JP2007126471A - 生体試料のガラス化方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生物学的標本を直接的に凍結物質に暴露する。凍結物質に暴露されると生物学的標本がガラス化する。ガラス化した生物学的標本を一定期間保存し、次いで後日解凍しうる。解凍した生物学的標本は生存状態のままである。好ましい本発明による生物学的標本は生育中の細胞である。
【選択図】図1
Description
本発明は、生体試料を解凍した後にその生体試料が生存状態に維持されるような形での、生体試料のガラス化方法に関する。
本発明は、生体試料のガラス化法に関する。本発明の方法によれば、生体試料を直接冷凍剤に曝露する。冷凍剤への曝露により、生体試料はガラス化する。ガラス化した生体試料をある期間保存してから、後日解凍する。解凍された生体試料は生存状態に保たれている。本発明による好ましい生体試料は発生細胞である。
本発明においては、全体を通じて以下の用語を用い、それらの用語は本願に関して以下のように定義される。
A.培地
以下の実施例で使用した培地は、レーンら記載の方法(Lane et al., Mol. Reprod. Dev., 50: 443-450 (1998))に従って調製したハムスター胚培地−10(HECM−10)であった。胚の採取および冷凍保存については、20mM NaHCO3を20mM Hepes(pH7.35)に代えたHECM−10のHepes緩衝調製培地を用いた。使用直前に、培地に凍結防止剤溶液を加えた。ウシ胚培養用の培地は、ガードナーら記載の(Gardner et al., Hum. Reprod. 13: 3434-3440 (1998))G1.2およびG2.2とした。全ての塩、炭水化物、アミノ酸、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレングリコールおよびショ糖は、シグマ社(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)から購入した。ウシ血清アルブミンは、バイエル・ダイアグノスティクス(Bayer Diagnostics)から購入した。
ハムスター胚は、レーンらによって既報の方法(Lane et al., Mol. Reprod. Dev., 50: 443-450 (1998))に従って、過剰排卵雌から採取した。ハムスター胚は前核1−細胞期または2−細胞期のいずれかで冷凍保存した。ハムスター胚は、レーンらの方法(Lane et al., Mol. Reprod. Dev., 50: 443-450 (1998))に従って、HECM−10で培養した。得られた胚盤胞の細胞数を、トリトン処理後のヨウ化プロピジウム染色によって評価した。
未成熟ウシ卵子を卵巣から摘出し、クリシャーら記載の方法に従って(Krisher et al., Biol. Redprod. 60: 1345-1352 (1999))成熟させた。成熟卵子は、ガラス化および解凍するか、あるいは対照として用いる場合はガラス化および解凍を行わず、クリシャーら記載の方法によって(Krisher et al., Biol. Redprod. 60: 1345-1352 (1999))in vitroで受精させた。受精後、推定受精体を単離し、順次の培地G1.2およびG2.2で、各培地について72時間培養した。計144時間後、桑実胚/胚盤胞ならびに胚盤胞期への発達を評価した。
ガラス化用に用いたループは、エポキシによって冷凍バイアル(Hampton Research, Laguna Niguel, CA)の蓋に保持されたステンレス管上に取り付けられたナイロンループ(幅20μm、直径0.5〜0.7mm)からなるものであった。凍結防止剤を用いた2段階負荷を用いて卵子および胚をガラス化した。最初に卵子および胚を、10%DMSOおよび10%エチレングリコールを含む凍結防止剤溶液Iに1〜3分間入れてから、20%DMSOおよび20%エチレングリコール、10mg/mLフィコール(分子量400000)および0.65Mショ糖を含む溶液IIに約20秒間移した。次に、溶液IIに予め浸漬して薄膜を形成しておいたループに細胞を移した。ハムスター胚の場合、10〜12個の胚をループに乗せ、ウシ胚の場合3〜6個の胚を各ループに乗せた。次に、ナイロンループに懸濁させた胚を直接液体窒素に投入した。冷凍バイアルを予め液体窒素に浸しておくことで、液体窒素の入った冷凍バイアル中に、胚の入ったループを投入し、1回の動作で液体窒素下で密閉した。
比較の目的で、Vajtaら,Cryo−Letters 18:191−195(1997)によって記載されたオープンプルドストロー(OPS)法を使用してハムスターの胚をガラス化した。上記と同じ濃度のエチレングリコールとDMSOとから成る凍結保護剤の2段階充填を使用して、10−12個の胚を凍結保護剤に接触させた。胚を第二凍結保存溶液の1μl液滴にピペット注入し、次いで毛細管作用を利用してプルドストローに充填し、胚を収容したストローを液体窒素に直接浸漬させた。解凍のためには、加温中の圧力増加によって胚をストローから押出し、上記のように解凍した。
ハムスターの桑実胚/胚盤胞を3日目(day3)(非同期の前日(−1 day))の偽妊娠レシピエントに移植した。各子宮ホルンに8個の胚を移植した。妊娠14日目に数匹の動物を安楽死させ、着床率及び胎児発生率を測定した。残りの雌は妊娠16日目に出産した。産まれた仔の数を誕生直後に記録した。
分布が二項分布である線形−ロジスティック回帰を使用して処理間の発生の差異を評価した(Glim 4.0,Numerical Algorithms Group,Oxford,UK)。実験日も1つの要因であった。ガウスの正規分散及び均等分散が確認されたので分散分析を使用して細胞数の差異を評価した。処理間の多重比較をBonferroniの多重比較手順によって評価した。
