WO2018038115A1 - ウシ生殖細胞の凍結保存用組成物及び凍結保存方法 - Google Patents

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貴朗 安藤
玄　丞烋
優基 玄
修二 今村
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Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation composition and a cryopreservation method useful for cryopreservation of bovine germ cells, for example.
  • animal cells or tissues In order to preserve animal cells or tissues for a long period of time, a cryopreservation method at a temperature of 0 ° C. or lower is routinely used.
  • animal cells or tissues contain water, and when frozen, water molecules crystallize during freezing while eliminating solutes and contaminant media to form ice crystals consisting only of water molecules. It is known that the medium of solutes and contaminants diffuses unevenly in the material and freeze concentration occurs.
  • various low molecular compounds are added.
  • low molecular weight dimethyl sulfoxide or glycerol is added as a cryoprotectant to minimize damage to cells due to intracellular crystallization that occurs during cryopreservation. The way is done.
  • glycerin is known as a cryoprotectant used for freezing bovine sperm.
  • glycerin, ethylene glycol, and propanediol are known as cryoprotectants used for freezing bovine ova and embryos.
  • dimethyl sulfoxide is known as a cryoprotectant used for freezing bovine somatic cells.
  • each of these conventional cryoprotectants has a problem of strong cytotoxicity.
  • PCT / JP2009 / 002941 discloses a cryopreservation solution containing an amphoteric polymer electrolyte having an amino group and a carbosyl group in the side chain.
  • the cryopreservation solution can be used for cryopreservation of bovine cells such as germ cells and somatic cells.
  • an object of the present invention is to provide a cryopreservation composition and a cryopreservation method useful for freezing bovine cells including bovine germ cells.
  • an amphoteric polyelectrolyte in which an amino group of ⁇ -poly-L-lysine (PLL) was reacted with succinic anhydride and an appropriate amount of carboxyl group was introduced.
  • PLL ⁇ -poly-L-lysine
  • the present invention includes the following.
  • An amphoteric polymer electrolyte comprising a structural unit represented by the following formula (I) and a structural unit represented by the following formula (II), wherein the proportion of the structural unit represented by the following formula (II) is 50 to 99 mol%
  • a composition for cryopreservation useful for bovine germ cells can be provided, and bovine offspring productivity can be improved.
  • a composition for cryopreservation having low toxicity for bovine somatic cells can be provided.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the enclosure mode to the dedicated straw of a frozen embryo. It is a graph showing the number of adherent cells (seeded after removing cryoprotectant) seeded after freezing and thawing of cryopreserved bovine somatic cells (bovine skin-derived fibroblasts). It is a graph showing the number of adherent cells seeded after freezing and thawing of cryopreserved bovine somatic cells (bovine cumulus cells) (seeding after removing cryoprotectant).
  • composition for cryopreservation of bovine cells comprises carboxylating by reacting 50 to 99 mol% of the amino group of ⁇ -poly-L-lysine having a number average molecular weight of 1,000 to 20,000 with succinic anhydride. (Hereinafter referred to as “antifreeze polyamino acid”).
  • the antifreeze polyamino acid in the present invention includes (or consists of) a structural unit represented by the following formula (I) and a structural unit represented by the following formula (II), and represented by the following formula (II): It is an amphoteric polymer electrolyte in which the proportion of structural units shown is 50 to 99 mol%.
  • composition for cryopreservation of bovine cells according to the present invention the viability and proliferation of bovine germ cells or somatic cells after freezing and thawing can be significantly improved. Moreover, according to the composition for cryopreservation of bovine cells according to the present invention, the fertility rate by artificial insemination or embryo transfer can be significantly improved without impairing the developmental ability of bovine sperm or embryo after freezing and thawing. .
  • examples of ⁇ -poly-L-lysine include ⁇ -poly-L-lysine having a number average molecular weight of 1,000 to 20,000, particularly 1,000 to 10,000 produced by a microorganism or an enzyme.
  • ⁇ -poly-L-lysine is produced by actinomycetes belonging to the genus Streptomyces and is used exclusively as a food additive.
  • those having a polymerization degree of 15 to 35 those having a polymerization degree of 20 or less Production has also been attempted (for example, JP 2003-171463 A and JP 2005-318815 A).
  • the number average molecular weight or the number average degree of polymerization is measured by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), for example, using an electrophoresis apparatus manufactured by Ato Co., Ltd. and a densitograph (AE-6920V type). And can be easily measured. At this time, a standard protein marker is used. Note that ⁇ -poly-L-lysine can be used with a molecular weight of 30,000 or more by increasing the molecular weight by heat treatment. However, the above molecular weight range is preferable from the viewpoint of preventing an increase in viscosity.
  • the amino group of ⁇ -poly-L-lysine is preferably 50 to 99 mol%, particularly 50 to 93 mol%, more preferably 50 to 90 mol%, still more preferably 55 to 80 mol%, most preferably. Block by carboxylating 58-76 mol%.
  • the composition for cryopreservation of bovine cells according to the present invention is obtained by dissolving an antifreeze polyamino acid in a physiological aqueous solution.
  • a physiological aqueous solution a general culture solution for various cells or tissues can be used in addition to physiological saline.
  • Dulbecco's modified Eagle MEM medium DMEM
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle MEM medium
  • the composition for cryopreservation of bovine cells according to the present invention is a composition for cryopreservation of bovine sperm, which contains the antifreeze polyamino acid and glycerin described above.
