WO2012074060A1 - 人工授精用ストロー - Google Patents

人工授精用ストロー Download PDF

Info

Publication number
WO2012074060A1
WO2012074060A1 PCT/JP2011/077813 JP2011077813W WO2012074060A1 WO 2012074060 A1 WO2012074060 A1 WO 2012074060A1 JP 2011077813 W JP2011077813 W JP 2011077813W WO 2012074060 A1 WO2012074060 A1 WO 2012074060A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
layer
straw
semen
dilution
artificial insemination
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/077813
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
京子 内山
芳明 湊
Original Assignee
社団法人家畜改良事業団
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 社団法人家畜改良事業団 filed Critical 社団法人家畜改良事業団
Priority to EP11845911.4A priority Critical patent/EP2647284A4/en
Priority to CA2820677A priority patent/CA2820677C/en
Priority to US13/990,987 priority patent/US9339360B2/en
Priority to JP2012546938A priority patent/JP5738314B2/ja
Publication of WO2012074060A1 publication Critical patent/WO2012074060A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A61D19/02—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for artificial insemination
    • A61D19/022—Containers for animal semen, e.g. pouches or vials ; Methods or apparatus for treating or handling animal semen containers, e.g. filling or closing
    • A61D19/024—Tube-like containers, e.g. straws

