KR101510946B1 - 유리화동결을 위한 변형된 스트로우 로딩방법 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스트로우 유리화 동결법(straw vitrification)에 관한 것 으로, 보다 구체적으로, 플라스틱 스트로우의 내벽에 만든 홈 부위(depressed area)에 부착시키는 방법을 이용하는, 생식세포의 동결보존 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 생식세포의 주입과정이 편리할 뿐만 아니 라, 융해 후 생식세포의 회수율 및 생존율도 우수하므로, 생식세포의 동결보존을 활용하는 분야에 매우 유용할 것이다.

Description

유리화동결을 위한 변형된 스트로우 로딩방법 및 이의 이용 {Modified Straw Loading Method for Vitrification and Use thereof}

발명은 스트로우 유리화 동결법(straw vitrification)에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 스트로우의 내벽에 형성된 홈 부위(depressed area)에 부착시키는 방법을 이용하는 생식세포의 동결보존 방법에 관한 것이다.

세포나 조직, 개체 등과 같은 생물학적 재료를 형태와 기능적인 변화가 일어나지 않은 상태로 저온에서 장기간 보관하고, 원래 상태의 기능을 회복하도록 융해하는 과정을 동결보존(cryopreservation)이라 한다.

이러한 동결보존은 인류의 생활과 매우 밀접한 관련을 맺고 발전해 왔고, 특히 최근 들어 눈부시게 발전하는 생식생물학 (reproductive biology)과 인간과 동물의 보조생식술 (assisted reproductive technology, ART) 분야에 접목되어 그 중요성이 점점 커지고 있다. 초기에는 크기가 작은 정자나 배아에서만 사용할 수 있었던 동결기법은 그 발전을 통해 가장 큰 세포인 난자와 조직의 보관으로 그 적응증을 넓혀가고 있다.

일반적인 체세포에 비해 상대적으로 크기가 크고 수분의 함유량이 높은 배아와 난자의 동결보존을 위해 연구자들은 우선적으로 일반적인 완만동결-급속융해법 (slow cooling-rapid thawing)을 도입하여 사용하였다. 완만동결 방법은 우선 세포질 내 수분의 일부와 투과 동결억제제 (permeable cryoprotectant)를 치환하여 평형시킨다. 이후 세포 동결기에 넣어 세포외부의 수분을 천천히 동결시키는 과정을 통해 세포외부의 동결억제제의 농도를 올려 삼투압을 발생시키고, 이 힘을 이용하여 세포 내에 남아있는 물을 천천히 제거함으로 최소한의 수분만을 남겨 얼음결정의 생성을 최소화시키는 기술이다. 완만동결은 비교적 그 기술이 단순하여 손쉽게 사용 가능한 장점을 가지고 있으나, 상대적으로 고가의 장비와 많은 액체질소의 사용량, 많은 시간의 소요, 얼음결정에 의한 동결상해 (cryoinjury)와 같은 단점을 가지고 있다.

동결과정 중에 세포의 손상을 유발하는 가장 큰 원인은 동결 시 생기는 빙결정의 형성에 의한 기계적인 손상이다. 따라서 이러한 손상을 극복하기 위해 많은 학자들은 동결방법, 동결속도, 동결보호제의 선택 및 융해방법에 대한 다양한 연구를 시도하였으며, 최근에는 아예 빙결정형성이 일어나지 않는 유리화 동결법을 도입하였다. 연구에 따르면 배아나 난자와 같이 상대적으로 크고 수분함량이 높은 세포의 유리화동결을 위해서는 일반적인 체세포에 비해 고농도의 동결억제제의 노출시간을 줄이거나 냉각속도를 올리는 것이 필수적이다.

유리화 동결법의 도입은 배아의 동결 보존에 의미 있는 발전으로 평가되고, 난자와 초기 배아의 동결 보존 시 동결에 의한 손상을 막기 위해 첨가하는 동결 보호제는 세포가 동결하는 과정에서 생기는 세포 내 전해질의 농축이나 상승 및 세포내외의 빙 결정 형성 등 생존에 불리한 상태를 완화하거나 조절하는 작용을 한다. 모든 세포에서 성공적인 동결 보존을 위한 중요한 요인은 세포 내 빙결정, 동결 보호제의 독성과 삼투압 팽창이다.

따라서, 유리화 동결방법에서 투과율이 높고 독성이 적은 동결억제제를 도입하거나 투과성과 비투과성 동결억제제를 조합하여 상대적 농도의 변화 없이 절대적인 농도를 낮추는 전략을 통해 세포에 미치는 독성을 감소시켜 유리화동결/융해 후 효율을 증진시키거나, 둘째, 냉각속도를 올리기 위해 유리화 동결하는 세포와 동결억제제의 부피를 줄일 수 있는 여러 가지 방법을 개발하고 있는 실정이다.

그러나, 유리화 동결방법에 있어서, 동결 용액의 종류 및 이의 노출 온도, 보관용기의 열전도율, 동결용액의 양, 배아 발달시기 및 질 등이 많은 요소들이 유리화 동결의 결과에 많은 영향을 미치기 때문에 이를 표준화하기에는 다소 어려움이 있다.

1. AGCA, Y., MONSON, R.L., NORTHEY, D.L., PESCHEL, D.E., SCHAEFER, D.M. and RUTLEDGE, J.J., 1998. Normal calves from transfer of biopsied, sexed and vitrified IVP bovine embryos. Theriogenology, 50(1), pp. 129-145. 2. AKIYAMA, K., KOBAYASHI, J., SATO, Y., SATA, R., OHASHI, M., SASAKI, E., ODA, Y., OGAWA, Y., UEDA, S., NABENISHI, H. and MATOBA, S., 2010. Calf production from vitrified bovine sexed embryos following in-straw dilution. Animal science journal = Nihon chikusan Gakkaiho, 81(4), pp. 461-466.

본 발명의 목적은 융해 후 생식세포의 생존률이 높으면서도 수행이 용이한, 내벽 홈을 가진 스트로우를 이용한 유리화 동결방법 및 이에 사용되는 생식세포 유리화동결용 내벽 홈 함유 스트로우을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 내벽 홈을 가진 스트로우에 의한 유리화 동결방법에 의해 유리화 동결된 생식세포 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 이전에 스트로우 유리화 동결법(straw vitrification)을 사용하여, 스트로우의 내벽에 생식세포를 붙이는 부착성 스트로우 유리화동결(paste an embryo in the vitrification straw, pV)법을 이용하는 생식세포 유리화 동결방법을 개발하여, 로딩 부피를 감소시킴으로써 동결 속도를 증가시킬 뿐만 아니라, 유리화동결 용액의 재결정화의 감소에 의해 용해 후 생존 가능성을 향상시켰다.

그러나, 이러한 스트로우(plastic straw) 내벽에 붙이는 방법은 그 과정에 실수의 확률이 높은 단점이 있었다. 또한 스트로우 내에 컬럼을 만들어 수정란의 동결보존을 실시할 때는 용적이 커서 융해 후 수정란의 생존율을 저하시키는 원인이 되어 실제 스트로우를 사용한 동결방법에서는 융해 후 생존율의 한계 때문에 실용화에 다소 문제점을 가지고 있음을 발견하였다.

