CN109006802A - 一种羊鲜精长时保存方法 - Google Patents
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Abstract
一种羊鲜精长时保存方法属于生物技术领域。羊冷冻精液用于人工授精时受胎率较低，效果不理想，且精子活力较低。本发明公开一种羊鲜精稀释液制备方法及低温长时保存技术。稀释液主要成分包括糖类、卵黄、甘油、缓冲物质等。利用加压装置充入空气，然后恢复至正常大气压。采用本发明中的绵羊鲜精稀释液处理的绵羊精子可在4℃条件下保存存时间达到12d左右。
Description
技术领域
本发明涉及现代生物技术领域，尤其是一种羊鲜精稀释液制备方法及低温长时保存技术。
背景技术
绵羊冻精技术对长期保存优良品种的精子，提高种公羊配种效能，血统更新、引种和降低生产成本等具有十分重要的意义。目前，国内种公羊的精子大多当天采集当天使用，保存时间较短。冷冻保存是目前比较常用的精子保存方法，但该方法需要长期使用液氮和低温保存设备，这在部分地区难以实现，且运输困难。随着科技的进步，绵羊鲜精保存技术有了很大的提升和改良，通过稀释液处理的绵羊精子在0-4℃可保存较长的时间。但往往绵羊冷冻精液用于人工授精时受胎率较低，效果不理想，且精子活力较低。因此，近年来低温保存鲜精已成为精子保存研究的新热点，而提高保存精液的品质以及受精能力是低温保存技术的关键所在。
在畜牧业生产上，对精液品质进行分析，可以评价公畜的种用价值，也可以为精液的利用作准备。目前，精液品质的主要检测指标有精子活力、精液量、精液颜色、精子密度、精子畸形率、顶体完整率、存活时间、气味等。精液稀释液可模拟绵羊体内环境的渗透压和PH值，同时起到防止精细胞卵磷脂流失、细菌污染和防冻剂的作用。采用本发明中的绵羊鲜精稀释液处理的绵羊精子可在4℃条件下保存存时间达到12d左右。
发明内容
为了克服现有精子保存技术的不足，本发明公开一种绵羊鲜精稀释液制备方法及低温长时保存技术。稀释液主要成分包括糖类、卵黄、甘油、缓冲物质等。其中糖类能够为精子提供存活所需营养，起到低温保护的作用。卵黄对精子耐受低渗和高渗以及保持精子活力具有重要作用。甘油通过渗透作用阻碍细胞内冰晶形成，同时还能降低稀释液中盐的解离度，但甘油的添加浓度需要适量。此外，为维持精液适当的pH值和抑制稀释液中细菌生长，稀释液中需加入柠檬酸钠、磷酸二氢钾等缓冲物质和青霉素、链霉素等抗菌物质抑制细菌微生物的生长。鲜精液稀释液配方：3g海藻糖、80mg谷胱甘肽、250mg牛血清蛋白、150mg三磷酸腺苷、800mg维生素C、3.2g柠檬酸钠、5mg超氧化物歧化酶、量取20mL卵黄、5mL乙二醇、加入20万单位青霉素、20万单位链霉素。注：按上述配方称量后，加双蒸水定容至100mL。
将按照上述配方配置好的稀释液移至密封罐中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1个标准大气增加到1.2个标准大气压，保持15min后，继续充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1.2个标准大气增加到1.3个标准大气压，保持15min后，恢复至正常大气压。所得稀释液为本发明绵羊鲜精低温保存稀释液。
本发明的有益效果为延长精子存活时间、提高精子活率、提高精子顶体完整性。利用本发明可大大提高优良种公羊精液的利用率，是值得在生产中应用的新型技术。
具体实施方案
配制精液稀释液：称取3g海藻糖、80mg谷胱甘肽、250mg牛血清蛋白、150mg三磷酸腺苷、800mg维生素C、3.2g柠檬酸钠、5mg超氧化物歧化酶、量取20mL卵黄、5mL乙二醇、加入20万单位青霉素、20万单位链霉素，加双蒸水定容至100mL。将采集到的种公羊精液与在35℃预热后的本发明稀释液按重量比以1：3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至4℃并转移至密封罐中，然后利用加压装置充入4℃空气，在55-60秒之间将该密封罐中气压由1个标准大气增加到1.2个标准大气压，保持15min，继续充入4℃空气，在55-60秒之间将该密封罐中气压由1.2个标准大气增加到1.3个标准大气压，保持15min，恢复至正常气压，然后于4-6℃保存。所得稀释液为本发明绵羊鲜精低温保存稀释液。
1，一种羊鲜精长时保存方法，其特征是：第一步，配制精液稀释液：称取3g海藻糖、80mg谷胱甘肽、250mg牛血清蛋白、150mg三磷酸腺苷、800mg维生素C、3.2g柠檬酸钠、5mg超氧化物歧化酶、量取20mL卵黄、5mL乙二醇、加入20万单位青霉素、20万单位链霉素，加双蒸水定容至100mL，
第二步，将采集到的种公羊精液与在35℃预热后的第一步所述的稀释液按以重量比为1：3等温稀释后置于水浴杯中，将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至4℃并转移至密封罐中，然后利用加压装置充入4℃空气，在55-60秒之间将该密封罐中气压由1个标准大气增加到1.2个标准大气压，保持15min，然后，继续充入4℃空气，在55-60秒之间将该密封罐中气压由1.2个标准大气增加到1.3个标准大气压，保持15min，然后，恢复至正常气压，然后于4-6℃保存。
试验介绍
选择5只膘情中等、体质健康、性欲旺盛、体型大小相似的萨福克种公羊，采取舍饲与放牧相结合的饲养方式，所谓饲草为青干草和青贮草。采用隔日采精法，利用假阴道法采集精液，精液采集完毕后，测定种公羊精液射精量，用显微镜观察精子活力，立即进行常规品质评定，按照国标要求原精液活力在0.7以上，无异常气味，色泽乳白，用于低温保存，活力低于0.7则废弃。
第1组将采集到的种公羊精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比以1：3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至4℃保存。
第2组将采集到的种公羊精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比以1：3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃保存。
