CN109688812A

CN109688812A - 牛生殖细胞的冷冻保存用组合物和冷冻保存方法

Info

Publication number: CN109688812A
Application number: CN201780051137.1A
Authority: CN
Inventors: 窪田力; 安藤贵朗; 玄丞烋; 玄优基; 今村修二; 月精悟
Original assignee: Bioverde Inc
Current assignee: BMG Inc
Priority date: 2016-08-22
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2037-08-22
Also published as: BR112019003560B1; JP2018048115A; US20190174742A1; AU2017317452A1; AU2017317452B2; JP7038369B2; US20220386592A1; KR20190042638A; WO2018038115A1; KR102328832B1; US11659833B2; CN114868737A; KR102316820B1; CN114868737B; KR20210127774A; EP3501278A1; EP3501278A4; CN109688812B; EP3501278B1; BR112019003560A2

Abstract

本发明提供了一种牛精子等的牛生殖细胞的冷冻保存液以及冷冻保存方法。使用在生理溶液中溶解了0.3～0.9w/w％的对数均分子量为1000～20000的ε‑聚赖氨酸的氨基的50～99％(摩尔)与琥珀酸酐发生反应而引入适当量的羧基的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和2～4w/w％的甘油的冷冻保存液。在冷冻保存方法的优选实施方式中，包括：用生理溶液将牛的精液稀释至2.5～10倍，并在2～8℃保持的第一稀释工序；以及保持在2～8℃的同时，通过点滴将添加有两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和甘油的生理溶液添加到通过第一稀释工序获得的悬浮液中，进一步稀释将牛的精液稀释至5～20倍的第二稀释工序。

Description

牛生殖细胞的冷冻保存用组合物和冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及一种例如对于牛生殖细胞的冷冻保存有用的冷冻保存用组合物以及冷冻保存方法。

背景技术

为了长期保存动物的细胞或者组织，日常使用在0℃以下温度的冷冻保存方法。然而，当动物的细胞或者组织包含水而进行冷冻时，由于在冷冻中水分子一边排除溶质和混入物的介质一边结晶化，形成仅由水分子形成的冰晶，因此在含水物中溶质和混入物的介质不均匀地扩散，而发生冷冻浓缩。

为了防止这种冷冻浓缩，进行了添加各种低分子化合物的方法。例如，在进行细胞的冷冻保存时，为了将冷冻保存中引起的因细胞内的结晶化对细胞造成的损害抑制到最低限度，进行了添加低分子的二甲基亚砜或甘油等作为冷冻保护剂的方法。

特别是，为了提高牛的子畜生产力，开发一种对牛生殖细胞有用的冷冻保存方法变得重要。

例如，作为用于冷冻牛精子的冷冻保护剂，已知有甘油。另外，作为用于冷冻牛卵子以及胚胎的冷冻保护剂，已知有甘油、乙二醇、丙二醇。进一步地，作为用于冷冻牛体细胞的冷冻保护剂，已知有二甲基亚砜。

然而，这些以往的冷冻保护剂无论哪一种都存在细胞毒性强这样的问题。

同时，PCT/JP2009/002941(日本专利特许第5726525号)公开了一种包含在侧链具有氨基和羧基的两性高分子电解质的冷冻保存液。然而，尚不知该冷冻保存液能够用于生殖细胞或体细胞等牛细胞的冷冻保存。

如上所述，为了提高牛的子畜生产力，开发一种对牛生殖细胞有用的新型冷冻保存剂以及冷冻保存方法变得重要。然而，以往的用于冷冻牛细胞的冷冻保护剂无论哪一种都存在细胞毒性强这样的问题。

发明内容

因此，鉴于这些情况，本发明的目的在于提供一种对包含牛生殖细胞的牛细胞的冷冻有用的冷冻保存用组合物以及冷冻保存方法。

为了解决上述问题而进行广泛研究的结果，发现通过将ε-聚赖氨酸(PLL)的氨基与琥珀酸酐反应而引入适当量羧基的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)单独使用或者与以往的冷冻保护剂合用，对牛生殖细胞或体细胞的冷冻保存有用，从而完成了本发明。

即，本发明包括以下。

一种牛精子等牛生殖细胞的冷冻保存用组合物以及使用该组合物的冷冻保存方法，其包含两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和甘油，所述两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)包含由下式(I)所示的结构单元以及由下式(II)所示的结构单元，并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％。

