CN116267890A - 一种含硫氨基酸的冻存保护剂及生物样本低温保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含硫氨基酸的冻存保护剂及生物样本低温保存方法；该细胞冻存保护剂的主要组分是甲硫氨酸亚砜；相应的冻存保护液由细胞培养基与甲硫氨酸亚砜组成，其中甲硫氨酸亚砜质量含量为2‑10％。将冻存保护液与细胞悬液物理混合于冻存管之中，冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％CO2，37℃培养箱孵育0.5‑4小时后转移至液氮冻存。甲硫氨基亚砜对细胞无毒，细胞相容性良好。在最佳方案下，甲硫氨酸亚砜在超速冻存法下表现出有效的细胞冻存保护效果，细胞复苏后细胞成活率达到84.0％。替代传统有毒冻存保护剂二甲基亚砜的可能性，并为开发无毒/低毒的二甲基亚砜类似物用于细胞冷冻保护应用提供了技术。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物相容性的含硫氨基酸冻存保护剂及细胞低温冻存技术。
背景技术
细胞越来越广泛地应用于生物医学的各个领域，包括细胞治疗、组织工程、药物筛选以及化妆品。随着这些技术的不断发展，在这些技术中处于“主角地位”的活细胞也愈加凸显了其重要性。但细胞离体后会失去原有生存内环境，虽然在体外培养可使之保持活性和功能，但其各项生物学特性可能会将随着培养时间的延长、传代次数的增多和培养条件的改变而不断发生变化，影响其使用效果。将细胞存储起来是维持其活性和功能的最佳选择，此外，将细胞储存起来也更便于细胞的运输。因此，在细胞应用之前如何高效保存细胞，维持其正常生理功能及细胞活性至关重要，是细胞在各个方面规模化应用的重要前提。超低温冻存技术是保存细胞的主要技术手段，将细胞置于-80或-196摄氏度下，细胞新陈代谢停止，处于休眠或假死状态。[1]但在降温过程中，冰晶的形成会对细胞造成致命的渗透压损伤和机械损伤，因此需要加入冻存保护剂保护细胞免受这两种损伤从而成活。[2]其余生物样本(血液、组织)的低温存储也面临同样的挑战。目前，最常用的冷冻保存策略是添加二甲基亚砜(DMSO)作为冻存保护剂，[3]但DMSO具有内在毒性，会抑制细胞繁殖，改变细胞的生物功能以及引发干细胞分化等，用于人体容易引起恶心，呕吐，腹泻，肾衰竭，心动过缓，心脏阻塞，肺水肿，心跳停止和支气管痉挛等副作用。[4]因此，开发无毒高效的冻存保护剂具有重要意义。
目前，绝大部份细胞冻存都以DMSO作为主要冻存保护剂，添加量通常为10％(由细胞培养基配制成而成)，但DMSO具有内在的毒性，寻求其替代物至关重要。自然界中存在部分含硫氨基酸，它们的结构与DMSO相似，但甲硫氨酸，蒜氨酸具有良好的生物相容性。从DMSO的结构出发，甲硫氨酸亚砜是一种较为贴切的DMSO的类似物，是一种从红藻中分离出来的含硫氨基酸，具有氨基酸的一般性质，能通过氨基和羧基与水结合形成氢键，阻碍冰的形成和生长。在生物系统中，甲硫氨酸亚砜可作为甲硫氨酸亚砜还原酶系统中的信号分子，参与蛋白质合成转化。[5]不对细胞带来严重的细胞毒性的基础上，与DMSO类似使用细胞完全培养基(1640完全培养基、DMEM培养基等)将甲硫氨酸亚砜配制成质量含量为2-10％(DMSO通常使用浓度为10％)的冻存保护液，实现细胞的有效超低温冻存具有重要意义，将为替代传统有毒冻存保护剂DMSO提供可能，并为开发无毒/低毒的DMSO类似物用于细胞冷冻保护应用提供见解，这对细胞保存领域有十分重要的意义。
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发明内容
本发明的目的是，针对现有冻存保护剂DMSO存在的问题，开发无毒高效的冻存保护剂为细胞超低温保存提供一种无毒高效的冻存保护剂。甲硫氨酸亚砜具有与二甲基亚砜相似的化学结构，含有一个亲水的亚硫酰基，甲硫氨酸亚砜S＝O键的氧原子与水O-H键中的氢原子能够结合形成氢键，氢键的生成可阻止温度降到零度下时水分子间氢键的形成。针对现有冻存保护剂的局限，开发基于DMSO类似物冻存保护剂用于细胞冻存，为超低温条件下细胞的保存提供无毒/低毒的冻存保护剂。