第3组将采集到的种公羊精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比以1：3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃并转移至密封罐中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中气压由1个标准大气压增加到1.2个标准大气压，保持30min，恢复至正常气压，于6℃保存。
本发明所述的1min内，指的是：在55-60秒之间。以下也如此。
第4组将采集到的种公羊精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比以1：3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃并转移至密封罐中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1个标准大气增加到1.1个标准大气压，保持30min，恢复至正常气压，于6℃保存。
第5组将采集到的种公羊精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比以1：3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃并转移至密封罐中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1个标准大气增加到1.3个标准大气压，保持30min，恢复至正常气压，于6℃保存。
第6组将采集到的种公羊精液与在35℃预热后的本发明配方稀释液按重量比以1：3等温稀释后置于水浴杯中。将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至6℃并转移至密封罐中，利用加压装置充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1个标准大气增加到1.2个标准大气压，保持15min，继续充入4℃空气，在1min内将该密封罐中大气压由1.2个标准大气增加到1.3个标准大气压，保持15min，恢复至正常气压，于6℃保存。
试验方法
1.精子存活率
精子活率检测：将稀释精液摇匀后，取10μL中层精液滴于经预热的37℃恒温板载玻片上，盖片后置于显微镜下放大400倍，检查精子约1000个左右，分别计算呈直线运动精子数和总精子数。每间隔48h镜检精子活率一次。
2.顶体膜完整性检验
精子顶体膜完整性利用SYBR-14/PI双染法测定。将5μL SYBR-14和2.5μL PI加入50μL复苏精液中，37℃水浴孵育8min，8000rpm离心3min，收集沉淀，用4-羟乙基哌嗪乙磺酸液(Hepes)洗涤两次，最后用50μL Hepes溶解沉淀，轻轻吹打混匀后取15μL均匀涂在载玻片上，在荧光显微镜下计数约200个精子，并记录染成不同颜色精子的数量，分析顶体完整性。
3.统计分析
每组实验重复3次，所得数据以平均值±标准误表示。
测定结果如下所示：
平均采精量为1.06±0.11ml，精液外观呈浓稠的乳白色，无异味。分别在0d,2d,4d,6d,8d,10d,12d和14d比较不同处理绵羊鲜精低温保存活率。不同处理绵羊鲜精低温保存活率如表1所示，第6组处理(即本发明绵羊鲜精稀释液)于12d精子活力为0.71，精液活率仍保持在70％以上。
表1不同处理绵羊鲜精低温保存活率比较
分别在0d,2d,4d,6d,8d,10d,12d和14d比较不同处理绵羊鲜精低温保存顶体完整性。不同处理绵羊鲜精低温保存顶体完整性如表2所示，第6组处理(即本发明绵羊鲜精稀释液)于12d保存顶体完整性较其他组最佳。
表2，不同处理绵羊鲜精低温保存顶体完整性比较
通过本发明配置的稀释液，绵羊鲜精的低温保存时间达12d，且同时精液活率仍保持在70％以上，远远超过现今普遍存在的稀释液所能保存的时间。目前我国很多地区受技术条件的限制造成了优质种羊杂交改良地方品种的进展缓慢，使优质种羊的高效利用难以得到推广。而本发明绵羊鲜精超长时间保存技术可以使优质种羊的精液12d内精子活率在0.71以上，且保证更高的顶体完整性。本发明使得绵羊鲜精保存技术有了很大的提升和改良。
Claims (1)
1.一种羊鲜精长时保存方法，其特征是：第一步，配制精液稀释液：称取3g海藻糖、80mg谷胱甘肽、250mg牛血清蛋白、150mg三磷酸腺苷、800mg维生素C、3.2g柠檬酸钠、5mg超氧化物歧化酶、量取20mL卵黄、5mL乙二醇、加入20万单位青霉素、20万单位链霉素，加双蒸水定容至100mL，
第二步，将采集到的种公羊精液与在35℃预热后的第一步所述的稀释液按以重量比为1：3等温稀释后置于水浴杯中，将水浴杯置于4℃冰箱，2h内缓慢降温至4℃并转移至密封罐中，然后利用加压装置充入4℃空气，在55-60秒之间将该密封罐中气压由1个标准大气增加到1.2个标准大气压，保持15min，然后，继续充入4℃空气，在55-60秒之间将该密封罐中气压由1.2个标准大气增加到1.3个标准大气压，保持15min，然后，恢复至正常气压，然后于4-6℃保存。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111053080A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-04-24 | 中国农业大学 | 一种提高精液低温保存品质的精液稀释液及其应用方法 |
| CN111657270A (zh) * | 2020-07-21 | 2020-09-15 | 张良斌 | 一种家畜精液常温保存剂及其制备方法和使用方法 |
| CN112514890A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-03-19 | 洛阳市洛瑞牧业有限公司 | 一种羊鲜精常温短期保存稀释液及制备方法 |
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2018
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|---|---|---|---|---|
| CN111053080A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-04-24 | 中国农业大学 | 一种提高精液低温保存品质的精液稀释液及其应用方法 |
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