CN102124098A - 细胞及组织的冷冻保存用组合物 - Google Patents
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Abstract
【课题】提供可不使用二甲基亚砜等的有害的冷冻保存剂地安全地冷冻保存包括人的动物或植物的细胞或组织的冷冻保存用组合物。另外，提供向食品或药品的冷冻保存或冷冻干燥制品的应用。【解决手段】使ε-聚-L-赖氨酸与无水琥珀酸反应使而阻断ε-聚-L-赖氨酸的氨基的60％以上。将如此得到的高分子化合物以7.5w/w％溶解于市售的培养液之一的Dulbecco-改良的Eagle培养基(DMEM)中而作为冷冻保存液。另外，向食品或药品添加0.5～10％ε-聚-L-赖氨酸琥珀酸衍生物而防止冷冻浓缩。
Description
【技术领域】
本发明涉及人及动物细胞及组织的冷冻保存用试剂，其能减轻在冷冻及解冻细胞及组织时对细胞及组织的损伤或伤害。此冷冻保存技术预期在需要冷冻保存活的组织(例如皮肤，角膜，胰岛及心脏瓣膜)的移植医学中，及在需要冷冻保存细胞(例如造血干细胞，间叶干细胞，胚胎干细胞，iPS细胞(诱导的多能干细胞)等)的再生医学中高度需求。
【背景技术】
在0℃或以下温度的冷冻保存技术常规用于长-时间保存带水的或含水物质(例如植物及动物的细胞及组织以及食品)。已知冷冻这些物质时，冰晶形成，得到不均匀浓度的被水分子排除的溶质及混入物，称为‘冷冻浓缩’。
为阻止冷冻浓缩，可将各低分子量化合物加入冷冻保存介质。例如，加入二甲基亚砜(DMSO)，甘油等作为冷冻-保护剂，以最小化由冷冻保存过程中细胞中的结晶化的水导致的对细胞及组织的损伤。
因此，细胞通常悬浮于冷冻管中的含5～20％冷冻保存剂(例如DMSO，甘油，乙二醇及丙二醇)的生理溶液，培养基中，及于低温，-80℃或-196℃保存。
这些试剂中，DMSO是最有效的及常采用的，但其在生理学上有毒，及已知当将细胞输注到受者时导致高血压，恶心及呕吐。而且，DMSO毒性倾向于衰减解冻的细胞培养或输注到受者身体后细胞的存活率和/或功能。
这些试剂中，甘油具有更低冷冻保存效果，及要求仅于室温或非冷冻低温保持细胞悬浮液后冷冻，或通过使用程序冷冻器等精确控制降低的温度。而且，因为它们对细胞生存及功能的低保护效果，所述冷冻保存剂对解冻的细胞有害。
冷冻保存干细胞(例如胚胎干细胞或iPS细胞)或生殖细胞(例如精子，未受精的或受精卵)中，用高浓度的冷冻保护剂(例如DMSO，乙酰胺，丙二醇及聚乙二醇)进行快速冷冻或玻璃化。玻璃化快速致使细胞内水成为玻璃化状态，以避免冰晶形成所致的对细胞的伤害或损伤。还是，细胞或组织被浓的冷冻保存剂的高毒性损伤非常可能；因此，此技术仅在一些有限情况中采用。
制备药学产品，食品及用于展示目的的冰雕中，使用例如氯化钠或糖，葡萄糖及海藻糖的添加剂。也使用其他由生物(例如植物，鱼及昆虫)制得的例如抗冷冻蛋白或抗冷冻糖蛋白的添加剂(特开2005-126533及特开2003-250506)。
燃料电池中，水通过电化学反应在任何一个电极产生。例如，在质子-交换膜燃料电池中，水在阴极电极产生；及产生的一部分水通过电解质膜向阳极侧移动。水也将从进入电池的气体中的蒸汽冷凝产生。这些水潜在地阻碍气流，耗竭气体本身的供给及最终降低电池表现。这些错杂可通过用亲水包被材料(例如蛋白)处理气体分隔物表面，由此限制水冷凝来防止，但液体水甚至在所述条件下于低温偶尔冷冻导致其他错杂。为防止此问题，将有抗冷冻蛋白的聚合物电解质加入树脂层，其然后包被聚合物电解质膜表面(下列Adler等人)，但此方法具有高成本的问题。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】特表平10-511402
【专利文献2】专利第3694730号
【专利文献3】特开2005-126533
【专利文献4】特开2003-250506
【专利文献5】特开2008-041596
【非专利文献】
【非专利文献1】Lovelock JE and Bishop MWH，Nature183：1394-1395，1959