＜化学式I＞

＜化学式II＞

发明效果

根据本发明，能够提供一种对牛生殖细胞有用的冷冻保存用组合物，并且能够提高牛的子畜生产力。另外，根据本发明，能够提供一种对牛体细胞具有低毒性的冷冻保存用组合物。

附图说明

图1为表示将冷冻胚胎封入专用吸管的封入方式的图。

图2为表示经冷冻保存的牛体细胞(源自牛皮肤的纤维芽细胞)在冷冻融解后进行接种的贴壁细胞数量(去除冷冻保护剂后接种)的曲线图。

图3为表示经冷冻保存的牛体细胞(牛卵丘细胞)在冷冻融解后进行接种的贴壁细胞数量(除去冷冻保护剂后接种)的曲线图。

具体实施方式

本发明所涉及的牛细胞的冷冻保存用组合物为包含对于数均分子量为1000～20000的ε-聚赖氨酸的氨基的50～99mol％使琥珀酸酐反应并羧基化而封端的组合物(以下，称为“防冻聚氨基酸”)。

具体地，本发明中的防冻聚氨基酸为两性高分子电解质，该两性高分子电解质包含由下式(I)所示的结构单元以及由下式(II)所示的结构单元，或者由下式(I)所示的结构单元以及由下式(II)所示的结构单元，并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％。

＜化学式I＞

＜化学式II＞

根据本发明所涉及的牛细胞的冷冻保存用组合物，能够显著提高冷冻融解后的牛生殖细胞或者体细胞的生存率以及增殖。另外，根据本发明所涉及的牛细胞的冷冻保存用组成物，能够显著提高利用人工授精或胚胎移植的受胎率，而不损害冷冻融解后的牛精子或者胚胎的发育能力。

在本发明中，作为ε-聚赖氨酸，可以例举由微生物或者酶生产的数均分子量为1000～20000，特别是1000～10000的ε-聚赖氨酸。ε-聚赖氨酸为由属于链霉菌属(Streptomyces)的放线菌生产的专用食品添加剂，除了聚合度15～35的之外，还尝试生产了聚合度为20以下的ε-聚赖氨酸(例如，日本专利特开2003-171463号公报以及特开2005-318815号公报)。数均分子量或者数均聚合度的测量能够通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)法，例如使用由Atto Corporation制造的电泳装置以及密度计(AE-6920V型)而容易测量。此时，使用标准蛋白质标记物。并且，ε-聚赖氨酸可以通过加热处理的高分子量化而以分子量30000以上使用。然而，从防止粘度增加等观点来看，优选上述的分子量范围。

通过下述所示的反应，ε-聚赖氨酸的氨基被琥珀酸酐部分羧基化而封端。

＜化学式III＞

此时，对于ε-聚赖氨酸的氨基，优选50～99mol％、特别优选50～93mol％、更优选50～90mol％、进一步优选55～80mol％、最优选58～76mol％被羧基化而封端。

相对于ε-聚赖氨酸的氨基，使52～53mol％的琥珀酸酐反应，能够将约50mol％的氨基封端。另外，当使100mol％的琥珀酸酐反应时，在常规的反应条件下，能够将90～95mol％的氨基封端。无论是封端率超过上述的范围还是低于上述的范围，冷冻保存效果都变小。

本发明所涉及的牛细胞的冷冻保存用组合物为将防冻聚氨基酸溶解在生理水溶液中而获得的组合物。作为生理水溶液，除了生理盐水之外，还可以使用各种细胞或者组织用的通用培养液。例如，可以例举Dulbcco改良Eagle MEM培养基(DMEM)作为优选实例。

在本发明的第一实施方式中，本发明所涉及的牛细胞的冷冻保存用组合物为包含上述防冻聚氨基酸和甘油的牛精子的冷冻保存用组合物。本发明所涉及的牛精子的冷冻保存用组合物包含：例如浓度为0.25～1.0w/w％、优选为0.3～0.9w/w％或者0.3～0.8w/w％的防冻聚氨基酸以及浓度为1.5～4.5w/w％或者1.5～4.4w/w％、优选为2.0～4.0w/w％的甘油。该甘油含量为使以往用于牛精子的冷冻保存量显著减少或减半的量，本发明所涉及的牛精子的冷冻保存用组合物为具有低细胞毒性的冷冻保护剂。