本発明のループを使用してハムスターの2細胞胚をガラス化し、凍結保護剤に接触させた対照胚、または、実施例1に記載のようなOPS法を使用してガラス化した胚の結果に比較した。ハムスターの胚を輸卵管から採取し、対照、ループガラス化またはOPSガラス化に配分した。以下の表1に示すように、ループ内でガラス化した胚は、OPSを使用してガラス化した胚に比較して、桑実胚/胚盤胞期及び胚盤胞期まで発生した胚の数が有意に増加していた。
ループ法またはOPS法を使用してハムスターの胚をガラス化した。加温後、胚を桑実胚/胚盤胞期まで培養し(ガラス化した胚及び対照胚の双方)、偽妊娠レシピエントに移植した。以下の表2に示すように、2細胞期に予めガラス化しておいた桑実胚/胚盤胞期の胚が着床し生存胎児まで発生する生存率を凍結保存しなかった対照胚に比較すると、差異は存在しなかった。しかしながら表2に示すように、OPSを使用してガラス化したときに着床し生存胎児まで発生できた胚の数は有意に減少していた。ループを使用して2細胞期にガラス化した桑実胚/胚盤胞を移植した追加の2匹の雌が出産し、5匹の正常仔が誕生した。これらの仔は形態学的に健常で生殖能力のある成体に発生した。
本発明のガラス化方法が種々の細胞特性をもつ胚のガラス化に成功する能力を有するか否かを判定するために、ウシの卵母細胞及び胚を実施例1の教示に従ってガラス化し、それらの生存率及びその後の発生を評価した。結果を表3に示す。卵母細胞及び胚を対照グループまたは本発明の方法を使用するループガラス化グループに配分した。in vitro産生した胚盤胞はループを使用するガラス化に成功し、表3に示すように80%を上回る膨張胚盤胞がガラス化後に膨張を再開し孵化することが可能であった。対照胚盤胞を培養すると、48時間の培養後に100%の孵化率を示した。更に、完全に孵化した胚盤胞の75%がループガラス化を使用したガラス化に成功した。本発明のガラス化方法を使用してガラス化したウシの8細胞胚をガラス化し加温すると、その後の生存率(桑実胚/胚盤胞期まで及び胚盤胞期までの発生によって評価)は、表3に示すように、凍結保存しなかった新しい胚で得られた生存率に均等であった。4細胞期の胚のガラス化は、新しい胚に比較して生存率を多少減少させたが、表3に示すように、多くが桑実胚/胚盤胞期まで正常な発生を完了できた。ウシの卵母細胞は低温損傷に極めて感受性であり、凍結保存後に何らかの成功を示した報告は殆どない。in vitro成熟したウシMII卵母細胞はループを使用したガラス化に成功した。ガラス化し加温した卵母細胞はその後に受精し、そのうちの33%が桑実胚/胚盤胞期まで発生を継続した(n=42)。
A.培養培地
胚の培養培地はG1.2及びG2.2(IVF Sciences Scandinavian,Gothenburg,Sweden)であった。胚の採取培地はHEPES改質G1.2(H−G1.2)であり、凍結保存及び解凍用の基本培地はアミノ酸及びビタミンを含まないHEPES緩衝改質G2.2(H−G2.2)であった。双方の改質培地は、20mMのNaHCO3を20mMのHEPESで置換することによって培地を改質し、pH7.35に調整したものである。
4−6週齢の雌のF1(C57BL6xCBa)マウスから胚を採取した。雌マウスを5iuの妊馬血清型ゴナドトロピン(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)で刺激し、48時間後に5iuのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG;Sigma Chemical Co.)で刺激した。hCGの注入後、雌マウスを同系統の雄マウスと同居させ、翌朝、膣栓の存在によって交配が生じたことを確認した。hCGの22時間後に受精卵を採取し、H−G1.2中で0.5mg/mlのヒアルロニダーゼと共に1分間未満のインキュベーションを行うことによって周囲の卵丘から剥離した。受精卵をH−G1.2中で2回洗浄し、培養した。
マウスの受精卵を10個ずつのグループにしてG1.2培地の20μl液滴に入れ、5%CO2の空気から成る湿潤雰囲気下、37℃で培養した。48時間の培養後、8細胞胚をG2.2培地で3回洗浄し、G2.2培地の20μl液滴中で更に48時間培養した。96時間培養後に胚盤胞の発生を評価した。
胚盤胞増殖用の培養系をGardnerら,Hum.Reprod.13:3434−40(1998)に記載の方法で作製した。卵母細胞の回収後、卵丘に包囲された卵母細胞を胎児臍帯血清(FCS)を加えたHamのF−10培地でインキュベートして、精液注入の準備をした。精液の初期パラメーター次第で、50−70−95不連続勾配法またはミニ勾配法で精液を調製した(Pure Sperm,Nidacon,Gothenburg)。得られたペレットをHamのF−10培地で洗浄した。正常な精液注入のために、各卵母細胞に50−100,000精子/mLを添加した。細胞質内注入(ICSI)を行ったときは、ヒアルロニダーゼ及び吸引ピペットを使用して卵母細胞を剥離した。成熟卵母細胞の各々を、15%のFCSを加えたリン酸塩緩衝生理食塩水の6μl液滴に入れた。パートナーの精子をPVP(IVF Sciences Scandinavian)の6μl液滴に入れた。全部の液滴をOvoil(IVF Sciences Scandinavian)で被覆した。ICSIは、Nikon倒立顕微鏡上でNarishigeマイクロマニピュレーターで行った。次に、注入した卵母細胞を洗浄し、受精を評価するまでG1.2を入れた管に維持した。精子注入またはICSIの15−18時間後に受精を評価した。27ゲージの使い捨て針で解剖して卵丘及びコロナ細胞を切除して器官培養皿に維持した。得られた2個の前核胚を十分に洗浄し、次いで2−3個のグループにして1mLのFalcon培養管に入れたG1.2培地中で5%CO2の空気中で培養した。