Definitions

  • the present invention relates to an artificial insemination straw including a dilution layer, an isolation layer, and a semen storage layer used in artificial insemination.
  • the penetration rate of artificial insemination is almost 100% in Japan.
  • the conception rate of cattle has been decreasing year by year.
  • the initial conception rate was 62.4%, and in 1 to 3 times, the conception rate was 62%.
  • the initial conception rate was 46. 1%, decreased to 44.6% at 1 to 3 conception rates.
  • Various factors can be considered to decrease the conception rate, and stress due to high milk production of dairy cows can be considered.
  • Frozen semen dispensed into straw semen tubes is generally used for artificial insemination of livestock.
  • a straw semen tube for cryopreservation is prepared by diluting semen into a primary dilution for cryopreservation, and then diluting with a secondary dilution obtained by adding a cryoprotectant to the primary dilution and filling the straw. It is obtained and stored frozen in liquid nitrogen (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 1 Conventionally, a single-layer type straw including only a single semen storage layer has been used, but recently, a semen filling apparatus capable of filling two layers has been developed (Patent Document 1).
  • This semen filling device that can fill two layers has the same cryopreservation solution as the cryopreservation solution of the semen preservation layer on the cotton plug side to prevent the loss of semen due to the semen preservation layer coming into contact with the cotton plug. It was something to do.
  • the components of semen dilutions used for freezing semen have been improved for the purpose of improving sperm survival rate and fertilization activity after freezing and thawing.
  • egg yolk preservatives mainly composed of egg yolk As dilution liquids, egg yolk preservatives mainly composed of egg yolk, sugar and buffer and milk preservatives mainly composed of milk are generally known, and egg yolk preservatives are widely used worldwide. It has been. Egg yolk has effects such as low-temperature shock mitigation, cell membrane protection, and maintenance of sperm survival, and these effects are thought to be due to lipoproteins and phospholipids in egg yolk.
  • various cryopreservatives (Patent Document 2) and sperm activators (Patent Document 3) for increasing the fertilization rate have been studied in order to prevent sperm frost damage. In the process of freezing and thawing, since salts adversely affect sperm, salts are generally not added to a diluting solution for freezing.
  • the problem to be solved by the present invention is to improve the conception rate by improving the conventional artificial insemination straw.
  • the present inventors introduced an isolation layer into the artificial insemination straw.
  • the layers are separated, and artificial insemination is performed so that one side contains a semen preservation layer consisting of an aqueous solution containing semen and antifreeze, and the other side contains a dilution layer consisting of an aqueous solution containing at least one of a buffer, sugar or salt
  • a semen preservation layer consisting of an aqueous solution containing semen and antifreeze
  • a dilution layer consisting of an aqueous solution containing at least one of a buffer, sugar or salt
  • the present invention encompasses the following inventions: [1] A semen comprising a straw and a dilute layer comprising an aqueous solution containing at least one of a buffer, a sugar or a salt, disposed in the cavity of the straw; an isolation layer; and an aqueous solution containing semen and antifreeze An artificial insemination straw comprising a storage layer, wherein a dilution layer and a semen storage layer are separated by a separation layer. [2] The artificial insemination straw according to [1], wherein the dilution layer: the semen storage layer is 3: 2 to 1: 4.
  • An artificial insemination straw comprising a dilution layer comprising an aqueous solution containing at least one of a buffer, a sugar or a salt separated by an isolation layer in the straw cavity and a semen storage layer comprising an aqueous solution containing semen and antifreeze
  • a dilution layer comprising an aqueous solution containing at least one of a buffer, a sugar or a salt separated by an isolation layer in the straw cavity
  • a semen storage layer comprising an aqueous solution containing semen and antifreeze
  • FIG. 1 is a schematic view of an artificial insemination straw including a dilution layer + isolation layer + semen storage layer in a straw cavity containing a cotton plug.
  • FIG. 2 shows an artificial insemination straw including a dilution layer, an isolation layer and a semen storage layer in a straw cavity, and the artificial insemination straw obtained by changing the dilution layer to various aqueous solutions is frozen and thawed.
  • It is a graph which shows the rate of the sperm which has survived and has a normal acrosome. As a dilution layer, it is shown that the percentage of sperm that survives most and has normal acrosomes is high when TCGN is used.
  • FIG. 1 is a schematic view of an artificial insemination straw including a dilution layer + isolation layer + semen storage layer in a straw cavity containing a cotton plug.
  • FIG. 2 shows an artificial insemination straw including a dilution layer, an isolation
  • FIG. 3 is a graph showing sperm motility after the artificial insemination straw was frozen and thawed by changing the ratio between the TCGN dilution layer and the semen storage layer in the straw cavity.
  • the length of the TCGN diluted layer + the length of the semen storage layer 80 mm, the length of the semen storage layer was changed to 4 to 72 mm, and the sperm motility after thawing was examined.
  • the TCGN dilution layer: semen preservation layer 2: 3 to 4: 1 shows excellent sperm motility, and particularly 1: 1 indicates that the motility is most excellent.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of a conception test in heifers.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of the conception test in parous cows.
  • FIG. 6 is a graph showing experimental results separately showing the results of the conception test for heifers and the results of the conception test for each calf.
  • FIG. 7 is a graph showing the normal rate of acrosomes in semen in an artificial insemination straw thawed after cryopreservation.
  • FIG. 8 shows a straw for artificial insemination including a glycerin-added egg yolk tris sugar (ETG) layer + isolation layer + semen storage layer, TCGN dilution layer + isolation layer + semen storage layer, or semen storage layer (single layer) in the straw cavity
  • ESG egg yolk tris sugar
  • EMG egg yolk tris sugar
  • the present invention relates to a straw and a diluted layer (1) which is disposed in the cavity of the straw, and comprises an aqueous solution containing at least one of a buffer, a sugar or a salt; (2) a separating layer; and (3)
  • the present invention relates to an artificial insemination straw comprising a semen storage layer comprising an aqueous solution containing semen and an antifreezing agent, wherein the dilution layer and the semen storage layer are separated by a separation layer.
  • the straw used for the artificial insemination straw of the present invention can be manufactured with any material, it is a disposable cylindrical tube, for example, a plastic cylindrical tube such as polyvinyl chloride (PVC).
  • PVC polyvinyl chloride
  • straws of any length and diameter are used, many of the commercially available straws are 133 mm long and have a diameter of 1.95 mm or 2.85 mm.
  • Liquid or gas that becomes a dilution layer, isolation layer, and semen storage layer is sequentially injected into a straw containing a cotton plug, and is sealed by thermocompression bonding using ultrasonic waves.
  • save layer can also be dispensed manually, it can be filled using the filling apparatus described in patent document 1, for example. After sealing, it is frozen with liquid nitrogen vapor over 7-10 minutes and immersed in liquid nitrogen for storage.
  • the capacity of the straw used for the artificial insemination straw of the present invention may be any capacity as long as it is used for artificial insemination, for example, 0.25 to 5 ml.
  • the capacity of the straw is changed depending on the animal species, and from the viewpoint of freezing the semen of cattle and dogs, a straw volume of 0.25 to 0.5 ml is preferable.
  • One end of the straw is sealed with a plug such as a cotton plug, and is placed in the order of the dilution layer, the isolation layer, and the semen storage layer, and the other end is sealed by thermocompression bonding or the like. .
  • the dilution layer or semen storage layer and the sealing part may be in contact with each other or may be separated by a gas layer.
  • the order of the dilution layer and the semen preservation layer may be interchanged.
  • a multilayer straw including a dilution layer, an isolation layer, and a semen storage layer is shown, but a multilayer straw including two or more dilution layers and a semen storage layer may be used.
  • the buffer is Tris (hydroxymethylaminomethane) and citric acid
  • the sugar is glucose
  • the salt is sodium chloride.
  • a diluted layer is referred to herein as a TCGN diluted layer.
  • the diluted layer does not contain glycerin.
  • the osmotic pressure of the aqueous solution of the diluted layer of the present invention may be any osmotic pressure as long as it can maintain the fertilization activity of sperm, but is usually 230 to 400 mOsm. This range is specified by Non-Patent Document 2 as a range in which the sperm motor activity can be maintained.
  • the osmotic pressure of the aqueous solution in the dilution layer is 260 to 350 mOsm, more preferably 280 to 330 mOsm. 295 to 320 mOsm is particularly preferable.
  • the osmotic pressure can be calculated from the solute concentration, the degree of dissociation, and the like, but is determined using an osmometer (osmometer) in consideration of the interaction of substances constituting the solution.
  • the glucose concentration and sodium chloride concentration in the aqueous solution of the dilution layer of the present invention are determined so that the osmotic pressure of the aqueous solution is in the above range.
  • the glucose concentration is 5 mM to 100 mM, preferably 10 mM to 50 mM.
  • the sodium chloride concentration is 50 to 200 mM, preferably 50 to 150 mM, more preferably 50 to 100 mM.
  • the pH of the aqueous solution of the dilution layer of the present invention may be any pH as long as it is in a pH range that is not toxic to sperm, for example, 6.0 to 8.0. Preferably, it is 6.4 to 7.5, and more preferably 6.8 to 7.2.
  • the concentrations of tris (hydroxymethylaminomethane) and citric acid in the aqueous solution of the diluted layer of the present invention are determined so that the final pH of the aqueous solution falls within the above pH range. More specifically, the concentration of tris (hydroxymethylaminomethane) of the present invention is 50 to 300 mM, preferably 75 to 200 mM.
  • the citric acid concentration is 20 to 100 mM, preferably 25 to 75 mM.
  • the dilution layer of the present invention is preferably made of an aqueous solution containing tris (hydroxymethylaminomethane), citric acid, glucose and sodium chloride, but tris (hydroxymethylaminomethane) can be used as long as the desired pH is achieved.
  • buffers instead of citric acid can be used.
  • any buffer that has a buffering action near neutrality can be selected.
  • Good buffer such as female, hepes, tes, and tricine, phosphate buffer, citrate buffer Acetate buffer, carbonate buffer, and the like.
  • glucose is a substance that serves as an energy source for sperm, but can be replaced with other sugars or energy sources that can be used by sperm.
  • xylose rhamulose, fructose, mannose, galactose, sucrose, lactose, maltose, trehalose, melibiose, raffinose, meletulose, stachyose, dextrin, N-acetyl-D-glucosamine, D-glucuronic acid and the like.
  • sodium chloride other salts such as potassium chloride, sodium glutamate, potassium glutamate, sodium gluconate, potassium gluconate, sodium citrate, potassium citrate, sodium acetate, potassium acetate, sodium carbonate, potassium carbonate, Sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate and the like may be used.
  • the aqueous solution of the diluted layer of the present invention may further contain an activator that activates sperm.
  • activators include catechin, caffeine, theophylline, pentoxyphyllin, procaine, imidazole, sodium pyruvate, hypotaurine, polyphenol, L-glutamine, SOD, vitamin B2, vitamin C, vitamin E, flavonoids , Spermine, ⁇ -carotene, glutathione, glutathione peroxidase, glutathione reductase, catalase, carnitine, albumin, transferrin, ceruloplasmin, glucose phosphate D dehydrogenase and the like.
  • Activator is included in a dilution layer separated by a semen preservation layer and an isolation layer, and activated when injected into the internal uterine ostium or uterine cavity after thawing without activating sperm before freezing Can be promoted. This makes it possible to activate at an appropriate timing without wasting sperm energy in the stage before freezing.
  • the aqueous solution in the diluted layer may contain antibiotics for storage.
  • the aqueous solution containing or not containing the active agent that can be used in the dilution layer of the present invention can be added during artificial insemination separately from the artificial insemination straw of the present invention.
  • a single-layer artificial insemination straw containing a semen preservation layer is thawed and injected with an aqueous solution that can be used for the dilution layer of the present invention before or after being injected into the internal uterine ostium or uterine cavity of a cow.
  • the aqueous solution of the dilution layer and the aqueous solution of the semen preservation layer may be mixed in the uterus of the cow.
  • the isolation layer is any solid, liquid or gas layer that prevents the dilution layer and semen storage layer from coming into direct contact and mixing.
  • preferred isolation layers include air, inert gases such as nitrogen and rare gases, oils (vegetable oils, animal oils), liquids such as organic solvents that separate from water, and solids that form partitions made of any substance. Is mentioned.