根据第一实施方式的优选的冷冻保存方法，包括：通过添加了防冻聚氨基酸以及甘油的生理溶液，将牛的精液稀释至5～20倍，使牛精子悬浮在包含0.3～0.9w/w％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)、2～4w/w％的甘油、以及源自于牛的精液的一部分的冷冻保存液中的稀释工序；使牛精子悬浮的冷冻保存液冷冻在管状的容器中的工序；以及之后保持在-60℃以下的温度进行保存的工序。

优选地，所述稀释工序包括：用生理溶液将牛的精液稀释至2.5～10倍，并保持在2～8℃的第一稀释工序；以及保持在2～8℃的同时，通过点滴将添加了两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和甘油的生理溶液添加到通过第一稀释工序而获得的悬浮液中，进一步稀释将牛的精液稀释至5～20倍的第二稀释工序。

另外，优选地，使用直径为5mm以下的冷冻保存用吸管，通过程序冷冻仪等采用冷却速率为100℃/分钟以下的缓慢冷冻法，或者通过液氮浸渍的冷却速率为300℃/分钟以上的玻璃化冷冻法，冷却至-140℃以下。另外，优选地，在冷冻融解6小时后，运动精子率可达30％以上，快速前向运动率可达10％以上。

作为生理溶液，可以适当地使用等渗性的Tris-柠檬酸缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)、柠檬酸、葡萄糖、氯化钠等的水溶液(包含生理盐水)、或者向该水溶液适当添加了蛋黄、氨基酸等的溶液、M199、CR1aa、Dulbcco改良培养基(DMEM)、Eagle的MEM培养基(MEM)等中的至少一种。培养基可以包括例如1000mg/L～4500mg/L的葡萄糖或者其他单糖类、二糖类等。

作为牛精子的保存优选的生理溶液的例子，可以例举如下述调制的基于Tris-柠檬酸缓冲液的生理溶液。即，在一个具体例中，加入17.031g的Trip(三羟甲基氨基甲烷)(和光纯药工业)、9.519g的柠檬酸一水合物(和光纯药工业)、3.000克的葡萄糖(和光纯药工业)以及4.625g的氯化钠(和光纯药工业)，进一步加入3mL的100万IU/4.6mlSPUF的青霉素G钾(万有制药)、3ml的1000mg滴定度/4.3mlSPUF的链霉素(明治制果)，并用蒸馏水定容至1000ml，可以使用包含140.6mM的Tris(三羟甲基氨基甲烷)、45.3mM的柠檬酸、16.7mM的葡萄糖、79.1mM的氯化钠的水溶液。

作为牛精子的保存的优选生理溶液的另一个例子，可以例举添加了蛋黄的Tris-柠檬酸缓冲液(蛋黄Tris糖液(ET))。此为由社团法人家畜改良事业团以商品名“Sort 90”市售的精液第一稀释液。

在本发明的第二实施方式中，本发明所涉及的牛细胞的冷冻保存用组合物为包含如上所述的防冻聚氨基酸、乙二醇、丙二醇和胎牛血清的牛胚胎的冷冻保存用组合物。作为待冷冻保存的牛胚胎，可以例举例如通过体外受精(IVF)6～9天(优选7至8天)产生的牛胚胎等。

本发明所涉及的牛胚胎的冷冻保存用组合物包含：例如浓度为5～10w/w％(优选为7w/w％)的防冻聚氨基酸；浓度为4～6w/w％，例如浓度为5w/w％的乙二醇；浓度为4～8w/w％，例如浓度为6w/w％的丙二醇(1,3-丙二醇；1,2-丙二醇)；以及浓度为15～25w/w％，优选浓度为20w/w％的胎牛血清。

在本发明的第三实施方式中，本发明所涉及的牛体细胞的冷冻保存用组合物为包含如上所述的防冻聚氨基酸和胎牛血清的牛体细胞的冷冻保存用组合物。作为待冷冻保存的牛体细胞，可以例举例如纤维芽细胞、卵丘细胞、间充质细胞、源自于骨髓的间充质干细胞、源自于脂肪的干细胞等。

本发明所涉及的牛细胞的冷冻保存用组合物例如包含：浓度为5～30w/w％(优选为5～25w/w％)防冻聚氨基酸以及浓度为65～85w/w％(优选为70～80w/w％)的胎牛血清。