이에, 본 발명자들은 생식세포의 주입과정이 훨씬 용이하고 편리하면서도 융해 수정란의 회수와 생존율에 전혀 나쁜 결과를 주지 않는 방법을 개발하고자 추가로 연구를 계속하여, 스트로우 내벽에 홈을 만들어 생식세포를 부착시키는 방법이 수정란의 주입과정을 매우 쉽게 할 수 있고 실수를 크게 줄일 수 있는 방법일 뿐만 아니라 효과적으로도 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

구체적으로 본 발명은 스트로우 내벽의 홈 부위에 생식세포를 부착시키는 것을 특징으로 하는 생식세포 유리화 동결방법을 제공한다.

이 때, 스트로우 내벽의 홈 부위에 생식세포를 직접 주입하여 부착시키는데, 상기 홈은 직경 1 mm 내외 및 깊이 200 ㎛ 내외의 크기의 범위를 가지는 것을 특징으로 한다.

상기 생식세포는 난자, 체외수정란 또는 배아세포일 수 있고, 본 발명의 일 구체예서는 체외수정란을 사용하였다. 특히, 상기 배아 세포는 포배기 세포(blastocyst)인 것이 바람직하다.

상기 방법에 사용할 수 있는 유리화 동결용 조성물로, 예를 들어 이하와 같은 구성의 조성물을 사용할 수 있다:

홀딩 배지 (HM: 10% FBS가 첨가된 TCM199),

유리화 동결 용액 1 (VS1: HM + 10%[vol/vol] 에틸렌 글리콜),

유리화 동결 용액 2 (VS2: HM + 35%[vol/vol] 에틸렌 글리콜 + 5% PVP((polyvinylpyrrolidone) + 0.5 M 수크로오스),

희석 용액 1 (DS1: HM + 0.3 M 수크로오스), 및

희석 용액 2 (DS2: HM + 0.15 M 수크로오스).

또한, 본 발명은 상기 생식세포 유리화 동결방법에 사용할 수 있는 스트로우를 제공한다. 즉, 생식세포 유리화 동결을 위해, 구성적으로 스트로우 내벽에 직경 1 mm 내외 및 깊이 200 ㎛ 내외의 크기를 갖는 홈이 형성된 스트로우를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 유리화 동결시킨 생식세포의 다양한 용도도 제공한다.

일 구체예로서, 상기 방법으로 유리화 동결된 생식세포를 융해 후 추가의 공정 없이, 인간을 제외한 포유류에게 직접적으로 이식하는 것을 특징으로 하는, 생식세포 이식방법을 제공할 수 있다.

실험실 동물, 예를 들어 래트, 마우스 및 햄스터, 농업용 가축, 예를 들어 돼지, 양, 소, 염소 및 말을 포함한 동물 공급원의 이용에 유용하게 사용될 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 소(bovin)과 동물에 적용하였다.

이처럼, 본 발명은 스트로우 내벽의 홈 부위에 생식세포를 부착시키는 것을 특징으로 하는 생식세포 유리화 동결방법에 관한 것으로, 이에 사용되는 변형된 스트로우 및 이와 관련된 동결보존을 활용하는 다양한 용도를 모두 포함한다.

본 발명은 스트로우 내벽에 홈을 만들어 생식세포를 주입하는 방법을 활용함으로써 생식세포 주입과정의 용이성 및 편리성을 발휘한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 방법은 융해 후 생식세포의 회수율 및 생존율도 매우 우수하므로, 생식세포의 동결보존을 활용하는 다양한 분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 aV 및 maV 방법으로 0.25 ㎖ 플라스틱 스트로우 내에 수정란을 주입하는 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 대조군, aV 및 maV 그룹에서의 TUNEL-염색된 포배의 대표적인 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 대조군, aV 및 maV 그룹에서의 골지체 및 미토콘드리아에 대한 공초점 현미경 관찰 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 대조군, aV 및 maV 그룹의 포배에서 다양한 유전자의 상대적인 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"동결보존(cryopreservation)"이란 용어는 생물 물질의 극저온에서의 보존을 나타낸다. 세포나 조직을 0℃ 이하의 온도 즉, 일반적으로 -196℃(액체질소의 끓는점)에 저장하는 것이다. 이런 저온에서는 세포가 죽는(cell death) 생화학적 반응을 포함한 모든 생물학적 활동이 효과적으로 정지된다.

"동결물질"이란 용어는 생물 물질의 초자화를 일으킬 수 있는 임의의 물질을 나타낸다. 이론상 샘플이 동결 매질과 직접 접촉하지 않기 때문에 충분히 저온인 임의의 동결매질을 사용할 수 있다. 적합한 물질로는 비 제한적으로 액체 기체, 예를 들어 액체 질소, 액체 프로판, 액체 헬륨, 에탄 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 액체 질소를 사용하였다.

"직접적으로"란 용어는 생물 물질이 예를 들어 상기 생물 물질의 표면, 또는 상기 물질이 존재하는 매질, 용액 또는 물질이 동결 물질과 접촉하게 되는 경우 상기 동결 물질에 "직접적으로" 접촉하거나 또는 "직접적으로" 노출됨을 의미한다.

"배아" 란 용어는 수정 후 기관과 기관 시스템이 발생하기 시작하는 임신후 3개월 개시 시점까지의 배아를 의미한다.

"포배 배아" 란 용어는 외부 세포층, 액체 충전강 및 내부 세포괴를 가진 세포의 볼(ball) 또는 구로 구성된 착상 전의 배아를 지칭한다.

"배지" 란 용어는 본 발명의 세포를 유지할 수 있는 적합한 배지를 의미한다. 세포가 증식할 수 있고, 정상적인 핵형을 유지할 수 있고, 다능성을 유지할 수 있는 조성물을 말한다. 다양한 배지가 당해 업계에서 알려져 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 변형된 스트로우 유리화 동결(modified straw vitrification, maV) 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 스트로우의 내벽에 생식세포를 붙이는 방법을 개선시켜, 스트로우의 내벽에 약간의 홈(depressed area)을 만들어 수정란을 부착시키는 방법을 이용하는 생식세포 유리화 동결방법에 관한 것이다.

본 발명은 종래의 칼럼 형성의 스트로우 유리화동결(column in the vitrification straw, cV)법이 아닌, 스트로우의 내벽에 생식세포를 붙이는 부착성 스트로우 유리화동결(paste an embryo in the vitrification straw, pV)법이다. 이에 한 걸음 더 나아가, 스트로우 내벽에 홈을 만들어 그 부위(depressed area)에 생식세포를 붙이는 방법을 특징으로 함으로써, 주입과정의 편리성, 안정성을 개선시키면서도 융해 후 생존율이 여전히 우수한 효과를 가진다.

본 명세서 도 1에 (a) 스트로우의 내벽에 생식세포를 붙이는 방법(aV)과 (b) 스트로우의 내벽에 홈을 만들어 생식세포를 붙이는 방법(maV)에 대해 도식화하여 나타내었다.

본 발명의 maV 방법에서 스트로우 내벽에 만든 홈은 수정란 등의 생식세포의 주입과정을 매우 쉽게 할 수 있고 실수를 크게 줄일 수 있는 방법일 뿐만 아니라 융해 수정란의 회수와 생존율에 전혀 나쁜 결과를 주지 않는다.