ガラス化に使用したループは、クリオバイアルの蓋に挿入されたステンレススチール管に装着されたナイロンループ(20μm幅;0.5−0.7mm径)から構成されていた。ループを購入し(Hampton Research,Laguna Niguel,CA)、装着し、次いでバイアル内でエポキシ化した。蓋の金属インサートが存在するので、所望の場合にはループ操作用の小磁石の付いたハンドルを使用できる。
マウス及びヒトの胚盤胞の発達をその後の生存率のマーカーとして評価した。胚盤胞の付着及び発達を評価するために、10%胎児臍帯血清を加えたG2.2培地に胚盤胞を移した。500μlの液滴中の0.1%のゼラチンを予めコートした4ウェルのプレート(Nunclon,Denmark)中で胚盤胞を5%CO2の空気中で37℃で48時間培養した。24時間培養後に胚盤胞の孵化及び付着を評価し、更に24時間培養後に発達を評価した。内部細胞塊(ICM)及びトロフェクトデルムの発達を、発達の量に基づいて0−3のスコアで示した。Spindle and Pederson,J.Exp.Zool.,186:305−318(1972)に記載されているように、スコア0は発達が生じなかったことを示し、3は広範囲の発達を示す。
ガラス化後のマウス胚盤胞の生存率を偽妊娠レシピエントに移植することによって評価した。加温後、移植の前に、胚盤胞をG.2.2培地中で6時間培養した。6時間の期間後に膨張を再開した胚盤胞をプールし、移植する胚盤胞を無作為に選択した。各子宮ホルンに6個の胚盤胞を移植した。妊娠15日目に、着床、胎児の発生及び胎児の体重を評価した。対照には凍結保存しなかった胚盤胞を使用した。
ガラス化後の孵化、付着及び生存率の差異をYates補正を伴うχ2(カイ2乗)分析によって評価した。ICM及びトロフェクトデルムの双方の発達データを先ずKolmogorov−Smirnovテストで処理してデータが正規であることを決定した。次にFテストを使用して2つのグループのデータが均等分散を有することを評価した。正規分散及び均等分散を確定した後で、スチューデントのt検定で発達の差異を評価した。
合計160個のマウスの胚盤胞を本発明のループを使用してガラス化した。ガラス化後、これらの胚盤胞の100%が培養中に膨張を再開できた。表4に示すように、培養中に孵化及び付着し得るガラス化胚盤胞の能力を対照胚に比較すると、差異は存在しなかった。同様に表4に示すように、培養中のICMまたはトロフェクトデルムの発達能力に関しても対照胚盤胞とガラス化胚盤胞との差はなかった。
最小から半分までの範囲に膨張した18個のヒト胚盤胞を本発明方法でループを使用してガラス化した。そのうちの11個の胚盤胞(83.3%)が培養中に膨張を再開した。培養中の孵化とICM及びトロフェクトデルムの発達とに関しては表5に示すように、ガラス化した胚盤胞と凍結保存しなかった対照胚盤胞とが同様の能力を示した。
この実施例では以下の溶液を使用した:
凍結溶液:
溶液1:10%のエチレングリコールと10%のDMSOとを含有する基本培地(実施例1に教示);
溶液2:0.65Mのショ糖と20%のエチレングリコールと20%のDMSOと10mg/mlのフィコールとを含有する基本培地:
解凍溶液:
溶液1:0.25Mのショ糖を含む基本培地;
溶液2:0.125Mのショ糖を含む基本培地;
溶液3:基本培地;
溶液4:基本培地。
ウシ胚盤胞を実施例1に記載の方法で作製し、実施例8に記載の方法でガラス化した。次に実施例8に記載の方法で胚盤胞を解凍し、培養した。48時間後、80%の胚盤胞が孵化した。
7日目のウシ胚盤胞を実施例1に記載の方法で作製し、実施例1に記載のG1.2/G2.2を使用して培養した。合計20個の胚盤胞を実施例8に記載の方法でガラス化し、解凍し、ループあたり2−3個の胚盤胞にして2時間凍結した。次に実施例8に記載の方法で胚盤胞を解凍し、培養した。解凍した胚盤胞を48時間培養した後、20個のうちの15個の胚盤胞が孵化し、2個が膨張を再開した。
この実施例では、本発明方法を使用するウシ卵母細胞のガラス化を、公知のオープンプルドストロー(OPS)法を使用してガラス化した卵母細胞及び凍結しなかった対照卵母細胞に比較した。実施例8に記載の溶液を使用し、ガラス化すべき卵母細胞を溶液1で35秒間処理し、次いで単独の溶液2または粘性溶液を加えた溶液2で30秒間処理した。次に卵母細胞を、ストローあたり1−3個、またはループあたり1−3個にして、液体窒素に浸漬させることによって凍結させた。ガラス化した後、全部の卵母細胞を実施例8の溶液を使用して以下の計画で解凍した:溶液1に1分間;溶液2に5分間;溶液3に5分間;及び溶液4に5分間。次に、ウシ卵母細胞を成熟培地に戻して2分間維持し、正常に受精させた。1日後、卵母細胞を実施例1のG1.2培地に移した。4日後、分割した胚を実施例1に記載の新しいG1.2培地に移した。対照卵母細胞は37.5%が分割を生じ、本発明方法でガラス化した卵母細胞は19%が分割を生じたが、OPS法を使用してガラス化した卵母細胞で分割を生じたのは14%であった。次に卵母細胞を新しいG2.2培地に移して更に4日間培養した。8日後、出発卵母細胞の表皮を剥離した24個の対照のうちの2個だけが桑実胚発生期に到達した。比較として本発明方法でガラス化した16個の卵母細胞のうちの3個が桑実胚発生期に到達した。比較としてOPS法を使用してガラス化した28個の卵母細胞で桑実胚発生期に到達したものはなく、OPS法の最も成功した唯一の例は16−32細胞期まで進行したが、このような卵母細胞は4個しか生存しなかった。
A.培養培地