本发明利用一种含硫氨基酸细胞冻存保护剂保存细胞，细胞冻存保护剂的主要组分是甲硫氨酸亚砜，技术方案如下：
本发明的一种含硫氨基酸细胞冻存保护剂，该细胞冻存保护剂由甲硫氨酸亚砜和细胞培养基组成，其中甲硫氨酸亚砜质量百分含量为2-10％。
本发明的含硫氨基酸细胞冻存保护剂用于细胞冻存的方法，包括如下步骤：
(1)将甲硫氨酸亚砜称重加入细胞完全培养基中，配制质量浓度为2-10％的细胞冻存保护液；
(2)将配制的质量浓度为2-10％细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；
(3)将步骤(2)制得的质量浓度为2-10％细胞冻存保护液，抽取冻存保护液转移至冻存管中；
(4)将细胞悬液物理混合于步骤(3)冻存管之中；
(5)将步骤(4)冻存管直接转移至液氮冻存；或放置于5％ CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。
本发明的细胞冻存的方法，适用于的细胞适用于成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞以及干细胞。
本发明的含硫氨基酸细胞冻存保护剂用于血液存储，以PBS缓冲液作为溶剂，配制质量浓度为2-10％甲硫氨酸亚砜形成冻存保护液；将配制好的冻存保护液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，抽取冻存保护液于冻存管中，加入占冻存保护液体积分数1～6％的红细胞，然后置于液氮中进行超速冻存。
本发明含硫氨基酸细胞冻存保护剂，适用于多种离体生物组织的短期及长期冻存，如皮肤、骨、软骨、心脏或肾脏。
具体说明如下：
一种利用含硫氨基酸细胞冻存保护剂保存细胞的方法，该细胞冻存保护剂的主要组分是甲硫氨酸亚砜，使用细胞完全培养基(1640完全培养基、DMEM培养基等)甲硫氨酸亚砜配制成质量含量为2-10％的冻存保护液，将冻存保护液和细胞悬液物理混合冷冻保存细胞。
所述含硫氨基酸细胞冻存保护剂的主要组分是甲硫氨酸亚砜。
所述含硫氨基酸细胞冻存保护剂是DMSO类似物。
具体而言，将甲硫氨酸亚砜称重加入细胞完全培养基中，配制质量浓度为2-10％的细胞冻存保护液；将配制质量浓度为2-10％的细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；过滤后，将质量浓度为2-10％的细胞冻存保护液，分别抽取冻存保护液转移至冻存管中。将细胞悬液物理混合于冻存管之中，冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％ CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。该冻存保护剂适用于但是不限于如下细胞：成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞以及干细胞。
该含硫氨基酸细胞冻存保护剂可用于血液存储(如猪红细胞，兔血红细胞，大鼠血红细胞等)，具体技术方法如下：
以PBS缓冲液作为溶剂，配制质量浓度为2-10％细胞冻存保护液。将配制好的冻存保护液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，抽取冻存保护液于冻存管中，加入占冻存保护液体积分数1～6％的红细胞，然后将各个样品直接置于液氮中进行超速冻存。
本发明的创新性如下：1)基于DMSO的结构特点，选择含有亲水亚硫酰基的甲硫氨酸亚砜作为冻存保护剂，无DMSO的添加避免细胞受到化学试剂的损害，甲硫氨酸亚砜生物生物相容性良好，添加量6％低于DMSO的常规使用量，保存简便易行，无需使用梯度冻存法；2)甲硫氨酸亚砜S＝O键的氧原子与水O-H键中的氢原子能够结合形成氢键，氢键的生成可阻止温度降到零度下时水分子间氢键的形成，同时甲硫氨酸亚砜具有比DMSO较高的生物相容性。