<대상>

본 발명의 대상으로 동결보존을 필요로 하는 생물물질이라면 제한은 없지만, 상시 생물물질은 살아있는 세포 또는 세포 주, 특히 생식 세포 또는 생식세포로부터 유래된 세포이다.

상기 세포는 임의의 발생 단계에 있을 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 포유동물 공급원, 예를 들어 비 제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이, 실험실 동물, 예를 들어 래트, 마우스 및 햄스터, 농업용 가축, 예를 들어 돼지, 양, 소, 염소 및 말을 포함한 동물 공급원으로부터 얻을 수 있다.

주로 정자와 난자, 배아 등의 생식세포, 더욱 바람직하게는 난자, 수정란, 배아들을 동결 보존하는 데 본 발명을 이용할 수 있다. 특히, 상기 수정란은 체외수정란(in vitro-produced)을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서는 소(bovin)의 체외 수정란을 사용하였다.

이들이 어떠한 발달단계에 있는지와 무관하게 본 발명의 방법을 사용할 수 있지만, 특히, 배아에 있어서, "포배기 배아세포(blastocyst)"는 그 세포수가 많고 크기가 작으므로 전핵기의 배아나 초기분열기의 배아보다 동결보존 후 생존율이 높으며, 보다 발달가능성이 크므로, 동결 보존 대상으로 가장 바람직하다. 포배기의 배아를 사용하면, 융해(해동) 후 적은 수의 배아를 이식해도 적절한 임신율을 유지함과 동시에 다태임신을 줄일 수 있는 장점도 지닌다. 본 발명의 일 실시에서는 체외 수정에 의한 7일령의 포배기 세포를 사용하였다.

배아의 발달을 위한 배양은 공지의 방법을 참조하여 당업자가 적절히 수행할 수 있다.

가능한 기간은 10 초 내지 20 분일 수 있는데, 그 이유는 이 단계에서 상기 시점이 용액과의 평형을 증진시키고 동결보호제가 충분히 살포되도록 하기 때문이나, DMSO가 존재하는 경우 세포는 다소 독성이 있는 DMSO에 너무 오래 노출되어서는 안된다. 통상적으로는 5 초 내지 약 20 분의 기간 동안, 예를 들어 약 10 초 내지 약 15 분, 약 15 초 내지 약 10 분, 약 20 초 내지 약 7.5 분, 약 30 초 내지 약 5 분, 약 40 초 내지 약 4 분, 약 50 초 내지 약 3 분, 약 30 초 내지 약 2 분, 약 45 초 내지 약 1.5 분 또는 약 1 분의 기간 동안 약 37 ℃에서 수행할 수 있다.

인간을 포함한 포유류의 난자, 배아 등은 그 수가 매우 적고 발생학적 중요성 때문에 그 어떤 세포보다도 동결보존의 필요성이 높다. 즉, 인간 난자와 배아의 성공적인 동결보존은 생식력보전의 중요한 수단으로 사용될 뿐만 아니라 생성 및 이식 배아의 수 조절을 가능하게 해 윤리 또는 법적인 문제점을 해결하는데 많은 기여를 할 수 있다.

한편, 본 발명에서는 상기 생식세포에 대하여 유리화 동결 전에 천공(Puncture)을 형성시켜 사용할 수도 있다.

상기 천공 형성은 당업계의 공지의 기술을 적절히 사용할 수 있다. 예를 들어, 미세 파스츄어 피펫(fine Pasteur pipette)으로 포배낭을 파쇄(collapsing)시킴으로써 천공을 형성할 수 있다. 이와 같이 유리화 동결 전에 천공을 형성시킴으로써 생식세포의 부화(hatching) 및 부화된 배아에 대한 발달 능력(developmental competence)을 증가시킬 수 있다.

<유리화 동결법( vitrification )>

난자 및 배아 등은 일반 세포에 비해 부피가 크고 더불어 수분함유량이 매우 많아 이를 효과적으로 동결보존하기 위해서는 특히 얼음결정을 최소화하는 동결보존 기술이 필요한데, 이런 관점에서 도입되어진 방법이 유리화 동결법(vitrification)이다.

유리화 동결은 세포를 -196℃의 액체질소 (liquid nitrogen, LN₂)에 직접 노출시켜 동결보존을 유도하지만, 실제로는 동결과정에서 세포 내에 얼음결정이 형성되지 않고 수분이 액체와 고체의 중간인 비결정질과 같은 상태를 유지하도록 하는 기술이다. 이러한 상태를 "유리화"라고 하며, 이를 얻기 위해서는 세포 내 수분이 고농도의 동결억제제로 치환되는 것이 필요하며, 이에 더불어 매우 높은 냉각속도 (분당 - 3,000℃ 이상)가 필요하다. 유리화 동결의 장점은 조작이 간단하며 고가의 장비가 필요 없다는 점이며, 무엇보다도 얼음결정이 원천적으로 형성되지 않아 상해를 최소화할 수 있다는 것이 대표적이다.

본 발명은 이러한 유리화 동결방법에 대한 것으로, 일 관점에서, 스트로우 내벽의 홈(depressed area)에 생식세포를 부착시키는 방법을 이용하는, 생식세포 유리화 동결방법에 관한 것이다.

기본적으로, 스트로우 (Straw) 방법을 이용하므로, 이에 필요한 통상적인 공정, 예를 들어 스트로우를 밀봉하여 액체 질소(LN₂)에 담지하는 등의 공정은 당연히 포함한다.

이하에서는 종래의 방법과 구별되는 특징적인 점을 중심으로 본 발명을 상세히 기술한다.

(i) 유리화 동결용 조성물

본 발명의 유리화 동결용 조성물은 하나 이상의 동결방지제 또는 동결방지제들의 혼합물을 함유할 수 있다.

무독성 동결방지제가 바람직하다. 동결방지제는 동결되지 않은 물 중에 남아있는 다른 용질들의 몰 분율을 감소시킴으로써 수축을 최소화하는데 일조한다. 상기는 결정성 얼음의 형성을 억제하며, 따라서 물의 빙점을 낮춘다. 상기는 또한 결합수와의 수소 결합에 의해 단백질 변성을 방지할 수 있다. 세포가 냉각됨에 따라, 용매 수는 세포 외 얼음으로 전환하며, 불투과성 전해질 또는 비-전해질의 증가하는 세포 외 농도는 세포를 손상시킨다.

세포는 동결보호제로 처리될 때, 훨씬 더 낮은 온도에 도달할 때까지, 처리되지 않은 세포의 염 농도에 도달하지 않는다. 화학 반응은 상기와 같이 낮은 온도에서는 매우 느리게 진행하며 결과적으로 세포 손상이 최소화된다.

대개는 동결보호제들의 조합을 사용하는데, 그 이유는 상이한 유형들간에 차이가 있을 수도 있기 때문이다. 상기 동결보호제들은 또한 삼투 활성제로서도 작용할 수 있다. 적합한 동결보호제를 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디메틸설폭사이드, 글리세롤, 프로판 디올, 당, 예를 들어 수크로오스, 트레할로즈, 말토오스, 락토오스 및 메틸 펜탄 디올로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서는 유리화 동결에 사용되는 조성물은 다음의 성분을 포함하는 것이 바람직하다:

홀딩 배지 (HM: 10% FBS가 첨가된 TCM199),

유리화 동결 용액 1 (VS1: HM + 10%[vol/vol] 에틸렌 글리콜),

유리화 동결 용액 2 (VS2: HM + 35%[vol/vol] 에틸렌 글리콜 + 5% PVP((polyvinylpyrrolidone) + 0.5 M 수크로오스),

희석 용액 1 (DS1: HM + 0.3 M 수크로오스), 및

희석 용액 2 (DS2: HM + 0.15 M 수크로오스).