胚の培養培地は5mg/mlのヒト血清アルブミンを加えたG1.2及びG2.2であった(Gardnerら,Hum.Reprod.13:3434−40(1998))。胚の採取及びガラス化用の培地はHEPES改質G1.2(H−G1.2)であり、凍結保存及び解凍用の基本培地は、20mMのNaHCO3を20mMのHEPESで置換することによって培地を改質し、pH7.35に調整したEDTAを含まないHEPES緩衝改質G1.2であった。
4−5週齢の雌のF1(C57BL6xCBa)マウスから卵母細胞を採取した。雌マウスを5iuの妊馬血清型ゴナドトロピン(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)で刺激し、53時間後に5iuのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG;Sigma Chemical Co.)で刺激した。hCG注入の14時間後に卵母細胞を採取し、H−G1.2中で0.5mg/mlのヒアルロニダーゼと共に1分間未満のインキュベーションを行うことによって周囲の卵丘から剥離した。卵母細胞をH−G1.2中で2回洗浄し、精液注入するかまたは凍結保存した。
Gardnerら,Hum.Reprod.13:3434−40(1998)に従って被験者を刺激して多数卵母細胞を産生させた。卵母細胞を卵胞から排出させ、G1.2培地に入れて4時間維持した。G1.2中でヒアルロニダーゼと共にインキュベーションすることによって卵母細胞を周囲の卵丘から剥離した。次に未成熟の卵母細胞を胎児臍帯血清を加えたG2.2中で24時間培養した。次に成熟したMII卵母細胞を対照またはループを使用するガラス化に配分した。
凍結保護剤の2段階充填を使用して卵母細胞をガラス化した。最初に、卵母細胞を10%のDMSOと10%のエチレングリコールとを含有する凍結保護溶液Iに入れて1分間維持した。次いで、20%のDMSOと20%のエチレングリコールと10mg/mlのフィコール(分子量400,000)と0.65Mのショ糖とを含有する溶液IIに移してほぼ20秒間維持した。卵母細胞を次に、溶液IIに予め浸して薄膜を形成したループに移し、液体窒素に直接浸漬させた。クリオバイアルを液体窒素に予め沈めておくことによって、液体窒素を含んでいるクリオバイアルに卵母細胞を含んだループを入れ、液体窒素下で1動作でシールすることが可能であった。バイアルを標準ケーンに保存した。
12−16週齢の雄のF1(C57BL6xCBa)マウスの精巣上体から精子を1mg/mlのグルタチオンと5mg/mlのHSA(Scandinavian IVF Sciences,Gothenburg,Sweden)を加えたFG1培地(Gardner and Lane,1997,Hum.Reprod.Update 3:367−382に記載)に吸引した。精子に受精能を獲得させるために精子注入に先立って精子を1.5時間処理した。卵母細胞に精子を注入する前に、Fertilase 670nmレーザー照準ビーム及び平行にした1.48μMレーザービーム(MTM Medical Technologies,Montreux,Switzerland)を使用して卵母細胞の帯層に小孔(5μM)を形成した。卵母細胞をFG1の100μl液滴に入れ、約1×104の精子と共に4時間コインキュベートした。卵母細胞を2回洗浄し、G1.2の20μlの液滴に入れ、6%CO2、5%O2及び89%N2中、37℃で培養した。翌朝、2細胞胚の存在によって受精を評価した。全部の2細胞を新しいG1.2液滴に移した。48時間の培養後、胚をG2.2で十分に洗浄し、G2.2培地中で更に48時間、胚盤胞期まで培養した。
ヒト卵母細胞の生存性を色素排除により評価した。卵母細胞を25μg/ml ヨウ化プロピジウムを含有するH−GI.2に10分間置き、次いでH−GI.2中5分間洗浄した。ガラス化法で生存できなかった卵母細胞は核物質染色で陽性であるが、生存卵母細胞は染色されない。
直線ロジスティック回帰を用いて処置間の発生の差異を評価し、この場合分布は二項式であった(グリム4.0、ニューメリカル・アルゴリズム・グループ、オックスフォード、英国)。実験日は因子として適合させた。分散分析とガウス正規化の両方を用いて細胞数の差を評価し、分散を確認した。多重比較用のボンフェロニ法により処置間の多重比較を評価した。
表6に示すように、本発明の方法を用いてガラス化した卵母細胞では低速凍結法を用いて低温保存した卵母細胞と比較して生存率は有意に高かった。同様に、表6に示すように、本発明の方法を用いてガラス化した卵母細胞では低速凍結法と比較して受精率は有意に高かった。表6に示すように、本発明の方法を用いてガラス化した卵母細胞では受精率は授精した対照の新鮮卵母細胞と同等である。表6に示すように、低速凍結法を用いて低温保存した卵母細胞では受精率は有意に低かった。凍結しなかった対照の胚は全卵母細胞から70.0%、または二細胞胚から95.4%の率で胚盤胞段階まで発生した。表6に示すように、ループを用いてガラス化した卵母細胞からの胚盤胞発生率は対照卵母細胞と比較して差はなかった。対照的に、表6に示すように、低速凍結により低温保存した卵母細胞では全卵母細胞から、または二細胞胚からの胚盤胞発生率は有意に低下した。
新鮮かまたは低温保存した卵母細胞のいずれかから誘導した胚盤胞(本発明の方法によるガラス化かまたは低速凍結のいずれかによる)を偽妊娠受体に移し、着床させ、胎児の生育を評価し、その結果を表7に示す。本発明の方法を用いてガラス化した卵母細胞から誘導した胚盤胞では着床率は新鮮な卵母細胞と類似したが、胎児の生育はわずかに低下した。対照的に、低速凍結法を用いて凍結した卵母細胞では対照卵母細胞または本発明の方法を用いてガラス化した卵母細胞のいずれかと比較して、着床率および胎児生育率が有意に低下した。さらに、2匹の雌の各々にガラス化した卵母細胞から得られた8個の胚盤胞を移し同腹子にした。これらの雌から11匹の仔が生まれ(7匹および4匹)、全て形態学的に正常で繁殖力のある成熟マウスに生育した。生まれた11匹の仔のうち、8匹は雌で3匹は雄であった。