  • the gas or liquid isolation layer may be solidified depending on the cryopreservation temperature.
  • the length of the isolation layer may be any length as long as the dilution layer and the semen storage layer can be separated. From the viewpoint of the length and inner diameter of the artificial insemination straw, for example, a length of 0.5 cm to 2 cm is used. A length of 1 cm is generally used.
  • the length of each layer refers to the length in the longitudinal direction of the straw. Since the inner diameter of the straw is usually constant, the “length” of each layer is proportional to the volume of each layer.
  • the semen preservation layer consists of an aqueous solution containing semen and a freezing agent.
  • This aqueous solution may be any cryopreservation solution as long as it is a cryopreservation solution used for cryopreserving semen.
  • a cryopreservation solution using egg yolk, milk, soybean lecithin or the like is used as a semen cryopreservation solution.
  • the egg yolk cryopreservation solution includes, for example, an aqueous solution of sodium citrate and egg yolk of egg yolk, tris (hydroxymethylaminomethane), citric acid, lactose, raffinose, egg yolk tris sugar solution containing egg yolk, and antibiotics (for example, penicillin) And streptomycin, etc.) and an appropriate reagent.
  • the egg yolk tris sugar solution has a tris (hydroxymethylaminomethane) concentration of 75 to 200 mM, preferably 100 to 150 mM, a citric acid concentration of 25 to 75 mM, preferably 30 to 60 mM, and a lactose concentration of 10 to 100 mM, preferably 25.
  • Non-patent Document 1 glycerin-added egg yolk tris sugar solution in which glycerin is added to egg yolk tris sugar solution to a concentration of 6.5% is a classified semen straw (Sort90) for male and female production sold by the Japan Livestock Improvement Corporation. It is used in frozen semen straws and can be obtained from Sort90.
  • the milk-based cryopreservation solution is an aqueous solution obtained by adding a buffer, antibiotics, etc. to heat-sterilized whole milk or skim milk. Although these aqueous solutions need to be appropriately changed according to the animal species, cryopreservation solutions suitable for cattle, pigs, goats, horses and other mammals are known (Non-patent Document 1). .
  • the antifreezing agent contained in the semen preservation layer is a drug that prevents the contraction and intracellular freezing of cells by substituting with free water in the cells, and prevents the denaturation of cellular constituent proteins due to the concentration of intracellular salts.
  • the freezing agent can suppress the amount of ice in the extracellular fluid due to freezing and can alleviate physical damage during freezing and thawing processes, the freezing agent's toxicity appears depending on the concentration.
  • dilute raw semen with primary dilution that does not contain antifreeze and then gradually dilute into secondary dilution with antifreeze. Semen is stored frozen.
  • the primary diluent and the secondary diluent differ only in whether or not they contain a freezing agent.
  • any antifreezing agent suitable for semen cryopreservation can be used.
  • glycerin, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol, or a mixed solution thereof can be used.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ethylene glycol or a mixed solution thereof can be used.
  • glycerin is preferable.
  • the volume ratio of the dilution layer to the semen storage layer in the straw of the present invention may be any ratio.
  • the dilution layer: semen storage layer is preferably in the range of 3: 2 to 1: 4, and more preferably in the range of 3: 2 to 1: 2. Most preferred is 1: 1.
  • the number of spermatozoa contained in the semen storage layer contained in the artificial insemination straw of the present invention may be any number as long as sufficient fertility can be maintained, but usually the fertility rate increases as the sperm number increases.
  • the composition of the present invention that is, artificial insemination including a dilution layer composed of an aqueous solution containing at least one of a buffer, sugar or salt in the straw cavity, an isolation layer, and a semen storage layer Since it is considered that the effect produced by the drinking straw can be examined more clearly, in the examples described later, experiments are performed with about 3 million sperm per straw.
  • the number of sperm contained in the straw for artificial insemination of the present invention is not limited to 3 million, for example, about 1 million, about 3 million, about 5 million, about 7 million per straw, About 10 million or more sperm may be included. Among them, it is preferable to contain more than about 3 million sperm.
  • the semen contained in the artificial insemination straw of the present invention is semen derived from any animal as long as the animal is subjected to artificial insemination.
  • animals on which artificial insemination is performed include any mammals including humans, such as livestock animals, pet animals, zoo animals, and laboratory animals.
  • domestic animals include horses, sheep, cows, pigs, goats, and examples of pet animals include dogs, cats, rabbits, and the like.
  • the present invention also relates to an artificial insemination straw containing a semen of a species such as a panda that is feared to be extinct as a zoo animal.
  • Another aspect of the present invention also relates to an artificial insemination method using the artificial insemination straw of the present application.
  • the artificial insemination straw according to the present invention is melted in a warm bath at 30 to 40 ° C., and after melting, is loaded into a plastic syringe (for example, Kasugagan) and injected into the inner uterine ostium or uterine cavity of a cow at the end of estrus.
  • a plastic syringe for example, Kasugagan
  • the conception rate is improved.
  • the aqueous solution of the semen preservation layer containing the antifreezing agent can be used to inject the antifreezing agent when injected into the internal uterine ostium or uterine cavity after thawing.
  • Dilution with an aqueous solution of a dilution layer that does not contain the effect of reducing the toxicity of the cryoprotectant, preventing overcooling of the semen storage layer due to the ice-planting effect of the dilution layer, and the energy source of sperm It is conceivable that glucose to be supplied is supplied at an appropriate timing, that is, when it is injected into the internal uterine ostium or uterine cavity.
  • Example 1 Preparation of TCGN diluted solution, egg yolk tris sugar solution (ET solution), glycerin-added egg yolk tris sugar solution (ETG solution), sperm washing solution 17.031 g of tris (hydroxymethylaminomethane) (Wako Pure Chemical Industries), 9.519 g of citric acid monohydrate (Wako Pure Chemical Industries), 3.000 g of glucose (Wako Pure Chemical Industries), and 4.625 g of sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries), and another 1 million IU / 4.
  • EMG egg yolk tris sugar solution
  • the sperm washing solution was prepared by dissolving 0.3 g of bovine serum albumin (Wako Pure Chemical Industries) in the TCGN diluted solution prepared above to make 100 ml.
  • Example 2 In accordance with work made by a conventional method of straw for artificial insemination, the original semen 10 ⁇ l taken from male cattle and ReagentS100 in diluted 400 times to be used in the Nucleo Counter SP-100 (chemometec Co., Ltd.), to measure the number of sperm, original semen The sperm concentration of was measured. Depending on the sperm concentration, the original semen was diluted with egg yolk tris sugar solution (ET solution), which is the primary dilution of semen, to a sperm count of about 40 million per ml. The primary diluted semen thus obtained was diluted with a secondary dilution of semen at a volume ratio of 1: 1 to obtain a glycerin egg yolk tris sugar solution (ETG) containing about 20 million sperm per ml.
  • EDG glycerin egg yolk tris sugar solution
  • a single-layer artificial insemination straw was prepared by injecting 450 ⁇ l of secondary diluted semen into a straw with a cotton plug. These artificial insemination straws were frozen by applying liquid nitrogen vapor over 7 to 10 minutes and stored by immersing in liquid nitrogen.
  • Example 3 Influence of the type of diluent in the dilution layer on the rate of sperm having survival and normal acrosomes after freezing and thawing
  • a TCGN 2-fold dilution As an aqueous solution of the dilution layer, in addition to the TCGN dilution, a TCGN 2-fold dilution, The effectiveness of phosphate buffered saline (PBS), physiological saline, G100 mM (glucose 100 mM), and glycerin-added yolk tris sugar solution was tested.
  • PBS phosphate buffered saline
  • G100 mM glucose 100 mM
  • glycerin-added yolk tris sugar solution was tested.
  • an artificial insemination straw including a diluted layer composed of these diluted solutions, an air separating layer, and a semen storage layer was prepared and melted at 38 ° C. according to a conventional method.
  • the entire contents of the straw were transferred to a polystyrene conical tube, stirred well, and then washed twice by centrifugation at 2000 rpm for 5 minutes at room temperature using a sperm washing solution. Thereafter, the washed sperm was adjusted to 10 million / ml, 2 ⁇ g / ml PI (Sigma) and 2 ⁇ g / ml PNA-FITC (Sigma) were added and incubated at 25 ° C. for 10 minutes. Next, centrifugal cleaning was performed once at 3000 rpm using a sperm cleaning solution at room temperature for 5 minutes.
  • Example 4 Effect of ratio of TCGN dilution layer and semen preservation layer on artificial insemination straw including TCGN dilution layer, isolation layer, and semen preservation layer in straw cavity on sperm motility after freezing and thawing Cotton plug
  • An artificial insemination straw containing a TCGN dilution layer, a semen storage layer, and a 10 mm air isolation layer as an isolation layer was prepared in the plastic straws contained in the ratios shown in the following table.
  • These artificial insemination straws are frozen and stored in liquid nitrogen according to a conventional method, and after thawing, only the portion of the artificial insemination straw is transferred to a conical tube, and sperm movement is performed at 38 ° C. using CASA. Sex was tested.
  • Motility was shown by the ratio of sperm that moved 50 ⁇ m or more per second (Rapid (%)).
  • the experimental results are shown in FIG.
  • the length of the semen storage layer is 32, 40, 48, 56, 64 mm, that is, when the TCGN dilution layer: semen storage layer is in the range of 3: 2 to 1: 4, the sperm motility after thawing is It was shown to be expensive.
  • TCGN dilution layer: semen preservation layer 1: 1, sperm motility after thawing was the highest.
  • Example 5 Artificial Insemination Straw Using an Artificial Insemination Straw Containing TCGN Dilution Layer, Isolation Layer, and Semen Storage Layer in Straw Cavity Artificial Containing TCGN Dilution Layer, Air Isolation Layer, and Semen Storage Layer in Straw Cavity Insemination straws, and artificial insemination straws containing a glycerin-added egg yolk tris sugar solution dilution layer, air isolation layer, and semen preservation layer in a straw cavity as a control, are melted at 38 ° C. according to a conventional method, and are made of plastic. It was loaded into a vessel and injected into the inner uterine ostium or uterine cavity of a cow in the late estrus. After injection, the presence or absence of conception was examined by the non-return method or the fetal membrane palpation method (60 days), and the conception rate was measured.
  • Fig. 6 shows the results of the fertilization test results (from 382 in the test area and 387 in the control area) divided into each parti- cal and each product from 2001 to 2010.
  • the improvement of the conception rate was observed in the test plots for all of the puerperium and each production.
  • the test plot showed a significant improvement in conception rate compared to the control plot (chi-square test: P ⁇ 0.1). ).
  • Example 6 Measurement of normal rate of sperm acrosomes after freezing and thawing of an artificial insemination straw (1) Cryopreserved in liquid nitrogen (1) Glycerin-added egg yolk tris sugar solution dilution layer and air isolation layer in the straw cavity Straw for artificial insemination including semen storage layer (ETG layer + isolation layer + semen storage layer), (2) TCGN dilution layer, air isolation layer, and semen storage layer (TCGN layer + isolation layer + semen storage) in the straw cavity
  • the artificial insemination straw containing (layer) and (3) the artificial insemination straw containing a single layer of semen storage layer (450 ⁇ l) in the straw cavity were thawed at 38 ° C. according to a conventional method.
  • Example 7 Measurement of effect of supercooling during freezing of artificial insemination straw (1) Glycerin-added egg yolk tris sugar solution dilution layer, air isolation layer and semen preservation layer (ETG layer + isolation layer + in the straw cavity) (2) Artificial insemination straw including a TCGN dilution layer, an air isolation layer, and a semen storage layer (TCGN layer + isolation layer + semen storage layer) in the straw cavity, and (3) The artificial insemination straw containing a single-layered semen preservation layer (450 ⁇ l) in the straw cavity was frozen by applying it to liquid nitrogen vapor according to a conventional method.
  • the semen monolayer straw is changed to a multi-layer including a dilution layer, an isolation layer and a semen preservation layer, and glycerin is removed from the dilution solution to minimize sperm damage due to supercooling. It was shown that As a result of the decrease in supercooling, the normal rate of acrosome of Example 6 is considered to have improved. The prevention of overcooling is thought to be due to the ice planting effect by the first lyophilized dilution layer not containing glycerin.
  • the dilution solution passes through the straw first, so that a small amount of the dilution solution freezes in the straw lumen and freezes the semen storage layer. It is thought to promote.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

