル部から前記装置の容器まで前記移送を行うことを含む。

本発明の第２態様の使用の別の実施形態は、前記容器から最終標的まで第２移送を行うことを含む。

本発明の第２態様の使用によって使用される装置は、いくつかの実施形態では、本発明の第１態様の装置である。

本発明の第１態様の装置を使用する方法は、
ａ）装置の装填部に生体物質を装填するステップと、
ｂ）前記装填部に装填された前記生体物質を凍結保存するステップと、
ｃ）前記装填部に装填された前記凍結保存された生体物質を加温するステップと、
を含み、前記ステップｃ）は、前記装置を用いて、少なくとも１種の加温液（および必要な場合は希釈液）を導通させ、かつ前記装填部に装填された前記生体物質に付与することによって行われる。

生体物質については、実施形態に応じて、卵母細胞、胚、幹細胞等の細胞および組織を含む群から選択された生体物質またはそのサンプルである。

好ましい実施形態では、前記ステップｂ）の前記凍結保存は、ガラス化技法によって行われる。

前記使用方法は、実施形態では、前記ステップｂ）の後に、前記装置の前記装填部を、たとえば綿プランジャにより端部が閉鎖され、かつ概してハンドル部の大部分あるいは全体も覆うカバーストローにより、着脱可能に覆うステップもさらに含む。

言及した生体物質移植を行うために、使用方法は、実施形態では、その目的に対して十分な流れで前記加温液を付与することにより、生体物質を装填部から前記カバーストローに向かって押し流すステップと、前記カバーストロー内に、前記付与された加温液とその中に懸濁している前記生体物質とを希釈した凍結保護剤とともに受け取るステップとを含む。

使用方法は、一実施形態によれば、加温液に懸濁している前記生体物質を含む前記カバーストローを授精カテーテル内に、前記授精カテーテルの少なくとも一部をカバーストローに、閉鎖端をカテーテル端に結合して導入することによって挿入し、綿プランジャを、シリンジのように前記授精カテーテルを用いて押すことによりカバーストローの中身を動物の子宮に向かって押し出すことにより、動物の子宮内に加温された生体物質を直接移植するステップｄ）を含む。

本発明によって提供される装置および使用方法は、特に、胚のガラス化に適しており、顕微鏡を用いない加温および直接胚移植を可能にする。この装置および使用の利点は、ＬＵＥＲコネクタによってたとえば標準シリンジに接続されている中空ハンドルを介して、１種または複数種の加温液を直接加えることにより、加温が容易かつ迅速に達成され、胚移植が、光学機器を必要とすることなく、実施形態では、現場状態での使用に最適である保護カバーとして授精ストローを使用して、直接行われる、ということである。

先のおよび他の利点および特徴は、例示的かつ非限定的にみなされなければならない添付図面を参照して、実施形態の以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。

図１は、実施形態に対する本発明の第１態様の装置の側面図である。 図２は、図１に示すものと同じ実施形態に対する本発明の装置の平面図である。 図３は、図２の線ＩＩＩ−ＩＩＩによって示す平面に沿って取り出された断面図である。 図４は、本発明の第１態様の装置のハンドル部の端部と、それに結合される取付支持体とを示す組立分解平面図である。 図５は、図４と同じ要素を示す組立分解側面図である。 図６ａは、図４によって示すものに対して代替的な２つのそれぞれの実施形態に対する２つの取付支持体のうちの１つを示す。 図６ｂは、図４によって示すものに対して代替的な２つのそれぞれの実施形態に対する２つの取付支持体のうちの１つを示す。 図７は、図１〜図３と同じ実施形態に対する本発明の第１態様の装置を示す斜視図である。 図８は、本発明の第１態様の装置の嵌合コネクタに結合可能なＬＵＥＲコネクタを備えた、本発明の一部ではないピペットを斜視図で示す。 図９は、実施形態に対し、図８のピペットを、そのＬＵＥＲコネクタが本発明の第１態様の装置のコネクタに結合されている斜視図で示す。 図１０は、装置がカバーストローを備え、本発明の一部ではないシリンジが、装置の内部流路に加温液を供給するために用いられる実施形態に対する、本発明の第１態様の装置の分解されていない図である。 図１１は、装置がカバーストローを備え、本発明の一部ではないシリンジが、装置の内部流路に加温液を供給するために用いられる実施形態に対する、本発明の第１態様の装置の組立分解図である。 図１２ａは、代替実施形態に対する、本発明の第１の態様の装置のハンドル部と、図４および図５のものとは異なる結合手段によってハンドル部に結合される（結合されているように示されている）取付支持体とを示す。 図１２ｂは、代替実施形態に対する、本発明の第１の態様の装置のハンドル部と、図４および図５のものとは異なる結合手段によってハンドル部に結合される（組立分解図で示す）取付支持体とを示す。 図１３は、生体物質を加温液とともに精液ストロー内に移送するために、使用の対応する連続的な段階を表す４つの一連の画像ａ、ｂ、ｃおよびｄを用いて、装置が精液ストローを備えている実施形態に対する本発明の第１態様の装置を示す。 図１４は、本発明の第１態様の装置の別の実施形態に対する、種々の断面寸法を備えた部分を有する容器内に、生体材料を加温液とともに移送する装置の使用の対応する連続的な段階を表す４つの一連の画像ａ、ｂ、ｃおよびｄを示す。