本発明の方法によりガラス化した後、ヒト卵母細胞の生存性を評価した。表8に示すように高い生存率が観察された。
実施例1に記載の方法により胚を収集した。収集後すぐにループを用いて一細胚盤胞をガラス化し、一方実施例1に記載の方法により培養して24時間後に二細胞胚が得られた。
実施例12に記載の方法により成熟マウス精子を収集した。
(b)移動用器具および生物学的標本を直接凍結物質の中に置くこと;
からなる生物学的標本のガラス化方法であって、ここで生物学的標本を直接凍結物質に暴露し、それによりガラス化し、さらに生物学的標本を解凍した後、生物学的標本が生存しているガラス化方法。
(i)ガラス化の前に凍結防止剤で生物学的標本を処置すること;
を含んでなる[0116]段落に記載の生物学的標本のガラス化方法。
(c)ガラス化した生物学的標本を解凍すること;
を含んでなる[0116]段落に記載の生物学的標本のガラス化方法。
(i)ガラス化した生物学的標本を凍結物質が含まれている保存用コンテナに移すこと;および
(ii)ガラス化した生物学的標本を解凍しようとするときまでガラス化した生物学的標本を含む保存用コンテナを保存すること;
を含んでなる[0116]段落に記載の生物学的標本のガラス化方法。
(i)凍結物質から生物学的標本を除去すること;および
(ii)生物学的標本を解凍溶液中に置くこと;
を含んでなる[0120]段落に記載の生物学的標本のガラス化方法。
(i)基本培地に生物学的標本を置くこと;
を含んでなり、ここで生物学的標本を胚、卵母細胞、精子、胚盤胞および桑実胚からなる群から選択し、移動用器具をループ、ネットおよびヘラからなる群から選択し、(b)がさらに:
(i)生物学的標本を含む移動用器具を凍結物質内に置くことであって、ここで凍結物質をコンテナ内に配置して生物学的標本をガラス化し:および
(ii)凍結物質、移動用器具および生物学的標本を含むコンテナに封をすること;
を含んでなる[0116]段落に記載の生物学的標本のガラス化方法。
(c)ガラス化した生物学的標本を解凍すること;
を含んでなる[0125]段落に記載の生物学的標本のガラス化方法。
(i)凍結物質から生物学的標本を除去すること;および
(ii)生物学的標本を解凍溶液中に置くこと;
を含んでなる[0127]段落に記載の生物学的標本のガラス化方法。
(b)生物学的標本をコンテナ内に配置した凍結物質内に移動させるための移動用器具を用いて、生物学的標本を凍結物質に直接暴露し、ガラス化を行うこと;
(c)凍結物質、移動用器具および生物学的標本を含むコンテナに封をすること;
(d)封をしたコンテナを保存に供すること;
(e)封をしたコンテナから生物学的標本を除去すること;および
(f)生物学的標本を解凍溶液中に置くこと;
からなる生物学的標本のガラス化方法。
発生細胞のガラス化方法。
(i)ガラス化の前に凍結防止剤で生物学的標本を処置すること;
を含んでなる[0136]段落に記載の発生細胞のガラス化方法。
(i)ガラス化の前に凍結防止剤で胚盤胞または卵割段階にある胚を処置すること;
を含んでなる[0139]段落に記載の哺乳動物の胚盤胞または卵割段階にある胚のガラス化方法。
ウマの胚またはブタの胚のガラス化方法。
ガラス化の前に凍結防止剤で胚を処置すること;
を含んでなる[0144]段落に記載のウマの胚またはブタの胚のガラス化方法。
(b)生物学的標本を直接凍結物質に暴露する生物学的標本をガラス化するための指示;
(c)ループ;および
(d)バイアル、ここでバイアルはガラス化した生物学的標本を含有するループを保存するのに適当な大きさおよび形状である;
からなる生物学的標本をガラス化するためのキット。
(e)凍結保護剤;
を含んでなる[0148]段落に記載の生物学的標本をガラス化するためのキット。
Claims (6)
- (a)移動用器具;(b)凍結防止(保護)剤を含む培地の薄膜であり、薄膜は培地と移動用器具の間の付着力により保持される;および(c)薄膜に保持された1または2以上の発生細胞を含む、発生細胞をガラス化するためのシステム。
- 移動用器具が薄膜を取り囲む、請求項1に記載のシステム。
- 移動用器具がループである、請求項2に記載のシステム。
- 発生細胞が卵母細胞、桑実胚、胚盤胞、または胚を含む、請求項1に記載のシステム。
- a)発生細胞を移動用器具上に配置し、ここで移動用器具は、薄膜と移動用器具の間の付着力により保持された薄膜中に発生細胞を保持するものであり;b)発生細胞をガラス化することを含む、発生細胞のガラス化方法。
- 発生細胞が卵母細胞、桑実胚、胚盤胞、または胚を含む、請求項5に記載の方法。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009148221A (ja) * | 2007-12-21 | 2009-07-09 | National Agriculture & Food Research Organization | 生殖細胞凍結保存容器及び生殖細胞凍結保存方法 |
WO2018038115A1 (ja) * | 2016-08-22 | 2018-03-01 | 株式会社バイオベルデ | ウシ生殖細胞の凍結保存用組成物及び凍結保存方法 |
KR102066218B1 (ko) * | 2019-04-19 | 2020-01-14 | 주식회사 엠케이바이오텍 | 개과 동물의 난자를 유리화 동결하고 해동하는 방법 및 그에 따른 동결해동난자 |
Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4318861B2 (ja) * | 1998-10-14 | 2009-08-26 | フオレスト,カトリーナ・テイー | 生体試料のガラス化方法 |
JP4373025B2 (ja) * | 2001-04-18 | 2009-11-25 | 株式会社北里サプライ | 卵凍結保存用具および筒状部材保持器具 |
JP4355186B2 (ja) | 2003-04-15 | 2009-10-28 | 株式会社北里サプライ | 卵凍結保存用具 |
JP2006525006A (ja) * | 2003-05-08 | 2006-11-09 | セルアーティス アーベー | 閉塞ストローガラス化方法を利用するヒト胚盤胞由来幹細胞の低温保存法 |
EP1660653A4 (en) * | 2003-09-02 | 2007-10-03 | Univ North Carolina | BIODEGRADABLE CONJUGATES OF POLYMERS AND LIGANDS AND USE IN THE ISOLATION OF CELL SUBPOPULATIONS, CRYOPRESERVATION, CULTURE AND TRANSPLANTATION OF CELLS |
CN1309301C (zh) * | 2003-09-28 | 2007-04-11 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 鲟科鱼类精子超低温冷冻保存方法 |
AU2005228201A1 (en) * | 2004-03-25 | 2005-10-13 | Community Hospitals Of Indiana, Inc. | Cryopreservation media |
WO2006066385A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-29 | Mcgill University | Retractable tool and method for manipulating developmental cells in a process of cryopreservation |
US20060246414A1 (en) * | 2005-04-28 | 2006-11-02 | Livestock Research Institute, Council Of Agriculture | Method for microdrop vitrification of cells |
FR2894830B1 (fr) * | 2005-12-19 | 2008-04-04 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede d'inactivation virale par chauffage a sec selon la temperature de transition vitreuse |
US8652844B2 (en) * | 2006-06-13 | 2014-02-18 | The Curators Of The University Of Missouri | Methods for the cryopreservation of animal cells that contain high levels of intracellular lipids |
JP4539613B2 (ja) | 2006-06-28 | 2010-09-08 | 富士ゼロックス株式会社 | 画像形成装置、画像生成方法およびプログラム |
US20080113431A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-05-15 | Mariposa Biotechnology, Inc. | Methods and compositions for cryopreserving oocytes |
US20080113432A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-05-15 | Mariposa Biotechnology, Inc. | Methods and compositions for reanimating cryopreserved oocytes |
JP4189518B2 (ja) | 2007-03-15 | 2008-12-03 | コニカミノルタビジネステクノロジーズ株式会社 | 画像形成装置及び画像形成システム |
CN100459861C (zh) * | 2007-06-18 | 2009-02-11 | 北京锦绣大地农业股份有限公司 | 家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法 |
ES2319714B1 (es) * | 2007-09-27 | 2010-02-16 | Universidad De Sevilla | Criopreservacion celular por vitrificacion con bajas concentraciones de crioprotector. |
JP2011511623A (ja) * | 2008-01-17 | 2011-04-14 | ヴァンス プロダクツ インコーポレイテッド | ガラス化のための急冷装置 |
DK2257155T3 (en) * | 2008-02-25 | 2019-01-21 | Genea Ip Holdings Pty Ltd | CRYO CONSERVATION OF BIOLOGICAL CELLS AND TISSUE |