本发明为了解决现有细胞冻存保护剂的不足之处，开发了含硫氨基酸甲硫氨酸亚砜为生物样本冻存保护剂，并建立了一种无毒高效保存方法，克服传统基于DMSO冻存技术存在毒性的问题。甲硫氨酸亚砜含有一个亲水的亚硫酰基，甲硫氨酸亚砜S＝O键的氧原子与水O-H键中的氢原子能够结合形成氢键，利用甲硫氨酸亚砜具有与二甲基亚砜相似的化学结构用于细胞冷冻保存，提供一种无毒/低毒的二甲基亚砜类似物用于细胞冷冻保护。甲硫氨酸亚砜具有抑制冰晶形成和重结晶能力，在-6℃淬火30min后，冰晶形貌相对圆滑，如图1a所示，此外，冰晶尺寸明显减小相比于纯水而言，6％甲硫氨酸亚砜冰晶尺寸小于30.3μm(如图1b)。更为重要的是，与冻存保护剂DMSO进行比较，甲硫氨酸亚砜具有比DMSO较好的生物相容性(如图2)。甲硫氨酸亚砜S＝O键的氧原子与水O-H键中的氢原子能够结合形成氢键，氢键的生成可阻止温度降到零度下时水分子间氢键的形成，从而达到良好的冻存效果，冻存复苏后的细胞其贴壁能力和正常的细胞一样,其细胞形态均与正常细胞一致，没有发生改变(图3)。细胞在复苏后细胞的生长率与未冻的细胞基本一致，没有显著差异，复苏后的细胞同样保持了其正常的增殖能力。本发明首次将DMSO类似物甲硫氨酸亚砜应用于细胞冻存，利用其于DMSO相似的化学结构为实现细胞在超低温下的保存提供了可能(图4)。
附图说明
图1：甲硫氨酸亚砜和DMSO冰重结晶抑制活性：其中图1a：纯水和纯水分散的甲硫氨酸亚砜和DMSO在-6℃下退火30min后的冰重结晶的光学显微图像；图1b：纯水和含有甲硫氨酸亚砜和DMSO溶液的平均最大冰晶粒径。
图2：甲硫氨酸亚砜和DMSO的细胞毒性评估：其中：图2a：甲硫氨酸亚砜与DMSO细胞毒性贴壁显微镜图；图2b：甲硫氨酸亚砜与DMSO细胞毒性正常细胞贴壁率统计结果柱状图。图3：复苏后细胞的黏附和增殖行为考察：其中图3a：冻存复苏后细胞黏附显微镜图；图3b:冻存复苏后细胞增殖柱状图。
图4：使用甲硫氨酸亚砜作为冻存保护剂超快速冷冻细胞：其中图4a：冻存复苏后细胞活死染色荧光图；图4b：冻存复苏后细胞成活率统计结果的柱状图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但本发明不受这些具体实施例的限制。
含硫氨基酸细胞冻存保护剂的主要组分是甲硫氨酸亚砜；将甲硫氨酸亚砜称重加入细胞完全培养基中，配制质量浓度为2-10％的细胞冻存保护液；将配制质量浓度为2-10％的细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；过滤后，将质量浓度为2-10％的细胞冻存保护液，分别抽取冻存保护液转移至冻存管中。将细胞悬液物理混合于冻存管之中，冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％ CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。
实施例1：
(1)将甲硫氨酸亚砜称重加入至1640完全培养基中，配制质量浓度为2的细胞冻存保护液；
(2)将配制的质量浓度为2％细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；
(3)将制得的质量浓度为2％细胞冻存保护液，抽取冻存保护液分别转移至冻存管中。
(4)将含有1×106个L929细胞悬液物理混合于冻存管之中。
(5)将冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％ CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。37℃水浴复苏细胞，通过荧光染色的方法检测冻存管中细胞的存活率，结果如图4b示,随着孵育时间的延长，2％甲硫氨酸亚砜冻存后的细胞复苏成活率从18.0％增加至50.5％。
实施例2：
(1)将甲硫氨酸亚砜称重加入至1640完全培养基中，配制质量浓度为6的细胞冻存保护液；
(2)将配制的质量浓度为6％细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；
(3)将制得的质量浓度为6％细胞冻存保护液，抽取冻存保护液分别转移至冻存管中。。
(4)将含有1×106个L929细胞悬液物理混合于冻存管之中。