【非专利文献2】Polge C，Smith AU，Parkes AS，Nature164：666-666，1949
【非专利文献3】Miszta-Lane H，Gill P，Mirbolooki M，LakeyJRT.Cell Preserv Technol 5，16-24，2007
【非专利文献4】Ha SY，Jee BC，Suh CS，Kim HS，Oh SK，Kim SH，Moon SY.Human Reproduction 20，1779-1786，2005
【非专利文献5】Yu HN，Lee YR，Nob EM，et al.INT JHEMATOL≡87：189-194；2008
【非专利文献6】Adler S，Pellozzer C，Paparella M，Hartung T，Bremer S.Toxicol in Vitro 20：265-271；2006
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
常规冷冻保存方法(包括快速冷冻技术)在冷冻及解冻后不可保存细胞或组织的完全结构完整性；因此，非常需要有低毒性的新冷冻保存物质。而且，已知DMSO诱导细胞(例如HL-60细胞)分化；因此，其不适于某些类型的细胞。抗冷冻蛋白及糖蛋白具有优良的保存能力，但用于食物成本太高(JPY1，300,000YEN/g)，更别提用于细胞及组织。
本发明旨在提供具有优良的保护效果及对于细胞或组织的低毒性的冷冻保存剂，从而取代DMSO。本发明也旨在提供廉价的及安全的具有类似于抗冷冻蛋白及糖蛋白的阻止冷凝的性质的冷冻保存剂，从而以使冷冻保存及冷冻干燥物质(例如食品及药学产品)。
【解决课题的技术方案】
本发明的冷冻保存液包括：基本上1～50％的具有侧链氨基的聚胺；及生理溶液(例如盐水或培养基)。
【发明效果】
通过将各动物细胞(包括人细胞)及植物细胞浸入冷冻保存液然后于-80℃冷冻保存或用液体或蒸汽氮冷却下，而能不使用高度毒性DMSO或其他常规冷冻保存剂而保持它们的存活率及生物活性地保存。因为未使用常规冷冻保存剂(例如DMSO，甘油，乙二醇)等，对细胞的毒性保持低，及能不降低细胞的生物活性地长时间冷冻保存细胞。而且，冷冻保存液无蛋白成分(例如胎牛血清及白蛋白)，因此，无感染疾病的担忧，及不受偶尔见于由生物材料制成的药学产品的巨大变化的影响。
具有侧链氨基的聚胺(例如ε-聚-L-赖氨酸及聚烯丙胺)由于侧链氨基而具有与细胞膜的亲和力，因此，认为具有细胞保护效果。具有丰富的羧基的聚合物化合物也具有与水的高亲和性，因此，将在冷冻过程中，将细胞内水辅助移出到周围的培养基，由此预期具有冷冻保存效果。以足够的比例兼有氨基及羧基的聚合物化合物预期在冷冻时具有对细胞的进一步改善的冷冻保存效果。因此，本发明以提供具有高有效性及高安全性的冷冻保存液为目标，锐意研究了具有阳离子基团(例如侧链氨基)的聚合物化合物(例如聚氨基酸)，或具有阴离子基团(例如羧酸基)的聚合物化合物、以及兼有阳离子及阴离子基团的聚合物化合物的条件或要求。
本发明的冷冻保存剂相比DMSO毒性小，及不要求细胞或组织解冻后洗涤。然后可将解冻的细胞或组织直接悬浮于培养基中，以立即开始培养处理。
可根据本发明稳定地进行实验用培养细胞的冷冻保存；及而且期望能通过保持功能细胞(例如胰岛及干细胞(例如ES细胞，间叶干细胞及iPS细胞))的细胞功能来保存。因此，预期改善这些细胞的移植效率。
通过使用本发明的非冷冻聚-氨基酸，能阻止具有生理物质的带水物质的冷冻过程中的生理物质的钝化。而且，通过使用非冷冻聚-氨基酸，可在通过带水或含水物质的冷冻或冷冻干燥来获得冷冻的产品或冷冻干燥的产品的过程中达到不同于水分子的成分的均匀扩散。冷冻的产物可为冰淇淋，果汁牛奶冻，其他冷冻甜食，展览用冰，速冻汤等；及冷冻干燥产品可为冷冻干燥的粉末形式的食品或药学产品。
本发明的非冷冻试剂也可应用于工业用燃料电池，以阻止它们的由于液体冷冻的起始表现的劣化。
【附图说明】