US8030063B2 (en) * | 2008-06-18 | 2011-10-04 | The Cleveland Clinic Foundation | Systems and methods for vitrifying tissue |
JP5157774B2 (ja) | 2008-09-17 | 2013-03-06 | 株式会社リコー | 画像形成装置、画像形成方法およびプログラム |
US9700038B2 (en) | 2009-02-25 | 2017-07-11 | Genea Limited | Cryopreservation of biological cells and tissues |
CN101779623B (zh) * | 2010-03-11 | 2012-02-22 | 中国农业大学 | 一种卵母细胞/胚胎玻璃化冷冻保存方法及其冷冻载体 |
CN103179852B (zh) | 2010-05-28 | 2015-04-08 | 格尼亚有限公司 | 改良的显微操作和储存装置以及方法 |
WO2013020032A2 (en) * | 2011-08-04 | 2013-02-07 | University Of Kansas | Automated vitrification device |
WO2013096659A1 (en) * | 2011-12-20 | 2013-06-27 | Cook General Biotechnology Llc | Methods and compositions for storage of animal cells |
US9216037B2 (en) | 2013-06-21 | 2015-12-22 | Previvo Genetics, Llc | Uterine lavage for embryo retrieval |
US9282995B2 (en) | 2011-12-22 | 2016-03-15 | Previvo Genetics, Llc | Recovery and processing of human embryos formed in vivo |
US20150272622A1 (en) * | 2011-12-22 | 2015-10-01 | Previvo Genetics, Llc | Recovery and processing of human embryos formed in vivo |
US10433540B2 (en) * | 2014-06-09 | 2019-10-08 | Somnio Global Holdings, Llc | Capillary assisted vitrification processes and devices |
WO2016040063A1 (en) * | 2014-09-08 | 2016-03-17 | The Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Cryopreservation instrument and method of using same |
CN104222071B (zh) * | 2014-09-22 | 2016-04-20 | 四川大学华西第二医院 | 卵巢组织深低温保存方法 |
EP3386297A1 (en) | 2015-12-07 | 2018-10-17 | CooperSurgical, Inc. | Low temperature specimen carriers and related methods |
CN107232185B (zh) * | 2017-07-31 | 2021-02-26 | 青岛德瑞骏发生物科技股份有限公司 | 一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液、冷冻保存方法和应用 |
ES2737681A1 (es) * | 2018-07-11 | 2020-01-15 | Univ Sevilla | Dispositivo y procedimiento de preparacion de celulas para vitrificacion ultra-rapida por deshidratacion |
US11116206B2 (en) | 2018-10-01 | 2021-09-14 | Cook Medical Technologies Llc | Cryocontainer |
AR118008A1 (es) * | 2019-02-07 | 2021-09-08 | Vitricell Sa | Composiciones para criopreservación de un material biológico |
ES2713800B2 (es) * | 2019-04-16 | 2020-06-24 | Univ Valencia Politecnica | Dispositivo para la criopreservacion de una muestra de ovulos y embriones por vitrificacion |
CN112293407A (zh) * | 2019-07-28 | 2021-02-02 | 符晓倩 | 一种卵巢组织程序化冷冻保存的方法 |
CN116267890A (zh) * | 2023-02-08 | 2023-06-23 | 天津大学 | 一种含硫氨基酸的冻存保护剂及生物样本低温保存方法 |