本発明の第１態様によって提供される装置１は、ハンドル部５を備え、ハンドル部５は、図１〜図７および図９〜図１１に示す実施形態では、その全長を通して内部長手方向流路Ｃ（図１〜図３および図７に示す）が画定されており、流路Ｃは、インサイチュでの加温のために、その中に加温液（図１３および図１４におけるＷ）を導通させるように、かつ装填部２ａに装填されている生体物質（図示せず）の上に加温液を付与するように配置されている。

図１〜図７、図９および図１１に示すように、装置１の装填部２ａは、図示する実施形態では、前記細長い本体５の第１端５ａに配置された取付支持体２の第１端部である。

取付支持体２に対する３つの異なる実施形態を添付の図に示し、１つの実施形態は、図４および図５に詳細に示されており、取付支持体２が薄い平面フィルムであり、別の実施形態は、図６ａに示されており、取付支持体２がリングの形態の先端２ａを有し、第３の実施形態は、図６ｂに示されており、取付支持体２がループの形態の先端２ａを有している。

図１〜図３ならびに図４および図５に特に示すように、内部流路Ｃは、その内部を循環する加温液を、装填部２ａに装填された生体物質に向けるために、取付支持体２に向かって面している出口Ｃｓを有している。

図４および図５に示す実施形態では、取付支持体２の部分２ｂの側縁を、自由端に向かって断面が低減している、面しているＵ字型輪郭のアームｂ１、ｂ２（図４を参照）内に、かつＵ字型輪郭アームｂ１、ｂ２のそれぞれの内側に面する壁に長手方向に画定されている２つのそれぞれの溝穴Ｒ（図３および図５には一方のみを図示する）内に、案内されるように導入しかつ移動させる（図４および図５に矢印によって示す）ことによって、前記取付支持体２は、細長い本体５すなわち細長いハンドル部５の前記第１端５ａに着脱可能に結合される。前記内側に面する壁の一方のみ、特に図５に参照記号ｂ１ｗによって示すもののみを図示している。

図４および図５に示す実施形態では、取付支持体２は、上記段落に説明したように細長い本体５に結合され、貫通開口部Ａの一部を覆い、貫通開口部Ａは、図４において、取付支持体２が細長い本体５に結合される前、その最大寸法で示されており、図２において、取付支持体２が細長い本体５に、溝穴Ｒの端部まで完全には導入されずに結合されると、その最小寸法で示されている。

図１２ａおよび図１２ｂは、図４および図５によって示すものに対する代替実施形態を示し、そこでは、装置１は、図４および図５のものとは異なる細長いハンドル部５の第１端５ａへの取付支持体の結合手段を含む。前記結合手段は、取付支持体２の部分２ｂに、貫通穴１３ａによって形成される結合構造を備え、その貫通穴１３ａ内に、細長いハンドル部５の第１端５ａの一致する結合構造のそれぞれの突起が入りかつ適合し、前記突起１３ｂは、アクセス溝穴１３ｒから前記穴１３ａに、前記アクセス溝穴１３ｒの境界を定める部分２ｂの材料を弾性的に変形させることによって入る。

図示する実施形態では、生体物質を、装填部２ａの２つの側部のいずれにも装填することができ、それは、図５に示すように、取付支持体が、流路Ｃの対称長手方向軸に、すなわち出口Ｃｓの中心に配置されており、そのため、出口Ｃｓ（図４および図５を参照）から出る加温液（図１３および図１４におけるＷ）が、前記２つの側部の両方に沿って、かつ図２に示す開口部Ａを通って流れるためである。しかしながら、さらなる実施形態（図示せず）では、生体物質を、支持体の面の一方に装填することも可能であり、それにより、前記支持体を、対称長手方向軸からシフトさせることができ、支持体は、何らかの溝穴状方法によるか、またはハンドル自体の一部であることによりハンドルに取り付けられる。