  • the composition for cryopreservation of bovine sperm according to the present invention comprises, for example, an antifreeze polyamino acid having a concentration of 0.25 to 1.0 w / w%, preferably 0.3 to 0.9 w / w% or 0.3 to 0.8 w / w%, and 1.5 It contains glycerin at a concentration of ⁇ 4.5 w / w% or 1.5-4.4 w / w%, preferably 2.0-4.0 w / w%.
  • the glycerin content is an amount that is significantly reduced or halved from the amount conventionally used for cryopreservation of bovine sperm, and the composition for cryopreservation of bovine sperm according to the present invention is a cryoprotectant with low cytotoxicity. is there.
  • bovine semen is diluted 5 to 20 times with a physiological solution to which an antifreeze polyamino acid and glycerin are added, whereby 0.3 to 0.9 w / w% amphoteric is obtained.
  • the method includes a step of freezing a cryopreservation solution in which bovine sperm is suspended in a tubular container, and a step of storing the cryopreservation solution at a temperature of ⁇ 60 ° C. or lower after that.
  • bovine semen is diluted 2.5 to 10 times with a physiological solution and maintained at 2 to 8 ° C, and the primary dilution while maintaining at 2 to 8 ° C.
  • a physiological solution containing amphoteric polyelectrolyte (antifreeze polyamino acid) and glycerin to the suspension obtained by the step by infusion, further dilution of bovine semen can be achieved by 5 to 20 And a secondary dilution step so as to be diluted twice.
  • the motility rate of the spermatozoa can be 30% or more, and the high-speed linear movement rate can be 10% or more.
  • Physiological solutions include isotonic Tris-citrate buffer (tris (hydroxymethylaminomethane), citric acid, glucose, sodium chloride aqueous solution (including physiological saline), or egg yolk, amino acids.
  • Tris-citrate buffer tris (hydroxymethylaminomethane), citric acid, glucose, sodium chloride aqueous solution (including physiological saline), or egg yolk, amino acids.
  • M199, CR1aa, Dulbecco's modified medium (DMEM), Eagle's MEM medium (MEM), etc. can be used as appropriate, for example, 1000 mg / L to 4500 mg / L glucose, for example. Or other monosaccharides, disaccharides, etc. can be included.
  • Examples of preferred physiological solutions for preservation of bovine sperm include those based on Tris-citrate buffer prepared as follows. That is, in one specific example, 17.031 g of tris (hydroxymethylaminomethane) (Wako Pure Chemical Industries), 9.519 g of citric acid monohydrate (Wako Pure Chemical Industries), 3.000 g of glucose (Wako Pure Chemical Industries) Yakuhin), 4.625 g of sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries), 3 ml of 1 million IU / 4.6 ml SPUF penicillin G potassium (Manyu Pharmaceutical), 1000 mg titer / 4.3 ml SPUF streptomycin (Meiji Seika) 3 ml) and made up to 1000 ml with distilled water, and an aqueous solution containing 140.6 mM Tris (hydroxymethylaminomethane), 45.3 mM citric acid, 16.7 mM glucose, 79.1 mM sodium chloride, Can be used.
  • Tris-citrate buffer prepared
  • Tris-citrate buffer solution egg yolk tris sugar solution (ET)
  • E gg yolk tris sugar solution
  • a composition for cryopreservation of bovine cells comprises a bovine embryo containing the antifreeze polyamino acid, ethylene glycol, propanediol, and fetal bovine serum described above.
  • a composition for cryopreservation examples include bovine embryos generated by in vitro fertilization (IVF) for 6 to 9 days (preferably 7 to 8 days).
  • the composition for cryopreservation of bovine embryo according to the present invention comprises, for example, an antifreeze polyamino acid having a concentration of 5 to 10 w / w% (preferably 7 w / w%), a concentration of 4 to 6 w / w%, for example 5 w / w ethylene glycol at a concentration of w%, a concentration of 4-8 w / w%, for example propanediol (1,3-propanediol; propylene glycol) at a concentration of 6 w / w%, and a concentration of 15-25 w / w%, preferably Contains fetal calf serum at a concentration of 20 w / w%).
  • an antifreeze polyamino acid having a concentration of 5 to 10 w / w% (preferably 7 w / w%), a concentration of 4 to 6 w / w%, for example 5 w / w ethylene glycol at
  • the composition for cryopreservation of bovine cells is a composition for cryopreservation of bovine somatic cells comprising the antifreeze polyamino acid and fetal bovine serum described above. is there.
  • bovine somatic cells to be cryopreserved include fibroblasts, cumulus cells, mesenchymal cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, adipose-derived stem cells, and the like.
  • composition for cryopreservation of bovine somatic cells comprises, for example, an antifreeze polyamino acid having a concentration of 5 to 30 w / w% (preferably 5 to 25 w / w%) and 65 to 85 w / w% (preferably Contains fetal bovine serum at a concentration of 70-80 w / w%).
  • composition for cryopreservation of bovine somatic cells according to the present invention may contain dimethyl sulfoxide.
  • the composition for cryopreservation of bovine somatic cells according to the present invention can contain, for example, dimethyl sulfoxide at a concentration of 0.1 to 10 w / w% (preferably 4 to 6 w / w%, 5 w / w%).
  • bovine cells are suspended in the composition for cryopreservation of bovine cells according to the present invention described above.
  • -20 to -100 ° C preferably -60 to -90 ° C or -70 to -90 ° C
  • Various bovine cells can be stored frozen by freezing in a freezer (preferably around -80 ° C).
  • bovine sperm for example, 15 to 30 million bovine sperm (preferably 20 to 30 million) are suspended in 0.25 to 0.5 mL of a cryopreservation composition and subjected to freezing.