进一步地，本发明所涉及的牛体细胞的冷冻保存用组合物也可包含二甲基亚砜。本发明所涉及的牛体细胞的冷冻保存用组合物例如可以包含浓度为0.1～10w/w％(优选为4～6w/w％、5w/w％)的二甲基亚砜。

通过将各种牛细胞悬浮在如上所述的本发明所涉及的牛细胞的冷冻保存用组合物中，并在例如-20～-100℃、优选为-60～-90℃或者-70～-90℃、特别优选为-80℃前后)的冷冻机中冷冻，由此可以冷冻并保存各种牛细胞。对于牛精子，例如将1500万个～3000万个(优选为2000万个～3000万个)的牛精子悬浮在0.25～0.5mL的冷冻保存用组合物中供冷冻。对于牛胚胎，例如将1～50个(优选为1～2个)牛胚胎悬浮在0.01～0.25mL(优选为0.02～0.05mL)的冷冻保存组合物中供冷冻。对于牛体细胞，例如，将50万～200万个(优选为50万～100万)牛体细胞悬浮在0.2～2mL(优选为1mL)的冷冻保存用组合物中供冷冻。

当使用冷冻的牛细胞时，可以基于各种牛细胞的一般融解方法，将冷冻的牛细胞融解并使用。另外，与二甲基亚砜等不同，防冻聚氨基酸的细胞毒性低，不需要在融解时除去。

另外，可以提供本发明所涉及的牛细胞的冷冻保存用组合物作为牛细胞的冷冻保存用试剂盒。除了冷冻保存组合物之外，该该试剂盒还可以包含例如用于冷冻保存的容器、试剂盒的使用说明书等。

实施例

以下，使用实施例更详细地说明本发明，但是本发明的技术范围并不限于这些实施例。

【实施例1】使用防冻聚氨基酸的牛精子的冷冻保存

1-1.冷冻保存液的调制

将以mol％计的65％的琥珀酸酐(和光纯药工业制))添加到25％的ε-聚赖氨酸水溶液(Chisso公司制，分子量为4000)中，以制备出ε-聚赖氨酸分子中的氨基的60mol％被羧基化而封端的防冻聚氨基酸。

其次，将制备的防冻聚氨基酸(CPLL)的溶液(约33w/w％的水溶液)以及甘油(Gly)添加到Dulbcco改良培养基(DMEM，Gibco(注册商标)11330-032，葡萄糖量：3151mg/L)中至规定的比例(甘油V/V％，CPLLw/w％)。此时，用1N的盐酸或者氢氧化钠水溶液中和使pH为7.0～8.0的范围。

1-2.牛精子的冷冻保存方法

检查从种公牛采取的精液的精子的数量、运动性等后，用第一稀释液(“1-1.”中使用的Dulbcco改良培养基)稀释至5倍程度，然后在低温室(4℃)静置并缓慢冷却。当精液的温度降温至4℃时，通过点滴用第一稀释液稀释至最终稀释量的一半。其后，保持在约4℃的温度同时，通过点滴将加入耐冻剂的第二稀释液(“1-1.”中获得的“冷冻保存溶液”)稀释至最终稀释量，分注、注入到冷冻保存用吸管(富士平工业株式会社制品“0.5ml细133型”、直径4mm×133mm)中。其后，暂时静置，通过使用程序冷冻仪的冷却速率100℃/分钟以下的缓慢冷冻法冷却、冷冻至-150℃前后，之后保存在液氮中(第二稀释液中的耐冻剂的添加量甘油：13v/v％：以往型；甘油6.5v/v％+CPLL1.0w/v％：新型)。

对于冷冻保存的精子悬浮液的融解，通过从液氮中取出冷冻保存用吸管之后，在30～38℃的热水中浸渍15秒来进行。

1-3.牛精子的冷冻保存的结果与考察

冷冻保存的牛精子在冷冻融解后的生存性结果示于以下的表1。

(表1)

表1、冷冻融解后的精子生存性

如表1所示，很明显CPLL可以用于牛精子的冷冻保存。此外，通过添加CPLL，可以使以往使用的Gly减少(减半)。这意味着具有细胞毒性低的新组成的冷冻液。

通过人工授精冷冻保存的牛精子的受胎成绩示于以下的表2。

(表2)