図１０および図１１に示す実施形態によれば、装置１は、カバーストロー４をさらに備え、それは、綿プランジャ７によって端部が閉鎖され、図１０に示すように細長い本体５に結合され、すなわち細長い本体５の長さの大部分を覆い、したがって、細長い本体５を機械的損傷から保護するとともに、そこに装填される生体物質を保護する。

先のセクションで説明したように、前記カバーストロー４は、付与される加温液の体積すべてを、その中に懸濁している生体物質とともに受け取りかつ保持するように寸法が決められ、また、授精カテーテル内に挿入されるように、かつ内部に収容されている生体物質を動物の子宮に移植するために用いられるようにも提供される。

図１、図２および図３に示すように、内部流路Ｃは、コネクタ６によって、加温液源の出口に接続された細長い本体５の第２端５ｂに、入口Ｃｉを有している。

図１０および図１１に示す実施形態では、前記加温液源はシリンジ８であり、それは、コネクタ６内にその先端を導入し、その中身を内部流路Ｃ内に押し込むことによって使用される。

図９は、加温液源が、コネクタ６に接続されたＬＵＥＲ−Ｌｏｃｋピペット３を含む、別の実施形態を示す。

図１３は、上述した実施形態に対する本発明の第１態様の装置を示し、そこでは、容器４は精液ストローであり、装置は、生体物質（図示せず）をシリンジ８によって前記精液ストロー４の内部に移送するために使用されている。

特に、図１３の図において、前記シリンジ８の排出ポートは、細長いハンドル部５の挿入コネクタ６に結合され、精液ストロー４は、ハンドル部５に、ハンドル部５をストロー口４ｂから導入することによって結合され、前記結合により、空気が前記口４ｂを介してカバーストロー４内部から逃げることができなくなる。

図１３の一連の画像を参照すると、図ｂにおいて、シリンジ８のプランジャが押し込まれており、それにより、その中身、すなわち押し流される生体物質（図示せず）とともに加温液Ｗがカバーストロー４に入り、内部の空気（図示せず）を押して、多孔性栓７を介してストロー４から逃し、それによりその空気の先の場所を占有する。

図１３の図ｃでは、シリンジ８は、細長いハンドル部５から切り離されかつ引き抜かれており、図ｄでは、細長いハンドル部５は、カバーストロー４から取り出され、内部に生体物質が懸濁している加温液Ｗは、それをカバーストロー４から押し出す可能性があるいかなる空気の逆圧も存在しないため、カバーストロー４内に残る。

図１４は、カバーストローの代りに、容器４が、断面寸法の異なる２つの部分、すなわち容器口４ｂを含む第１の部分４ｐ１およびより断面寸法の広い第２の部分４ｐ２を有する小さい瓶である、代替実施形態を示す。

この場合、瓶４内への加温液Ｗの導入もまた、図１４の図ａ〜ｄの順序に従って、シリンジ８から行われる。

図ｂでは、シリンジ８のプランジャは押されており、それにより、その中身、すなわち押し流される生体物質（図示せず）とともに加温液Ｗは、滴ることにより瓶４に入り（図ｂを参照）、第２部分４ｐ２の底部に沈殿し（図ｂ、図ｃおよび図ｄを参照）、わずかな内部空気の逆圧が生成される場合であってもそこに残り、それは、そうした逆圧が、部分４ｐ１および４ｐ２の断面の寸法比のために、沈殿した加温液Ｗを容器口４ｂに向かって決して押すことがないためである。

図１４の図ｃでは、シリンジ８は、細長いハンドル部５から切り離されかつ引き抜かれており、図ｄでは、細長いハンドル部５は、瓶４から取り出され、生体物質が懸濁している加温液Ｗは、いかなる空気の逆圧もそれを口４ｂに向かって押し出さないため、瓶４の底部に残っている。

次に、本発明によって提供される装置および使用の長所を試験するために、本発明者によって行われた研究について開示する。

体外胚生産
と殺された思春期前の仔牛およびウシから卵巣を収集し、１時間〜２時間以内におよそ３７℃の生理食塩水で実験室まで移送した。５ｍＬシリンジが取り付けられた２０ｇ針を用いて小胞の吸引により、胚を取得した。顆粒膜細胞の少なくとも２つの層によって包囲され均一に顆粒化した細胞質を含む卵胞卵を、体外成熟（ＩＶＭ）のために選択した。成熟に使用した培養液は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ｎｇ ｍＬ^−１上皮成長因子および５０μｇ ｍＬ^−１ゲンタマイシンが補充されたＴＣＭ−１９９であった。胚を、２４時間、３８．５℃の加湿した５％ＣＯ２空気雰囲気内で、４ウェルプレートにおいて５００μＬの培養液で培養した。

