KR20020075478A - 미수정란의 유리화 동결 보존 방법, 그 방법에 따라보존된 미수정란으로부터 엘리트 송아지를 생산하는 방법및 이에 사용되는 스트로 - Google Patents
미수정란의 유리화 동결 보존 방법, 그 방법에 따라보존된 미수정란으로부터 엘리트 송아지를 생산하는 방법및 이에 사용되는 스트로 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미수정란의 동결 보존 방법, 그 방법으로 보존된 미수정란으로부터 엘리트 송아지를 생산하는 방법 및 이에 사용되는 스트로에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 동결 보존 방법은, 미수정란을 에틸렌 글리콜 및 FBS를 포함하는 PBS 용액으로 4 내지 6분간 처리하는 1차 처리 단계; 상기 1차 처리된 미수정란을 FBS, 에틸렌 글리콜 및 수크로즈를 포함하는 PBS 용액인 유리화 용액에 25 내지 35초간 노출시키는 2차 처리 단계; 상기 1차 및 2차 처리된 미수정란을 스트로에 적하하는 스트로 단계; 및 상기 단계에서 처리된 스트로를 액체 질소로 처리하는 질소처리 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 미수정란의 유리화 동결 보존 방법 및 그 방법으로 동결된 미수정란으로부터 송아지를 생산하는 방법은, 복잡한 고가의 실험 장비나 고도의 숙련된 기술 없이도 미수정란을 신속하고 간단한 작업 공정을 통해 동결 보존할 수 있을 뿐만 아니라, 이로부터 높은 수태율로 우수한 형질을 갖는 송아지를 얻을 수 있다. 또한 우수한 품질의 난자를 공급하는 난자은행의 설립을 가능하게 하여 필요시 시간과 공간의 제약없이 미수정란을 공급할 수가 있다.
Description
본 발명은 미수정란(난자)의 유리화 동결 보존 방법, 및 그 방법에 의해 보존된 미수정란으로부터 엘리트 송아지를 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 체외에서 성숙된 소미수정란을 전평형액으로 평형시키고, 유리화 용액에 노출시킨 후 스트로에 적하하여 액체 질소 처리하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 우수한 유전자를 가진 종을 보존하고 이를 활용하여 그 생산성을 향상시키고자 하는 것이다. 특히, 우리 나라의 한우는 외국의 소에 비하여 맛과 육질이 월등하여 국제적인 경쟁력을 갖추고 있으므로, 이러한 우수한 유전자를 가진 종을 보존하고 이를 활용하여 그 생산성을 향상시킬 수가 있다면 국내 축산업 발전에 크게 기여할 것입이다.
한편, 우수한 형질을 가지는 종을 보존하고 그 생산성을 높이기 위하여는, 정자 및 미수정란(즉, 난자)가 제공되어야 한다. 현재 정자를 제공하는 기술을 토대로 하는 정자 은행은 어느 정도의 요구를 충족시키는 것이나, 미수정란을 보존하고 제공하는 기술은 극히 낙후되어 있다.
소의 미수정란의 경우, 냉해가 높아서 기계를 사용하는 완만 동결 방법이 아닌 액체 질소에 일시적으로 노출한 뒤 저장하는 초급속 동결이나 유리화 동결 방법을 주로 사용한다. 본 발명에서는, 유리화 동결 방법을 사용하여 미수정란을 효과적으로 보존하고, 그 방법에 따라서 동결 보존된 미수정란으로부터 엘리트 송아지를 생산하는 방법 및 이에 사용되는 스트로 구조를 제공하고자 한다.
미수정란 동결을 통한 산자 생산 방법에 대하여 아직까지 국내에서는 보고된 바 없으며, 국외에서도 극히 일부 성공 사례가 알려져 있다.
Fuku 등은 1992년 일본에서 완만 동결방법을 통해 2마리의 산자를 생산하였고, 같은 해에 Hamano 등은 유리화 동결방법을 통해 2마리 임신에 성공하였다. 그리고 같은 해에 일본에서 Otoi 등이 완만 동결방법으로 1마리 임신에 성공하였으며, 1998년에 들어서는 네덜란드의 Vatja 등이 유리화 동결방법으로 3마리의 산자를 생산하였다.
그런데, 이러한 국외의 사례에서는 복잡한 고가의 실험 장비를 사용하는 등, 미수정란의 효과적인 유리화 동결 보존 방법 및 그의 활용 방법에 관하여 제시하지 못하고 있다.