表2、冷冻牛精子的人工授精成绩

(P＝0.23)

如表2所示，通过人工授精使用了CPLL的冷冻牛精子获得了有效的受胎率。这意味着冷冻融解后的发育能力未受到损害。

1-4.评价冷冻融解6小时后的精子的生存性(运动性)

目的：

未看到刚刚冷冻融解之后的精子生存性差异(表1)，但由于发现通过人工授精的受胎率差异(表2)，因此探索了其主要因素。

方法：

将通过以往方法(6.5％甘油)或者新方法(3.25％甘油+0.5％CPLL)冷冻、融解的各个精子保温保持6小时之后，研究精子的运动性。为了评价牛精子的运动性，使用精子运动解析装置(CASA；SMAS3，Detect制)以及测量用室(MicroCell，Vitrolife制)，在37℃下测量精子运动参数(运动速率Mot、前向运动率Prog、直线速度VSL、曲线速度VCL、平均速度VAP、头部振幅AHL、头部振动数BCF)。VAP>10μm/秒作为运动精子，VAP>50μm/秒并且STR>0.75作为前向运动精子。

结果：

将结果示于以下的表3。

(表3)

(不同符号间显著差异：A/B P＜0.05，a/b P＜0.01)

※Mot：运动精子率，Prog：快速前向运动率，VAP：精子进行方向性速度的平均值

VSL：精子直线地点移动速度的平均值，VCL：精子曲线地点移动速度的平均值，

AHL：精子头部的平均振幅值，BCL：精子头部1秒间的振动数

如表3所示，对于冷冻融结6小时后的精子的生存性(运动性)，新方法明显优于以往方法。

考察：

虽然刚刚冷冻融结之后的精子的生存性(运动性)没有差异，但发现融解并经过一定时间的精子的生存性差异。

由于通过人工授精注入子宫颈管或者子宫体部的精子到达作为受精的场所的卵管扩大部约4小时，因此暗示融解后经过一定时间的精子的生存性的差异可能会影响受胎率。

1-5.评价冷冻融解后精子头部的细胞膜

目的：

虽未看到刚刚冷冻融解之后的精子生存性差异(表1)，但是由于发现融化6小时后的精子生存性差异(表3)，因此探索了其主要因素。

方法：

将通过以往方法(6.5％甘油)或新方法(3.25％甘油+0.5％CPLL)冷冻、融解的各个精子用SYBR14和碘化丙啶(PI)进行染色，研究精子头部细胞膜的损害。

并且，当细胞膜没有损害时，被SYBR14染成绿色，当受到损害时，被碘化丙锭染成红色。

结果：

将结果示于以下的表4。

(表4)

(不同符号间显著差异：P＜0.01)

如表4所示，对于冷冻融解后的精子头部细胞膜没有损害的比例，新方法明显多于以往方法。

考察：

推测观察有冷冻融解6小时后的精子的生存性差异的主要因素之一为由于冷冻融解而对精子细胞膜的损害。

【实施例2】使用防冻聚氨基酸的牛胚胎的冷冻保存

2-1.冷冻保存液的制备

将以mol％计的65％的琥珀酸酐(和光纯药工业制)添加到25％的ε-聚赖氨酸水溶液(Chisso公司制，分子量为4000)中，以制备出ε-聚赖氨酸分子中的氨基的60mol％被羧基化而封端的防冻聚氨基酸。

其次，将制备的防冻聚氨基酸(CPLL)的溶液、乙二醇(EG)、丙二醇(PD)和胎牛血清(FCS或CS)添加到磷酸缓冲生理盐水(PBS，Gibco制)中至规定的比例(w/w％)。此时，用1N的盐酸或氢氧化钠水溶液中和使pH为7.0～7.5的范围。

2-2.牛胚胎的冷冻保存方法

将从桑椹胚生长至胚泡期胚胎的牛胚胎用加入20％胎牛血清的PBS清洗之后，浸渍加有CPLL的冷冻保存液中，立即和冷冻液一起封入到0.25ml的冷冻保存用吸管IMV制)中(图1)。封入后，在平衡处理10分钟～20分钟后，通过程序冷冻仪采用冷却速度100℃/分钟以下的缓慢冷冻法冷却至-30℃之后，浸入液氮中进行冷冻。冷冻后，保存在液氮中直至使用。