　従来の人工授精用ストローの改良を行うことにより、凍結保存後の精液の受胎性を改善することを課題とする。解決手段として、人工授精用ストロー内に隔離層を導入して層を分離し、一方に精液と耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層、もう一方に耐凍剤を含まない希釈層を含むように凍結用ストローを作製し、希釈層にトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、クエン酸、グルコース、塩化ナトリウムを含む水溶液からなる希釈液を用いることによる。

Description

人工授精用ストロー
　本発明は、人工授精の際に用いる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローに関する。
　ウシの繁殖においては、我が国では人工授精の普及率はほぼ１００％になっている。しかしながら、ウシの受胎率は、年々低下しており、１９８９年では初回受胎率で６２．４％、１～３回の受胎率で６２％であったところ、２００８年では初回受胎率で４６．１％、１～３回の受胎率で４４．６％にまで低下している。受胎率の低下には、様々な要因が考えられるが、乳用牛の乳の高生産化によるストレス等が考えられる。
　受胎が失敗した場合、不受胎の牝ウシに対して再度の人工授精を行う必要が生じ、費用及び労力の点で育種農家の負担となっている。そこで、受胎率の向上に対する必要性が、牝ウシの点のみならず、牡ウシの点からも求められている。
　家畜の人工授精には、ストロー精液管に分注した凍結精液が一般的に用いられている。凍結保存用のストロー精液管は、精液を、凍結保存用の一次希釈液に希釈し、次に一次希釈液に耐凍剤を加えた二次希釈液で希釈したものを、ストロー中に充填して得られるもので、液体窒素中で凍結保存される（非特許文献１）。従来は、単一の精液保存層のみを含む単層式のストローが使用されていたが、近年、二層充填可能な精液充填装置が開発された（特許文献１）。この二層充填可能な精液充填装置は、精液保存層が綿栓に接触することによる精液の逸失を防ぐことを目的として、綿栓側に精液保存層の凍結保存液と同じ凍結保存液を配置するものであった。
　精液を凍結するために使用する精液希釈液については、凍結融解後の精子生存率・受精活性の改善を目的としてその成分の改良が行われている。希釈液として、卵黄、糖類及び緩衝剤を主成分とする卵黄系保存液と、牛乳を主成分とする牛乳系保存液が一般的に知られており、卵黄系保存液が世界的に多く用いられている。卵黄は低温衝撃の緩和、細胞膜の保護、精子の生存維持等の効果があり、これらの効果は卵黄中のリポタンパク質とリン脂質に起因すると考えられている。また、精子の凍害を予防するために様々な凍結保存剤（特許文献２）、受精率を増加させるための精子の活性化剤（特許文献３）等について研究がされている。凍結・融解過程においては、塩類が精子に悪影響を及ぼすことから、一般的に凍結用の希釈液には塩類は添加されることはない。
特表２０１０－５０３４３８号公報 特開２００５－２７０００６号公報 特開２００５－２１３１４７号公報
家畜人工授精講習会テキスト Guthrieら、Biology of Reproduction 67, 1811-1816 (2002)
　本発明が解決すべき課題は、従来の人工授精用ストローの改良を行うことにより、受胎率を改善することである。
　本発明者らが、人工授精用ストローに充填された精子の生存性、並びに人工授精用ストローを用いた人工授精における受胎率について鋭意研究を行った結果、人工授精用ストロー内に隔離層を導入して層を分離し、一方に精液と耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層、もう一方に緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層を含むように人工授精用ストローを作製した場合に、驚くべきことに受胎率が向上したことが判明し本発明に到った。
　したがって、本発明は、以下の発明を包含する：
　［１］　ストローと、前記ストローの腔内に配置された、緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層；隔離層；及び精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層とを含み、希釈層と精液保存層とが隔離層により隔てられている、人工授精用ストロー。
　［２］　前記希釈層：前記精液保存層が、３：２～１：４である、［１］に記載の人工授精用ストロー。
　［３］　前記希釈層：前記精液保存層が３：２～１：２である［１］又は［２］に記載の人工授精用ストロー。
　［４］　前記希釈層：前記精液保存層が１：１である、［３］に記載の人工授精用ストロー。
　［５］　前記希釈層の水溶液が、グリセリンを含有しない、［１］～［４］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［６］　前記希釈層の緩衝剤がトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）及びクエン酸であり、糖がグルコースであり、そして塩が塩化ナトリウムである、［１］～［５］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［７］　前記希釈層の水溶液の浸透圧が、２３０～４００ｍＯｓｍである、［１］～［６］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［８］　前記希釈層の水溶液のｐＨが６．４～７．５である、［１］～［７］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［９］　前記グルコース濃度が１０ｍＭ～５０ｍＭであり、塩化ナトリウム濃度が５０～１００ｍＭである、［１］～［８］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［１０］　前記希釈層が、卵黄及び耐凍剤を含まない、［１］～［９］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［１１］　前記トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）が１４０．６ｍＭ、前記クエン酸が４５．３ｍＭ、前記グルコースが１６．７ｍＭ、前記塩化ナトリウムが７９．１ｍＭである、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［１２］　前記ストローの容量が、０．２５～０．５ｍｌである、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［１３］　前記精液が、哺乳動物の精液である、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［１４］　前記精液が、ウシ又はイヌの精液である、［１］～［１３］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［１５］　前記希釈層の水溶液にさらに精子運動活性剤を含んでなる、［１］～［１４］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　［１６］　前記人工授精用ストローが、凍結されている、［１］～［１５］のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
　ストロー腔内において隔離層により分離された緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層と精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層とを含む人工授精用ストローを人工授精に用いることにより、従来の単層式人工授精用ストローを用いた人工授精に比較して受胎率が改善する。
図１は、綿栓を入れたストロー腔内において希釈層＋隔離層＋精液保存層を含む人工授精用ストローの概略図である。 図２は、ストロー腔内において希釈層＋隔離層＋精液保存層を含む人工授精用ストローにおいて、希釈層を種々の水溶液に変更して得た人工授精用ストローを凍結保存し、融解した後における生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率を示すグラフである。希釈層として、ＴＣＧＮを用いた際に最も生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率が高いことが示される。 図３は、ストロー腔内のＴＣＧＮ希釈層と精液保存層との比率を変更して、人工授精用ストローを凍結保存し、融解した後の精子運動性を調べたグラフである。ＴＣＧＮ希釈層の長さ＋精液保存層の長さ＝８０ｍｍとして、精液保存層の長さを４～７２ｍｍに変更して、融解後の精子運動性が調べられた。ＴＣＧＮ希釈層：精液保存層＝２：３～４：１において精子運動性が優れており、特に１：１のときにその運動性が最も優れていることが示される。 図４は、未経産の牝ウシにおける受胎試験結果を示すグラフである。ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む複層式ストローを用いた場合に、対照に比較して受胎率の向上がみられた。対照は、精液保存層と同一成分であるが、精液を含まない水溶液（グリセリン加卵黄トリス糖液）からなる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む複層式ストローを用いた場合の受胎率である。 図５は、経産の牝ウシにおける受胎試験結果を示すグラフである。ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合に、対照に比較して受胎率の向上がみられた。対照は、精液保存層と同一成分であるが、精液を含まない水溶液（グリセリン加卵黄トリス糖液）からなる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合の受胎率である。 図６は、未経産の牝ウシについての受胎試験結果と各産次の牝ウシについての受胎試験結果とを分けて示した実験結果を示すグラフである。ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合に、対照に比較して受胎率の向上がみられた。対照は、精液保存層と同一成分であるが、精液を含まない水溶液（グリセリン加卵黄トリス糖液）からなる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合の受胎率である。 図７は、凍結保存後に融解された人工授精用ストロー内の精液のアクロソーム正常率を示すグラフである。ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖（ＥＴＧ）層＋隔離層＋精液保存層、ＴＣＧＮ希釈層＋隔離層＋精液保存層、又は精液保存層（単層、４５０μｌ）を含む人工授精用ストローについて実験が行われた。値は、平均値と標準偏差で示す（Ｎ＝４）。ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層＋隔離層＋精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた場合に、アクロソームの正常率が最も高いことが示される。 図８は、ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖（ＥＴＧ）層＋隔離層＋精液保存層、ＴＣＧＮ希釈層＋隔離層＋精液保存層、又は精液保存層（単層）を含む人工授精用ストローを液体窒素蒸気で凍結する際における精液保存層の過冷却時間を示すグラフである。値は、平均値と標準偏差で示す（Ｎ＝１０）。希釈層として、ＴＣＧＮ希釈層を用いた場合に過冷却の時間が少なくなることが示される。 図９は、ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖（ＥＴＧ）層＋隔離層＋精液保存層、ＴＣＧＮ希釈層＋隔離層＋精液保存層、又は精液保存層（単層）を含む人工授精用ストローを液体窒素蒸気で凍結する際において、精液保存層に氷が析出した温度を示すグラフである。値は、平均値と標準偏差で示す（Ｎ＝１０）。希釈層として、ＴＣＧＮ希釈層を用いた場合に高い温度で氷が析出することが示される。