본 발명의 유리화 동결용 조성물은 유리화 동결 용액(VS) 두 종류를 포함하고, 이러한 VS1 및 VS2는, VS2 용액 중에 함유된 개별적인 작용제들의 농도는 통상적으로 5 내지 50% v/v, 예를 들어 약 5% 내지 약 40% v/v, 예를 들어 약 5% 내지 약 25% v/v(VS1 용액) 및 약 5% 내지 약 30% v/v(VS2 용액)의 범위이다. 통상적으로는, 상기 VS2 용액 중의 동결보호제의 총 농도(v/v, w/v 또는 M으로서 계산됨)는 VS 1 용액 중의 농도보다 크다. 상기 VS1 및 VS2 용액은 동일하거나 상이한 하나 이상의 동결보호제를 함유할 수 있다. 상기 VS1 및 VS2 용액 중의 하나 이상의 동결보호제의 농도는 동일하거나 상이할 수 있으며, 통상적으로는 상기 제 VS2 용액 중의 동결보호제의 총 농도가 VS1 용액 중의 농도보다 크다.

본 발명의 일 구체예에서, 희석제로 수크로오스를 사용할 수 있다. 상기 유리화동결 조성물에 함유된 수크로오스의 농도는 통상적으로는 약 0.02 M 내지 약 1 M, 예를 들어 약 0.05 M 내지 약 0.9 M, 약 0.1 M 내지 약 0.8 M, 약 0.2 M 내지 약 0.7 M, 약 0.3 M 내지 약 0.65 M, 약 0.4 M 내지 약 0.6 M, 약 0.45 M 내지 약 0.55 M의 범위 내에 있다.

수크로오스는 독특한 천연 이당류이며, 수백 개의 식물 및 동물에서 발견된다. 수크로오스는 중요한 에너지원이며 동결 시기 동안 유기체의 안정화에 주요한 인자이다. 수크로오스는 세포막의 상전이 온도를 낮추어 상기 세포막이 건조 시에조차도 액정 상태로 남아있게 할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 재 수화 중에 세포막 누출을 방지하여, 세포 생육력을 보존함이 가정되어 있다. 단백질에 관해서, 수크로오스는 세포가 수화된 상태로 있을 때 단백질 표면으로부터 물의 배제에 의한 단백질 변성을 억제한다.

본 발명의 상기 유리화 동결용 조성물은 상기 설명한 조성물로 구성되는 것이 가장 바람직하나 당업자가 필요에 따라 농도 등을 적절히 조절하여 사용할 수 있다.

또한, 선택적으로, 상기 유리화 동결용 조성물은 하나 이상의 점도 조절제를 포함할 수 있다. 점도 조절제로서, 피콜(Ficoll), 퍼콜(Percoll), 히아루론산, 알부민, 폴리비닐 피롤리돈, 알긴산, 젤라틴 및 글리세롤 등로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있다. 하나 이상의 점도 조절제의 농도는 동일하거나 상이할 수 있다

(ii) 변형된 스트로우 제작

본 발명에서 사용되는 유리화 동결에 사용될 플라스틱 스트로우는 그 내벽에 약간의 홈을 가진, 변형된 스트로우로서, 예를 들어, 다음과 같은 방법으로 제작할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 0.25 ml 플라스틱 스트로우를 사용하였다. 핫 플레이트 상에서 가열된 강철 바(bar)를 이용하여 직경 약 1 mm 내외와 깊이 약 200 um 내외의 크기로 홈을 만든다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서 내벽 홈이 형성된 생식세포 유리화 동결을 위한 스트로우에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 스트로우 내벽에 홈이 형성되어 있어서 여기에 생식세포를 부착시키기 때문에, 기술적으로 주입과정을 매우 쉽게 할 수 있고 실수를 크게 줄일 수 있는 방법이다. 액체질소 등과 직접적 접촉이 방지될 뿐만 아니라, 다양한 오염물질, 바이러스 등과의 접촉이 차단됨으로써 오염을 방지할 수 있는 장점이 있다. 한편, 본 발명에 따른 내벽홈이 형성된 스트로우를 이용하는 경우 융해 수정란의 회수와 생존율에는 전혀 나쁜 결과를 주지 않는 다는 것을 확인하였다.

(iii) 동결과정

동결시킬 생식 세포 및 상기 유리화 동결용 조성물의 혼합물을, 상기 제작한 내벽 홈 함유 스트로우에 로딩시킨다.

이 때, 유리 피펫 (Pasteur, VWR International)등을 사용하여, 상기 혼합물로 종래처럼 컬럼 (column)을 만들지 않고 스트로우 내벽의 홈 부위에 붙인다. 이처럼, 스트로우의 내벽의 홈에 생식세포를 직접 주입시켜 부착시키는 것을 본 발명의 주요한 특징으로 한다.

특히, 스트로우 내벽에 직접 생식세포를 붙이는 방법보(aV)다 내벽에 홈을 만들어 이용함으로써, 생식세포의 주입과정이 훨씬 용이하고 편리할 뿐만 아니라, 홈을 이용함으로써 안정적으로 주입할 수 있다. 이러한 주입과정의 용이성과 편리성은 본 발명의 매우 큰 장점이라고 할 수 있다.

스트로우에 로딩 후, 상기 스트로우를 밀봉하고 액체질소(LN₂)에 담지한다. 동결배아의 생존성에 영향을 미치는 요인 중 하나는 동결속도 (cooling rate)인데, 본 발명의 방법은 스트로우 상에 유리화 동결 용액의 로딩 부피를 줄임으로써 동결 속도를 증가시킬 수 있다. 또한, 배아를 함유하는 유리화동결 용액의 재결정화(recrystalization)의 감소에 의해 용해 후 생존 가능성(post-thaw survivability)을 향상시킨다.

<융해>

상기 방법으로 유리화 동결보존된 배아를 이용하기 위해서는 융해과정(thawing procedure)을 거쳐야 한다.

융해방법은 배아를 LN₂에서 꺼내 상온이나 37℃ 온수에 넣어 융해하는 급속융해 (rapid thawing)과 LN₂서 꺼낸 배아를 -80℃ 내지 -100℃로 조정된 동결기에 넣어 서서히 융해하는 완만융해(slow thawing)와 급속 융해방법이 이용되고 있다.급속 융해방법은 배아의 융해과정 시에 손상이 가장 많이 일어나며 특히 융해 시 재결빙 현상이 일어나기 쉬우므로 각별히 주의해야 한다.

융해된 배아는 세포내에 유입된 동결보호제를 제거해야 한다.

세포내 동결보호제의 제거에는 여러가지 방법이 이용되고 있지만 대표적으로 수크로오스 같은 당 (sugar)이 함유된 용액을 사용하여 융해된 배아의 세포질 손상이 없이 동결보호제를 제거하는 방법이 이용된다. 즉, 융해 시에 여러 가지 농도가 함유된 수크로오스 용액을 준비하여 고농도에서 저농도로 배아를 처리함으로서 융해과정에서의 급격한 삼투압의 변화에 따른 세포막의 손상을 최소화하면서 배아세포질내의 동결보호제를 제거하는 방법이 이용되고 있다. 본 발명의 일 실시예에서도 이러한 수크로오스를 이용하였다.