冷冻保存的冷冻胚胎的融解，通过从液氮中取出冷冻保存用吸管，在空气中保持5秒之后，在30～38℃的热水中浸渍15秒来进行。

2-3.牛胚胎的冷冻保存的结果以及考察

将冷冻保存的牛胚胎的冷冻融解后的生存性的结果示于以下的表5中。

(表5)

表5、牛胚胎冷冻、融解后的生存性

*牛胚胎：根据IVF在第7～8天产生的Mr～EBL

(不同符号间显著差异：P＜0.05)

如表5所示，很明显CPLL可以用于牛胚胎的冷冻保存(缓慢冷冻法)。此外，通过将CPLL添加到以往的冷冻保护剂(浓度)中，可以确保与以往冷冻保护剂相同的生存性。这意味着新组成的冷冻液。

冷冻保存的牛胚胎的胚胎移植成绩示于以下的表6中。

(表6)

表6、冷冻牛胚胎的胚胎移植成绩

(P＝0.06)

如表6所示，通过使用CPLL的冷冻牛胚胎的胚胎移植获得有效的受胎率。这意味着冷冻融解后的发育能力未受到损害。

冷冻保存的牛胚胎在冷冻溶解后，暴露于冷冻液中时的胚胎的生存性的结果示于以下的表7中。

(表7)

表7、牛胚胎冷冻融解后在冷冻液暴露时胚胎的生存性

【实施例3】使用防冻聚氨基酸的牛体细胞的冷冻保存

3-1.冷冻保存液的调制

将以mol％计的65％的琥珀酸酐(和光纯药工业制)的)添加到25％的ε-聚赖氨酸水溶液(Chisso公司制，分子量为4000)中，以制备出ε-聚赖氨酸分子中的氨基的60mol％被羧基化而封端的防冻聚氨基酸。

其次，将制备的防冻聚氨基酸溶液(CPLL)、二甲基亚砜(DMSO)以及胎牛血清(CS)添加到Dulbcco改良培养基(DMEM，Sigma-Aldrich制)中至规定的比例(w/w％)。此时，用1N的盐酸或者氢氧化钠水溶液中和使pH为7.0～7.5的范围。

3-2.牛体细胞的冷冻保存方法

通过PBS清洗，用胰蛋白酶的酶处理等的常规方法回收在组织培养瓶(培养皿)培养至融合的牛体细胞。将回收的牛体细胞浸渍冷冻保存用吸管(1.0ml用，Falcon制)中的冷冻保存液中，立即置于-80℃低温冰箱内，冷冻并保存(在长期保存的情况下，在液氮中保管)。

对于冷冻保存的牛体细胞的融解，从保管场所取出之后，立即浸渍30～38℃的温水中直至米粒大的冰晶残留在管内，在通过常规方法通过离心操作将冷冻保存液除去之后，接种在细胞培养用设备中。此外，用本发明的冷冻保存液冷冻，不需要在融解后除去冷冻保存液(可以在不除去的情况下接种)。

3-3.牛体细胞的冷冻保存的结果以及考察

冷冻保存的牛体细胞(源自于牛皮肤的纤维芽细胞)在刚刚冷冻融解之后的生存性的结果示于以下的表8中。此外，冷冻保存的牛体细胞(源自于牛皮肤的纤维芽细胞)在冷冻融解之后的细胞增殖性的结果示于以下的表9中。进一步地，冷冻保存的牛体细胞(源自于牛皮肤的纤维芽细胞)在冷冻融解之后接种的贴壁细胞数(除去冷冻保护剂后接种)示于图2。

(表8)

表8、冷冻融解之后的体细胞的生存性(源自于牛皮肤的纤维芽细胞)

(不同符号间显著差异：P＜0.05)

(表9)

表9、冷冻融解之后的细胞增殖性(源自于牛皮肤的纤维芽细胞)

离心除去(+)：融解后进行离心除去耐冻剂进行培养(在进行细胞数计数前不交换培养基)

冷冻保存的牛体细胞(牛卵丘细胞)在刚刚冷冻融解之后的生存性的结果示于以下的表10中。此外，冷冻保存的牛体细胞(牛卵丘细胞)在冷冻融解之后的细胞增殖性的结果示于以下的表11中。进一步地，冷冻保存的牛体细胞(牛卵丘细胞)在冷冻融解之后接种的贴壁细胞数(除去冷冻保护剂后接种)示于图3。