  • bovine embryos for example, 1 to 50 (preferably 1 to 2) bovine embryos are suspended in 0.01 to 0.25 mL (preferably 0.02 to 0.05 mL) of a cryopreservation composition and subjected to freezing.
  • bovine somatic cells for example, 500,000 to 2,000,000 (preferably 500,000 to 1,000,000) bovine somatic cells are suspended in 0.2 to 2 mL (preferably 1 mL) of a cryopreservation composition and frozen.
  • the frozen bovine cells When using frozen bovine cells, the frozen bovine cells can be thawed and used in accordance with the general thawing method of various bovine cells. Note that antifreeze polyamino acids have low cytotoxicity and, unlike dimethyl sulfoxide, do not need to be removed upon thawing.
  • composition for cryopreservation of bovine cells according to the present invention can also be provided as a kit for cryopreservation of bovine cells.
  • the kit can contain, for example, containers used for cryopreservation, instruction manuals for the kit, and the like.
  • Example 1 Cryopreservation of bovine sperm using an antifreeze polyamino acid 1-1.
  • Preparation of Cryopreservation Solution 65% succinic anhydride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was added to a 25% aqueous solution of ⁇ -poly-L-lysine (manufactured by Chisso, molecular weight 4000), and ⁇ -poly- An antifreeze polyamino acid blocked by carboxylation of 60 mol% of the amino group in the L-lysine molecule was prepared.
  • CPLL polyamino acid
  • Gly glycerin
  • DMEM Dulbecco's modified medium
  • glucose amount 3151 mg / L
  • the solution was neutralized with 1N hydrochloric acid or an aqueous sodium hydroxide solution so that the pH was in the range of 7.0 to 8.0.
  • the thawed cryopreserved sperm suspension was thawed by taking out a cryopreservation straw from liquid nitrogen and then immersing it in hot water at 30 to 38 ° C. for 15 seconds.
  • Table 2 shows the results of conception by artificial insemination of bovine spermatozoa stored frozen.
  • the sperm viability (motility) after 6 hours after freezing and thawing was significantly better in the new method than in the conventional method.
  • Example 2 Cryopreservation of bovine embryos using antifreeze polyamino acids 2-1. Preparation of Cryopreservation Solution 65% succinic anhydride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was added to a 25% aqueous solution of ⁇ -poly-L-lysine (manufactured by Chisso, molecular weight 4000), and ⁇ -poly- An antifreeze polyamino acid blocked by carboxylation of 60 mol% of the amino group in the L-lysine molecule was prepared.
  • succinic anhydride manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • the prepared antifreeze polyamino acid solution (CPLL), ethylene glycol (EG), propanediol (PD) and fetal calf serum (FCS or CS) are added to phosphate buffered saline (PBS, manufactured by Gibco) in a predetermined manner. It added so that it might become a ratio (w / w%).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the solution was neutralized with 1N hydrochloric acid or an aqueous sodium hydroxide solution so that the pH was within the range of 7.0 to 7.5.
  • Bovine embryo cryopreservation method Bovine embryos grown from morula to blastocyst stage were washed with PBS containing 20% fetal bovine serum, then immersed in a cryopreservation solution containing CPLL, and immediately 0.25 ml The frozen storage straw (manufactured by IMV) was enclosed together with the frozen solution (FIG. 1). After the enclosure, the mixture was equilibrated for 10 to 20 minutes, then cooled to ⁇ 30 ° C. by a slow freezing method with a cooling rate of 100 ° C./min or less by a program freezer, and then frozen by immersing in liquid nitrogen. After freezing, it was stored in liquid nitrogen until use.
  • the thawed frozen embryos were thawed by taking out a cryopreservation straw from liquid nitrogen, holding them in the air for 5 seconds, and immersing them in warm water at 30 to 38 ° C. for 15 seconds.
  • Table 7 shows the results of embryo viability when the cryopreserved bovine embryo was frozen and thawed and then exposed to a freezing solution.
  • Example 3 Freezing preservation of bovine somatic cells using antifreeze polyamino acid 3-1.
  • Preparation of Cryopreservation Solution 65% succinic anhydride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was added to a 25% aqueous solution of ⁇ -poly-L-lysine (manufactured by Chisso, molecular weight 4000), and ⁇ -poly- An antifreeze polyamino acid blocked by carboxylation of 60 mol% of the amino group in the L-lysine molecule was prepared.
  • CPLL prepared antifreeze polyamino acid solution
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • CS fetal bovine serum
  • DMEM Dulbecco's modified medium
  • Bovine somatic cells cultured to confluence in a tissue culture flask (dish) were collected by an ordinary method such as PBS washing or enzyme treatment with trypsin.
  • the collected bovine somatic cells were immersed in a cryopreservation solution in a cryopreservation tube (for 1.0 ml, manufactured by Falcon), immediately placed in a -80 ° C deep freezer, and frozen and stored (for long-term storage) Stored in liquid nitrogen).
  • FIG. 2 shows the number of adherent cells seeded after freezing and thawing of cryopreserved bovine somatic cells (bovine skin-derived fibroblasts) (seeding after removing the cryoprotectant).
  • Table 10 shows the results of the viability immediately after freezing and thawing of the cryopreserved bovine somatic cells (bovine cumulus cells).
  • Table 11 shows the results of cell proliferation after freeze-thawing of cryopreserved bovine somatic cells (bovine cumulus cells).
  • FIG. 3 shows the number of adherent cells seeded after freezing and thawing of cryopreserved bovine somatic cells (bovine cumulus cells) (seeding after removing the cryoprotectant).
  • CPLL can be used for cryopreservation of bovine somatic cells.
  • CPLL was a substitute for DMSO as a cryoprotectant, and only CPLL could be cryopreserved as a cryoprotectant.