(5)将冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％ CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。37℃水浴复苏细胞，通过荧光染色的方法检测冻存管中细胞的存活率，结果如图4b示，随着孵育时间的延长，6％甲硫氨酸亚砜冻存后的细胞复苏成活率在孵育1小时后快冻的细胞成活率高达84％。
实施例3：
(1)将甲硫氨酸亚砜称重加入至1640完全培养基中，配制质量浓度为10的细胞冻存保护液；
(2)将配制的质量浓度为10％细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；
(3)将制得的质量浓度为10％细胞冻存保护液，抽取冻存保护液分别转移至冻存管中。。
(4)将含有1×106个L929细胞悬液物理混合于冻存管之中。
(5)将冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％ CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。37℃水浴复苏细胞，通过荧光染色的方法检测冻存管中细胞的存活率，结果如图4b示，随着孵育时间的延长，10％甲硫氨酸亚砜冻存后的细胞复苏成活率从41.0％降至7.2％。
实施例4：
(1)将甲硫氨酸亚砜称重加入至1640完全培养基中，配制质量浓度为6的细胞冻存保护液；
(2)将配制的质量浓度为6％细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；
(3)将制得的质量浓度为6％细胞冻存保护液，抽取冻存保护液分别转移至冻存管中。
(4)将含有0.5×106个L929细胞悬液物理混合于冻存管之中。
(5)将冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。37℃水浴复苏细胞，通过荧光染色的方法检测冻存管中细胞的复苏存活率，存活率与实施例2中的结果类同。
实施例5：
(1)将甲硫氨酸亚砜称重加入至1640完全培养基中，配制质量浓度为6的细胞冻存保护液；
(2)将配制的质量浓度为6％细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；
(3)将制得的质量浓度为6％细胞细胞冻存保护液，抽取冻存保护液分别转移至冻存管中。
(4)将含有1×106个GLC-82细胞悬液物理混合于冻存管之中。
(5)将冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。37℃水浴复苏细胞，通过荧光染色的方法检测冻存管中细胞的复苏存活率，存活率与实施例2中的结果类同。
实施例6：
(1)将甲硫氨酸亚砜称重加入至DMEM完全培养基中，配制质量浓度为6的细胞冻存保护液；
(2)将配制的质量浓度为6％细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；
(3)将制得的质量浓度为6％细胞细胞冻存保护液，抽取冻存保护液分别转移至冻存管中。
(4)将含有1×106个3T3细胞悬液物理混合于冻存管之中。
(5)将冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。37℃水浴复苏细胞，通过荧光染色的方法检测冻存管中细胞的存活率，存活率与实施例2中的结果类同。
本发明所述的含硫氨基酸冻存保护剂甲硫氨酸亚砜保存细胞各方性能指标如下：
(1)冰重结晶抑制活性测试
从1m高度，将水、甲硫氨酸亚砜、DMSO溶液分别滴到放置在液氮蒸汽上的盖玻片上。随后，将盖玻片快速转移到预冷至-30℃的样品室中。然后在10℃ min-1的加热速率下将温度加热至-6℃进行退火30min。随后，用光学显微镜拍摄冰重结晶的图像。纯水冰晶显微照片作为阴性对照。利用ImageJ测量软件测量冰晶的尺寸大小。平均最大晶粒尺寸值越小，冰重结晶抑制活性越好。
(2)细胞毒性测试