图1是显示ε-聚-L-赖氨酸中阻断的氨基的百分率与通过使用氨基通过琥珀酸酐部分阻断的ε-聚-L-赖氨酸冷冻保存的有活力的L929细胞的百分率之间的关系的坐标图；
图2是显示部分阻断的聚-L-赖氨酸的浓度与通过使用已以相当于ε-聚-L-赖氨酸的氨基的63％的摩尔量加入琥珀酸酐的ε-聚-L-赖氨酸(PLL琥珀酸酐63％)冷冻保存的有活力的L929细胞的百分率之间的关系的坐标图；
图3-1是显示已在10％DMSO/胎牛血清中冷冻，然后解冻及不洗涤或稀释地立即培养于平板24小时的L929细胞的培养物的显微镜图像；
图3-2是显示已在含63％琥珀酸酐的7.5％PLL溶液中冷冻，然后解冻及不洗涤或稀释地立即转移到平板24小时的L929细胞的培养物的显微镜图像；
图4是显示在含63％琥珀酸酐和10％DMSO/胎牛血清的7.5％PLL溶液中冷冻的大鼠间叶干细胞(RMSC)，及就它们的分化为骨，脂肪体，及软骨的多能性进行评估的一组坐标图。包括未冷冻的及未分化的细胞用于比较。
图5是显示通过在30％蔗糖水溶液中加入0.1～15％PLL(ε-聚-L-赖氨酸)(PLL琥珀酸酐63％)防止冰重结晶的一系列显微镜图像。
图6是显示冷冻的不含琥珀酸酐的5％PLL溶液(ε-聚-L-赖氨酸)及含63％琥珀酸酐的5％PLL溶液(PLL琥珀酸酐63％)中的晶体结构的显微镜图像。
图7是冷冻干燥的琼脂凝胶的照片(1)。左边的凝胶是无添加剂，及右边的具有含63％琥珀酸酐的5％PLL。
图8是冷冻的-解冻的琼脂凝胶的照片(2)。含63％琥珀酸酐的PLL浓度是0％(左)，1％(中)及3％(右)。
【实施方式】
通过在生理溶液中溶解1～50w/w％；优选2～20w/w％，特别优选3～15w/w％，及更优选5～10w/w％的聚合物(例如聚-赖氨酸)来得到本发明的冷冻保存液。待使用的生理溶液是生理盐水以及用于培养各细胞及组织的培养基。例如，Dulbecco-改良的eagle MEM培养基(DMEM)可为优选的培养基之一。代之以，或除了聚-赖氨酸之外，可使用聚烯丙胺。代替这些，或除了这些之至少一种之外，待使用的化合物选自：其他聚胺(例如导入氨基的多糖类)及聚-氨基酸(例如聚-精氨酸，聚-谷氨酸及聚-天冬氨酸)；也选自葡聚糖，糊精，支链淀粉及脱乙酰壳多糖的多糖化合物，以及聚羧酸(例如聚丙烯酸)。这些聚合物中，优选的是具有可通过在相同单体分子中兼有阳离子及阴离子取代基的单体化合物的聚合获得的结构的聚合物；及尤其优选的是聚-氨基酸。更特别是，尤其优选的是具有兼有氨基及羧基的重复单元的聚合物。
待使用的聚-赖氨酸可为ε-聚-L-赖氨酸或ε-聚-D-赖氨酸或α-聚-L-赖氨酸。冷冻保护剂聚合物具有100与100,000之间的分子量。最优选的聚合物落入常规用作食品添加剂的一组ε-聚-L-赖氨酸。这些或者是通过酶合成的或通过链霉菌属真菌产生的，及具有1000～20,000的平均分子量，及特别具有1000～10,000的平均分子量(http://www.chisso.co.jp/fine/jp/polylisin/index.html)，尝试产生有变动于15～35之间的聚合度，及有20或更低聚合度(例如，特开2003-171463及特开2005-318815)。平均分子量或平均聚合度可容易通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过例如使用由Atto有限公司提供的电泳设备及密度计(AE-6920V型)测量。标准蛋白标记物用于测量。可热处理聚-赖氨酸，以增加其分子量大于30,000及用作聚合物化合物。但是，以上提及的分子量范围由于随着分子量的增加的粘度而优选。因为具有游离末端羧基的聚-赖氨酸具有侧链伯氨基，它们的如下文所述的通过二羧酸酐的部分酰胺化大大给出优良的混合性及增溶表现。也可根据本发明采用的其他特别有利的聚合物化合物是平均分子量1000～1,000,000，优选1000～20,000的聚烯丙胺。例如，所述可采用的聚合物是：向烯丙胺聚合物(日东纺织有限公司的PAA-03)的水溶液加入乙酸酐或乙酸；及部分-甲氧基-羰基化的烯丙胺聚合物(日东纺织有限公司的PAA-U5000)。烯丙胺聚合物，如同聚-赖氨酸，仅具有侧链基团伯氨基，但每单位分子量的伯氨基密度相比在聚-赖氨酸中，在烯丙胺聚合物中更大。而且，当烯丙胺部分羧化时，得到的聚合物化合物认为如同后述部分-羧化的聚-赖氨酸发挥作用。