  • the ability to increase after freezing and thawing was higher with CPLL than with DMSO.
  • CPLL did not need to be removed at the time of freezing and thawing, and cells could be seeded without removal.
  • CPLL was a substitute for DMSO as a cryoprotectant in cumulus cells, and only CPLL could be cryopreserved as a cryoprotectant.
  • optimal CPLL concentrations of fibroblasts (CPLL 5%) and cumulus cells (CPLL 25%) differed from the increased ability after freezing and thawing.

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Abstract

ウシ精子などのウシ生殖細胞の凍結保存液及び凍結保存方法を提供する。数平均分子量1,000～20,000のε-ポリ-L-リジンのアミノ基の50～99モル％について、無水コハク酸を反応させてカルボキシル基を適当量導入した両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）0.3～0.9w/w％と、グリセリン2～4w/w％とを、生理的溶液に溶解させた凍結保存液を用いる。凍結保存方法の好ましい実施形態では、ウシの精液を、生理的溶液により2.5～10倍に希釈し、2～8℃で保持する１次希釈工程と、2～8℃で保持しつつ、１次希釈工程により得られた懸濁液に、両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）とグリセリンとを添加した生理的溶液を点滴により添加することで、さらに希釈することにより、ウシの精液が5～20倍に希釈されるようにする２次希釈工程とを含む。

Description

ウシ生殖細胞の凍結保存用組成物及び凍結保存方法
　本発明は、例えばウシ生殖細胞の凍結保存に有用な凍結保存用組成物及び凍結保存方法に関する。
　動物の細胞又は組織を長期に保存するために、0℃以下の温度での凍結保存法が日常的に用いられている。しかしながら、動物の細胞又は組織は水を含有し、凍結すると、凍結中に水分子同士が、溶質や混入物の媒質を排除しながら結晶化して水分子のみから成る氷結晶を形成するため、含水物中で溶質や混入物の媒質が不均一に拡散し、凍結濃縮が発生することが知られている。
　このような凍結濃縮を防止するため、様々な低分子化合物を添加する方法が行われている。例えば、細胞の凍結保存を行う場合に、凍結保存中に起こる細胞内の結晶化による細胞へのダメージを最小限に抑えるために、凍結保護剤として、低分子のジメチルスルホキシドやグリセロール等を添加する方法が行われている。
　特に、ウシの子畜生産性向上を図るためには、ウシ生殖細胞にとって有用な凍結保存方法の開発が重要である。
　例えば、ウシ精子の凍結に用いられる凍結保護剤としてはグリセリンが知られている。また、ウシ卵子及び胚の凍結に用いられる凍結保護剤としては、グリセリン、エチレングリコール、プロパンダイオールが知られている。さらに、ウシ体細胞の凍結に用いられる凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシドが知られている。
　しかしながら、これら従来の凍結保護剤は、いずれも細胞毒性が強いといった問題があった。
　ところで、PCT/JP2009/002941（日本特許第5726525号）は、アミノ基とカルボシル基を側鎖に持つ両性高分子電解質を含有する凍結保存液を開示する。しかしながら、当該凍結保存液が、生殖細胞や体細胞等のウシ細胞の凍結保存に使用できることは知られていなかった。
　上述のように、ウシの子畜生産性向上を図るためには、ウシ生殖細胞にとって有用な新規凍結保存剤及び凍結保存方法の開発が重要である。しかしながら、従来のウシ細胞の凍結に使用される凍結保護剤は、いずれも細胞毒性が強いといった問題があった。
　そこで、本発明は、これらの実情に鑑み、ウシ生殖細胞を含むウシ細胞の凍結に有用な凍結保存用組成物及び凍結保存方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ε-ポリ-L-リジン(PLL)のアミノ基を無水コハク酸と反応させてカルボキシル基を適当量導入した両性高分子電解質(不凍ポリアミノ酸)が、単独で、又は従来の凍結保護剤と併用することで、ウシ生殖細胞又は体細胞の凍結保存に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下を包含する。
下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50～99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）とグリセリンとを含む、ウシ精子などウシ生殖細胞の凍結保存用組成物、及び、これを用いる凍結保存方法。
　　＜化学式I＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　　＜化学式II＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　本発明によれば、ウシ生殖細胞に有用な凍結保存用組成物を提供することができ、ウシの子畜生産性を向上させることができる。また、本発明によれば、ウシ体細胞にとって毒性の低い凍結保存用組成物を提供することができる。
凍結胚の専用ストローへの封入様式を示す図である。 凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解後に播種した接着細胞数(凍結保護剤除去後播種)を示すグラフである。 凍結保存したウシ体細胞(ウシ卵丘細胞)の凍結融解後に播種した接着細胞数(凍結保護剤除去後播種)を示すグラフである。
　本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、数平均分子量1,000～20,000のε-ポリ-L-リジンのアミノ基の50～99モル％について、無水コハク酸を反応させてカルボキシル化することでブロックしたもの(以下、「不凍ポリアミノ酸」と称する)を含むものである。