(表10)

表10、冷冻融解之后的细胞的存活率(牛卵丘细胞)

(表11)

表11、冷冻融解之后的细胞增殖性(牛卵丘细胞)

如表8～11以及图2～3所示，很明显CPLL可以用于牛体细胞的冷冻保存。

如表8和9以及图2所示，在源自于牛皮肤的纤维芽细胞中，CPLL替代DMSO作为冷冻保护剂，可以仅将CPLL作为冷冻保护剂进行冷冻保存。此外，与DMSO相比，使用CPLL的冷冻融解后的增殖能力高。进一步地，在冷冻融解时不需要除去CPLL，并且可以在不除去的情况下接种细胞。

另一方面，如表10和11以及图3所示，在卵丘细胞中，CPLL替代DMSO作为冷冻保护剂，可以仅将CPLL作为冷冻保护剂进行冷冻保存。此外，基于冷冻融解后的增殖能力可知，纤维芽细胞(CPLL 5％)和卵丘细胞(CPLL25％)的最佳CPLL浓度不同。

Claims

1.一种牛精子的冷冻保存液，为用于使牛精子悬浮并冷冻的牛精子的冷冻保存液，其特征在于，包含：

0.3～0.9w/w％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)，包含由下式(I)所示的结构单元以及由下式(II)所示的结构单元，并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％；以及

2～4w/w％的甘油，

2.根据权利要求1所述的牛精子的冷冻保存液，其特征在于，

所述冷冻保存液为将防冻聚氨基酸和甘油添加到Dulbecco改良培养基(DMEM)、Eagle的MEM培养基(MEM)、其他的细胞用培养液或者其他的生理溶液中，同时调整pH范围为7.0～8.0，进而添加源自牛精液的液体以使所述源自牛精液的液体为5～20w/w％的水溶液。

3.一种牛精子的冷冻保存方法，其特征在于，包括：

通过添加了包含由下式(I)所示的结构单元和由下式(II)所示的结构单元并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和甘油的生理溶液，将牛的精液稀释至5～20倍，使牛精子悬浮在包含0.3～0.9w/w％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)、2～4w/w％的甘油以及源自于牛的精液的一部分的冷冻保存液中的稀释工序；

使牛精子悬浮的冷冻保存液冷冻在管状的容器中的工序；以及

之后保持在-60℃以下的温度进行保存的工序，

4.根据权利要求3所述的牛精子的冷冻保存方法，其特征在于，

所述稀释工序包括：

用生理溶液将牛的精液稀释至2.5～10倍，并保持在2～8℃的第一稀释工序；以及

保持在2～8℃的同时，通过点滴将添加了两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)和甘油的生理溶液添加到通过第一稀释工序而获得的悬浮液中，进一步稀释将牛的精液稀释至5～20倍的第二稀释工序。

5.根据权利要求3或4所述的牛精子的冷冻保存方法，其特征在于，使用直径为5mm以下的冷冻保存用吸管，冷却至-140℃以下。

6.根据权利要求3～5中任一项所述的牛精子的冷冻保存方法，其特征在于，在冷冻融解6小时后，运动精子率能够为30％以上，快速前向运动率为10％以上。

7.一种牛胚胎的冷冻保存液，为用于使牛胚胎悬浮并冷冻的牛胚胎的冷冻保存液，其特征在于，包含：

5～10w/w％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)，包含由下式(I)所示的结构单元以及由下式(II)所示的结构单元，并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％；

4～6w/w％的乙二醇；

4～8w/w％的丙二醇；以及

15～25w/w％的胎牛血清，

8.一种牛胚胎的冷冻保存方法，其特征在于，

采用冷却速率为100℃/分钟以下的缓慢冷冻法通过权利要求7的冷冻保存液进行冷却和冷冻。

9.一种牛体细胞的冷冻保存液，为用于使牛体细胞悬浮并冷冻的牛体细胞的冷冻保存液，其特征在于，包含：

5～25w/w％的两性高分子电解质(防冻聚氨基酸)，包含由下式(I)所示的结构单元以及由下式(II)所示的结构单元，并且由下式(II)所示的结构单元的比例为50～99mol％；

70～80w/w％的胎牛血清；以及

4～6w/w％的二甲基亚砜，