본 발명의 목적은, 복잡한 고가의 실험 장비나 고도의 숙련된 기술 없이도 미수정란을 신속하고 간단한 작업 공정을 통해 동결 보존하는 방법과, 이러한 동결 보존 방법으로 동결된 미수정란을 이용하여 우수한 형질을 갖는 엘리트 송아지를 생산하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 난자 은행 설립의 기반이 되는 미수정란 보존 방법을 제시하여, 우수한 형질을 가지는 종을 보존하고 그 생산성을 높이는데 기여하고자 하는 것이다.
도1은 본 발명에 따른 미수정란 동결 보존용 스트로의 구조,
도2는 종래에 사용된 수정란 이식에 사용된 스트로의 구조,
도3은 본 발명에 의한 방법이 시험된 한우 수소, 대리모 및 본 발명에 의하여 태어난 송아지의 사진.
*도면의 주요부분에 대한 설명*
1 : 유리화 용액에 노출된 미수정란(난자) 드롭
2 : 유리화 동결액층3, 4 : 공기층
5, 6 : 희석제층(수크로즈)7 : 솜마개
8 : 열 밀봉부9 : 수정란
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 미수정란의 유리화 동결 보존 방법은, 미수정란을 에틸렌 글리콜 및 FBS를 포함하는 PBS 용액으로 4 내지 6분간 처리하는 1차 처리 단계; 상기 1차 처리된 미수정란을 FBS, 에틸렌글리콜 및 수크로즈를 포함하는 PBS 용액인 유리화 용액에 25 내지 35초간 노출시키는 2차 처리 단계; 상기 1차 및 2차 처리된 미수정란을 스트로에 적하하는 스트로 단계; 및 상기 단계에서 처리된 스트로를 액체 질소로 처리하는 질소처리 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 의한 엘리트 송아지의 생산 방법은, 상기 유리화 동결 보존 방법에 따라 동결된 미수정란을 융해하는 융해 단계; 상기 융해된 미수정란을 원하는 우수형질을 보유한 정자와 체외수정시키고 이로써 얻어진 수정란을 배양하는 체외수정 및 배양 단계; 상기 배양된 수정란을 발정된 수란우에게 이식하는 이식 단계; 및 상기 수란우의 임신을 확인한 후 분만까지 유도하는 분만 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 의한 미수정란의 유리화 동결 보존에 사용되는 스트로는, 유리화 용액에 노출된 미수정란 드롭이 위치하는 스트로 말단부의 직경이 다른 부분보다 작은 것임을 특징으로 한다.
도1에 도시된 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 스트로는, 유리화 용액에 노출된 미수정란 드롭(1)(이하에서, "미수정란 드롭(1)"이라고 함)이 스트로의 말단부에 위치하고, 스트로의 다른 부분은 사용하지 아니한다. 특히, 이 말단부의 직경은 다른 부분보다 작게 구성된 것이 특징이다. 미수정란 드롭(1)의 적하를 구체적으로 설명하면, 스트로의 한 말단부의 한 면을 잘라낸 다음 내부가 드러난 벽면 상에 2㎕의 미수정란 드롭(1)을 적하한다. 상기 미수정란 드롭(1)의 반대편 말단은 솜마개로 막혀져 있다.
이러한 본 발명의 스트로는, 수정란 이식에 사용된 종래의 스트로와 구조가 상이하다. 도2에 도시된 바와 같이, 수정란 이식에 사용된 종래의 스트로는, 유리화 용액을 중앙부위에 채우고 그 안에 수정란(9)을 위치시킨 유리화 동결액층(2)과, 그 층을 양쪽에서 둘러싸는 공기층(3,4)이 있어서 융해시 동결액의 희석을 용이하게 하는 역할을 하였다. 또한 그 공기층(3,4)을 다시 둘러싸는 희석제층(5,6)을 갖추어서 융해시 동결액을 희석시켰다.
"난자은행"이란 정자은행과 마찬가지로 필요시 난자를 제공하는 곳이다. 현재, 국내외에서 가장 첨단 생명공학 기술로 인정되고 있는 생명 복제 기술은 시간적, 공간적 제약을 많이 받고 있다. 그 이유는 난자의 공급 방법에 어려움이 있기 때문이다. 예전부터 이용되었던 정자은행과 마찬가지로, 난자은행을 통해 난자를 제공받음으로써 시간과 공간의 제약을 극복할 수 있다. 이러한 난자은행에서 본 발명에 의한 동결방법을 이용하여 난자를 보존한다면 우수한 품질의 난자를 제공할 수 있게 될 것이다.