　具体的には、本発明における不凍ポリアミノ酸は、下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み(又はから成り)、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50～99モル％である両性高分子電解質である。
　　＜化学式I＞
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　　＜化学式II＞
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012

　本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物によれば、凍結融解後のウシ生殖細胞又は体細胞の生存率及び増殖を有意に向上させることができる。また、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物によれば、凍結融解後のウシ精子又は胚の発生能を損なうことなく、人工授精や胚移植による受胎率を有意に向上させることができる。
　本発明において、ε-ポリ-L-リジンとしては、微生物又は酵素により生産される数平均分子量が1,000～20,000、特には1,000～10,000のε-ポリ-L-リジンを挙げることができる。ε-ポリ-L-リジンは、ストレプトマイセス属(Streptomyces)に属する放線菌により生産されて専ら食品添加物として用いられており、重合度15～35のものの他、重合度が20以下のものの生産も試みられている(例えば、特開2003-171463号公報及び特開2005-318815号公報)。数平均分子量又は数平均重合度の測定は、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)法により、例えば、アトー(株)製の電気泳動装置及びデンシトグラフ(AE-6920V型)を用いて容易に測定することができる。このとき、標準タンパク質マーカーを用いる。なお、ε-ポリ-L-リジンは、加熱処理による高分子量化により分子量30,000以上として用いることもできる。しかしながら、粘度の上昇を防ぐ等の観点から上記の分子量範囲が好ましい。
　下記に示す反応により、ε-ポリ-L-リジンのアミノ基は、部分的に無水コハク酸によってカルボキシル化されて、ブロックされる。
　　＜化学式III＞
 
　この際、ε-ポリ-L-リジンのアミノ基について、好ましくは50～99モル％、特に50～93モル％、より好ましくは50～90モル％、さらに好ましくは55～80モル％、最も好ましくは58～76モル％をカルボキシル化することでブロックする。
　ε-ポリ-L-リジンのアミノ基に対して52～53モル％の無水コハク酸を反応させることで約50モル％のアミノ基をブロックすることができる。また、100モル％の無水コハク酸を反応させた場合、通常の反応条件で、90～95モル％のアミノ基をブロックすることができる。ブロック率が上記の範囲を超えても、また、下回っても、凍結保存効果が小さくなる。
　本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、生理的水溶液に不凍ポリアミノ酸を溶解したものである。生理的水溶液としては、生理食塩水の他、各種の細胞又は組織用の一般的な培養液を用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグルMEM培地(DMEM)を好ましいものとして挙げることができる。
　本発明の第一実施形態においては、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、上記に説明した不凍ポリアミノ酸とグリセリンとを含む、ウシ精子の凍結保存用組成物である。本発明に係るウシ精子の凍結保存用組成物は、例えば0.25～1.0w/w％、好ましくは0.3～0.9w/w％または0.3～0.8w/w％の濃度の不凍ポリアミノ酸、及び1.5～4.5w/w％または1.5～4.4w/w％好ましくは、2.0～4.0w/w％の濃度のグリセリンを含む。当該グリセリン含有量は、従来においてウシ精子の凍結保存に使用される量を有意に低減又は半減した量であり、本発明に係るウシ精子の凍結保存用組成物は細胞毒性の低い凍結保護剤である。
　第一実施形態による好ましい凍結保存方法によると、不凍ポリアミノ酸及びグリセリンとを添加した生理的溶液により、ウシの精液を5～20倍に希釈することで、0.3～0.9w/w％の両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）と、2～4w/w％のグリセリンと、ウシの精液に由来する部分とを含有する凍結保存液中にウシ精子を懸濁させるようにする希釈工程と、ウシ精子を懸濁させた凍結保存液を、管状の容器中にて凍結に供する工程と、この後、-60℃以下の温度に保持することで保存を行う工程とを含む。
　前記希釈工程は、好ましくは、ウシの精液を、生理的溶液により2.5～10倍に希釈し、2～8℃で保持する１次希釈工程と、2～8℃で保持しつつ、１次希釈工程により得られた懸濁液に、両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）とグリセリンとを添加した生理的溶液を点滴により添加することで、さらに希釈することにより、ウシの精液が5～20倍に希釈されるようにする２次希釈工程とを含む。
　また、好ましくは、径が5mm以下である凍結保存用ストローを用い、プログラムフリーザーなどによる冷却速度100℃／分以下の緩慢凍結法で、または、液体窒素浸漬により冷却速度300℃／分以上のガラス化凍結法で、－140℃以下にまで冷却する。また、好ましくは、凍結融解6時間後にて、運動精子率を30%以上とし、高速直進運動率を10%以上とすることができる。
　生理的溶液としては、等張性のトリス・クエン酸緩衝液（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、クエン酸、グルコース、塩化ナトリウム等の水溶液（生理食塩水を含む）、もしくは、これに卵黄、アミノ酸などを適宜添加したもの、M199、CR1aa、ダルベッコ改変培地(DMEM)、イーグルのMEM培地(MEM)などの少なくとも一種を、適宜用いることができる。培地は、例えば1000mg/L～4500mg/Lのグルコースまたはその他の単糖類、二糖類などを含むことができる。
　ウシ精子の保存に好ましい生理的溶液の例としては、下記のように調製したトリス・クエン酸緩衝液ベースのものを挙げることができる。すなわち、一具体例において、１７．０３１ｇのトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）（和光純薬工業）、９．５１９ｇのクエン酸一水和物（和光純薬工業）、３．０００ｇのグルコース（和光純薬工業）、及び４．６２５ｇの塩化ナトリウム（和光純薬工業）、さらに１００万ＩＵ／４．６ｍｌＳＰＵＦのペニシリンＧカリウム（万有製薬）を３ｍｌ、１０００ｍｇ力価／４．３ｍｌＳＰＵＦのストレプトマイシン（明治製菓）を３ｍｌ加え、蒸留水で１０００ｍｌにメスアップして、１４０．６ｍＭのトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、４５．３ｍＭのクエン酸、１６．７ｍＭのグルコース、７９．１ｍＭの塩化ナトリウムを含む水溶液としたものを用いることができる。