스트로우의 내용물을 융해시킬 때, 온도는 실온 내지 40℃일 수 있다. 보다 높은 온도는, 세포를 융해 후 수욕으로부터 신속하게 제거하지 않는 경우 상기 세포의 융해 시 열 쇼크를 유발할 수 있다.

<이용>

또한, 본 발명은 상기 스트로우의 내벽 홈에 생식세포를 부착시키는 방법에 의해 유리화 동결된 생식 세포 및 이의 이용을 포함한다.

본 발명의 방법은 배아를 포함하는 유리화동결 대상의 스트로우에 대한 로딩 부피를 감소시킴으로써 동결 속도를 증가시킬 뿐만 아니라, 이러한 방법을 거친 유리화동결된 배아는 추가의 실험 공정 없이 융해 후 수령체에 직접적으로 이식하여도 생존율과 융해 후 발생률, 임신율을 향상시킨다. 그러므로, 인공수정("AI" ) 및 생체외수정("IVF" )와 같은 과정에 유용하게 사용할 수 있다.

그러므로, 본 발명은 일 구체예로써, 상기 유리화 동결된 생식세포를 융해 후 추가의 공정 없이 인간을 제외한 포유류에게 직접적으로 이식하는 것을 특징으로 하는 생식세포 이식방법을 포함한다.

인간을 제외한 포유류로서, 비 제한적으로 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이, 실험실 동물, 예를 들어 래트, 마우스 및 햄스터, 농업용 가축, 예를 들어 돼지, 양, 소, 염소 및 말을 포함한 동물 공급원을 말한다.

즉, 본 발명의 유리화 동결 방법은 잉여의 배아를 효율적으로 이용함으로서 불임환자에게 임신의 기회를 제공하는 효과적인 보조생식술로서, 예를 들어, 특히, 가축 관리에서의 효과적으로 이용할 수 있는데, 바람직한 특성을 가지는 자손의 생산을 증가시키는데 사용될 수 있다.

이처럼, 본 발명은 수정란의 동결보존을 활용하는 모든 분야에 적용이 가능하다.

인간의 수정란에서부터 모든 축종의 수정란 동결보존에 활용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 젖소 또는 식용우와 같은 동물의 생산자가 가축 생산 효율 및 품질을 증가시킬 수 있을 것이다.

실제 한우 및 젖소의 수정란 이식에 의한 개량은 매우 큰 효과가 있다. 국내의 한우는 약 300만두 중 암컷 가임두수는 약 110만두, 젖소 가임두수는 약 40만두 총 한우 및 젖소의 가임두수 150만두에서 그 중 10%를 수정란이식에 의한 번식을 한다고 하면 약 15만두다. 신선란 위주로 수정란이식을 함으로써 모든 대리모는 수정란의 공급일자에 따른 발정동기화가 반드시 필요하고, 신선란을 이용하는데 산업화에 한계가 있다. 왜냐하면 시간적, 공간적 한계가 있기 때문이다. 이러한 문제점을 일거에 해결할 수 있는 방법이 동결수정란을 활용한 수정란이식이다. 현재까지 전 세계적으로 실험실 내에서 수정란동결기술은 많이 개발되었으나, 현장에서 직접 활용 가능한 스트로우, 예를 들어, 0.25 ml 플라스틱 스트로우 내에서 수정란의 동결보존기술은 거의 없었을 뿐만 아니라, 지금까지 개발된 0.25 ml 플라스틱 스트로우를 이용한 방법들 또한 융해 후 생존율이 낮아 실제 현장에서 활용될 수 없었다. 즉, 실험실 내에서 활용될 수 있는 방법이 실제 현장에서 활용되지 못해 산업화가 어려운 실정이었다.

그러나, 본 발명은 스트로우를 직접 활용하여 동결함으로써 현장에서 직접 동결수정란을 이용한 수정란이식이 가능하다.

또한, 상기 인위적인 발정동기화 과정을 생략할 수 있는 장점이 있다. 동결수정란을 활용하기 때문에, 대리모의 자연발정주기에서 생식기의 검사 후 이식 가능한 대리모일 경우라면 상기 동경수정란의 융해 후 직접 이식하는 방법으로 적용할 수 있으므로 별도의 인위적인 발정동기화 과정을 생략할 수 있다. 즉, 기존의 동결정액을 이용한 인공수정과 같은 방법으로 활용이 가능하다.

또한, 이러한 과정 등의 생략에 의해 이식비용을 큰 폭으로 절감할 수 있어서 산업화에 크게 기여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

따로 언급이 없다면, 모든 화합물들 및 배지는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 동물의 보살핌 및 이용은 경상 대학교의 실험동물을 위한 가이드라인을 따랐다. approval no. GAR-110502-X0017).

배아 제조

소의 IVP 포배기 세포를 제조하기 위해, 경남 지방 도살장으로부터 한우의 난소들을 수집하여 2~4시간 이내에 수송하였다. 난자-난구 복합체(cumulus-oocyte complexes, COC)를　 진공펌프에 붙어 있는 18 게이지 바늘을 이용하여 직경 2 내지 8 mm 모낭으로부터 회복하였다.　 빽빽한 난구세포 및 세포질에의 3-5 레이어를 가지고 있는 난자들을 TL-HEPES (114 mM 염화나트륨, 3.2 mM 염화칼륨, 2 mM 중탄산나트륨, 0.34 mM 이인산나트륨, 10 mM 소듐 락테이트, 0.5 mM 염화마그네슘, 2.0 mM 염화칼슘, 10 mM HEPES, 1 μL/mL 페놀 레드, 100 IU/mL 페니실린, 및 0.1 mg/mL of 스트렙토마이신)에서 세척하고,　IVM (in vitro maturation) 배지 [10% (vol/vol) FBS, 1 μg/mL 에스트라디올-17β, 10 μg/mL FSH, 0.6 mM 시스테인, 및 0.2 mM 소듐 피루베이트가 보충된 TCM199] 에서 세척하고, 23-24시간 동안 700 μL의 IVM 배지를 함유하는 4-웰 디쉬의 웰로 옮겼다.

IVM 후, 난자-난구 복합체를 1분 동안 36℃에서 중탕기에서 융해시킨 한우 수컷의 정자와 수정시키고, 1분 동안 36℃에서 중탕기에서 융해시킨 한우 수컷의 정자와 COC를 수정시키고 Dulbecco’s PBS (D-PBS)에서 세척한 후, 상온에서 5분 동안 750 × g 원심분리에 의해 펠렛화시켰다.

상기 펠렛을 조심해서 20 μg/mL 헤파린 소듐 염을 함유하는 500 μL IVF (in vitro fertilization) 배지(6 mg/mL BSA, 22 μg/mL 소듐 피루베이트, 100 IU/mL 페니실린, 및 0.1 mg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Tyrode’s lactate 용액)에서 재현탁시킨 다음, 희석시키고 5% CO₂의 습한 대기에서 15분 동안 배양하여 정자가 수정 능력을 가질 수 있도록 하였다.