　本発明は、ストローと、前記ストローの腔内に配置された、（１）緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層；（２）隔離層；及び（３）精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層とを含み、希釈層と精液保存層とが隔離層により隔てられている、人工授精用ストローに関する。
　本発明の人工授精用ストローに用いられるストローは、任意の材料で製造することができるが、１回で使い捨てされることから、例えばポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）等のプラスチック製の円筒管である。任意の長さ、直径のストローが用いられるが、市販されているストローの多くは、長さ１３３ｍｍであり、直径が１．９５ｍｍ又は２．８５ｍｍである。綿栓をいれたストローに、希釈層、隔離層、及び精液保存層となる液体又は気体を順次注入し、超音波によって熱圧着して閉封される。希釈層、隔離層、及び精液保存層となる液体又は気体を手動で分注することもできるが、例えば特許文献１に記載される充填装置を用いて充填することができる。閉封後に、７～１０分かけて液体窒素蒸気で凍結され、液体窒素中に浸漬して保存される。
　本発明の人工授精用ストローに用いられるストローの容量は、人工授精に用いられるものであれば任意の容量であってもよく、例えば０．２５～５ｍｌである。ストローの容量は、動物種によって変更され、ウシやイヌの精液を凍結するという観点では、０．２５～０．５ｍｌのものが好ましい。ストローの一方の端が綿栓等の栓により閉封されており、希釈層、隔離層、そして精液保存層の順に入れられ、そして他方の端が、熱圧着等がなされて閉封されている。希釈層又は精液保存層と閉封部とは、それぞれ接触していてもよいし、気体層により隔てられていてもよい。希釈層と精液保存層との順序は入れ替えられてもよい。また、本発明の例として、希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む複層式ストローを示したが、希釈層や精液保存層をそれぞれ２層以上含む複層式ストローとしてもよい。
　前記希釈層において、好ましくは緩衝剤がトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）及びクエン酸であり、糖がグルコースであり、そして塩が塩化ナトリウムである。このような希釈層を、本明細書においてＴＣＧＮ希釈層という。好ましくは、希釈層には、グリセリンが含まれない。
　本発明の希釈層の水溶液の浸透圧は、精子の受精活性が維持できる浸透圧であれば任意の浸透圧であってもよいが、通常は２３０～４００ｍＯｓｍである。この範囲は、非特許文献２の記載により、精子の運動活性を維持できる範囲として特定されている。好ましくは、希釈層の水溶液の浸透圧は、２６０～３５０ｍＯｓｍ、さらに好ましくは２８０～３３０ｍＯｓｍである。２９５～３２０ｍＯｓｍが特に好ましい。浸透圧は、溶質の濃度、解離度等から理論値を計算することもできるが、溶液を構成する物質の相互作用等を考慮して、浸透圧計（オズモメーター）を用いて決定される。本発明の希釈層の水溶液におけるグルコース濃度及び塩化ナトリウム濃度は、水溶液の浸透圧が、上記範囲となるように決定される。グルコース濃度は、５ｍＭ～１００ｍＭであり、好ましくは１０ｍＭ～５０ｍＭである。塩化ナトリウム濃度は５０～２００ｍＭであり、好ましくは５０～１５０ｍＭであり、さらに好ましくは５０～１００ｍＭである。
　本発明の希釈層の水溶液のｐＨは、精子への毒性が無いｐＨ範囲であれば任意のｐＨであってもよく、例えば６．０～８．０である。好ましくは、６．４～７．５であり、さらに好ましくは６．８～７．２である。本発明の希釈層の水溶液中のトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）とクエン酸の濃度は、最終的な水溶液のｐＨが、上記のｐＨ範囲となるように決定される。より具体的に、本願発明のトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）の濃度は、５０～３００ｍＭ、好ましくは７５～２００ｍＭである。クエン酸濃度は、２０～１００ｍＭ、好ましくは２５～７５ｍＭである。
　本発明の希釈層は、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、クエン酸、グルコース及び塩化ナトリウムを含む水溶液からなることが好ましいが、所望のｐＨを達成するものであれば、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）及びクエン酸の代わりの緩衝剤が使用されうる。使用できる緩衝剤として、中性付近に緩衝作用を持つ緩衝剤であれば任意のものを選択でき、例えば、メス、ヘペス、テス、トリシン等のグッド緩衝剤、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられる。同様に、グルコースは精子のエネルギー源となる物質であるが、精子が利用可能な他の糖やエネルギー源に代えることもできる。他の例として、キシロース、ラムロース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、メリビオース、ラフィノース、メレチロース、スタキオース、デキストリン、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｄ－グルクロン酸等が挙げられる。また、塩化ナトリウムの代わりに、他の塩類、例えば塩化カリウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等が使用されることもある。
　本発明の希釈層の水溶液には、さらに精子を活性化させる活性化剤を含めることができる。活性化剤の具体的な例として、カテキン、カフェイン、テオフィリン、ペントキシフィリン、プロカイン、イミダゾール、ピルビン酸ナトリウム、ハイポタウリン、ポリフェノール、Ｌ－グルタミン、ＳＯＤ、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＥ、フラボノイド、スペルミン、βカロテン、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、カタラーゼ、カルニチン、アルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミン、グルコースホスフェートＤデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。活性化剤を、精液保存層と隔離層により隔てられた希釈層に含めることで、凍結前に精子を活性化することなく、融解後内子宮口又は子宮体腔内に注入された際に活性化を促進することができる。これにより、凍結前の段階で、精子のエネルギーを浪費することなく、適切なタイミングで活性化することが可能になる。また、希釈層の水溶液には、保存のため抗生物質が含まれうる。
　なお、本発明の希釈層に用いることができる活性剤を含むか又は含まない水溶液は、本発明の人工授精用ストローとは別個に人工授精の際に添加することもできる。例えば、精液保存層を含む一層式の人工授精用ストローを解凍し、牝ウシの内子宮口又は子宮体腔内に注入する前、又は後に、本発明の希釈層に用いることができる水溶液を注入することで、牝ウシの子宮内で希釈層の水溶液と精液保存層の水溶液が混合されてもよい。
　隔離層は、希釈層と精液保存層とが直接接触し混合することを妨げる任意の固体、液体又は気体の層である。好ましい隔離層の例として、空気、不活性ガス、例えば窒素、希ガス等の気体、油（植物油、動物油）、水と分離する有機溶媒等の液体、並びに任意の物質でできた仕切りとなる固体が挙げられる。気体や液体の隔離層は、凍結保存する温度によっては、凝固してもよい。隔離層の長さは、希釈層と精液保存層とを分離することができれば任意の長さであってよく、人工授精用ストローの長さや内径の観点から、例えば０．５ｃｍ～２ｃｍの長さであり、１ｃｍの長さが一般的に用いられる。
　なお、本明細書において、各層の長さとは、ストローの長手方向における長さを指す。ストローの内径は通常一定であるので各層の「長さ」は、各層の体積に比例する。
　精液保存層は、精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる。この水溶液は、精液を凍結保存するために用いられる凍結保存液であれば任意の凍結保存液であってもよい。一般的に精液凍結保存液として、卵黄、牛乳、大豆レシチン等を用いた凍結保存液が用いられている。卵黄系凍結保存液は、例えばクエン酸ナトリウムと鶏卵の卵黄の水溶液、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、クエン酸、ラクトース、ラフィノース、卵黄を含む卵黄トリス糖液があり、さらに抗生物質（例えば、ペニシリンやストレプトマイシン等）、適切な試薬等を添加することにより製造される。卵黄トリス糖液は、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）の濃度が７５～２００ｍＭ、好ましくは１００～１５０ｍＭ、クエン酸濃度が２５～７５ｍＭ、好ましくは３０～６０ｍＭ、ラクトース濃度が１０～１００ｍＭ、好ましくは２５～７５ｍＭ、ラフィノース濃度が１０～１００ｍＭ、好ましくは２５～７５ｍＭ、卵黄濃度が１５～２５％である（非特許文献１）。例えば、卵黄トリス糖液にグリセリンを６．５％の濃度になるように加えたグリセリン加卵黄トリス糖液は、社団法人家畜改良事業団が販売する雌雄産み分け用選別精液ストロー（Ｓｏｒｔ９０）や一般凍結精液ストローで用いられており、Ｓｏｒｔ９０から取得可能である。牛乳系凍結保存液では、加熱殺菌された全乳又は脱脂乳に緩衝剤、抗生物質等が添加された水溶液である。これらの水溶液は、動物種に応じて適切に変更する必要があるが、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、その他の哺乳動物に対して適した凍結保存液が知られている（非特許文献１）。
　精液保存層に含まれる耐凍剤は、細胞内の自由水と置換して細胞の収縮及び細胞内凍結を防止するとともに、細胞内の塩類の濃縮による細胞構成タンパク質の変性を防止する薬剤である。耐凍剤は、凍結による細胞外液中の氷量を抑えて、凍結及び融解過程の物理的損傷を緩和することができるものの、濃度によっては耐凍剤の毒性が表れる。耐凍剤の毒性の影響を低減するため、精液希釈液の作製の際に、耐凍剤を含有しない一次希釈液で原精液を希釈後、耐凍剤を含む二次希釈液に段階的に希釈し、精液の凍結保存が行われている。一般に一次希釈液と二次希釈液とは、耐凍剤を含むか否かの点でのみ異なっている。本発明において用いられる耐凍剤は、精液の凍結保存に適した耐凍剤であれば、任意のものを使用することができ、例えばグリセリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、又はそれらの混合液等を使用することができるが、特に精液保存の観点からは、グリセリンが好ましい。
　本発明のストロー中の希釈層：精液保存層の体積比は、任意の比率であってもよい。しかしながら、融解後の混合液における精子運動性の観点から、希釈層：精液保存層が３：２～１：４の範囲であることが好ましく、さらに３：２～１：２の範囲も好ましい。最も好ましくは１：１である。