　ウシ精子の保存に好ましい生理的溶液の他の例としては、卵黄を添加したトリス・クエン酸緩衝液（卵黄トリス糖液（ＥＴ））を挙げることができる。これは、社団法人家畜改良事業団が「Ｓｏｒｔ９０」の商品名で市販する精液一次希釈液である。
　本発明の第二実施形態においては、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、上記に説明した不凍ポリアミノ酸とエチレングリコールとプロパンダイオールとウシ胎子血清とを含む、ウシ胚の凍結保存用組成物である。凍結保存対象のウシ胚としては、例えば体外受精(IVF)により6～9日間(好ましくは7～8日間)発生させたウシ胚等が挙げられる。
[規則91に基づく訂正 28.08.2017]　
　本発明に係るウシ胚の凍結保存用組成物は、例えば5～10w/w％(好ましくは、7w/w％)の濃度の不凍ポリアミノ酸、4～6w/w％の濃度、例えば5w/w％濃度のエチレングリコール、4～8w/w％の濃度、例えば6w/w％の濃度のプロパンダイオール(1,3-プロパンジオール；プロピレングリコール)、及び15～25w/w％の濃度、好ましくは20w/w％)濃度のウシ胎子血清を含む。
　本発明の第三実施形態においては、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物は、上記に説明した不凍ポリアミノ酸とウシ胎子血清とを含む、ウシ体細胞の凍結保存用組成物である。凍結保存対象のウシ体細胞としては、例えば線維芽細胞、卵丘細胞、間葉系細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞等が挙げられる。
　本発明に係るウシ体細胞の凍結保存用組成物は、例えば5～30w/w％(好ましくは、5～25w/w％)の濃度の不凍ポリアミノ酸、及び65～85w/w％(好ましくは、70～80w/w％)の濃度のウシ胎子血清を含む。
　さらに、本発明に係るウシ体細胞の凍結保存用組成物は、ジメチルスルホキシドを含んでもよい。本発明に係るウシ体細胞の凍結保存用組成物は、例えば0.1～10w/w％(好ましくは4～6w/w％、5w/w％)の濃度のジメチルスルホキシドを含むことができる。
　以上に説明した本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物中に各種ウシ細胞を懸濁し、例えば-20～-100℃、好ましくは-60～-90℃または-70～-90℃、特に好ましくは-80℃前後)のフリーザー中で凍結することで、各種ウシ細胞を凍結保存することができる。ウシ精子については、例えば1500万～3000万個(好ましくは、2000万～3000万個)のウシ精子を0.25～0.5mLの凍結保存用組成物に懸濁し、凍結に供する。ウシ胚については、例えば1～50個(好ましくは、1～2個)のウシ胚を0.01～0.25mL(好ましくは、0.02～0.05mL)の凍結保存用組成物に懸濁し、凍結に供する。ウシ体細胞については、例えば50万～200万個(好ましくは、50万～100万個)のウシ体細胞を0.2～2mL(好ましくは、1mL)の凍結保存用組成物に懸濁し、凍結に供する。
　凍結したウシ細胞を使用する場合には、各種ウシ細胞の一般的な融解方法に準じて、凍結したウシ細胞を融解し、使用することができる。なお、不凍ポリアミノ酸は、細胞毒性が低く、ジメチルスルホキシド等と異なり、融解時に除去する必要はない。
　また、本発明に係るウシ細胞の凍結保存用組成物を、ウシ細胞の凍結保存用キットとして提供することもできる。当該キットには、凍結保存用組成物に加えて、例えば凍結保存に使用する容器、キットの取扱説明書等を含むことができる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕不凍ポリアミノ酸を用いたウシ精子の凍結保存
１－１．凍結保存溶液の調製
　ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)の25％水溶液に、モル％で65％の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル％についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。
　次いで、作製した不凍ポリアミノ酸(CPLL)の溶液（約33w/w％の水溶液）及びグリセリン(Gly)をダルベッコ改変培地(DMEM、Gibco(登録商標)11330-032、グルコース量：3151mg/L)に所定の割合（グリセリンV/V%，CPLLw/w%）となるように添加した。この際、pHが7.0～8.0の範囲内になるように1Nの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液で中和した。
１－２．ウシ精子の凍結保存方法
　種雄牛から採取した精液は、精子の数・運動性等を検査した後、１次希釈液（「１－１．」で用いたダルベッコ改変培地）で５倍程度に希釈した後、低温室(４℃)にて静置し、ゆっくり冷却した。精液の温度が４℃程度まで下がった段階で１次希釈液にて最終希釈量の半量まで点滴にて希釈した。その後、４℃程の温度を維持しつつ、耐凍剤の入った２次希釈液（「１－１．」で得られた「凍結保存溶液」）を点滴にて最終希釈量まで希釈し、凍結保存用ストロー（富士平工業株式会社製品「0.5ml 細133型」、径4mm×133mm）に分注・注入した。その後暫く静置し、プログラムフリーザーを用いた冷却速度100℃／分以下の緩慢凍結法で－150℃前後まで冷却・凍結してから、液体窒素中に保存した。（2次希釈液中の耐凍剤の添加量　グリセリン：13v/v％：従来型、グリセリン6.5v/v％＋CPLL1.0w/v％：新規型）
　凍結保存された精子懸濁液の融解は、液体窒素中から凍結保存用ストローを取り出した後、30～38℃の温湯中に15秒浸漬することで行われた。
１－３．ウシ精子の凍結保存の結果及び考察
　凍結保存したウシ精子の凍結融解後の生存性の結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１に示すように、ウシ精子の凍結保存にCPLLが使用できることが明らかとなった。また、CPLLを添加することにより、従来から使用されているGlyを低減(半減)できた。このことは、新たな組成の細胞毒性の低い凍結液を意味する。