优选地，聚胺的氨基通过用羧酸酐羧基化或乙酰化来部分阻断。此阻断通过氨基的羧化或乙酰化至优选50-99mol％，特别50～93mol％，更优选50～90mol％，再更优选为55～80mol％，及最优选58～76mol％的程度来进行。约50％的氨基将通过与52～53mol％的无水羧酸(相对于聚胺中氨基的摩尔量)反应来阻断。正常反应条件下，当与100mol％无水羧酸反应时，将阻断90～95％的氨基。以上提及的范围以上或以下的阻断率将降低冷冻保存效果。本文中可采用的羧酸酐包括：乙酸酐，柠檬酸酐，琥珀酸酐，戊二酸酐，苹果酸酐，富马酸酐及苹果酸酐。这些中，特别优选琥珀酸酐及乙酸酐。
但是，也可使用氨基未阻断而处于游离状态的聚胺；因此可采用的羧化及乙酰化程度跨0～100mol/mol％的范围。本发明中，可使用部分羧基胺化的聚羧酸。更特别是，聚羧酸可通过使其羧基与化合物(例如二胺，三胺及聚胺)反应来部分胺化。可采用的二胺是乙二胺及酰肼，例如己二酸二酰肼。这些氨基化合物与羧酸的反应以与碳二亚胺的加成反应方式进行。这种情况下，可采用在0～100mol/mol％范围内的胺化作用程度。如同氨基阻断，残留羧基的百分率优选在50～99mol％范围内，更优选在60～97mol％范围内，其中，残留百分率是胺化的羧酸基的残留百分比。例如，使用具有平均分子量1000～3,000,000，或尤其是1000～10,000的聚丙烯酸；及1～50mol％的，优选3～40mol％的聚丙烯酸的羧基用胺类及碳二亚胺(例如乙二胺二酰肼等)阻断。本发明的冷冻保存液也可含0.3～15w/w％，或尤其是0.1～50w/w％的常规冷冻保存物质，例如DMSO，甘油，乙二醇，海藻糖或蔗糖。因为细胞在冷冻及解冻期间经受氧化应激所致的损伤，将抗氧化剂添加到冷冻保护剂预期提高其保存效果。例如，可使用抗氧化剂，例如过氧化氢酶，过氧化物酶，超氧化物歧化酶，维生素E，维生素C，多酚(例如表没食子儿茶酚没食子酸酯)或谷胱甘肽。
本发明的冷冻保存剂的渗透压是200～1000mOsm/kg，更优选为300～700mOsm/kg，及还优选400～600mOsm/kg。本发明的冷冻保存剂可应用于保存不仅细胞，而且组织。所述待用冷冻保存剂冷冻保存的细胞及组织之例是培养的细胞系，动物及人来源的受精卵。进一步例为：精子细胞，胚胎干细胞，iPS细胞，间叶干细胞，造血干细胞，神经元干细胞，脐带血干细胞，肝细胞，神经细胞，心肌细胞，血管内皮细胞，血管平滑肌细胞及血细胞。不仅可包括动物或人细胞，而且包括植物细胞。能通过根据本发明的冷冻保存剂保存的组织及器官是皮肤，神经，血管，软骨，角膜，肝，肾，心脏及胰岛。
而且，以上提及的聚合物化合物也可应用于通过将聚合物化合物加入食品或药物用含水或带水物质，以避免冷冻浓缩及由此获得成分均匀扩散的冷冻的或冷冻干燥的产品来产生冷冻的或冷冻干燥的食品或药物。特别可采用通过与琥珀酸酐，乙酸酐或其他羧酸酐反应来用羧化或乙酰化阻断氨基的选自下列的化合物：ε-聚-L-赖氨酸，α-聚-L-赖氨酸，聚精氨酸，其他聚氨基酸，胺化的多糖类及聚烯丙胺。没必要使用生理溶液溶解聚合物化合物。例如，将具有部分阻断的氨基的聚-赖氨酸，其他聚-氨基酸或胺化的聚-糖加入前述用于冰淇淋或冷冻干燥的食品的带水的或含水物质，从而聚合物化合物的浓度成1～15％。用此方式，冷冻浓缩被阻止。如果将琥珀酸酐用于阻断聚合物基团，则当相当于氨基的50～85mol％的摩尔量的琥珀酸酐与聚合物反应时(其中实际氨基-阻断率在约48～80mol％的范围内)，得到阻止冷冻浓缩的优良效果。