수정능이 있을 것이라고 여겨지는 정자들을 1~2×10⁶ spermatozoa/mL 밀도로 IVF 배지에 희석하고, 성숙된 난자들을 18-20 시간 동안 정자들을 함유하고 있는 IVF 배지 (700 μL)로 옮겼다.

정자와 배양 후, 35-mm 디쉬 (SPL Life Sciences Co. Ltd., Gyeonggi-do, Republic of Korea)에서, TL-HEPES에 접합체를 형성하고 있는 것으로부터 피펫팅으로 난구세포들을 제거하였다.

나출된(Denuded) 접합체를, 44 μg/mL 소듐 피루베이트, 14.6 μg/mL 글루타민, 10 μL/mL 페니실린/스트렙토마이신, 3 mg/mL BSA 및 310 μg/mL 글루타치온이 보충된 700 μL CR1-aa 배지 (Rosenkrans et al., 1993) 를 함유하는 4-웰 디쉬의 웰에 3일 동안 두었다 (IVC-I).

이들은 배아 발달 7일까지(D1; IVC가 수행된 날) 배양하되, 3일 째에 BSA가 10% (vol/vol) FBS로 대체시킨 것 외에는 동일한 배지에서 배양하였다(IVC II).

IVM, IVF, 및 IVC 동안 배양조건은 최대 습기 하 38.5℃에서 대기 중 5% CO₂ 조건이었다. 포배의 발달율은 7일째에 평가하였고, 결과는 IVC-I 배지 내로 옮겨진 접합체의 비율로 나타내었다. 7일 째, 확장된 포배 또는 좋은 형태의 눈에 보이는 포배강 캐비티를 가지는 포배를 선별하여 유리화 동결하였다

유리화동결 및 융해 공정(Vitrification and thawing procedures)

유리화동결 용액을, 홀딩 배지 (HM, 10% FBS 보충된 TCM199), 유리화동결 용액 1 (VS1, 10%[vol/vol] 에틸렌 글리콜 보충된 HM), 유리화동결 용액 2 (VS2, 35% [vol/vol]에틸렌 글리콜 + 5% [vol/vol]PVP(polyvinylpyrrolidone) + 0.5 M 수크로오스 보충된 HM), 희석 용액 1 (DS1: 0.3 M 수크로오스 보충된 HM) 및 희석 용액 2 (DS2: 0.15 M 수크로오스 보충된 HM)으로 구성하였다.

In vitro-생성된 포배를 선별하여 임의로 각 처리군에 배분하였다. 포배를 HM에 노출시킨 후 미세 유리 파스츄어 피펫으로 VS1에 옮겼다. VS1에서 5분 후, 포배를 VS2로 옮기고 미세 유리 파스츄어 피펫으로 0.25 mL 스트로우에 로딩하였다. 상기 포배는 컬럼의 블로킹없이 스트로우 내벽의 표면 상에 붙거나 (aV, 도 1a); 또는 플라스틱 스트로우의 내부 표면의 홈 영역(depressed area)에 붙었다(maV, 도 1b). 상기 홈 영역은 핫 플레이트 상에서 가열된 강철 바(bar)에 의해 만들었다(도 1b).

로딩된 스트로우는 약 5초 동안 열접착기로 밀봉하였다. 배아를 포함하는, 상기 밀봉된 스트로우의 사이드를 액체질소 LN₂ 에 1분 동안 우선 담지하고, 그 후 스트로우의 나머지를 담지하였다. 이는 동결된 스트로우의 분해(와해)를 방지한다. 포배를 융해시키기 위해, 유리화동결된 스트로우를 액체 질소로부터 제거하고 상온에 10초 동안 노출시킨 후, 30초 동안 37℃에서 항온 수조 세트(water bath set)에 담지하였다.

융해된 스트로우를 종이 타월로 건조시키고, 뒤집어서 유리화동결 용액의 윗 부분에서의 배지와 희석 용액의 낮은 부분에서의 배지를 혼합시켰다. 그 이후, 밀봉된 스트로우 윗 부분을 잘라서 내용물을 30 mL 페트리 디쉬에 옮기고 HM으로 세척하였다. 30 mL 페트리 디쉬에서 포배들을 0.3 M 수크로오스에서 5분 동안, 및 0.15 M 수크로오스에서 3분 동안 순차적으로 희석하였다.

융해 후 포배의 평가

24시간 후 재-확장 실험에 의해 10% (vol/vol) FBS 보충된 CR1aa에서 배양된, 융해된 포배를 이용하여 융해 후 포배의 생존율을 평가하였다.

포배 당 세포사멸 세포의 전체 수를 측정하기 위해, 포배는 임의로 선별하여 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)을 수행하였다. TUNEL 분석은 프로토콜에 따라 In Situ Cell Death Detection Kit를 이용하여 수행하였다(Fluorescein; Roche Diagnostics Corp.; Indianapolis, IN, USA; Cat. 1684795).

간략히 말하면, 고정된 배아를 1 M PVP-PBS (0.3% (w/v) polyvinyl pyruvic acid 함유하는 PBS)로 2회 세척하고, 상온 하 투과 용액(permeabilization solution)( 0.5% (v/v) Triton X-100, 0.1% (w/v) sodium citrate) 에서 30분 동안 배양하였다.

투과화(permeabilization) 후, 배아들을 PVP-PBS로 2회 세척하고 어둠속에서 상온 하 1시간 동안 형광물질-결합된 dUTP 및 tdt(terminal deoxynucleotide transferase)로 배양하였다.

TUNEL-염색된 배아들을 PVP-PBS로 세척하고 10 μg/mL Hoechst 33342 함유하는 PVP-PBS에서 10분 동안 배양하였다. 포배들을 PVP-PBS로 2회 세척하여 과잉의 Hoechst 33342를 제거하고 유리 슬라이드 커버슬립 상에 마운팅하여 염색체 구성(chromatin configuration)을 평가하였다

각 포배에서 세포의 수는 수은 램프가 구비된 형광 현미경을 이용하여 계수하였다. TUNEL-양성 세포들이, 세포사멸이 일어났음을 의미하는 밝은 붉은 형광을 내는 것이 명확하게 확인되었다. 세포들의 전체 수는 녹색/파랑 형광의 양에 의해 측정되었다. 각 처리군에서, 3~4의 다른 세션으로부터 포배들을 사용하였다.

실시예 2 : 공초점 현미경( Confocal microscopy )

형태에서의 변화 및 세포내 기관(organelles)의 위치화는 중요한 독성 지표가 될 수 있다. 이러한 현상들을 조사하기 위해, 배아들을 세포 구조 마커로 염색하여 기관의 온전한 보전(integrity)을 관찰하였다.

미토콘드리아를 프로토콜에 따라 Mito Tracker Red CMXRos를 이용하여 염색하였다(Invitrogen, Eugene, OR, USA; Cat. M7512). 간략히 보면, 배아를 MitoTracker Deep Red(pre-warmed to 37℃)를 함유하는 용액에서 30분 동안 37℃ 하 어둠속에서 배양하였다. 그 후 상기 배아를 신선한 예열된 TL-HEPES로 세척하였다. 배지를 배아로부터 조심스럽게 제거하고, 4% 포름알데하이드 함유하는 PVP-PBS로 15분 동안 37℃에서 고정시켰다

고정 후, 상기 배아를 얼음의 차가운 PVP-PBS로 2회 세척하고, 골지체를 NBD C6-세라마이드로 염색하였다. (Invitrogen, Eugene, OR, USA; Cat. N22651). 세척 후, 상기 배아를 아이스-바스(ice-bath)에 옮기고 5 μM 세라마이드(ceramide)-BSA 복합체에서 30분 동안 어둠에서 4℃하 배양하였다.