"엘리트 송아지"란 생산형질 유전능력이 제1위인 한우 숫소의 냉동 정액 및 난자은행으로부터 얻은 동결 미수정란을 체외수정한 후 대리모에 이식하여 10개월 후 태어나는 암송아지를 말한다.
이하 본 발명의 바람직한 일실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명이 이러한 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적에 불과하며, 이것이 본 발명의 권리범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 본 발명의 효과를 입증하기 위해 하기와 같은 단계를 거치는과정을 통하여 엘리트 송아지를 생산하였다.
1. 한우 미성숙란의 회수 및 체외 성숙
한우에서 적출된 한우 난소로부터, 2 내지 3mm의 가시난포에서 난구세포 부착 미성숙란을 회수하였다. 그 미성숙란을 TL-HEPES 배양액으로 3회 세척한 후 체외 성숙용 배양액 50㎕ 당 10개씩 넣어 배양하였다. 체외 성숙용 배양액으로는, 0.2mM 소듐-피루베이트, 1㎍/ml의 여포-자극 호르몬, 1㎍/ml의 에스트라디올-17β, 25㎍/ml의 젠타마이신 술페이트 및 10%의 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 TCM-199 배양액을 사용하였다. 배양은 39℃, 5% CO2배양기에서 22시간동안 체외성숙을 유도하였다.
2. 한우 미수정란의 유리화 동결 및 융해(Minimum Volume Cooling, MVC)
먼저 FBS가 10% 첨가된 D-PBS 보존액에 30%(v/v)의 에틸렌 글리콜과 0.5M의 수크로즈를 넣어 유리화 용액을 제조하였다. 상기 1에서 체외성숙된 미수정란을 전평형액으로서 10%(v/v) 에틸렌글리콜 및 10% FBS를 포함하는 D-PBS용액에서 5분간 평형시켰다. 그런 다음, 상기 제조된 유리화 용액에 약 30초간 노출시킨 후, 0.25ml의 스트로(IMV, L'Aigle, France)의 한쪽 말단의 내부벽면에 2㎕의 유리화 용액 드롭을 떨어뜨리고 여기에 상기 미수정란을 적하하였다. 그 후 액체 질소에 노출시키고 보관하였다.
상기 동결 보존된 미수정란을 융해시키는 과정은 총 4단계로 수행되었다. 먼저 1.0M의 수크로즈 및 10%의 FBS가 함유된 D-PBS 용액이 담겨진 디쉬에 상기 스트로를 담그어 융해를 유도한 후, 융해된 미수정란을 0.5M의 수크로즈, 0.25M의 수크로즈 및 0.125M의 수크로즈에 각각 순서대로 1분씩 처리함으로써 미수정란 내에 함유된 동해제를 제거하였다.
3. 체외수정 및 배양
상기 융해 과정을 통해 융해된 한우 미수정란을 체외 수정용 배양액 TL-스톡으로 세척하여 50㎕ 드롭에 10개씩 넣은 후, 원하는 우수 유전형질을 보유한 동결-융해된 한우 정액으로부터 회수된 고 활력 정자만을 ml당 1백만개의 농도로 수정을 실시하였다. 수정으로부터 44시간이 경과되어 형성된 2-세포기 이상의 난할배를 배발생 효율을 높이기 위해 10% FBS가 첨가된 CR1 배양액에서 난구세포와 5일간 공동배양하였다.
4. 수정란 이식
상기와 같이 7 내지 8일동안 체외 배양함으로써 형성된 상실배 및 배반포기배를 수란우에 이식하였다. 이식은, 발정 상태가 정상이고 발정 주기 6 내지 8일째에 황체가 존재하는 쪽 자궁각에 비외과적인 방법으로 수행하였다.
5. 임신 감정 및 분만
수정란 이식 후 발정 재귀에 따라 임신 여부를 1차적으로 확인하였으며, 약 2 내지 3개월 후에 직장 검사법으로 임신여부를 확인하였다. 임신으로 확인된 수란우를 분만까지 유도하였다.
상기와 같이 실험한 결과는 다음과 같다.