成熟に続き、ＣＯＣを、ウェル毎に２５０μｌの受精培地を含む４ウェルプレートに最大５０の群で移植する前に、ＰＢＳにおいて４回、その後、受精培地（２５ｍＭの重炭酸ソーダ、２２ｍＭの乳酸ナトリウム、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび６ｍｇ ｍＬ^−１の脂肪酸フリーＢＳＡおよび１０ｍｇ ｍＬ^−１のヘパリンナトリウム塩を含むタイロード培地）において洗浄した。アストゥリアス産雄牛からの解凍した精液を、室温で７００ｇ、８分間、不連続のＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配（２．５ｍＬ ９０％（ｖ／ｖ）Ｐｅｒｃｏｌｌの上に２．５ｍＬ ４５％（ｖ／ｖ）Ｐｅｒｃｏｌｌ）で遠心分離することにより、精子運動率を取得した。ペレットを、Ｈｅｐｅｓ緩衝タイロード培地で洗浄し、５分間１００ｇでの遠心分離により再びペレット化した。受精を、５％ＣＯ_２で加湿した空気雰囲気において３８．５℃で２２時間、最終的な濃度が１×１０６の精子ｍＬ^−１の、５００μＬの受精培地で行った。個々の雄牛間の変動を、すべての実験において２頭の雄牛からの等しい精液サンプルを混合することによって回避した。

２２時間、精子との共培養の後、予定接合子を、鉱油の下で２５μｌ培養液滴（１胚／μｌ）に移植した。胚を、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２で加湿した雰囲気において３８．５℃で７日間または８日間、人工卵管液培地で培養した。卵割速度を受精後４８時間で記録し、胚盤胞の数を、受精後７日目および８日目に確定した。

胚ガラス化
ガラス化−加温液を処方するために使用した保持培養液（ＨＭ）は、２０％ＦＣＳでＨｅｐｅｓ緩衝したＴＣＭ １９９であった。すべてのステップを、各ステップを視覚化するために実体顕微鏡を用いて、３８．５℃に加熱された層流フード下で行った。胚盤胞を、ＨＭで１０分間〜１５分間、７．５％エチレングリコール（ＥＧ）および７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む平衡液に移植した。最初の収縮の後、胚盤胞はそれらの元の体積に戻り、その後、それらを、ＨＭに溶解した１５％ＥＧ、１５％ＤＭＳＯおよび０．５Ｍスクロースを含むガラス化液（ＶＳ）に移した。６０秒間の培養の後、１つの胚盤胞を胚取付先端２ａに装填し、残りの溶液を大部分除去して、胚盤胞を覆う薄層のみを残し、サンプルを液体窒素内に迅速に浸漬した。その後、プラスチックキャップまたはカバーストロー４を装置１の上に引き寄せた。ＶＳへの浸漬から液体窒素への投入までのプロセス全体を、６０秒間〜９０秒間内で完了した。装填した装置を、−１９６℃の液体窒素に保管した。

胚加温および移植（現場状態）
液体窒素から装置１全体を取り除いた直後、１００マイクロリットルの加温液（ＨＭに溶解した１Ｍスクロース）を、標準シリンジ８を用いて中空ハンドル５の内部流路Ｃを通して保護キャップ４に直接加えた。１分間後、１００マイクロリットルのＨＭを、同様に保護キャップ４に加えた。胚からの凍結保護物質の拡散を、保護キャップ４を緩やかに動かすことによって行った。胚の子宮移植を、人工授精と同じ手続きを用いて希釈の直後に行った。

原型試験結果
本発明者らの実験室において行われた予備試験において、加温液が本発明によって提供される装置１に加えられたときに、胚がまったく喪失せず、それにより、すべての胚が加温後にカバーストロー４に残った。

当業者は、添付の特許請求の範囲において定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく、記載されている実施形態において変形および変更を導入することができる。

参考文献
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Claims (16)