배아들을 PVP-PBS로 헹구고 상온에서 45분 동안 2 mg/mL BSA에서 배양하여 골지 염색을 강화시켰다. 이렇게 염색된 배아들을 신선한 PVP-PBS로 세척하고, 10 μg/mL Hoechst 33342 (Invitrogen, Eugene, OR, USA; Cat. H3570)를 함유하는 PVP-PBS에서 10분 동안 배양하고, PVP-PBS로 2회 세척하여 과잉의 Hoechst 33342를 제거하였다. 염색된 포배를 유리 슬라이드 위에 마운팅하고 lan-Apochromat 40×, 1.4 NA, oil immersion objective (Carl Zeiss, Jena, Germany)로 LSM 710 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰하였다.

MitoTracker Red CMXRos 및 NBD C6-ceramide 염색은 파장 561nm (diode-pumped solid-state laser) 및 488nm (air cooled argon laser) 각각에서 샘플들을 여기함으로써 가시화시킨다. MitoTracker Red CMXRos 및 NBD C6-ceramide는 각각 550∼600 nm 및 500∼550 nm 파장에서 빛을 방출시킨다. Hoechst33342-표지된 핵 염색질(chromatin)은 405nm (blue diode laser) 파장에서 여기되어 430∼480 nm 파장에서 빛을 방출시켰다.

Red CMXRos, NBD C6-ceramide 및 Hoechst 33342로 표지된 포배들을 multi-track configuration을 이용하여 스캔하였고, 각 트랙은 개별적인 유닛으로 다른 트랙들과 독립적으로 설정되었다. 모든 이미지들이 순차적 모드로 수득되어 영상이 겹치는 블리드 스루(bleed-through)를 피하였다. 각 프레임을 4번 스캔하고, 상기 스캔들을 평균하여 노이즈가 감소된 이미지를 수득하였다. 초점이 맞지 않는 형광신호들을 검출기 앞에서 핀홀에 의해 감소시켰다. 심도 측정 및 검출 효율 사이에서 가장 좋은 절충을 위해, 이미지를 1 Airy unit에 상응하는 공초점 핀홀로 수득하는 것이었다. 완전한 z-시리즈 이미지의 20∼22 시각적 섹션들을 2μm 간격으로 수득하였다. 수득된 시각적 섹션들을 Carl Zeiss ZEN 소프트웨어를 이용하여 디지털적으로 단일 이미지로 편집하였다.

각 그룹으로부터의 이미지들을 정확히 비교하기 위해, 현미경 대물렌즈, 에어리 유닛(airy unit), 광행로 기구(light path tool), 이력(gain), 및 레이저 파워를 동일하게 유지하였다.

유전자 발현 시스템

전체 RNA를, 각 그룹으로부터 4∼5 융해된 포배로부터 Purelink RNA mini kit를 이용하여 추출하였다(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Cat. 12183018A). 요약하면, 포배를 100 μL 추출 버퍼에 재현탁하고, 간단히 혼합하고, 30분 동안 42℃하에서 배양한 후 2분 동안 3,000 g에서 원심분리하였다. 상청액을 70% 에탄올과 혼합하고, 미리 조건화된(preconditioned) RNA 정제 칼럼에 첨가하였다

상기 칼럼을 2분 동안 100 g에서 원심분리하고, RNA를 바인딩하기 위해 그 후 즉시 16,000 g에서 30 sec 동안 원심분리하였다. 상기 칼럼을 3번 세척하고, RNA를 키트가 제공하는 용리 버퍼로 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 용리시켰다. 전체 RNA를 SuperScript VILO™ cDNA를 이용하여 first stand cDNA로 역전사시켰다 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Cat. 11754-050)

간략히 말하면, 전체 RNA를 5×VILO reaction mix 및 10×SuperScript Enzyme mix.를 함유하는 200 μL micro centrifugetube에 옮겼다. 상기 반응물을 25℃, 10분 동안 및 42℃, 60분 동안 배양하였다. 마지막으로, 85℃, 5분 동안 배양함으로써 반응을 종결시켰다. 샘플들을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

cDNA를, F/R 프라이머들로 EXPRESS SYBR Green ERqPCR Super Mixes universal (EXPRESS SYBR Green ERqPCR SuperMixes 및 Two-step qRT-PCR kit, Invitrogen, Carlsbad, CA; USA; Cat. 11784-200/01K) 와 혼합하였다. 이러한 프라이머들은 Primer 3 software (http://frodo.wi.mit.edu/) 를 이용하여 디자인하고, 이를 표 1에 기재하였다.

사이클링 조건은 이하와 같다: 50℃에서 2분 동안, 그리고 95℃에서 2분 동안, 이어서 95℃에서 15 초, 60℃에서 1분 동안의 40 사이클을 수행하였다. 증폭에 이어서, 온도가 60℃에서 95℃까지 0.2℃/sec 속도로 증가하는 동안 점차적인 변성을 이용하여 melting curve analysis이 이루어졌다. 가열하는 동안 형광신호를 측정하였다.

또한, 다양한 반응의 산물들을 체크하여 0.5 mg/mL ethidium bromide를 함유하는 0.5×Tris-borate-EDTA 버퍼(45 mM Tris base, 45 mM boric acid, and 1 mM EDTA; pH 8.0)에 5% 아가로즈 겔 상에서 전기영동분석에 의해 예상되는 크기를 벗어났는지 확인하였다.

타겟 유전자들을 CFX manager V1.1 software (Bio-Rad Laborator ies)를 이용하여 ΔΔc(t) 방법에 의해 정량분석하였다. 표 3의 참고 유전자로서 GAPDH를 이용하여 정상화 (Normalization )을 수행하였다.

실험 디자인(Experimental design)

실험 1: 융해 후 소-포배의 후-융해 생존(survival) 상에서 유리화동결 스트로우 로딩 방법의 효과

D 7의 포배를 aVor maV 스트로우 방법을 이용하여 유리화 동결화시켰다. 각 실험에서, 3∼5 포배는 그룹마다 유리화 동결화되었다. 상기 유리화동결된 포배를 융해시키고 IVC2 배지에서 24시간 동안 배양하고, 포배 재확장을 평가하였다.

실험 2: 융해 후 소-포배의 후-융해 생존 가능성(viability) 상에서 유리화 동결 스트로우 로딩 방법의 효과

융해 후 24시간째, 전체 세포 후 및 포배당 세포사멸 세포의 수를 TUNEL 분석으로 계수하였다. 골지체 및 미토콘드리아의 공초점 현미경 분석을 수행하여 유리화동결화가 이러한 세포기관들에게 손상을 입혔는지 여부를 관찰하였다.