먼저, 동결하지 않은 난자로 이루어진 대조군에 대하여, 그리고 상기 본 발명의 실험군의 동결된 미수정란을 각각 융해시킨 후 수정율 및 체외 발달율 조사한 결과는 하기 표1과 같다.
| 처리군 | 공시 난자수 | 생존 난자수 | 체외 발달율 | |
| 수정율 | 배반포 형성율 | |||
| 대조군 | 130 | 130(100%) | 102(78.3%) | 37(36.3%) |
| 실험군 | 204 | 186(91.2%) | 129(69.4%) | 36(27.9%) |
상기 표1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 MVC 방식으로 동결된 난자는 동결하지 않은 신선한 난자에 별로 뒤지지 않는 높은 생존율 및 체외 발달율을 보임을 알 수 있었다.
상기 실시예에 의해 융해된 한우 미수정란을 체외에서 수정하여 배반포기배를 얻고 이를 수란우에 이식하였을 때의 임신율을 조사한 결과는 하기 표2에 나타내었다.
| 항목 | 수 | 퍼센트 |
| 대리모의 수 | 6 | |
| 이식 난자수 | 22(대리모 1마리당 3 내지 4개 이식) | |
| 임신한 대리모의 수 | 4/6 | 66.7% |
| 임신말기까지 임신이 유지된 대리모의 수 | 3/6 | 50.0% |
| 송아지를 생산한 대리모의 수 | 2/6 | 33.3% |
| 분만된 송아지 | 1(분만됨)1(분만 예정, 2001/3/27) |
상기 표2에 나타난 바와 같이, 전체 대리모 6마리에게 생산된 수정란을 각각 3 내지 4개씩 이식한 결과, 6마리중 4마리가 임신되었고, 그 중 3마리가 임신말기까지 임신이 유지되었으며, 그 중 2마리가 송아지를 생산하였다. 이미 분만된 송아지는 분만시 체중이 23kg으로 양호한 상태였다.
도3은 본 발명에 의한 방법이 시험된 한우 수소, 대리모 및 본 발명에 의하여 태어난 송아지의 사진이다. 도3에서, 우측 하단에 삽입된 사진은 국내에서 생산형질 유전능력이 제1위인 한우 수소이고, 중앙의 사진(640)은, 상기 한우 수소의 냉동 정액과 본 발명에 의하여 보존된 미수정란이 체외수정된 수정란이 이식된 대리모 암소이고, 우측 하단의 사진(511)은 상기 대리모 암소에 이식된 후 10개월 후에 태어난 엘리트 암송아지로서 분만시 체중이 23㎏이었다.
본 발명에 따른 미수정란의 유리화 동결 보존 방법 및 그 방법으로 동결된 미수정란으로부터 송아지를 생산하는 방법은, 복잡한 고가의 실험 장비나 고도의 숙련된 기술 없이도 미수정란을 신속하고 간단한 작업 공정을 통해 동결 보존할 수 있을 뿐만 아니라, 이로부터 높은 수태율로 우수한 형질을 갖는 송아지를 얻을 수 있다. 또한 우수한 품질의 난자를 공급하는 난자은행의 설립을 가능하게 하여 필요시 시간과 공간의 제약없이 미수정란을 공급할 수가 있다.
Claims (3)
- 미수정란을 에틸렌 글리콜 및 FBS를 포함하는 PBS 용액으로 4 내지 6분간 처리하는 1차 처리 단계;상기 1차 처리된 미수정란을 FBS, 에틸렌 글리콜 및 수크로즈를 포함하는 PBS 용액인 유리화 용액에 25 내지 35초간 노출시키는 2차 처리 단계;상기 1차 및 2차 처리된 미수정란을 스트로에 적하하는 스트로 단계; 및상기 단계에서 처리된 스트로를 액체 질소로 처리하는 질소처리 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미수정란의 유리화 동결 보존 방법.
- 미수정란의 유리화 동결 보존 방법에 의하여 보존된 미수정란으로부터 엘리트 송아지를 생산하는 방법에 있어서,제 1 항의 유리화 동결 보존 방법에 따라 동결된 미수정란을 융해하는 융해 단계;상기 융해된 미수정란을 원하는 우수형질을 보유한 정자와 체외수정시키고 이로써 얻어진 수정란을 배양하는 체외수정 및 배양 단계;상기 배양된 수정란을 발정된 수란우에게 이식하는 이식 단계; 및상기 수란우의 임신을 확인한 후 분만까지 유도하는 분만 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 엘리트 송아지의 생산 방법.
- 미수정란의 유리화 동결 보존에 사용되는 스트로에 있어서,상기 제1항의 보존 방법에서 1차 및 2차 처리되어 유리화 용액에 노출된 미수정란 드롭이 위치하는 스트로 말단부의 직경이 다른 부분보다 작은 것임을 특징으로 하는 스트로.
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