上述聚合物化合物可在工业用燃料电池中应用，从而将聚合物化合物加入燃料电池，以阻止它们的起始表现的劣化(可在起始时以别的方式液体冷冻所致)。更特别是，可采用具有氨基的单元形成的聚合物化合物，其选自：ε-聚-L-赖氨酸，α-聚-L-赖氨酸，聚精氨酸，其他聚氨基酸，胺化的多糖类及聚烯丙胺；其中聚合物化合物的氨基通过羧化或乙酰化，通过与琥珀酸酐，乙酸酐或其他羧酸酐反应来阻断；及聚合物化合物可加入暴露于燃料电池内侧的表面层材料。例如，聚合物化合物可以1～15w/w％掺入形成分隔物或固体电解质膜表面的涂层材料，或尤其是UV固化性树脂液体。
【实施例】
以下示本发明的实施例以及比较例，但本发明不限于以下实施例。
【实施例1：冷冻保存溶液的制备】
使用ε-聚-L-赖氨酸(由Chisso公司制造；分子量：4000)的25％水溶液；及使用聚烯丙胺(Nittobo，分子量5000[PAA-05L]，15000[PAA-L]，60000[PAA-H])的20％水溶液。相对于聚胺聚合物的氨基，向各溶液均加入0～100mol％琥珀酸酐(和光纯药工业制)，以获得有具有不同氨基-阻断率的阻断的氨基的聚-胺类。将各聚-胺溶液加入Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Sigma Aldrich)至0～10w/w％。此时，将培养基pH用1N盐酸或氢氧化钠溶液调至7.0～8.0。而且，用蒸汽压渗透压计(5型520，Wescor)测量培养基渗透压及用10％氯化钠水溶液调节。
【实施例2：培养的细胞的冷冻保存】
在冷冻瓶(Simport Plastics)中，将1×106细胞的L929，MG63，Caco-2(大日本住友制药)，Colon26，HT1080，B16F1及KB细胞(ATCC)的各细胞种均悬浮于1ml的各冷冻液；然后在-80℃冷冻器中冷冻。一周后，将细胞在37℃水浴中快速解冻，在DMEM中洗涤及用锥虫蓝染料进行细胞死亡率测试。然后将解冻的细胞以1×105细胞/孔接种于6孔培养板，及在培养6及24小时后用锥虫蓝染料评价细胞存活率。将作为通常使用的冷冻保存剂的胎牛血清(FBS)中的10％DMSO用作比较例的冷冻保存液。
如图1中所示，当在冷冻保存L929细胞中用作冷冻保存液的是已通过相对于氨基加入50％或更多摩尔量的琥珀酸酐来修饰的聚-赖氨酸(PLL)的各7.5％溶液时，则达到几乎相同或高于使用DMSO溶液的比较例的细胞活力。作为通过茚三酮及TNBS方法定量测量残留氨基的结果，已通过加入100％摩尔量的琥珀酸酐修饰的羧化的聚-赖氨酸(PLL)显示具有93％氨基-阻断百分率。已通过相对于聚-赖氨酸的氨基加入10mol％，27mol％，45mol％，52mol％，63mol％及79mol％摩尔量的琥珀酸酐修饰的聚-赖氨酸(PLL)分别显示具有10％，25％，43％，50％，60％及76％的氨基-阻断百分率。如图1中所示，具有在50～93％范围内的氨基-阻断百分率的聚-赖氨酸溶液显示具有冷冻保存效果；及通过具有60％的阻断百分率(已加入63mol％的琥珀酸酐)及76％阻断百分率(已加入79mol％的琥珀酸酐)的聚-赖氨酸溶液达到特别高冷冻保存效果。当使用具有部分阻断的氨基的聚烯丙胺(其为分子量5000的烯丙胺聚合物，已与相当于烯丙胺聚合物中的氨基摩尔量的45～90mol％的琥珀酸酐反应)水溶液时也如同上述显示，随着氨基-阻断百分率增加的细胞存活率改善。
图2显示冷冻保存过程中，L929细胞的细胞存活率与通过相对于氨基加入63％摩尔量的琥珀酸酐来修饰的部分阻断的ε-聚-L-赖氨酸(其在图中被表示为″PLL(0.63)″及在下文说明书通篇称为″PLL琥珀酸酐63％″)的浓度之间的关系。如图2中所示，当部分阻断的聚-L-赖氨酸或PLL琥珀酸酐63％浓度是7.0％或更高时，则细胞存活率几乎相同于或高于使用DMSO溶液得到的细胞存活率。当使用具有部分阻断的氨基的聚烯丙胺(其为分子量5000的烯丙胺聚合物，已与相当于氨基的摩尔量的63～85mol％的琥珀酸酐反应)水溶液时也显示如同上述的趋势。
在图1～2中，呈现最佳结果的范围如在得到保存液的渗透压时显示，对应于在400～600mOsm/kg范围内的渗透压。更特别地，当渗透压在400～600mOsm/kg范围内时得到最佳保存效果。