실험 3: 융해 후 소-포배의 유전자 발현 프로파일 상에서 유리화동결 스트로우 로딩 방법의 효과

융해 후, 유리화 동결된 포배의 정량분석을 위해, 프로-세포사멸 관련 유전자 Bax 및 Caspase-3, 항-세포사멸 관련 유전자 Bcl2 및 Mcl-1, 그리 고 항산화 관련 유전자 MnSOD 및 Prdx5의 발현 프로파일을 RT(real-time) qPCR에 의해 분석하였다. 각 분석에서 5 포배가 그룹 당 사용되었고, GAPDH는 참고 유전자로 사용되었다.

통계학적 분석

재확장된 포배의 수는 융해 후 생존된 경우의 퍼센트로서 표현하였다. 전체 세포의 수 및 포배 당 세포사멸 세포의 수는 평균 ± SD로 표현하였다.

다양한 유전자들의 발현 수준은 Student’s t-test를 이용하여 3 그룹 사이에서 비교하였다. 통계학적 차이는 one-way ANOVA (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)로 분석하였고, 그룹 간 유의미한 차이는 Duncan’s multiple range test에 의해 수행하였다. P< 0.05 는 유의미한 것으로 간주한다.

실시예 1 : 유리화동결된 소 IVP 포배의 용해 후 생존(Post-thaw survival)

융해 후 포배의 회복율은 aV 및 maV 그룹간에서 현저히 상이하지 않았다(95.8% vs. 94.3%,P> 0.05). 그러나, 대조군 그룹(94.3% vs. 100%, P> 0.05) 보다는 aV 그룹에서 현저히 낮았다.

포배의 융해 후 생존율은 aV 및 maV 그룹(86.4% vs. 88.2%, P> 0.05) 사이에서는 크게 다르지 않았지만, 두 경우 모두 대조군 그룹보다 매우 낮았다(100%, P< 0.05). 그럼에도 불구하고, aV 및 maV 그룹에서 융해 후 85.5% 이상의 생존율은 이러한 소의 동결건조 방법을 매우 실현가능하도록 한다.

실시예 2 : 유리화 동결된 소 IVP 포배의 융해 후 생존가능성( viability )

포배의 전체 세포수는 aV 및 maV 그룹보다 대조군에서의 경우가 현저히 높았지만(142 ± 21.8 vs. 117 ± 29.7 and 120 ± 25.2, P < 0.05); aV 및 maV 그룹 사이의 유의미한 차이는 없었다(표 3 및 도 2).

포배 당 세포사멸성 세포의 수는 aV 및 maV 그룹이 대조군의 경우보다 현저히 높았고(8.9 ± 10.4 and 9.4 ± 14.7 vs. 1.5 ± 2.1, P< 0.05), aV 및 maV 그룹 사이의 유의미한 차이는 없었다(표 2 및 도 2).

골지체 및 미토콘드리아의 형광신호 강도는 대조군 그룹과 비교하여, aV 및 maV이 다소 감소하였다. 그러나, aV 및 maV 그룹 사이에 눈에 띌 정도로 차이는 없었다(도 3).

이러한 포배에서의 높은 세포 수 및 세포 내 기관에서의 보전에 근거해 볼 때, aV 및 maV 방법은 모두 IVP 배아를 동결보존하는데 사용할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3 : 융해 후 소 IVP포배의 유전자 발현 프로파일

프로-세포사멸 관련 유전자 Bax 및 Caspase-3의 mRNA 수준은 aV 및 maV 그룹이 대조군보다 현저히 높았다(Bax: 1.23 and 1. 32 vs. 1, Caspase-3: 1.27 and 1.41 vs. 1, P< 0.05).

항-세포사멸 관련 유전자 Bcl2 및 Mcl-1 의 mRNA 수준은 aV 및 maV 그룹이 대조군보다 현저히 낮았다 (Bcl-2: 0.83 and 0.88 vs. 1, Mcl-1: 0.82 and 0.7 4 vs. 1, P< 0.05).

항산화 관련 유전자 MnSOD 및 Prdx5 mRNA 수준도 aV 및 maV 그룹이 대조군보다 현저히 낮았다 (MnSOD: 0.77 and 0.75 vs. 1, Prdx5: 0.82 and 0.74 vs. 1, P< 0.05) (표 4 및 도 4).

즉, 대조군에 비해, aV 및 maV 방법은 세포사멸 관련유전자인 Bax와 Caspase-3의 mRNA 발현수준은 유의적으로 높았지만, 항-세포사멸 유전자인 Bcl-2와 Mcl-1 및 항산화 관련 유전자인 MnSOD와 Prdx5 유전자의 발현수준은 유의적으로 낮았다 (P < 0.05).

결론적으로 aV 및 maV 방법은 소 체외수정란의 동결보존에 활용될 수 있으며 maV 방법은 기존의 aV 방법보다 훨씬 더 쉽게 주입하고 편리하게 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 이와 같은 우수한 효과를 통해, 당업자들은 다른 생물학적 물질, 예컨데, 인간을 포함한 말, 염소, 돼지 등에게도 용이하게 적용가능함은 명확히 이해될 것이다.

Claims (12)

1. 스트로우 내벽의 홈 부위에 생식세포를 부착시키는 것을 특징으로 하는, 생식세포 유리화 동결방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 홈은 직경 1 mm 내외 및 깊이 200 ㎛ 내외의 크기 범위를 가지는 것을 특징으로 하는, 생식세포 유리화 동결방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 방법은 스트로우 내벽의 홈 부위에 생식세포를 직접 주입하여 부착시키는 것을 특징으로 하는, 생식세포 유리화 동결방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 생식세포는 난자, 체외수정란 또는 배아세포인 것을 특징으로 하는 생식세포 유리화 동결방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 배아 세포는 포배기 세포(blastocyst)인 것을 특징으로 하는 생식세포 유리화 동결방법.
6. 제1항에 있어서,
   TCM199 배양액에 10%[v/v] FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 홀딩 배지;
   상기 홀딩 배지에 10%[v/v] 에틸렌 글리콜이 첨가된 유리화 동결 용액 1;
   상기 홀딩 배지에 35%[v/v] 에틸렌 글리콜, 5%[v/v] 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrollidone) 및 0.5M 수크로오스가 첨가된 유리화 동결 용액 2;
   상기 홀딩 배지에 0.3M 수크로오스가 첨가된 희석용액 1; 및
   상기 홀딩 배지에 0.15M 수크로오스가 첨가된 희석용액 2로 구성된 유리화 동결용 조성물을 이용하여 유리화 동결시키는 것을 특징으로 하는 생식세포 유리 화 동결방법.
7. 제1항의 방법에 사용되고, 내벽 홈이 형성된 생식세포 유리화 동결용 스트로우.
8. 제7항에 있어서,
   상기 홈은 직경 1 mm 내외 및 깊이 200 ㎛ 내외의 크기 범위를 가지는 것을 특징으로 하는 스트로우.
9. 제1항의 방법으로 유리화 동결된 생식세포를 융해 후 추가의 공정 없이 인간을 제외한 포유류에게 직접적으로 이식하는 것을 특징으로 하는, 생식세포 이식방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 생식세포는 난자, 체외수정란 또는 배아세포인 것을 특징으로 하는 생식세포 이식방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 배아 세포는 포배기 세포(blastocyst)인 것을 특징으로 하는 생식세포 이식방법.
12. 제9항에 있어서,
    상기 인간을 제외한 포유류는 소(bovin)과 동물인 것을 특징으로 하는 생식세포 이식방법.

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