CN117305104A (zh) * | 2023-09-04 | 2023-12-29 | 上海交通大学 | 一种多物理场科学实验系统 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4817397A (en) * | 1988-06-21 | 1989-04-04 | Grischenko Valentin I | Device for refrigeration and freezing of biological objects |
DE3912723A1 (de) † | 1989-04-14 | 1990-10-18 | Naumann Dieter | Vorrichtung fuer eine vibrierende platinoese |
WO1991003935A1 (en) * | 1989-09-22 | 1991-04-04 | Tsi-Mason Research Institute | Method and compositions for one-step cryopreservation of embryos |
DE9109683U1 (de) † | 1991-08-03 | 1991-10-02 | Barkey, Volker, 4800 Bielefeld | Impföse |
US5518878A (en) * | 1993-09-15 | 1996-05-21 | Organogenesis Inc. | Cryopreservation of cultured skin or cornea equivalents with agitation |
US5856172A (en) * | 1997-01-03 | 1999-01-05 | Quality Technologies, Llc | Preservation of microorganisms in a vial with a cap comprising an immobilized desiccant |
AU1612699A (en) * | 1998-06-17 | 2000-01-05 | H. Randall Craig | Cryogenic freezing of liquids |
JP4318861B2 (ja) * | 1998-10-14 | 2009-08-26 | フオレスト,カトリーナ・テイー | 生体試料のガラス化方法 |
US20060046243A1 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Tyho-Galileo Research Laboratories | Method for vitrification of mammalian cells |
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Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009148221A (ja) * | 2007-12-21 | 2009-07-09 | National Agriculture & Food Research Organization | 生殖細胞凍結保存容器及び生殖細胞凍結保存方法 |
WO2018038115A1 (ja) * | 2016-08-22 | 2018-03-01 | 株式会社バイオベルデ | ウシ生殖細胞の凍結保存用組成物及び凍結保存方法 |
KR20190042638A (ko) * | 2016-08-22 | 2019-04-24 | 가부시키가이샤 바이오베르데 | 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법 |
KR102316820B1 (ko) | 2016-08-22 | 2021-10-22 | 가부시키가이샤 바이오베르데 | 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법 |
KR20210127774A (ko) * | 2016-08-22 | 2021-10-22 | 가부시키가이샤 바이오베르데 | 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법 |
KR102328832B1 (ko) | 2016-08-22 | 2021-11-18 | 가부시키가이샤 바이오베르데 | 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법 |
KR102066218B1 (ko) * | 2019-04-19 | 2020-01-14 | 주식회사 엠케이바이오텍 | 개과 동물의 난자를 유리화 동결하고 해동하는 방법 및 그에 따른 동결해동난자 |
WO2020213789A1 (ko) * | 2019-04-19 | 2020-10-22 | 주식회사 엠케이바이오텍 | 개과 동물의 난자를 유리화 동결하고 해동하는 방법 및 그에 따른 동결해동난자 |
JP2021529505A (ja) * | 2019-04-19 | 2021-11-04 | エムケイバイオテック カンパニー リミテッドMkbiotech. Co., Ltd. | イヌ科動物の卵子をガラス化凍結し解凍する方法およびそれによる凍結解凍卵子 |
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---|---|---|
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Oktay et al. | Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? | |
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