表1显示当将细胞冷冻保存于PLL琥珀酸酐63％的7.5％溶液时的其他细胞种的冷冻保存效果。如表1所示，全部细胞种达到几乎相同于或高于由DMSO溶液(10％DMSO/胎牛血清)得到的细胞存活率。尽管未显示数据，有部分阻断的氨基的聚烯丙胺产生类似结果。
【表1】7.5％PLL(0.63)对各细胞的冷冻保存效果
| 冷冻保存的细胞 | 解冻后24小时时的存活率 |
| MG63 | 93.1±2.3 |
| HT1080 | 90.2±4.3 |
| Colon26 | 92.3±2.3 |
| B16F1 | 94.2±0.6 |
| KB | 91.8±0.9 |
| Caco2 | 93.7±1.9 |
【实施例3：毒性测试】
对L929细胞进行毒性测试。将已悬浮于含10％胎牛血清的DMEM培养基的细胞接种于96孔平板(1.0×103细胞/孔)及于37℃培养72小时。然后，将各已加入有不同浓度的琥珀酸酐的ε-聚-L-赖氨酸及修饰的聚-赖氨酸均加入培养基，以达到0～10％的终浓度。然后，培养48小时后，通过MTT测定，相对于未加入有聚合物的培养基中的细胞生长，将50％细胞生长抑制时的浓度值测量为IC50。表2显示结果；及比较例的保存液是DMSO溶液(10％DMSO/胎牛血清)。如表2中所示，PLL琥珀酸酐58％，63％及79％的IC50值是DMSO溶液的2～3倍；这表明聚-赖氨酸的毒性是已被广泛地使用的冷冻保存液的1/2～1/3。尤其是，PLL琥珀酸酐63％及PLL琥珀酸酐58％的IC50值最大，它们是显示于图1的数据中高细胞存活率的最佳聚合物化合物。
同时，将含L929细胞的冷冻保存液冷冻，解冻，及直接接种于12孔平板，及于37℃培养24小时。更特别是，将细胞冷冻保存于PLL琥珀酸酐63％的7.5％溶液，及如实施例2解冻，除了既未对液体或细胞进行稀释，也未进行洗涤之外，及将含细胞的液体直接转移到培养平板。细胞的观察表明：如图3-1中所示，已冷冻保存于DMSO溶液(10％DMSO/胎牛血清)的细胞明显呈圆形及死亡；及如图3-2中所示，已冷冻保存于本发明的冷冻保存液的细胞附着到平板及存活良好。氨基部分阻断的聚烯丙胺(这是分子量5000的烯丙胺聚合物，其已与相当于氨基摩尔量的63～85mol％的琥珀酸酐反应)得到类似低毒性的测试结果。
【表2】冷冻保存剂对L929的50％细胞生长-抑制浓度
| IC50/％ |
| DMSO | 2.035±0.017 |
| PLL(0) | 1.194±0.006 |
| PLL(0.44) | 2.025±0.013 |
| PLL(0.58) | ＞7.500 |
| PLL(0.63) | 6.777±0.005 |
| PLL(0.68) | 3.412±0.097 |
| PLL(0.79) | 4.801±0.017 |
【实施例4：间叶干细胞的保存】
将大鼠间叶干细胞(RMSC)冷冻保存。比较例的保存液是10％DMSO胎牛血清；及实施例中使用的保存液是PLL琥珀酸酐63％的7.5％溶液，其在图4中被表示为7.5％PLL(0.63)。
表3显示，对本发明的冷冻保存液与DMSO溶液而言，解冻后大鼠间叶干细胞(RMSC)的存活率几乎相同。加入有7.5％氨基部分阻断的聚烯丙胺(分子量5000的烯丙胺聚合物，其与相当于氨基含量的63～85mol％的琥珀酸酐反应)的DMEM呈现类似高的细胞存活率。
【表3】对大鼠间叶干细胞的冷冻保存效果
| 立即 | 6小时之后 | 24小时之后 | |
| 10％DMSO | 92.3±2.3 | 88.3±1.1 | 92.8±3.5 |
| 7.5％PLL(0.63) | 95.4±3.8 | 92.9±2.0 | 95.7±1.3 |