　凍結保存したウシ精子の人工授精による受胎成績を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表２に示すように、CPLLを使用した凍結ウシ精子の人工授精で有効な受胎率が得られた。このことは、凍結融解後の発生能も損なわれていないことを意味する。
１－４．凍結融解6時間後の精子の生存性（運動性）の評価
目的：
　凍結融解直後の精子生存性に差異がみられなかったが(表１)、人工授精による受胎率には差異が認められたことから(表２)、その要因を検索した。
方法：
　従来法（6.5％グリセリン）または新規法（3.25％グリセリン+0.5％CPLL）により凍結され、融解されたそれぞれの精子を、6時間保温保存した後、精子の運動性を調査した。ウシ精子の運動性評価には、精子運動解析装置（CASA；SMAS 3、ディテクト製）および測定用チャンバー（MicroCell、Vitrolife 製）を使用して、37℃で精子運動パラメータ（運動率 Mot、前進運動率 Prog、直線速度 VSL、曲線速度VCL、平均速度 VAP、頭部振幅AHL、頭部振動数BCF）を測定した。VAP＞10μm/secを運動精子、VAP＞50μm/sec かつ STR＞0.75を前進運動精子とした。
結果：
　結果を以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表３に示すように、凍結融解6時間後の精子の生存性(運動性）は、従来法より新規法の方が有意に良好であった。
考察：
　凍結融解直後の精子の生存性（運動性）には差異が無いものの、融解して一定時間経過した精子の生存性に差異が認められた。
　人工授精で子宮頚管または子宮体部へ注入された精子は、4時間程度かけて受精の場である卵管膨大部に達することから、融解後一定時間経過した精子の生存性の差異は受胎率に影響する可能性が示唆される。
１－５．凍結融解後精子頭部の細胞膜の評価
目的：
　凍結融解直後の精子生存性に差異がみられなかったが(表１)、融解6時間後の精子生存性に差異が認められたことから(表３)、その要因を検索した。
方法：
　従来法（6.5％グリセリン）または新規法（3.25％グリセリン+0.5％CPLL）により凍結され、融解されたそれぞれの精子をSYBR14とpropidium iodide（PI）で染色を行い、精子頭部細胞膜の障害を調査した。
　なお、細胞膜に障害が無い場合はSYBR14で緑色に染まり、障害がある場合はpropidium iodideで赤く染まる。
結果：
　結果を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表４に示すように、凍結融解後の精子頭部細胞膜に障害が無い割合は、従来法より新規法の方が有意に多かった。
考察：
　凍結融解6時間後の精子の生存性に差異が認められた要因の一つは、凍結融解による精子細胞膜へのダメージによるものと推測される。
〔実施例２〕不凍ポリアミノ酸を用いたウシ胚の凍結保存
２－１．凍結保存溶液の調製
　ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)の25％水溶液に、モル％で65％の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル％についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。
　次いで、作製した不凍ポリアミノ酸溶液(CPLL)、エチレングリコール(EG)、プロパンダイオール(PD)及びウシ胎子血清(FCS又はCS)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、ギブコ製)に所定の割合(w/w％)となるように添加した。この際、pHが7.0～7.5の範囲内になるように1Nの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液で中和した。
２－２．ウシ胚の凍結保存方法
　桑実胚から胚盤胞期胚に成長したウシ胚は、20%ウシ胎子血清を加えたPBSで洗浄した後、CPLLを加えた凍結保存液に浸漬し、ただちに0.25mlの凍結保存用ストロー（IMV製）に凍結液とともに封入された（図１）。封入後、10分～20分の平衡処理後、プログラムフリーザーにより冷却速度100℃／分以下の緩慢凍結法で-30℃まで冷却した後、液体窒素中に浸漬することで凍結が行われた。凍結後は使用まで液体窒素中で保存された。
　凍結保存された凍結胚の融解は、液体窒素中から凍結保存用ストローを取り出し、5秒間空中保持された後、30～38℃の温湯中に15秒間浸漬することで行われた。
２－３．ウシ胚の凍結保存の結果及び考察
　凍結保存したウシ胚の凍結融解後の生存性の結果を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表５に示すように、ウシ胚の凍結保存(緩慢凍結法)にCPLLが使用できることが明らかとなった。また、従来の凍結保護剤(濃度)にCPLLを添加することで、従来と変わらない生存性を確保できた。このことは、新たな組成の凍結液を意味する。
　凍結保存したウシ胚の胚移植成績を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表６に示すように、CPLLを使用した凍結ウシ胚の胚移植で有効な受胎率が得られた。このことは、凍結融解後の発生能は損なわれていないことを意味する。
　凍結保存したウシ胚の凍結融解後に凍結液曝露した際の胚の生存性の結果を以下の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
〔実施例３〕不凍ポリアミノ酸を用いたウシ体細胞の凍結保存
３－１．凍結保存溶液の調製
　ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)の25％水溶液に、モル％で65％の無水コハク酸(和光純薬工業製)を添加し、ε-ポリ-L-リジン分子中のアミノ基の60モル％についてカルボキシル化することでブロックした不凍ポリアミノ酸を作製した。
　次いで、作製した不凍ポリアミノ酸溶液（CPLL）、ジメチルスルホキシド(DMSO)及びウシ胎子血清(CS)をダルベッコ改変培地(DMEM、シグマアルドリッチ製)に所定の割合(w/w％)となるように添加した。この際、pHが7.0～7.5の範囲内になるように1Nの塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液で中和した。
３－２．ウシ体細胞の凍結保存方法
　組織培養用フラスコ（ディッシュ）でコンフルエントまで培養されたウシ体細胞は、PBS洗浄、トリプシンによる酵素処理等定法によって回収された。回収されたウシ体細胞は、凍結保存用チューブ（1.0ml用、ファルコン製）中の凍結保存液に浸漬され、ただちに-80℃ディープフリーザー内に置かれ、凍結および保存された（長期保存の場合は液体窒素中で保管）。