细胞在含有2-4％甲硫氨酸亚砜和DMSO的培养基中暴露12小时，细胞完全贴壁后，在倒置显微镜的视野中进行观察并记录细胞形态，细胞贴壁形态如图2a所示，细胞形态与对照一致，说明甲硫氨基亚砜对细胞无毒，细胞相容性良好，4％甲硫氨酸亚砜的正常细胞贴壁率仍高达为92.4％(图2b)。而DMSO组随着浓度的增加细胞形态发生变化，细胞形态皱缩变形，细胞甚至死亡，如图2a所示；而4％DMSO的正常细胞贴壁率仅为22.6％,如图2b所示，细胞受到了严重的细胞损伤由于DMSO固有的内在毒性。
(3)利用含硫氨基酸冻存保护剂甲硫氨酸亚砜作为冻存保护剂保存细胞
甲硫氨酸亚砜作为冻存保护剂，利用细胞完全培养基配制成一定浓度的冻存保护液，将一定浓度冻存保护液与细胞悬液物理混合于冻存管之中，冻存管直接转移至液氮冻存，或放置于5％ CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。37℃水浴复苏细胞，通过荧光染色的方法检测冻存管中细胞的存活率，如图4b所示，6％甲硫氨酸亚砜冻存后的细胞复苏成活率在孵育1小时后快冻的细胞复苏成活率高达84％。
(4)细胞贴壁能力测试
将细胞样品用PBS缓冲液洗涤并重悬在细胞完全培养基中，然后将细胞悬液分别置于24孔板中培养(37℃，5％ CO2)。细胞完全贴壁后，在24小时，48小时和72小时随机对每个样品在倒置显微镜的视野进行观察并记录细胞形态以及贴壁细胞的数目，如图3a所示，实验组甲硫氨酸亚砜细胞形态与新鲜对照细胞形状一致，细胞形态正常，随着培养时间的增加，细胞数目逐渐增加，具有与对照组相似的细胞增殖率，表明使用甲硫氨酸亚砜冻存细胞，复苏后的黏附和增殖细胞功能未受损伤。
(5)细胞增殖能力测试
将细胞样品置于12孔板中，加入1细胞完全培养基进行培养(37℃，5％ CO2)，并用刚从培养瓶中消化下来的新鲜细胞作为对照。经过12小时细胞完全贴壁后作为起始时间点，每个样品在倒置显微镜下随机选择3个视野，3天内每24小时记录一次每个视野中的贴壁细胞数量，并每天更换培养基保证细胞正常生长，统计细胞增殖能力结果如图3b所示，随着培养时间的增加，细胞数目逐渐增加，甲硫氨酸亚砜实验组增殖率由1.0变为4.1，对照组增殖率由1变为4.0，实验组具有与对照组相似的细胞增殖率。
本发明公开和提出的所有方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变操作细节和实验环境等环节实现，尽管本发明的方法已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或重新组合，来实现最终的冻存保护效果。
Claims (5)
1.一种含硫氨基酸细胞冻存保护剂，其特征在于，该细胞冻存保护剂由甲硫氨酸亚砜和细胞培养基组成，其中甲硫氨酸亚砜质量百分含量为2-10％。
2.权利要求1的含硫氨基酸细胞冻存保护剂用于细胞冻存的方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)将甲硫氨酸亚砜称重加入细胞完全培养基中，配制质量浓度为2-10％的细胞冻存保护液；
(2)将配制的质量浓度为2-10％细胞冻存保护液用0.22微米的滤膜过滤除菌；
(3)将步骤(2)制得的质量浓度为2-10％细胞冻存保护液，抽取冻存保护液转移至冻存管中；
(4)将细胞悬液物理混合于步骤(3)冻存管之中；
(5)将步骤(4)冻存管直接转移至液氮冻存；或放置于5％CO2，37℃培养箱孵育0.5-4小时后转移至液氮冻存。
3.如权利要求2所述的细胞冻存的方法，其特征是，细胞适用于成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞以及干细胞。
4.权利要求1的含硫氨基酸细胞冻存保护剂用于血液存储，其特征是，以PBS缓冲液作为溶剂，配制质量浓度为2-10％甲硫氨酸亚砜形成冻存保护液；将配制好的冻存保护液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，抽取冻存保护液于冻存管中，加入占冻存保护液体积分数1～6％的红细胞，然后置于液氮中进行超速冻存。
5.权利要求1的含硫氨基酸细胞冻存保护剂，适用于多种离体生物组织的短期及长期冻存，如皮肤、骨、软骨、心脏或肾脏。
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