现在，将细胞如实施例2中所述冷冻保存及解冻；及诱导它们分化为骨细胞，脂肪细胞及软骨细胞，以评估它们的分化潜力。图4显示，细胞的多能性维持为与未冷冻的细胞及与在DMSO溶液中冷冻保存及解冻的细胞几乎相同。对彩色显微图像的图像数据进行到红，绿及蓝3原色的色彩分离；及仅将红色部分显示于图4。因此，将彩色图像中的红色转变为白色；及将彩色图像中的蓝色转变为黑色。到骨细胞的分化潜力通过以用茜素红S染色的方式评估钙淀积来评价；结果，各样品均着红色。如图4中的上行图像所示，相比未分化的细胞，全部分化的细胞的图像类似显示为稀释或低-灰度单色图案。稀释单色图案表明，彩色显微图像在它们的全区具有红色色泽。同时，冷冻保存于各冷冻保存液中的细胞均显示高如未冷冻的细胞的碱性磷酸酶活性。到脂肪细胞的分化潜力通过用油红O染色脂肪滴来评价。在冷冻保存于各冷冻保存液的细胞的显微图像均观察到着红色的脂肪滴。脂肪滴在图4的中行图像中呈现为具有低灰度及直径数十μm的圆形或椭圆形图案。到软骨细胞的分化潜力通过用Alcyan蓝染色细胞聚集物中的蛋白聚糖来评价。如同未冷冻的细胞，在冷冻保存于各冷冻保存液的细胞的显微图像均观察到着蓝色的蛋白聚糖。蛋白聚在图4的下行图像中呈现为深黑色部分。当将加入7.5％氨基部分阻断的聚烯丙胺(分子量5000的烯丙胺聚合物，其与相当于氨基含量的63～85mol％琥珀酸酐反应)的DMEM用作保存液时；则甚至在冷冻后也以类似方式维持细胞的分化潜力。
【实施例5：脐带血的保存】
从人脐带用装有10.5mg抗凝药(EDTA2Na)的7mL塑料真空采血管(Venoject II，Terumo公司)收集脐带血。随后，将加入有PLL琥珀酸酐63％至浓度成7.5％(如表示为7.5％PLL(0.63))的脐带血，在冷冻器中于-80℃冷冻保存3个月。然后将脐带血于37℃水浴中快速解冻，及通过流式细胞术分析未稀释的脐带血样品的表面标记物CD34的表达。表达CD34的造血细胞数根据描述于文献(A.Higuchiet al.，J.Biomed.Mater.Res.，68A，34-42(2004)的改良的方法)中的标准方法测量。因此，根据手册(国际血液疗法及移植学会ISHAGE指南)中的流程，使用Stem-试剂盒(Beckman-Coulter公司)估计表达CD34的造血细胞数。当向脐带血加入加有7.5％的PLL琥珀酸酐63％时，甚至在冷冻保存3个月后，表达CD34的造血细胞的计数的细胞数估计约为第一天的70％；然而，当将10％DMSO溶液状态的脐带血冷冻保存时，表达CD34的造血细胞数估计约为第一天的20％的。因此显示，当将脐带血保存于加入有ε-聚-L-赖氨酸的保存液中时，能将表达CD34的造血细胞长时间以未分化的状态保存。
这些结果显示，根据本发明的实施方式的冷冻保存液对脐带血的保存效果显著优良。
【实施例6：抗冷冻蛋白活性】
研究PLL(ε-聚-L-赖氨酸)及琥珀酸-酐修饰的PLL的抗冷冻蛋白活性或阻止冰重结晶的能力。已知抗冷冻蛋白具有各特定活性，及已知导致热滞后，阻止冰重结晶生长，及冰晶形态学改变为六角形或双锥体。请见JP2005-126533A，JP2003-250506A及JP2008-041596A。
将30％蔗糖水溶液加入非修饰的PLL及PLL琥珀酸酐20％，PLL琥珀酸酐46％，PLL琥珀酸酐50％，PLL琥珀酸酐65％，PLL琥珀酸酐76％及PLL琥珀酸酐84％至1～15％。通过前述方法测量这些琥珀酸-酐修饰的PLL的实际氨基-阻断率，及显示分别约为0.20，0.43，0.48，0.62，0.73及0.80。将4微升(4μL)各非修饰的PLL及修饰的PLL溶液均放到玻璃平板上，及用另一玻璃平板覆盖；然后放置到Linkam公司的温控显微镜台，或快速冷却台10002L；及快速冷却到-30℃，以诱导冰晶形成。随后，逐渐升高台温度，然后保持在-9℃30分钟；及在此过程中，通过显微镜观察冰晶生长。如图5的一系列显微照片中所示，结果显示，通过导入达氨基的50％或更多的羧基可给给PLL赋予阻止冰重结晶的效果。图5显示加入非修饰的PLL及修饰的PLL至溶液中5重量百分率的结果，然而1％～15％浓度的PLL琥珀酸酐50％(PLL(0.50))～PLL琥珀酸酐84％(PLL(0.84))显示在阻止冰重结晶中有效。