　凍結保存された体細胞の融解は、保管場所より取り出された後、ただちに30～38℃の温湯中にチューブ内に米粒大の氷晶が残るまで浸漬され、定法により遠心操作により凍結保存液を除去された後、細胞培養用デバイスに播種された。また、本凍結保存液による凍結では、融解後の凍結保存液の除去が不要であった（除去せずに播種することが可能であった）。
３－３．ウシ体細胞の凍結保存の結果及び考察
　凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解直後の生存性の結果を以下の表８に示す。また、凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解後の細胞増殖性の結果を以下の表９に示す。さらに、凍結保存したウシ体細胞(ウシ皮膚由来線維芽細胞)の凍結融解後に播種した接着細胞数(凍結保護剤除去後播種)を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　凍結保存したウシ体細胞(ウシ卵丘細胞)の凍結融解直後の生存性の結果を以下の表１０に示す。また、凍結保存したウシ体細胞(ウシ卵丘細胞)の凍結融解後の細胞増殖性の結果を以下の表１１に示す。さらに、凍結保存したウシ体細胞(ウシ卵丘細胞)の凍結融解後に播種した接着細胞数(凍結保護剤除去後播種)を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　表８～１１及び図２～３に示すように、ウシ体細胞の凍結保存にCPLLが使用できることが明らかとなった。
　表８及び９並びに図２に示すように、ウシ皮膚由来線維芽細胞では凍結保護剤としてCPLLはDMSOの代替となり、CPLLのみを凍結保護剤として凍結保存が可能であった。また、凍結融解後の増加能力は、DMSOよりCPLL使用の方が高かった。さらに、CPLLは凍結融解時に除去をする必要は無く、除去せずに細胞を播種できた。
　一方、表１０及び１１並びに図３に示すように、卵丘細胞では凍結保護剤としてCPLLはDMSOの代替となり、CPLLのみを凍結保護剤として凍結保存が可能であった。また、凍結融解後の増加能力から、線維芽細胞(CPLL5％)と卵丘細胞(CPLL25％)の至適CPLL濃度が異なった。

Claims (9)

  1. 　ウシ精子を懸濁させて凍結するためのウシ精子の凍結保存液であって、
    　下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50～99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）0.3～0.9w/w％と、グリセリン2～4w/w％とを含む、ウシ精子の凍結保存液。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
  2. 　ダルベッコ改変培地(DMEM)、イーグルのMEM培地(MEM)、その他の細胞用培養液、または、その他の生理的溶液に、不凍ポリアミノ酸及びグリセリンが添加されるとともにpHが7.0～8.0の範囲内になるように調整され、さらに、ウシ精液に由来する液体が5～20w/w％となるように添加された水溶液である、請求項１記載のウシ精子の凍結保存液。
  3. 　下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50～99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）と、グリセリンとを添加した生理的溶液により、ウシの精液を5～20倍に希釈することで、0.3～0.9w/w％の両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）と、2～4w/w％のグリセリンと、ウシの精液に由来する部分とを含有する凍結保存液中にウシ精子を懸濁させるようにする希釈工程と、
    　ウシ精子を懸濁させた凍結保存液を、管状の容器中にて凍結に供する工程と、
    　この後、-60℃以下の温度に保持することで保存を行う工程とを含む、ウシ精子の凍結保存方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
  4. 　前記希釈工程は、
    　ウシの精液を、生理的溶液により2.5～10倍に希釈し、2～8℃で保持する１次希釈工程と、
    　2～8℃で保持しつつ、１次希釈工程により得られた懸濁液に、両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）とグリセリンとを添加した生理的溶液を点滴により添加することで、さらに希釈することにより、ウシの精液が5～20倍に希釈されるようにする２次希釈工程とを含む、請求項３記載のウシ精子の凍結保存方法。
  5. 　径が5mm以下である凍結保存用ストローを用い、－140℃以下にまで冷却することを特徴とする請求項３または４に記載のウシ精子の凍結保存方法。
  6. 　凍結融解6時間後にて、運動精子率を30%以上とし、高速直進運動率を10%以上とすることができる請求項３～５のいずれかに記載のウシ精子の凍結保存方法。
  7. 　ウシ胚を懸濁させて凍結するためのウシ胚の凍結保存液であって、
    　下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50～99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）5～10w/w％と、エチレングリコール4～6w/w％と、プロパンダイオール4～8w/w％と、ウシ胎子血清15～25w/w％とを含む、ウシ胚の凍結保存液。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
  8. 　請求項７の凍結保存液により、冷却速度100℃／分以下の緩慢凍結法で冷却及び凍結を行う、ウシ胚の凍結保存方法。
  9. 　ウシ体細胞を懸濁させて凍結するためのウシ体細胞の凍結保存液であって、
    　下記式(I)で示される構成単位及び下記式(II)で示される構成単位を含み、且つ下記式(II)で示される構成単位の割合が50～99モル％である両性高分子電解質（不凍ポリアミノ酸）5～25w/w％と、ウシ胎子血清70～80w/w％と4～6w/w％のジメチルスルホキシドとを含む、ウシ体細胞の凍結保存液。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
     
     
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