　本発明の人工授精用ストローに含まれる精液保存層に含まれる精子数は、十分な受胎性を維持できれば任意の数であってもよいが、通常、精子数が多ければ受胎率が高くなる。精子濃度をできるだけ薄くすることで、本発明の構成、すなわちストロー腔内に緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローにより生じる効果をより明確に調べることができると考えられるため、後述の実施例では、１ストローあたり約３００万個の精子数で実験を行っている。しかしながら、本発明の人工授精用ストローに含まれる精子数は３００万個に限定されることはなく、例えば１ストローあたり約１００万個、約３００万個、約５００万個、約７００万個、約１０００万個又はそれより多くの精子が含まれていてもよい。中でも約３００万個より多くの精子を含むことが好ましい。
　本発明の人工授精用ストローに含まれる精液は、人工授精が行われる動物であれば任意の動物由来の精液である。人工授精が行われる動物の例として、ヒトを含む任意の哺乳動物、例えば家畜動物、愛玩動物、動物園動物、実験動物が挙げられる。家畜動物として、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ等が挙げられ、愛玩動物として、イヌ、ネコ、ウサギ等が挙げられる。本発明は、動物園動物として、パンダ等の絶滅が恐れられている種の精液を含む人工授精用ストローにも関する。
　本発明の別の態様では、本願の人工授精用ストローを用いた人工授精方法にも関する。本発明の人工授精用ストローを３０～４０℃の温浴で融解し、融解後、プラスチック製の注入器（例えばカスーガン）に装填し、発情末期の牝ウシの内子宮口又は子宮体腔内に注入することにより、人工授精が行われる。この人工授精方法を用いることにより、受胎率が向上する。
　この受胎率の向上は、様々な要因のため生じるものと考えられるが、耐凍剤を含む精液保存層の水溶液が、解凍後家畜の内子宮口又は子宮体腔内への注入の際に耐凍剤を含まない希釈層の水溶液により希釈されることにより、耐凍剤の有する毒性の影響が低減されること、希釈層の植氷効果による精液保存層の過冷却が防止されること、並びに精子のエネルギー源となるグルコースが適切なタイミング、すなわち内子宮口又は子宮体腔内へと注入される際に供給される等が考えられる。
実施例１：ＴＣＧＮ希釈液、卵黄トリス糖液（ＥＴ液）、グリセリン加卵黄トリス糖液（ＥＴＧ液）、精子洗浄液の調製
　１７．０３１ｇのトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）（和光純薬工業）、９．５１９ｇのクエン酸一水和物（和光純薬工業）、３．０００ｇのグルコース（和光純薬工業）、及び４．６２５ｇの塩化ナトリウム（和光純薬工業）、さらに１００万ＩＵ／４．６ｍｌＳＰＵＦのペニシリンＧカリウム（万有製薬）を３ｍｌ、１０００ｍｇ力価／４．３ｍｌＳＰＵＦのストレプトマイシン（明治製菓）を３ｍｌ加え、蒸留水で１０００ｍｌにメスアップして、１４０．６ｍＭのトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、４５．３ｍＭのクエン酸、１６．７ｍＭのグルコース、７９．１ｍＭの塩化ナトリウムを含む水溶液（ＴＣＧＮ希釈液）を得た。
　卵黄トリス糖液（ＥＴ）は、社団法人家畜改良事業団がＳｏｒｔ９０や一般凍結精液で使用する精液一次希釈液を用いた。グリセリン加卵黄トリス糖液（ＥＴＧ）は、卵黄トリス糖液（ＥＴ）にグリセリンを６．５％となるように添加した水溶液であり、社団法人家畜改良事業団がＳｏｒｔ９０から取得可能であり、精液保存層の水溶液と、精液を含まないという点を除き同一である。
　精子洗浄液は、０．３ｇのウシ血清アルブミン（和光純薬工業）を、上で調製したＴＣＧＮ希釈液に溶解して１００ｍｌにすることにより調製した。
実施例２：人工授精用ストローの作製
　常法に従い、牡ウシから採取した原精液１０μｌをＮｕｃｌｅｏ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＳＰ－１００（ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社）で用いるＲｅａｇｅｎｔＳ１００で４００倍希釈し、精子数を計測し、原精液の精子濃度を測定した。精子濃度に応じて原精液を、精液の一次希釈液である卵黄トリス糖液（ＥＴ液）で１ｍｌあたり約４０００万の精子数となるように希釈した。こうして得られた一次希釈精液を精液の二次希釈液で１：１の体積比で希釈し、１ｍｌあたり約２０００万の精子数を含むグリセリン加卵黄トリス糖液（ＥＴＧ）を得た。
　綿栓を入れたプラスチック製ストロー（富士平工業、０．５ｍｌ細１３３型）に、希釈液１５０μｌを注入して希釈層とし、隔離層が１ｃｍとなるように隔離し、そして二次希釈精液を１５０μｌ注入し精液保存層とし、熱圧着を行って密封した。人工授精用ストローの概略図を図１として示す。これにより、１ストローあたりの精子数を約３００万とした。希釈層の水溶液として、ＴＣＧＮ希釈液又はグリセリン加卵黄トリス糖液をそれぞれ用いた。さらに、綿栓を入れたストローに４５０μｌの二次希釈精液を注入した単層の人工授精用ストローを作製した。これらの人工授精用ストローに液体窒素蒸気をあてて７～１０分かけて凍結させ、液体窒素中に浸漬することにより保存した。
実施例３：希釈層における希釈液の種類が、凍結融解後の生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率に及ぼす影響
　希釈層の水溶液として、ＴＣＧＮ希釈液の他に、ＴＣＧＮ２倍希釈液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、Ｇ１００ｍＭ（グルコース１００ｍＭ）、グリセリン加卵黄トリス糖液について、その有効性を試験した。具体的には、これらの希釈液からなる希釈層、空気の隔離層、精液保存層を含む人工授精用ストローを作製し、常法に従い３８℃で融解した。ストローの中身をポリスチレンコニカルチューブに全量移し入れ、よく撹拌後、精子洗浄液を用いて室温、５分間、２０００ｒｐｍで２回遠心洗浄を行った。その後、洗浄した精子を１０００万／ｍｌに調整し、２μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｓｉｇｍａ）及び２μｇ／ｍｌのＰＮＡ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を加えて２５℃で１０分間インキュベーションした。次に、精子洗浄液を用いて室温、５分間、３０００ｒｐｍで１回遠心洗浄を行った。そして、フローサイトメーター（Ｃｅｌｌ　Ｌａｂ　Ｑｕａｎｔａ　ＳＣ、ベックマン）を用いて、１サンプルあたり２万個の精子について生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率を測定した。ＰＩで染色されない精子は生存精子と判定し、ＰＮＡ－ＦＩＴＣで染色されない精子はアクロソーム正常精子と判定した。測定結果を図２として示す。ＴＣＧＮ希釈液を希釈層とする人工授精用ストローにおいて、最も生存し、かつ正常なアクロソームを有する精子の率が高かった。また、生理食塩水を希釈層とする人工授精用ストローにおいても、生存し、かつ正常なアクロソームを有する率が高かった。
実施例４：ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローにおけるＴＣＧＮ希釈層と精液保存層の比が、凍結融解後の精子運動性に与える影響
　綿栓を入れたプラスチック製ストロー中に、下記の表に記載される比でＴＣＧＮ希釈層と精液保存層、並びに隔離層として１０ｍｍの空気の隔離層を含む人工授精用ストローを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　これらの人工授精用ストローを、常法に従い液体窒素で凍結保存し、融解後、人工授精用ストローの内容液を精液保存層の部分のみコニカルチューブに移し、ＣＡＳＡを用いて３８℃において精子の運動性を試験した。運動性は、１秒間に５０μｍ以上動いた精子の割合（Ｒａｐｉｄ（％））で示した。実験結果を図３に示す。精液保存層の長さが３２、４０、４８、５６、６４ｍｍであるとき、すなわちＴＣＧＮ希釈層：精液保存層が、３：２～１：４の範囲の際に、融解後の精子運動性が高いことが示された。さらに、ＴＣＧＮ希釈層：精液保存層＝１：１であるとき、融解後の精子運動性が最も高かった。
実施例５：ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを用いた受胎試験
　ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、空気の隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストロー、並びに対照としてストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖液希釈層、空気の隔離層、及び精液保存層を含む人工授精用ストローを常法に従い、３８℃で融解させ、プラスチック製の注入器に装填し、発情末期の牝ウシの内子宮口又は子宮体腔内に注入した。注入後、ノンリターン法又は胎膜触知法（６０日）で受胎の有無を調べ、受胎率を測定した。
　一般に出産を経験した牝ウシでは受胎率が下がるため、未経産の牝ウシと経産の牝ウシの二群について実験を行った。実験結果は以下の通りであり、この結果を図４及び図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　平成１３年から平成２２年までの受胎試験結果（試験区３８２頭、対照区３８７頭）を、未経産と各産次に分けて表示した結果を図６に示す。図６において、未経産と各産次の全てについて、試験区で受胎率の向上がみられた。未経産についての結果と経産の各産次についての結果を合計したところ、試験区は対照区と比較して有意な受胎率の向上がみられた（χ２乗検定：Ｐ＜０．１）。
実施例６：人工授精用ストローの凍結融解後における精子のアクロソーム正常率の測定
　液体窒素中で凍結保存されている（１）ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖液希釈層と空気の隔離層と精液保存層（ＥＴＧ層＋隔離層＋精液保存層）を含む人工授精用ストロー、（２）ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、空気の隔離層、及び精液保存層（ＴＣＧＮ層＋隔離層＋精液保存層）を含む人工授精用ストロー、（３）ストロー腔内に単層の精液保存層（４５０μｌ）を含む人工授精用ストローを常法に従い、３８℃で融解した。ストローの中身をポリスチレンコニカルチューブに全量移し入れ、よく撹拌後、精液５～１０μｌをスライドグラスに載せ塗沫をし、２～３時間風乾し、ギムザ染色を行い、３００～５００個の精子について、形態を検査して、アクロソーム正常率を測定した。測定結果を図７に示す。
実施例７：人工授精用ストローの凍結の際における過冷却の影響の測定
　（１）ストロー腔内にグリセリン加卵黄トリス糖液希釈層と空気の隔離層と精液保存層（ＥＴＧ層＋隔離層＋精液保存層）を含む人工授精用ストロー、（２）ストロー腔内にＴＣＧＮ希釈層、空気の隔離層、及び精液保存層（ＴＣＧＮ層＋隔離層＋精液保存層）を含む人工授精用ストロー、及び（３）ストロー腔内に単層の精液保存層（４５０μｌ）を含む人工授精用ストローを、常法に従い、液体窒素蒸気にあてて凍結を行った。この際、精液保存層に対して温度センサーを入れて、精液保存層の過冷却の時間及び凝固開始温度を測定した。結果をそれぞれ図８及び図９に示す。単層精液保存層のストローにおいて、最も過冷却の時間が長く（図８）、かつ凝固開始温度が低かった（図９）。隔離層を導入して精液保存層と希釈層を分離することにより、過冷却時間が短くなり、凝固開始温度が上がり、さらに希釈液からグリセリンを除くことにより、さらに過冷却時間が短くなり、凝固開始温度が上昇した。この実験により、精液単層のストローから、希釈層、隔離層及び精液保存層を含む複層に変更し、また希釈液からグリセリンを除くことにより、過冷却による精子の損傷を最小限にすることができることが示された。過冷却の減少の結果として、実施例６のアクロソーム正常率が向上したと考えられる。過冷却の防止は、グリセリンを含まない希釈層が先に氷結することにより植氷効果によるものと考えられる。希釈層と精液保存層との間には空気の隔離層があるものの、希釈液が先にストローを通過するため、ストロー内腔に微量に付着した希釈液が氷結し、精液保存層の氷結を促進すると考えられる。