1. 凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作し、生体物質を装填する装填部（２ａ）を具備する装置（１）において、
   −長さに沿って、内部の少なくとも一部を通して流路（Ｃ）が画定されており、前記流路（Ｃ）が、インサイチュでの加温のために、内部に加温液（Ｗ）を導通させ、かつ前記装填部（２ａ）に装填されている前記生体物質に前記加温液（Ｗ）を付与するように配置されている、細長いハンドル部（５）と、
   −端部（４ａ）が閉鎖され、かつ口（４ｂ）を有する容器（４）であり、
   −前記細長いハンドル部（５）に、前記細長いハンドル部（５）を前記容器口（４ｂ）から導入することによって着脱可能に結合され、結合されると、内部の空気が前記口（４ｂ）を介して逃げることができないように、少なくとも前記装填部（２ａ）を覆い、
   −結合されると、内部空気が内部空気の逆圧によって前記加温液（Ｗ）を前記容器口（４ｂ）に向かって押すことなく、前記付与された加温液と、前記付与された加温液（Ｗ）によって加温されかつ前記装填部（２ａ）から離れるように押し流される前記生体物質との両方を受け取る
   ように配置され、寸法が決められ、かつ構成されている容器（４）と、
   をさらに具備することを特徴とする装置（１）。
2. 請求項１に記載の装置において、前記容器（４）が、気体に対して透過性であり液体に対して不透過性である多孔性材料からなる栓（７）によって前記端部（４ａ）が閉鎖されるカバーストローであり、それにより、前記加温液（Ｗ）が前記容器（４）内に導入されているとき、内部空気が前記栓（７）を介して逃げて、前記内部空気の逆圧を生成しないように、前記加温液（Ｗ）が内部空気の先の空間を占有することができるようにすることを特徴とする装置。
3. 請求項２に記載の装置において、前記栓（７）がまた、前記加温液（Ｗ）によって湿潤すると液体を浸透させない第２材料からなり、それにより、前記容器（４）が前記細長いハンドル部（５）から分離されると摺動することによって、前記容器の中身を前記口（４ｂ）から押し出すことができるプランジャとなり、前記プランジャが、外部作動手段によって押されることを特徴とする装置。
4. 請求項３に記載の装置において、前記カバーストローが精液ストローであることを特徴とする装置。
5. 請求項１に記載の装置において、前記容器（４）が多孔性材料からなるカバーストローであり、それにより、前記加温液（Ｗ）が前記容器（４）内に導入されているとき、内部空気が前記カバーストローの壁を通して逃げて、前記内部空気の逆圧を生成しないように、前記加温液（Ｗ）が内部空気の先の場所を占有することができるようにすることができることを特徴とする装置。
6. 請求項１に記載の装置において、前記容器（４）が、断面寸法の異なる２つの部分、すなわち、前記口（４ｂ）を含む第１部分（４ｐ１）と断面寸法がより広い第２部分（４ｐ２）とを有し、前記２つの部分（４ｐ１、４ｐ２）の断面寸法の間の寸法比により、前記加温液（Ｗ）が滴ることにより前記容器（４）に入り、前記第２部分（４ｐ２）の底部に沈殿し、前記細長いハンドル部（５）を取り出しているときであっても、内部空気の逆圧によって前記容器口（４ｂ）に向かって押し出されないことが可能になることを特徴とする装置。
7. 請求項１に記載の装置において、前記装填部（２ａ）が、前記細長いハンドル部（５）の第１端（５ａ）に配置された取付支持体（２）の一部であり、前記内部流路（Ｃ）が、前記取付支持体（２）に向かって面している出口（Ｃｓ）を有することを特徴とする装置。
8. 請求項７に記載の装置において、前記内部流路（Ｃ）が、前記細長いハンドル部（５）の第２端（５ｂ）において入口（Ｃｉ）を有することを特徴とする装置。
9. 請求項８に記載の装置において、前記細長いハンドル部（５）の前記第２端（５ｂ）が、前記流路入口（Ｃｉ）を加温液源の出口に接続するコネクタ（６）を備えることを特徴とする装置。
10. 凍結保存のプロセスにおいて生体物質を操作する装置の使用において、装置装填部に装填された凍結保存された生体物質を、加温液を導通させかつ前記装置装填部に装填された前記生体物質に付与することにより、同時に加温しかつ移送することを含むことを特徴とする使用。
11. 請求項１０に記載の使用において、前記装置の内部流路に前記加温液を導通させることを行うことを含むことを特徴とする使用。
12. 請求項１０または１１に記載の使用において、前記内部流路を画定する前記容器のハンドル部から前記装置の容器まで前記移送を行うことを含むことを特徴とする使用。
13. 請求項１２に記載の使用において、前記容器から最終標的まで第２移送を行うことを含むことを特徴とする使用。
14. 請求項１０乃至１３の何れか一項に記載の使用において、前記生体物質が、卵母細胞、胚、細胞および組織を含む群から選択された生体物質またはそのサンプルであることを特徴とする使用。
15. 請求項１０乃至１４の何れか一項に記載の使用において、前記凍結保存がガラス化技法によって行われることを特徴とする使用。
16. 請求項１０乃至１５の何れか一項に記載の使用において、前記装置が、請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置であることを特徴とする使用。

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