随后，在快速冷却台上，研究了非修饰的PLL的5％溶液的及修饰的PLL(PLL琥珀酸酐65％)的5％溶液的冰晶形态。更特别是，首先，将溶液快速冷却到-30℃，以诱导形成丰富的冰晶；然后以0.02℃/分钟的速度升高溶液温度达具有约10μm直径的一个冰晶存在于显微镜视野的温度。如图6的显微镜图像中所示，琥珀酸-酐修饰的PLL溶液中的冰晶显示具有六角形结晶形状。需知，所述六角形结晶显示，如果及当任意PLL琥珀酸酐50％(PLL(0.50))～PLL琥珀酸酐84％(PLL(0.84))的浓度均在1％～15％范围内。琥珀酸-酐修饰的PLL得到最大达0.1℃的热滞后(其为融解温度与结晶-生长-起始温度之间的差异，及抗冷冻蛋白的特性之一)。这显示，可通过导入PLL的氨基的50摩尔％或更多的羧酸基来获得抗冷冻蛋白活性。
【实施例7：食品保存】
阻止冷冻浓缩-冷冻-解冻的琼脂凝胶：向琼脂粉末(Nakaraitesque公司；1级试剂)加入PLL琥珀酸酐63％；然后制备5％溶液。向此溶液加入红墨水，放入塑料瓶，然后于-20℃冷冻；及随后于室温解冻。得到的结果显示于图7；添加5％PLL琥珀酸酐得到右侧凝胶；及无添加得到左侧凝胶。视图的左侧凝胶显示视图的上半侧的红色不透明的部分与视图的下半侧的半透明部分之间的清楚的区分，由此呈现纸巾的网模式，不过其在视图的右上相邻处诱导影。同时，添加PLL琥珀酸酐得到的右侧凝胶在凝胶全体均匀地显示红色；从而表明已阻止冷冻浓缩。
冷冻干燥的琼脂凝胶：向琼脂粉末(Nakaraitesque公司；1级试剂)加入0％，1％及3％PLL琥珀酸酐63％，实际氨基阻断比是0.6。将溶液放入塑料瓶，然后于-20℃冷冻；及随后通过以1Torr真空化来冷冻干燥2～3天，以获得冷冻干燥的琼脂凝胶。将得到的冷冻干燥的产物的照片图像显示于图8。视图左侧的添加0％PLL琥珀酸酐得到的冷冻干燥的琼脂凝胶显示体积收缩到约原来的三分之一，然而添加1％及3％PLL琥珀酸酐得到的冷冻干燥的琼脂凝胶(视图中心及右侧)显示仅小程度的体积收缩。此结果显示，含本发明的非冷冻聚氨基酸的溶液的冷冻干燥导致有效及保持产物质量的干燥。
Claims (9)
1.细胞及组织的冷冻保存用组合物，
其包括：
●聚合物化合物，
■其包括具有氨基的单元的聚合物，及
■其选自：ε-聚-L-赖氨酸，α-聚-L-赖氨酸，聚-精氨酸，其他聚-氨基酸，导入氨基的多糖类及聚烯丙胺；及
●生理溶液；及
将所述聚合物化合物溶于所述生理溶液至1～50w/w％。
2.权利要求1的组合物，其中所述聚合物化合物的50～99mol％的氨基通过与羧酸酐反应而具有羧酸基或乙酰基来阻断。
3.细胞及组织的冷冻保存用组合物，
其包括：
●聚合物化合物，
■其包括具有羧基的单元的聚合物，及
■其选自：聚丙烯酸，α-聚-谷氨酸，γ-聚-谷氨酸，聚-谷氨酸，聚-天冬氨酸，其他聚-氨基酸及羧化的多糖类；及
●生理溶液；及
将所述聚合物化合物溶于所述生理溶液至1～50w/w％。
4.权利要求3的组合物，其中所述聚合物化合物的1～50mol％的羧基通过与具有多个氨基的化合物反应来阻断，所述具有多个氨基的化合物例如二胺，三胺及聚胺。
5.权利要求1～4中任一项的组合物，其中所述生理溶液是盐水，Dulbecco-改良的eagle MEM培养基(DMEM)，或者细胞或组织用培养基。
6.权利要求1～5中任一项的组合物，其中所述聚合物化合物是具有在1000～20,000范围内的数平均分子量的ε-聚-L-赖氨酸。
7.权利要求1～5中任一项的组合物，其中所述聚合物化合物是具有在1000～3,000,000范围内的数平均分子量的聚丙烯酸。
8.食品或药物的冷冻保存或冷冻干燥用添加剂组合物，
其包括聚合物化合物，
●其包括具有氨基的单元的聚合物，及
●其选自：ε-聚-L-赖氨酸，α-聚-L-赖氨酸，聚-精氨酸，其他聚-氨基酸，导入氨基的多糖类及聚烯丙胺；且
其中所述聚合物化合物的氨基通过与羧酸酐反应而具有羧酸基或乙酰基来阻断。
9.制备食品，药物或燃料电池的方法，包括：将权利要求1中所述的添加剂加入：
●用于产生食品或药物的带水物质、或
●工业产品元件，例如燃料电池的内部结构元件，
至所述添加剂的浓度成为在1～15w/w％范围内。
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