Claims (6)

  1. 　ストローと、前記ストローの腔内に配置された、
    　　緩衝剤、糖又は塩のいずれか一つ以上を含む水溶液からなる希釈層；
    　　隔離層；及び
    　　精液及び耐凍剤を含む水溶液からなる精液保存層
    　とを含み、希釈層と精液保存層とが隔離層により隔てられており、希釈層：精液保存層の体積比率が、３：２～１：４である、人工授精用ストロー。
  2. 　前記希釈層が、グリセリンを含まない、請求項１に記載の人工授精用ストロー。
  3. 　前記希釈層において、前記緩衝剤が、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）及びクエン酸を含み、前記糖が、グルコースを含み、かつ前記塩が、塩化ナトリウムを含む、請求項１又は２に記載の人工授精用ストロー。
  4. 　前記希釈層の水溶液の浸透圧が２３０～４００ｍＯｓｍ、かつｐＨ６．４～７．５である、請求項１～３のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
  5. 　前記人工授精用ストローの液量が、０．２５～０．５ｍlである、請求項１～４のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
  6. 　前記精液が、ウシ又はイヌの精液である、請求項１～５のいずれか一項に記載の人工授精用ストロー。
PCT/JP2011/077813 2010-12-01 2011-12-01 人工授精用ストロー WO2012074060A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11845911.4A EP2647284A4 (en) 2010-12-01 2011-12-01 Straw for artificial insemination
CA2820677A CA2820677C (en) 2010-12-01 2011-12-01 Artificial insemination straw
US13/990,987 US9339360B2 (en) 2010-12-01 2011-12-01 Artificial insemination straw
JP2012546938A JP5738314B2 (ja) 2010-12-01 2011-12-01 人工授精用ストロー

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010268423 2010-12-01
JP2010-268423 2010-12-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012074060A1 true WO2012074060A1 (ja) 2012-06-07

Family

ID=46171985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/077813 WO2012074060A1 (ja) 2010-12-01 2011-12-01 人工授精用ストロー

Country Status (5)

Country Link
US (1) US9339360B2 (ja)
EP (1) EP2647284A4 (ja)
JP (1) JP5738314B2 (ja)
CA (1) CA2820677C (ja)
WO (1) WO2012074060A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017159737A1 (ja) * 2016-03-16 2017-09-21 一般社団法人家畜改良事業団 精子用希釈液及びそれを用いた精子の保存方法
WO2018038115A1 (ja) * 2016-08-22 2018-03-01 株式会社バイオベルデ ウシ生殖細胞の凍結保存用組成物及び凍結保存方法
US20230292743A1 (en) * 2017-12-18 2023-09-21 Imv Technologies Method for increasing the lifespan and motility of animal sperm using an inhibitor of Slo3 potassium channel

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005213147A (ja) 2004-01-27 2005-08-11 Ryoko Kumai 哺乳動物の精子の活性化剤及び活性化方法
JP2005270006A (ja) 2004-03-25 2005-10-06 Kyudo Kk 精子凍結保存剤
JP2008259506A (ja) * 2007-03-20 2008-10-30 Tokyo Univ Of Agriculture 人工授精用のウシ凍結精液
JP2009022214A (ja) * 2007-07-19 2009-02-05 Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine イヌ精子の凍結保存剤および凍結保存方法
JP2009142237A (ja) * 2007-12-17 2009-07-02 Hiroshima Univ 受胎率および産子数向上凍結精子およびその製法
JP2010503438A (ja) 2006-09-13 2010-02-04 ユール クリョ ヴェ 人工授精用ストローへの精液充填装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2254639B1 (ja) * 1973-12-18 1978-06-02 Agronomique Inst Nat Rech
US7208265B1 (en) * 1999-11-24 2007-04-24 Xy, Inc. Method of cryopreserving selected sperm cells
EP1249159A4 (en) * 2000-01-21 2005-01-26 Kurogi Masahiro METHODS FOR SEX SELECTION IN CATTLE AND TREATMENT AGENT THEREFOR
NZ518967A (en) 2002-05-15 2004-11-26 Livestock Improvement Corp Ltd Straws (inter alia) for insemination of animals

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005213147A (ja) 2004-01-27 2005-08-11 Ryoko Kumai 哺乳動物の精子の活性化剤及び活性化方法
JP2005270006A (ja) 2004-03-25 2005-10-06 Kyudo Kk 精子凍結保存剤
JP2010503438A (ja) 2006-09-13 2010-02-04 ユール クリョ ヴェ 人工授精用ストローへの精液充填装置
JP2008259506A (ja) * 2007-03-20 2008-10-30 Tokyo Univ Of Agriculture 人工授精用のウシ凍結精液
JP2009022214A (ja) * 2007-07-19 2009-02-05 Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine イヌ精子の凍結保存剤および凍結保存方法
JP2009142237A (ja) * 2007-12-17 2009-07-02 Hiroshima Univ 受胎率および産子数向上凍結精子およびその製法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"!!Sort90 Straw ga Atarashiku Narimashita!!", LIVESTOCK IMPROVEMENT ASSOCIATION OF JAPAN, INC., 1 December 2010 (2010-12-01), XP008172071, Retrieved from the Internet <URL:http://liaj.or.jp/giken/gijutsubu/hanbetu/pdf/2sou_sutoro-.pdf> [retrieved on 20120213] *
GIL, J. ET AL.: "Influence of centrifugation and different extenders on post-thaw sperm quality of ram semen.", THERIOGENOLOGY, vol. 54, no. 1, 1 July 2000 (2000-07-01), pages 93 - 108, XP005026549 *
GUTHRIE ET AL., BIOLOGY OF REPRODUCTION, vol. 67, 2002, pages 1811 - 1816
See also references of EP2647284A4 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017159737A1 (ja) * 2016-03-16 2017-09-21 一般社団法人家畜改良事業団 精子用希釈液及びそれを用いた精子の保存方法
JPWO2017159737A1 (ja) * 2016-03-16 2019-01-24 一般社団法人家畜改良事業団 精子用希釈液及びそれを用いた精子の保存方法
US11185068B2 (en) 2016-03-16 2021-11-30 Livestock Improvement Association Of Japan, Inc. Diluent for sperm and method for preserving sperm using same
WO2018038115A1 (ja) * 2016-08-22 2018-03-01 株式会社バイオベルデ ウシ生殖細胞の凍結保存用組成物及び凍結保存方法
KR20190042638A (ko) * 2016-08-22 2019-04-24 가부시키가이샤 바이오베르데 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법
CN109688812A (zh) * 2016-08-22 2019-04-26 博傲沃德株式会社 牛生殖细胞的冷冻保存用组合物和冷冻保存方法
KR102316820B1 (ko) 2016-08-22 2021-10-22 가부시키가이샤 바이오베르데 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법
KR20210127774A (ko) * 2016-08-22 2021-10-22 가부시키가이샤 바이오베르데 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법
KR102328832B1 (ko) 2016-08-22 2021-11-18 가부시키가이샤 바이오베르데 소 생식세포의 동결 보존용 조성물 및 동결 보존 방법
CN109688812B (zh) * 2016-08-22 2022-05-31 博傲沃德株式会社 牛生殖细胞的冷冻保存用组合物和冷冻保存方法
US11659833B2 (en) 2016-08-22 2023-05-30 Bioverde Inc. Composition for cryopreservation of bovine reproductive cells and cryopreservation method thereof
US20230292743A1 (en) * 2017-12-18 2023-09-21 Imv Technologies Method for increasing the lifespan and motility of animal sperm using an inhibitor of Slo3 potassium channel

Also Published As

Publication number Publication date
US20130267771A1 (en) 2013-10-10
JPWO2012074060A1 (ja) 2014-05-19
EP2647284A1 (en) 2013-10-09
CA2820677A1 (en) 2012-06-07
CA2820677C (en) 2017-03-28
US9339360B2 (en) 2016-05-17
EP2647284A4 (en) 2017-07-26
JP5738314B2 (ja) 2015-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Andrabi Factors affecting the quality of cryopreserved buffalo (Bubalus bubalis) bull spermatozoa
Salamon et al. Storage of ram semen
Johnson et al. Storage of boar semen
Woelders Fundamentals and recent development in cryopreservation of bull and boar semen
Barbas et al. Cryopreservation of domestic animal sperm cells
Oberstein et al. Cryopreservation of equine embryos by open pulled straw, cryoloop, or conventional slow cooling methods
JP6932893B2 (ja) 精子用希釈液及びそれを用いた精子の保存方法
Rehman et al. Semen extenders and artificial insemination in ruminants
CN102657149B (zh) 一种超高活力羊细管精液冷冻方法
Saragusty et al. Protective effects of iodixanol during bovine sperm cryopreservation
Mughal et al. Cryopreservation of buffalo (Bubalus bubalis) semen-limitations and expectations
Beltran et al. Optimized extenders for cryopreservation of buck semen for artificial insemination.
Isachenko et al. Vitrification technique-new possibilities for male gamete low-temperature storage
JP5738314B2 (ja) 人工授精用ストロー
Beheshti et al. The effect of vitamin E on post-thawed buffalo bull sperm parameters
Pickett et al. Extension and storage of stallion spermatozoa: a review
US9439414B2 (en) Sperm diluent solution and method for artificial insemination using same
US20120301868A1 (en) Extender for a semen suspension
Mittal et al. Cryopreservation of buffalo bull semen-restriction and expectation: A review
JP5920787B2 (ja) ヒトの体外受精用精液又は人工授精用精液の調整方法
Talukdar et al. Cryopreservation induces capacitation-like changes of the swamp buffalo spermatozoa
JP2015171346A (ja) 精子の希釈液及びそれを用いた精子の保存方法
KR102226182B1 (ko) 난황추출물과 유단백추출물을 포함하는 정자의 동결보존용 조성물
Abdussamad et al. Comparison of various semen extenders and addition of prostaglandin F2α on pregnancy rate in cows
Tibary et al. Challenges in the development of artificial insemination in the dromedary camel

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11845911

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012546938

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2820677

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13990987

Country of ref document: US